RU2813789C1 - Biological product for protecting agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects and method of producing this biological product - Google Patents
Biological product for protecting agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects and method of producing this biological product Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813789C1 RU2813789C1 RU2022131735A RU2022131735A RU2813789C1 RU 2813789 C1 RU2813789 C1 RU 2813789C1 RU 2022131735 A RU2022131735 A RU 2022131735A RU 2022131735 A RU2022131735 A RU 2022131735A RU 2813789 C1 RU2813789 C1 RU 2813789C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biological product
- strain
- hours
- leaf
- spore
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 241000193364 Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 20
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 10
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 7
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 abstract description 7
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000001666 entomocidal effect Effects 0.000 description 10
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 10
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 8
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 8
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 8
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000289763 Dasygaster padockina Species 0.000 description 5
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000001887 anti-feedant effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000258923 Neuroptera Species 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 2
- 241001143315 Xanthogaleruca luteola Species 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 2
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 241000255676 Malacosoma Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000243198 Peritrichia Species 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N deltamethrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](C=C(Br)Br)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010981 drying operation Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002737 fructose Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых на основе нового штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis.The group of inventions relates to agricultural microbiology and concerns the production of a biological product for the protection of agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects based on a new strain of entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.
Одним из эффективных штаммов, являющихся основой энтомопатогенного биопрепарата является штамм Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 98 (BtH1 98), выделенный из погибшей куколки капустной совки, и хранящийся в коллекции «ВНИИгенетика» под № ЦМПЛ В-2452. На его основе получают биопрепарат Битоксибациллин. Штамм BtH1 98 культивируют на питательной среде, содержащей фосфорнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, крахмал кукурузный и кормовые дрожжи, зеленую патоку, при аэрации в течение 48 ч, титр спор в культуральной жидкости 3,5-3,75 млрд/мл, содержание экзотоксина 0,5 мг/мл. В полученную культуральную жидкость вносят 1% натрия хлористого и высушивают. Получают Битоксибациллин, в котором содержится спор 65-72 млрд/г и 1% экзотоксина (А.с. 1074138 (1982). Штамм Bacillus thuringiensis subps. thuringiensis 98 - продуцент битоксибациллина).One of the effective strains that are the basis of the entomopathogenic biological product is the strain Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 98 (BtH1 98), isolated from a dead bollworm pupa, and stored in the collection of “VNIIGenetics” under No. TsMPL V-2452. Based on it, the biological product Bitoxibacillin is obtained. Strain BtH1 98 is cultivated on a nutrient medium containing ammonium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, corn starch and feed yeast, green molasses, with aeration for 48 hours, spore titer in the culture liquid is 3.5-3.75 billion/ml, exotoxin content 0.5 mg/ml. 1% sodium chloride is added to the resulting culture liquid and dried. Bitoxibacillin is obtained, which contains spores of 65-72 billion/g and 1% exotoxin (A.C. 1074138 (1982). Strain Bacillus thuringiensis subps. thuringiensis 98 is a producer of bitoxibacillin).
Недостатком штамма Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis 98 (BtH1 98) является то, что он быстро теряет энтомоцидную активность при хранении. Битоксибациллин на основе штамма BtH1 98 получают в сухой форме, в связи с чем его производство является энергоемким и затратным из-за проведения операции сушки. Кроме того, высокие температуры при сушке оказывают губительное влияние на кристаллы эндотоксина, разрушая их, что приводит к снижению энтомоцидной активности БитоксибациллинаThe disadvantage of the Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis 98 (BtH1 98) strain is that it quickly loses its entomocidal activity during storage. Bitoxibacillin based on the BtH1 98 strain is obtained in dry form, and therefore its production is energy-intensive and costly due to the drying operation. In addition, high temperatures during drying have a detrimental effect on endotoxin crystals, destroying them, which leads to a decrease in the entomocidal activity of Bitoxibacillin
Известен энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 800, выделенный из гусениц кольчатого шелкопряда в Крыму и также использующийся в качестве агента для получения биопрепарата Битоксибациллин (А.с. SU 1791973 А1; МПК A01N 63/00, C12N 1/20; 01.10.1992). Недостатками данного штамма при культивировании является необходимость отдельно стерилизовать некоторые компоненты питательной среды (зеленая патока) и вводить их в ферментер перед засевом инокулюма, что ведет к затрате дополнительной электроэнергии и увеличению числа технологических операций.The known entomopathogenic strain Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 800, isolated from ringed silkworm caterpillars in the Crimea and also used as an agent for the production of the biological product Bitoxibacillin (A.c. SU 1791973 A1; IPC A01N 63/00, C12N 1/20; 10/01/1992). The disadvantages of this strain during cultivation are the need to separately sterilize some components of the nutrient medium (green molasses) and introduce them into the fermenter before seeding the inoculum, which leads to the consumption of additional electricity and an increase in the number of technological operations.
Известен штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15, продуцент биопреперата Битоксин (патент RU 2514211 С1; МПК C12N 1/20, A01N 63/00; опубл. 27.04.2014, бюл. №12). Культурально-морфологические признаки штамма следующие. Грампозитивные подвижные палочки, перетрихи, вегетативные клетки одиночные или в виде коротких цепочек по 2-4 клетки в цепочке. Размеры клеток суточной культуры на рыбном агаре от 0,8-0,9 до 2,3-3,0 мкм на 3-4 сутки роста на рыбном агаре в клетках образуются споры бобовидной формы, расположенные субтерминально размером от 0,8-0,9 до 1,1-1,3 мкм и паросгюральные включения экзотоксина белкового кристалла - ромбовидной формы. На рыбном агаре через 48 часов роста при 24-28°С культура образует плоские колонии серовато-белого цвета округлой формы с неровным краем, поверхность мелкозернистая, диаметр колоний 22-24 мм. Штамм растет при температуре 20-34°С, оптимум роста при 26-32°С. И при рН 7,0-8,8 (оптимум 7,2-7,6). Биохимические свойтсва штамма ближайшего аналога следующие. Факультативный анаэроб, желатину разжижает на 5 сутки. Казеин разлагает, молоко иептонизирует через 24-28 часов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол. Гидролизует крахмал, использует цитраты.The known strain is Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15, producer of the biological product Bitoxin (patent RU 2514211 C1; IPC C12N 1/20, A01N 63/00; published 04/27/2014, bulletin No. 12). The cultural and morphological characteristics of the strain are as follows. Gram-positive motile rods, peritrichia, vegetative cells are single or in the form of short chains of 2-4 cells in a chain. The cell sizes of a daily culture on fish agar range from 0.8-0.9 to 2.3-3.0 microns; on the 3rd-4th day of growth on fish agar, bean-shaped spores are formed in the cells, located subterminally, ranging in size from 0.8-0. 9 to 1.1-1.3 microns and parosgural inclusions of exotoxin protein crystal - diamond-shaped. On fish agar, after 48 hours of growth at 24-28°C, the culture forms flat colonies of a grayish-white round shape with an uneven edge, the surface is fine-grained, the diameter of the colonies is 22-24 mm. The strain grows at a temperature of 20-34°C, optimal growth at 26-32°C. And at pH 7.0-8.8 (optimum 7.2-7.6). The biochemical properties of the strain of the closest analogue are as follows. A facultative anaerobe, it liquefies gelatin on the 5th day. Casein decomposes and milk eptonizes within 24-28 hours. Forms acetylmethylcarbinol on Clark's medium. Hydrolyzes starch, uses citrates.
На средах, содержащих желток образует лецитиназу, пигмент и уреазу не образовывают. Индол и сероводород не используют. Отношение к источнику углерода выражено в активном усвоении сахарозы, глюкозы, маннозы, левулезы, мальтозы, целлобиозы, салицина. Отношение к источнику азота выражено в активном росте на средах с аммонийными солями, на рыбном агаре. Антигенные свойства: дает позитивную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1 в разведении 1:6400. Штамм продуцирует энтомоцидный экзотоксин, который выделяется из клеток в процессе лизиса их оболочек, и экзотоксин, который выделяется в период вегетационного роста культуры.On media containing yolk it forms lecithinase, pigment and urease are not formed. Indole and hydrogen sulfide are not used. The relationship to the carbon source is expressed in the active absorption of sucrose, glucose, mannose, levulose, maltose, cellobiose, and salicin. The relationship to the source of nitrogen is expressed in active growth on media with ammonium salts and on fish agar. Antigenic properties: gives a positive flagellar antigen reaction with the standard serum of Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1 at a dilution of 1:6400. The strain produces an entomocidal exotoxin, which is released from cells during the lysis of their membranes, and an exotoxin, which is released during the vegetative growth of the crop.
Недостатки, препятствующие использованию Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 как эффективного штамма для создания на его основе биопрепарата: культивирование на сложных органоминеральных средах, штамм не продуцирует агрономически значимое количество стимулирующих рост растений веществ.Disadvantages preventing the use of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 as an effective strain for creating a biological product based on it: cultivation on complex organomineral media, the strain does not produce an agronomically significant amount of plant growth-stimulating substances.
В основу предложенного изобретения поставлена задача получения эффективного штамма энтомопатогенных бактерий группы Bacillus thurmgiensis и создания на его основе биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.The basis of the proposed invention is the task of obtaining an effective strain of entomopathogenic bacteria of the Bacillus thurmgiensis group and creating a biological product based on it to protect agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects.
Поставленная задача решена в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» путем выделения из природных популяций насекомых Крыма нового эффективного штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 и создания на его основе биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых. Способ получения биопрепарата включает получение маточной культуры Bacillus thuringiensis var. thuringiensis RCAM05207 на кукурузно-мелассной среде в течение 13-15 часов с титром КОЕ не менее 1,5-2,0⋅108 в 1 мл, которую в дальнейшем используют для получения жидкой споровой культуры с титром спор не менее 1,0-1,5 млрд. в 1 мл на той же среде при температуре 28-30°С, 220 об/мин., в течение 46-48 часов, после чего жидкую препаративную форму с титром спор не менее 2,4 млрд./мл нарабатывают в ферментере на стабилизированной по рН кукурузно-мелассно-соевой или кукурузно-мелассной среде при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм., при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин. в течение 72 часов, а по окончании культивирования к жидкой культуре добавляют стабилизатор, например, фенол, бензойную кислоту и карбоксиметилцеллюлозу, способствующий хранению биопрепарата в течение 6 месяцев.The task was solved at the Research Institute of Agriculture of Crimea by isolating a new effective strain of entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 and the creation of a biological product based on it to protect agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects. The method for producing a biological product includes obtaining a mother culture of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis RCAM05207 on corn-molasses medium for 13-15 hours with a CFU titer of at least 1.5-2.0⋅10 8 in 1 ml, which is subsequently used to obtain a liquid spore culture with a spore titer of at least 1.0- 1.5 billion in 1 ml on the same medium at a temperature of 28-30°C, 220 rpm, for 46-48 hours, after which a liquid formulation with a spore titer of at least 2.4 billion/ml produced in a fermenter in a pH-stabilized corn-molasses-soybean or corn-molasses medium at 28-30°C, pressure 0.4-0.6 atm., with stirring and aeration 0.17-0.36 volumes/min. for 72 hours, and at the end of cultivation, a stabilizer is added to the liquid culture, for example, phenol, benzoic acid and carboxymethylcellulose, which facilitates the storage of the biological product for 6 months.
Штамм 0371 имеет следующие свойства, совпадающие с известными штаммами. Бактерии штаммов 0371, 98, 800 и 800/15 подвижные, имеют перитрихиальное расположение жгутиков, кристалло- и спорообразующие, грампозитивные. В качестве источников азота штаммы используют минеральные и органические формы азота, как источник углерода - различные формы углеводов. Штаммы 0371 98, 800 и 800/15 способны синтезировать термостабильный экзотоксин. Штаммы 0371 и 800/15 имеют широкий спектр энтомопатогенного действия против листоедов.Strain 0371 has the following properties, which coincide with known strains. Bacteria strains 0371, 98, 800 and 800/15 are motile, have peritrichous flagella, crystal- and spore-forming, and gram-positive. Strains use mineral and organic forms of nitrogen as sources of nitrogen, and various forms of carbohydrates as a source of carbon. Strains 0371 98, 800 and 800/15 are capable of synthesizing a heat-stable exotoxin. Strains 0371 and 800/15 have a wide spectrum of entomopathogenic action against leaf beetles.
Штамм 0371 имеет такие отличительные особенности.Strain 0371 has such distinctive features.
Морфологические и физиолого-биохимические: размеры вегетативных клеток штамма 0371 на стадии суточной культуры от 0,6-1,0 до 3,0-6,0 мкм. Штамм 0371 слабо использует неорганические формы азота. По активности экзотоксинообразования штамм 0371 по LK50 для комнатной мухи составляет 5,4 мкл/г корма, штамм 800-5,0 мкл/г корма.Morphological and physiological-biochemical: the size of the vegetative cells of strain 0371 at the daily culture stage is from 0.6-1.0 to 3.0-6.0 microns. Strain 0371 weakly uses inorganic forms of nitrogen. According to the activity of exotoxin formation, strain 0371 according to LK50 for a housefly is 5.4 μl/g of feed, strain 800 is 5.0 μl/g of feed.
Технологические: экспоненциальная фаза роста штамма 0371 на стадии вегетативных клеток переходит к стационарной через 13-14 часов культивирования, тогда как у штамма 800 - через 16-17 часов. Культура нового штамма достигает технологической зрелости через 36 часов, а штамма 800 - через 40 часов. Штамм 0371 возможно культивировать на питательных средах, все компоненты которых стерилизуются одновременно с применением одного режима стерилизации. Штамм 0371 в отличие от штамма 800/15 возможно культивировать в ферментере с применением трех режимов подачи воздуха.Technological: the exponential growth phase of strain 0371 at the stage of vegetative cells passes to the stationary phase after 13-14 hours of cultivation, whereas for strain 800 - after 16-17 hours. The culture of the new strain reaches technological maturity after 36 hours, and strain 800 - after 40 hours. Strain 0371 can be cultivated on nutrient media, all components of which are sterilized simultaneously using the same sterilization regime. Strain 0371, unlike strain 800/15, can be cultivated in a fermenter using three air supply modes.
Энтомопатогенные: помимо высокой энтомоцидной активности против насекомых отряда Coleoptera (колорадского жука и ильмового листоеда) и Lepidoptera (плодовой моли, златогузки, американской белой бабочки) спектр действия штамма 0371 распространяется также на листоедов - вредителей капусты.Entomopathogenic: in addition to high entomocidal activity against insects of the order Coleoptera (Colorado beetle and elm leaf beetle) and Lepidoptera (fruit moth, lacewing, American white butterfly), the spectrum of action of strain 0371 also extends to leaf beetles - pests of cabbage.
Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 способен продуцировать индолилуксусную кислоту в концентрации 0,92 мг/мл, штамм 98 - в концентрации 0,86 мг/мл, в то время как штамм 800 - только 0,48 мг/мл.Strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 is capable of producing indolylacetic acid at a concentration of 0.92 mg/ml, strain 98 at a concentration of 0.86 mg/ml, while strain 800 produces only 0.48 mg/ml.
Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 имеет выраженное антифидантное и физиологическое действие.Strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 has a pronounced antifeedant and physiological effect.
Приведенная выше совокупность существенных признаков штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 подтверждает возможность получения на его основе эффективного биопреперата против листогрызущих вредителей сельскохозяйственных и декоративных растений.The above set of essential characteristics of the strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 confirms the possibility of obtaining an effective biological product based on it against leaf-eating pests of agricultural and ornamental plants.
Характеристика штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371. Номенклатурные данные: род Bacillus, вид Bacillus thurmgiensis. Происхождение штамма: штамм получен в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» из насекомых природных популяций.Characteristics of the bacterial strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371. Nomenclature data: genus Bacillus, species Bacillus thurmgiensis. Origin of the strain: the strain was obtained at the Federal State Budgetary Institution "Research Institute of Agriculture of the Crimea" from insects of natural populations.
Способ выделения: штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 выделен микробиологическим методом (Бурцева Л.И. Методы выделения и биотестирования энтомопатогенных бактерий // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / под ред. В.В. Глупова. - М.: Круглый год, 2001. - 736 с.) из гусениц кольчатого шелкопряда Malacosoma neustris L., идентифицирован по определителю Берджи (1974), Barjac, Bonnefoi (1968), Lusenco (1963) и сравнен с типовым штаммом бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800.Method of isolation: strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 was isolated by microbiological method (Burtseva L.I. Methods for isolation and biotesting of entomopathogenic bacteria // Insect pathogens: structural and functional aspects / edited by V.V. Glupov. - M.: Krugly God, 2001. - 736 p.) from caterpillars of the ringed silkworm Malacosoma neustris L., identified according to the key of Bergey (1974), Barjac, Bonnefoi (1968), Lusenco (1963) and compared with the type strain of bacteria Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800.
Штамм депонирован 5.12.2019 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05207.The strain was deposited on December 5, 2019 in the Departmental Collection of Beneficial Microorganisms for Agricultural Purposes of the Federal State Budgetary Institution All-Russian Research Institute of Agriculture under registration number RCAM05207.
Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки. Клетки суточной культуры палочкоподобные с закругленными концами, размер клеток от 0,6-1,0 до 3,0-6,0 мкм. Подвижные благодаря жгутикам (перитрихи), грамположительные. Образуют споры, белковый кристаллический эндотоксин и термостабильный экзотоксин. На РПА образовывают серовато-белые округлые, плоские, слабо жесткие колонии со слегка зубчатым краем. Диаметр колоний 2,0-3,5 мм.The strain has the following cultural and morphological characteristics. The cells of a daily culture are rod-shaped with rounded ends, cell size from 0.6-1.0 to 3.0-6.0 microns. Motile thanks to flagella (peritrichous), gram-positive. They produce spores, protein crystalline endotoxin and heat-stable exotoxin. On RPA they form grayish-white round, flat, slightly rigid colonies with a slightly jagged edge. The diameter of the colonies is 2.0-3.5 mm.
Физиолого-биохимические признаки штамма. Хорошо развивается на средах с органическим азотом, например, РПА, солями аммония. Штамм 0371 активно усваивает сахарозу, маннозу, целлобиозу, глюкозу, салицин, эскулин. Гидролизует крахмал, использует цитраты. На средах, содержащих желток образует лецитиназу, пигмента и уреазы не образует.Physiological and biochemical characteristics of the strain. It grows well on media with organic nitrogen, for example, RPA, ammonium salts. Strain 0371 actively absorbs sucrose, mannose, cellobiose, glucose, salicin, and esculin. Hydrolyzes starch, uses citrates. On media containing yolk it forms lecithinase, but does not form pigment or urease.
На плотных и жидких средах штамм 0371 растет в пределах 20-35°С, температурный оптимум составляет 25-32°С. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 7,0-8,3, а оптимальной является реакция среды 7,2-7,6. Признаки штамма стойкие. Антигенные свойства штамма: дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1. Культуру сохраняют на скошенном РПА при температуре 3-5°С, пересевая 2 раза в год. Состав питательной среды для долгосрочного сохранения штамма (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0, пептон ферментативный 8,0, NaCl - 4,0, агар - 20, вода - 1 л. рН - 7,2-7,4.On solid and liquid media, strain 0371 grows within the range of 20-35°C, the temperature optimum is 25-32°C. Bacterial growth is observed in the pH range of 7.0-8.3, and the optimal reaction is 7.2-7.6. The symptoms of the strain are persistent. Antigenic properties of the strain: gives a positive reaction of the flagellar antigen with the standard serum of Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1. The culture is stored on a slanted RPA at a temperature of 3-5°C, reseeding 2 times a year. Composition of the nutrient medium for long-term preservation of the strain (g/l): pancreatic hydrolyzate of fish meal - 8.0, enzymatic peptone 8.0, NaCl - 4.0, agar - 20, water - 1 l. pH - 7.2-7.4.
Энтомопатогенные свойства штамма: штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 обладает энтомоцидной активностью для насекомых отряда Coleoptera и Lepidoptera (таблица 1). Рекомендован для борьбы с личинками и гусеницами младших возрастов, в особенности колорадского жука, плодовой моли, ильмового листоеда, златогузки и капустной совки. Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека.Entomopathogenic properties of the strain: strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 has entomicidal activity against insects of the orders Coleoptera and Lepidoptera (Table 1). Recommended for combating larvae and caterpillars of younger instars, especially the Colorado potato beetle, fruit moth, elm leaf beetle, lacewing and cabbage cutworm. The strain is not pathogenic for warm-blooded animals and humans.
Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 способен продуцировать индолилуксусную кислоту в концентрации 0,92 мг/мл, в то время как штамм 800 - только 0,48 мг/мл (таблица 2). Штамм обладает высокой целлюлозолитической активностью (до 87,7% к контролю) и активно продуцирует целлюлазы - до 0,24 мкМ в мин.Strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 is capable of producing indolylacetic acid at a concentration of 0.92 mg/ml, while strain 800 produces only 0.48 mg/ml (Table 2). The strain has high cellulolytic activity (up to 87.7% of the control) and actively produces cellulases - up to 0.24 µM per minute.
Заявляемый штамм способен продуцировать несколько типов энтомоцидных кристаллических белков, принадлежащих к группам cry 1, cry 1А, cry 9 и cry 11, в то время как штамм 800 продуцирует белки cry 1 и cry 7-8, а штамм 98 - только cry 1.The inventive strain is capable of producing several types of entomocidal crystal proteins belonging to the cry 1, cry 1A, cry 9 and cry 11 groups, while strain 800 produces cry 1 and cry 7-8 proteins, and strain 98 produces only cry 1.
Биотехнологическая характеристика: штамм 0371 продуцирует энтомоцидный эндотоксин, освобождающийся из клеток в процессе лизиса их оболочек и экзотоксин, продуцирующийся в процессе вегетативного роста культуры. LD50 штамма (млн. спор/мл) по отношению к гусеницам американской белой бабочки и капустной совки составляет 8,9-17,2 для личинок колорадского жука - 12,3.Biotechnological characteristics: strain 0371 produces entomocidal endotoxin, released from cells during the lysis of their membranes, and exotoxin, produced during the vegetative growth of the culture. LD 50 of the strain (million spores/ml) in relation to the caterpillars of the American white butterfly and cabbage cutworm is 8.9-17.2 for the larvae of the Colorado potato beetle - 12.3.
Жидкая культура штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 является основой для разработки биопрепарата. Маточную культуру бактерий выращивают в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде, которая состоит из 2,0% кукурузного экстракта и 1,5% мелассы, воды водопроводной, рН 7,3-7,7. Маточную среду засевают суспензией спор, выращенных на РПА и инкубируют на термостабильной качалке при 28-32°С, 220 об/мин., в течение 13-15 часов. Титр колониеобразующих единиц (КУО) маточной культуры должен быть не менее 1,5-2,0⋅108 в 1 мл. Маточную культуру используют для засева питательной среды для получения жидкой споровой культуры. Как питательную среду используют среду того же состава, как и при получении маточного материала. Среду засевают в объеме 1% от объема среды. Культивирование проводят в стеклянных бутылях объемом 3 л с 0,5 л среды на технологичных качалках при температуре 28-30°С, 220 об/мин., в течение 46-48 часов. После окончания культивирования жидкая культура содержит в основной своей массе свободные споры, титр которых составляет 1,0-1,5 млрд. в 1 мл, включения эндотоксина и 0,4 мг/мл экзотоксина.Liquid culture of the strain Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 is the basis for the development of a biological product. A mother culture of bacteria is grown in Erlenmeyer flasks on a liquid nutrient medium, which consists of 2.0% corn extract and 1.5% molasses, tap water, pH 7.3-7.7. The mother medium is inoculated with a suspension of spores grown on RPA and incubated on a thermostable shaker at 28-32°C, 220 rpm, for 13-15 hours. The titer of colony forming units (CFU) of the mother culture should be at least 1.5-2.0⋅10 8 in 1 ml. The mother culture is used to inoculate a nutrient medium to obtain a liquid spore culture. As a nutrient medium, a medium of the same composition is used as when obtaining the mother material. The medium is inoculated in a volume of 1% of the medium volume. Cultivation is carried out in glass bottles of 3 liters with 0.5 liters of medium on technological rockers at a temperature of 28-30°C, 220 rpm, for 46-48 hours. After the end of cultivation, the liquid culture contains mostly free spores, the titer of which is 1.0-1.5 billion per 1 ml, inclusions of endotoxin and 0.4 mg/ml of exotoxin.
Для получения жидкой препаративной формы бактерии выращивают на средах следующего состава:To obtain a liquid formulation, bacteria are grown in media of the following composition:
Среда №1: 1,5% кукурузного экстракта, 2,0% мелассы и 1,5% соевой муки.Medium #1: 1.5% corn extract, 2.0% molasses and 1.5% soybean flour.
Среда №2: 3,0% кукурузного экстракта, 1,0% мелассы.Medium #2: 3.0% corn extract, 1.0% molasses.
Для стабилизации рН питательные среды обогащают 0,5 г/л K2HPO4, 0,5 г/л KH2PO4 и 1 г/л мела.To stabilize the pH, nutrient media are enriched with 0.5 g/l K 2 HPO 4 , 0.5 g/l KH 2 PO 4 and 1 g/l chalk.
В ферментер емкостью 50 л заливают 30 л воды и вносят компоненты среды, перемешивают с 40% гидроксидом натрия, при необходимости, доводят уровень рН до 7,2-7,4, стерилизуют при 1,5 атм. 2 часа. Среду охлаждают до 27-30°С и засевают посевным материалом (100-120 мл споровой культуры с титром спор не менее 1 млрд./мл). Культивирование ведут при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм., при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин. в течение 72 часов.30 liters of water are poured into a fermenter with a capacity of 50 liters and the components of the medium are added, mixed with 40% sodium hydroxide, if necessary, the pH level is adjusted to 7.2-7.4, and sterilized at 1.5 atm. 2 hours. The medium is cooled to 27-30°C and inoculated with inoculum (100-120 ml of spore culture with a spore titer of at least 1 billion/ml). Cultivation is carried out at 28-30°C, pressure 0.4-0.6 atm, with stirring and aeration 0.17-0.36 volumes/min. within 72 hours.
Титр спор в среднем после ферментации должен составлять не менее 2,4 млрд./мл.The average spore titer after fermentation should be at least 2.4 billion/ml.
Вносят 0,2-0,3% по объему пеногасителя (растительное масло). Пеногаситель стерилизуют при 1 атмосфере 40 минут.Add 0.2-0.3% by volume of defoamer (vegetable oil). The defoamer is sterilized at 1 atmosphere for 40 minutes.
Режим подачи воздуха.Air supply mode.
С 0 часов до 12 часов 0,15-0,2 объема воздуха (объем среды)/мин.From 0 o'clock to 12 o'clock 0.15-0.2 air volume (medium volume)/min.
С 12 часов до 24 часов 0,5 объема воздуха (объем среды)/мин.From 12 hours to 24 hours 0.5 air volume (medium volume)/min.
С 24 часов до 42 часов 0,6-0,7 объема воздуха (объем среды)/мин.From 24 hours to 42 hours 0.6-0.7 volume of air (volume of medium)/min.
Через 36-42 часа при наличии пенообразования прекращают подачу воздуха, температуру в ферментере поднимают до 35°С для ускорения выхода спор.After 36-42 hours, if foaming occurs, the air supply is stopped, the temperature in the fermenter is raised to 35°C to accelerate the release of spores.
Пробоотбор ведут через 18, 36, 42 и 70 часов объемом 100-150 мл.Sampling is carried out after 18, 36, 42 and 70 hours with a volume of 100-150 ml.
К жидкой культуре добавляют стабилизатор, в качестве которого может быть использовано 0,4% фенола, 0,4% бензойной кислоты и 4% карбоксиметилцеллюлозы. Полученная жидкая препаративная форма сохраняет титр спор не менее 2,4 млрд./мл в течение 6 месяцев.A stabilizer is added to the liquid culture, which can be 0.4% phenol, 0.4% benzoic acid and 4% carboxymethylcellulose. The resulting liquid formulation retains a spore titer of at least 2.4 billion/ml for 6 months.
Лабораторное определение энтомоцидной активности жидкой препаративной формы штамма 0371 проводили на личинках колорадского жука, гусеницах американской белой бабочки и капустной совки. Корм (листья картофеля, клена, капусты) обрабатывали водяной суспензией бактерий, потом подсаживали по 25 насекомых (в 3-кратной повторности). Для сравнения исследовали также штаммы 98 и 800. Результаты исследований приведены в таблице 2.Laboratory determination of the entomocidal activity of the liquid formulation of strain 0371 was carried out on the larvae of the Colorado potato beetle, caterpillars of the American white butterfly and cabbage cutworm. The food (potato, maple, cabbage leaves) was treated with a water suspension of bacteria, then 25 insects were added (in 3 repetitions). For comparison, strains 98 and 800 were also studied. The research results are shown in Table 2.
Энтомоцидная активность штамма Bacillus thuringiensis 800 (LD50, млн. спор/мл) по отношению к личинкам листоедов младшего возраста составляет соответственно: колорадского жука 9,2, американской белой бабочки 10,9, капустной совки 14,3 (таблица 3). Для гусениц американской белой бабочки и капустной совки LD50 штамма Bacillus thuringiensis 0371 составляет соответственно 8,3 и 9,2, что в 1,3 и 1,5 раза соответственно превышает эффективность штамма 800. Для колорадского жука штамм Bacillus thuringiensis 0371 проявляет энтомоцидность практически равную таковой для штамма 800 и превышает эффективность штамма 98 в 2,4 раза.The entomocidal activity of the Bacillus thuringiensis strain 800 (LD 50 , million spores/ml) against young leaf beetle larvae is, respectively: Colorado potato beetle 9.2, American white butterfly 10.9, cabbage cutworm 14.3 (Table 3). For caterpillars of the American white butterfly and cabbage cutworm, the LD 50 of the Bacillus thuringiensis strain 0371 is 8.3 and 9.2, respectively, which is 1.3 and 1.5 times higher, respectively, than the effectiveness of strain 800. For the Colorado potato beetle, the Bacillus thuringiensis strain 0371 exhibits almost entomocidal activity equal to that for strain 800 and exceeds the efficiency of strain 98 by 2.4 times.
Определение энтомопатогенного действия биопрепарата на основе штамма В. thuringiensis 0371 проводили в полевом опыте по летальности относительно наиболее активного и распространенного вредителя картофеля - колорадского жука. Площадь участка - 36 м2, повторность - 3-кратная, по 25 учетных кустов в повторе.Determination of the entomopathogenic effect of the biological product based on the B. thuringiensis 0371 strain was carried out in a field experiment on lethality relative to the most active and widespread potato pest - the Colorado potato beetle. Plot area - 36 m2 , repetition - 3-fold, 25 counting bushes per repetition.
Опрыскивание растений картофеля осуществляли жидкими препаративными формами В. thuringiensis (400 л/га). Для сравнения использовали вариант с опрыскиванием растений химическим инсектицидом Денис (1 мл на 5 л/га). Контрольные участки обрабатывали водой. Обработку растений картофеля проводили в вечернее время, в безветренную погоду при температуре 24-25°С в период массового появления личинок I-II возраста.Spraying of potato plants was carried out with liquid formulations of B. thuringiensis (400 l/ha). For comparison, we used the option of spraying plants with the chemical insecticide Denis (1 ml per 5 l/ha). Control areas were treated with water. Processing of potato plants was carried out in the evening, in calm weather at a temperature of 24-25°C during the period of mass appearance of larvae of I-II instars.
Учет вредителя проводили непосредственно перед обработкой и в дальнейшем на 3, 5, 7-е и 10-е сутки. Эффективность штаммов В. thurmgiensis и химического инсектицида определяли в % снижения численности вредителя с учетом изменения численности в контроле.The pest was counted immediately before treatment and subsequently on the 3rd, 5th, 7th and 10th days. The effectiveness of B. thurmgiensis strains and chemical insecticide was determined as a % reduction in pest numbers, taking into account changes in numbers in the control.
Жидкая препаративная форма на основе штамма В. thuringiensis 0371 является эффективным средством против личинок вредителя, особенно младшего возраста (таблица 4). Основное количество личинок младшего возраста (до 81,5%) погибали в течение 5 суток, старшего возраста (до 74,0%) - в течение 10 суток. В целом, в течение 10 суток под воздействием патогена количество погибших насекомых достигало 86,2%. При обработке жидкой препаративной формой на основе штамма В. thuringiensis 800 в течение первых 3 суток погибало до 40,0% личинок младшего возраста, однако на 10-е сутки их гибель достигала 88,7%. Основное количество личинок старшого возраста погибало на 10-й день учета (до 83,4%). A liquid formulation based on the B. thuringiensis strain 0371 is an effective remedy against pest larvae, especially younger ones (Table 4). The main number of younger larvae (up to 81.5%) died within 5 days, older ones (up to 74.0%) - within 10 days. In general, within 10 days under the influence of the pathogen, the number of dead insects reached 86.2%. When treated with a liquid formulation based on the B. thuringiensis 800 strain, up to 40.0% of younger larvae died during the first 3 days, but on the 10th day their death reached 88.7%. The main number of older larvae died on the 10th day of recording (up to 83.4%).
На участке, обработанном химическим инсектицидом, 100% гибель личинок отмечали в течение 3 суток.In the area treated with a chemical insecticide, 100% death of larvae was observed within 3 days.
Урожай картофеля при обработке жидкой препаративной формой В. thurmgiensis 0371 оказался на 38,28% выше, чем в контроле, и на 7,4%, чем при обработке В. thuringiensis 800. Прибавка к урожаю составила 22,84 ц/га относительно контроля. При обработке раствором Децис урожай уменьшился на 6,42%. Потеря урожая составила 3,83 ц/га.The potato yield when treated with the liquid preparative form of B. thurmgiensis 0371 was 38.28% higher than in the control, and by 7.4% than when treated with B. thuringiensis 800. The increase in yield was 22.84 c/ha relative to the control . When treated with Decis solution, the yield decreased by 6.42%. The yield loss was 3.83 c/ha.
Жидкая препаративная форма штамма 0371 имеет антифидантное действие: поврежденность корма после обработки не превышало 5%, контрольные (без обработки) 7 растений были повреждены на 80-95%. Физиологическое действие препаративной формы штамма 0371 проявлялось также в снижении веса на 25-82% и размеров на 25-60% исследуемых насекомых, в сравнении с контрольными после 10 суток опыта.The liquid formulation of strain 0371 has an antifeedant effect: the damage to the feed after treatment did not exceed 5%, the control (without treatment) 7 plants were damaged by 80-95%. The physiological effect of the preparative form of strain 0371 was also manifested in a reduction in weight by 25-82% and size by 25-60% of the studied insects, in comparison with the control after 10 days of experiment.
Оценка жидкой препаративной формы проведена на поливном участке капусты сорта Колобок ООО «Биовитерра» (Республика Крым). Площадь участка под каждым вариантом 3 га, повторность опыта 2-кратная. Расход рабочей жидкости 300 л/га. Проводили две обработки против гусениц 1-2 возрастов капустной моли, белянок и совок. Биологическая эффективность препарата оценивалась на 3, 5, 7 и 10-е сутки после обработки и составила 72,3-82,6%.The evaluation of the liquid preparative form was carried out on an irrigated plot of cabbage variety Kolobok LLC Bioviterra (Republic of Crimea). The area of the plot under each option is 3 hectares, the experiment is repeated 2 times. Working fluid consumption 300 l/ha. Two treatments were carried out against caterpillars of 1-2 instars of cabbage moths, white moths and cutworms. The biological effectiveness of the drug was assessed on days 3, 5, 7 and 10 after treatment and amounted to 72.3-82.6%.
Таким образом, предлагаемый новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 является эффективным и технологичным, обладает высокой энтомоцидной активностью в отношении широкого спектра вредителей, имеет выраженное антифидантное и физиологическое действие. Разработанный на основе заявляемого штамма биопрепарат может быть использован для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.Thus, the proposed new strain of bacteria Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 is effective and technologically advanced, has high entomocidal activity against a wide range of pests, and has a pronounced antifeedant and physiological effect. The biological product developed on the basis of the claimed strain can be used to protect agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects.
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813789C1 true RU2813789C1 (en) | 2024-02-16 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514211C1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-04-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук | BACTERIAL STRAIN Bacillus thuringiensis varthuringiensis N800/15 AS AGENT FOR PREPARING ENTOMOCIDAL BIOPREPARATION |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514211C1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-04-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук | BACTERIAL STRAIN Bacillus thuringiensis varthuringiensis N800/15 AS AGENT FOR PREPARING ENTOMOCIDAL BIOPREPARATION |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BOUKEDI, H. Isolation and characterization of a new Bacillus thuringiensis strain with a;promising toxicity against Lepidopteran pests, Microbiol. Res., 2016, No 186, 187, p. 9-15. * |
| КРЫЖКО А.В. и др., Выделение и изучение новых высокоактивных штаммов bacillus thuringiensis, Таврический вестник аграрной науки, N4 (8), 2016, с. 30-36. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109929784B (en) | One bacillus subtilis and its cultural method and application | |
| CN105802893B (en) | A kind of entomopathogenic nematode symbiotic bacteria bacterial strain and its application | |
| CN110628664B (en) | Pseudomonas eastern China for preventing and treating root-knot nematode as well as preparation method and application thereof | |
| CN111269858A (en) | Stenotrophomonas species and uses thereof | |
| CN114437994A (en) | Biological control bacterium Bacillus siamensis HT1 and application thereof in preparation of biological control bacterium agent | |
| CN113801818A (en) | Bacillus and application thereof | |
| KR101535893B1 (en) | New microorganism Bacillus amyloliquefaciens CC110 and Microbial agent biopesticide containing the same | |
| CN106244480B (en) | One plant of false Grignon anthropi and its application for preventing and treating plant nematode | |
| KR20080045346A (en) | Bacillus subtilis m27 and biological control of sclerotinia rot by using the same | |
| RU2813789C1 (en) | Biological product for protecting agricultural and ornamental plants from leaf-eating insects and method of producing this biological product | |
| KR20100116023A (en) | Pseudomonas geniculata mh102 strain and method for the biological control of plant diseases using same | |
| Chobchuenchom et al. | Isolation and characterization of pathogens attacking Pomacea canaliculata | |
| CN114085788A (en) | Pseudomonas japonicae strain and application thereof | |
| KR101288414B1 (en) | Novel Rhodotorula graminis Y435 and formulation for controlling plant postharvest disease containing same | |
| KR20060021162A (en) | Antifungal plant growth promoting rhizobacterium, bacillus amyloliquefaciens mj-3 and microbial bed soil using hereof | |
| RU2809733C1 (en) | Strain of entomopathogenic bacteria bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 0271, promising for obtaining biological product against leaf-eating insects | |
| KR101972068B1 (en) | Rhodanobacter glycinis T01E-68 promoting plant growth, inducing tolerance of plants to abiotic stress, and controlling plant diseases, and uses thereof | |
| Jallouli et al. | Improvement of Photorhabdus temperata strain K122 bioinsecticide production by batch and fed-batch fermentations optimization | |
| Khodair et al. | Improvement of Bacillus thuringiensis bioinsecticide production by fed-batch culture on low cost effective medium | |
| CN101475917A (en) | Serratia entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria | |
| RU2422511C1 (en) | Brevibacillus laterosporus BACTERIA STRAIN PRODUCING WIDE SPECTRUM OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS | |
| CN117866855B (en) | Serratia marcescens SMKY2308 strain and application thereof | |
| CN117384807B (en) | Bacillus mycoides HDMM 2 and application thereof | |
| RU2559548C2 (en) | Strain of bacteria bacillus thuringiensis to control colorado potato beetle | |
| RU2752903C1 (en) | Mixture of bacterial strains with cellulolytic and fungicidal activity |