JP4235298B2 - Antibiotic pareic acid A and its production method - Google Patents

Description

で表される化合物であるパレイン酸Ａ、あるいは その製薬学的に許容される塩が提供される。
【０００７】
第１の本発明による式（Ｉ）のパレイン酸Ａの理化学的性状は、次の通りである。
（１）外観
無色オイル
（２）分子式
Ｃ₁₈Ｈ₃₄Ｏ₃
（３）高分解能質量分析（ＨＲＦＡＢＭＳ：負イオンモード）
実験値：m/z 297.2459 （M - H)^-
計算値：m/z 297.2430
（４）比旋光度
［α］_D ²⁸＝ −５゜（ｃ 0.2，クロロホルム）
（５）赤外線吸収スペクトル
添付図面の図１に示す通りである。
【０００８】
（６）プロトン核磁気共鳴スペクトル
５００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で室温にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、添付図面の図２に示す通りである。
（７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル
１２５ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で室温にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、添付図面の図３に示す通りである。
（８）薄層クロマトグラフィー
シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ （メルク社製）の薄層クロマトグラフィーで展開溶媒としてクロロホルム−エタノール（２０：１）で展開したときのＲｆ値は０．４２である。
【０００９】
本発明による新規抗生物質パレイン酸Ａが前記の式（Ｉ）で示される化学構造を有することは、プロトンＮＭＲ、炭素１３ＮＭＲ等の分析を詳細に検討することにより前記の通り決定された。
【００１０】
パレイン酸Ａの製薬学的に許容される塩には、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩が包含される
本発明による式（Ｉ）のパレイン酸Ａは後記の生物学的性質を有する。
すなわち、パレイン酸Ａは、パスツレラ・ヘモリティカに対して特異的にすぐれた抗菌活性を示し、またパスツレラ・マルトシダのいくつかの菌株にも抗菌活性を示す。パレイン酸Ａは、ほ乳動物に対する急性毒性が低い。
【００１１】
試験例１
各種の微生物に対するパレイン酸Ａの抗菌スペクトルは日本化学療法学会標準法に基づいて、ミュラー・ヒントン寒天（Difco 社製）培地上およびブレイン・ハート・インフュージョン寒天（Difco 社製）培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果をそれぞれ表１および表２に示す。
【００１２】

【００１３】

【００１４】

【００１５】
試験例２
マウスを使用して式（Ｉ）のパレイン酸Ａの急性毒性を試験するにあたって、10％ジメチルスルホキシドおよびツイーン８０含有の生理食塩水にパレイン酸Ａを溶解し、その溶液を腹腔内に注射し、マウスを14日間観察した。その結果、パレイン酸Ａは65 mg／kgの投与量でも毒性は認められなかった。
【００１６】
さらに、第２の本発明（請求項１の発明）によると、FERM P−16999の受託番号で寄託されたパエニバチルス・アルベイ BMK771-AF3株を培養し、その培養物から、比旋光度〔α〕_Ｄ ^２８＝-5°（c 0.2,クロロホルム）をもつ無色オイル状物質の形で得られて次式（Ｉ）

で表される化合物であるパレイン酸Ａを採取することを特徴とする、抗生物質バレイン酸Ａの製造方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法で使用するパレイン酸Ａの生産菌としては、前述した理化学的性質および生物学的性質を有する抗生物質であるパレイン酸Ａを生産する能力を有するものであれば、パエニバチルス属のうちからその種を問わずに適当な微生物を選ぶことができる。かかる微生物のうち、パレイン酸Ａ生産菌の具体的かつ好適な一例には、本発明者らにより平成９年５月、微生物化学研究所において、長野県北安曇郡白馬村岩岳スキー場の土壌より分離したバクテリアで、パエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３の菌株番号が付された菌株がある。
【００１８】
以下にパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株の菌学的諸性質について記載する。
１．形態
（１）本菌株の細胞は捍菌であり、大きさは 0.7×0.8 〜 1.6×2.5 ミクロンである。
（２）細胞の多形性は、特に認められない。
（３）周鞭毛を有し、運動性を示す。
（４）胞子を有する。その形は卵円形、大きさは0.45〜0.55×1.0 ミクロン、位置は中立(central) 、菌体の膨隆を認める。
【００１９】
２．各種培地における生育状態
肉汁ゼラチン穿刺培養以外は、すべて30℃で培養して試験した。
（１）肉汁寒天平板培養
コロニーは、やや光沢のある不透明な円形で、培養後３日目頃より辺縁は不規則になる。色は無色から明るい茶灰（colorless 〜light brownish gray ）を示す。拡散性色素は認められない。
（２）肉汁液体培養
培養後１日でわずかに菌の生育がみられ、２日目には管底に少量の菌の沈澱を認める。培養後１週間で試験管表面にうっすらと白く生育し、管底にも沈澱を生ずる。培養後２週間を経過しても培地の濁度にさほどの変化はみられない。
【００２０】
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養
20℃培養では、培地表面及び穿刺線に沿って菌の生育が認められ、培養後２日目頃より液化が始まり、その後ゆっくりと進み、４週間で培地の２／３程度を液化した。液化作用は中等度である。30℃培養では培地表面及び全体に良好な菌の生育がみられ、培養後２日目で菌膜を形成する。液化は培養後２日目頃より始まり、４週間培養で完了した。その作用は中等度である。
（４）ミルク培養
ミルクに培養した場合は、培養後２日目頃より培地表面に近い管壁にわずかに生育する。培養後２週間では凝固が観察されず、３週間後に凝固が始まる。ペプトン化は、凝固終了後ただちに始まり、培養後４週間でほぼ完了した。反応は弱酸性である。
【００２１】
３．生理的性質（特に記さない限り、培養温度はすべて30℃）
（１）グラム染色性：不定（幼若培養で陽性、48時間培養では陰性菌に陽性菌が混在し、培養72時間以降は陰性となる。）
（２）硝酸塩の還元：陰性
（３）脱窒反応（駒形らの方法：長谷川武治編著；微生物の分類と同定,223頁，東京大学出版会，1975年) ：陰性
（４）ＭＲテスト：陰性
（５）Ｖ−Ｐテスト：陰性
（６）インドールの生成：陰性
（７）硫化水素の生成：陰性
（８）スターチの加水分解：陽性
（９）クエン酸の利用： Koserの培地、Christensen の培地で共に陰性
【００２２】
（10）無機窒素源の利用：硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムいずれも陽性
（11）色素の生成：キングＡ培地、キングＢ培地、いずれも溶解性色素は認められない。
（12）ウレアーゼ（尿素培地，栄研化学)：陰性
（13）オキシダーゼ：陽性
（14）カタラーゼ：陽性
（15）生育の範囲：pH 6.0〜9.0の範囲で生育を認め、最適 pH は 7.0である。 又、20℃〜37℃の範囲で生育を認め、最適温度は30℃である。
（16）酸素に対する態度：通性嫌気性
（17）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による) : 発酵型
【００２３】
（18）糖類からの酸の生成及びガスの生成（糖加アンモニウム塩培地における） 15種の糖からの酸の生成をＢＣＰ指示薬とＢＴＢ指示薬で調べ、その結果を表３に示す。
【００２４】

【００２５】
表３に示した糖からのガスの生成を調べたが上記15種の糖類のいずれの場合もガスを生成しない。
（19）カゼインの加水分解：陽性
（20）エスクリンの加水分解：陽性
（21）リゾチーム感受性（0.001 ％リゾチームを含む肉汁液体培地）：抵抗性
（22）チロシンの分解：陰性
（23）レシチナーゼ：陽性
（24）非抗酸性である。
【００２６】
４．化学分類学的性質
（１）ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃ含量）：44.9％
【００２７】
以上の性状を要約すると、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株は、グラム染色性が不定であり通性嫌気性の有芽胞捍菌である。又、周鞭毛を有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で中立(central) 、菌体の膨隆を認め、非抗酸性である。寒天培地での生育は不透明で、辺縁は不規則、コロニー表面はにぶい光沢を呈する。ゼラチンを液化し、ミルクを凝固、ペプトン化する。硝酸塩を還元せず、脱窒反応、ＭＲテスト及びＶ−Ｐテストは陰性である。インドールは検出されず、硫化水素を生成しない。スターチを分解し、クエン酸は利用しない。ウレアーゼ反応は陰性、オキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応は陽性である。
【００２８】
本菌株はpH 6.0〜 9.0の範囲で生育し、最適pHは 7.0である。また、20℃〜37℃の範囲で生育を認め、最適温度は30℃である。グルコースを酸化的に分解し、酸を生成するが、ガスは生成しない。なお、前記に示した通り、グルコース以外の他の糖類からも酸を生成するが、ガスは生成しない。リゾチームには抵抗性であり、カゼイン及びエスクリンを分解し、チロシンは分解しない。
【００２９】
以上の性状をもとに、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株を Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 、Volume 2（1986）で検索すると、バチルス(Bacillus)属に属し、バチルス・アルベイ(Bacillus alvei)、バチルス・ラテロスポルス(Bacillus laterosporus) 及びバチルス・ブレビス(Bacillus brevis) があげられた。現在、バチルス属は系統を反映した複数の属に分割され、バチルス属より、1993年にパエニバチルス(Paenibacillus) 属（文献、Antonie von Leeuwenhock 、64巻、243 〜260頁、1993年) が、1996年にブレビバチルス(Brevibacillus)属及びアニュリニバチルス(Aneurinibacillus)属が新属として提案された（文献、International Journal of Systematic Bacteriology、 46 巻、937〜946頁、1996年）。すなわち、検索で提案された上記３株はそれぞれパエニバチルス・アルベイ(Paenibacillus alvei)、ブレビバチルス・ラテロスポルス(Brevibacillus laterosporus) 及びブレビバチルス・ブレビス(Brevibacillus brevis)と記載されている。ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株と上記３種の菌株の性状を文献及び当研究所保存のPaenibacillus alvei IMC B-0925(IFO 3343^Ｔ)、Brevibacillus laterosporus IMC B-0514（1979年に農林水産省家畜衛生試験場より分譲された）及び Brevibacillus brevis IMC B-0115 (IAM 1031)と実地に比較検討し、次の表４に示した。
【００３０】

【００３１】

【００３２】
（注）：表４における各記号は次の意味を有する。
＊：実験結果
±：おそらく陽性と判定される。
1), 2), 3)：文献値 (＋：90％以上の株で陽性、ｄ：11−89％の株で陽性、−：90％以上の株で陰性)
^ａ ：High pressure liquid chromatography (HPLC法) で測定、^ｂ ：Thermal Denaturation Method (Tm 法) で測定、^ｃ ：Buoyant Density Method (BD法)で測定した結果である。
表４に示した１）、２）および３）は下記の引用文献を示す。
1): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Volume 2、1122〜1123頁、 Williams & Wilkins、Baltimore 、1986年
2): The genus Bacillus、Agriculture Handbook No.427 、United States Department of Agriculture 、Washington, D.C.、1973年
3): Topley & Wilson's Principles of Bacteriology、Virology and Immunity、6th edition 、Volume 1、1103頁、Edward Arnold 、London、1975年
【００３３】
以上の表４から明らかなように、ブレビバチルス・ラテロスポルスは芽胞の位置がカヌー型で、スターチの加水分解が陰性、硝酸塩を還元する点でＢＭＫ７７１−ＡＦ３株と大きく異なる。又、ブレビバチルス・ブレビスは生育後Ｖ−ＰブロスのpHが7.0以上を示し、嫌気性条件下では生育せず、50℃でも生育することがある点でＢＭＫ７７１−ＡＦ３株と区別される。一方、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株はインドールの生成が陰性である点で、パエニバチルス・アルベイと相異した結果を示したが、以下に述べる点で極めて近縁の性状を示した。すなわち、
ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株は、生育後Ｖ−ＰブロスのpHが6.0 以下を示し、スターの加水分解が陽性、硝酸塩を還元しない、チロシン を分解しない等の諸点である。なお、Ｖ−Ｐテストは実地に比較検討の結果、両者が陰性であり、文献２）The genus Bacillus、Agriculture Handbook No.427 によれば１／４の確率で陰性を示すと記載されている。又、Egg-yolkレシチナーゼ反応はパエニバチルス・アルベイが文献３）Topley & Wilson's Principles of Bacteriology、Virology and Immunity では陽性と記載されており、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株の成績と合致する。なお、Ｇ＋Ｃ含量についても両者は極めて近い数値を示した。
これらの結果より、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株をパエニバチルス・アルベイPaenibacillus alvei ＢＭＫ７７１−ＡＦ３と同定した。
【００３４】
なお、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成10年９月17日にFERM P−16999 として受託された。
【００３５】
第２の本発明の方法においては、パレイン酸Ａの製造は次の通り行われる。すなわち、パレイン酸Ａの製造は、パレイン酸Ａ生産菌を栄養培地中に接種して、25℃〜30℃の温度で好気的に振とうしながら培養することによって行うのが好ましく、パレイン酸Ａを含む培養物が得られる。このような目的に用いる栄養培地としては、バクテリアの培養に使用しうるものが使用される。栄養源として、例えば市販されているペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、コーン・グルテン・ミール等の窒素源が使用でき、また、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン、コーン・スターチ等の炭水化物あるいは脂肪などの炭素源が使用できる。さらに食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を添加して使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加することができる。これらのものは、パレイン酸Ａ生産菌が利用し、パレイン酸Ａの生産に役に立つものであればよく、公知の放線菌あるいはバクテリアの培養材料はすべて用いることができる。
【００３６】
パレイン酸Ａの生産には、パエニバチルス属に属して広く自然界に存在する微生物でパレイン酸Ａの生産能を有するバクテリアが使用される。具体的には、本発明者らの分離したパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株がパレイン酸Ａを生産することが本発明者らによって明らかにされているが、その他の菌株については、抗生物質生産菌の単離の常法によって自然界より分離することが可能である。また、パエニバチルス・アルベイＢＭＫ７７１−ＡＦ３株を含めて、パレイン酸Ａの生産菌を放射線照射その他変異処理に付して、パレイン酸Ａの生産能を高める余地も残っている。さらに遺伝子工学的手法によってパレイン酸Ａの生産菌を改変することも可能である。
【００３７】
パレイン酸Ａは、パレイン酸Ａの生産菌、好ましくはパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株を適当な培地で好気的に培養し、その培養液から採取することによって製造することができる。培養温度は、パレイン酸Ａ生産菌の発育が実質的に阻害されずにこの物質を生産しうる範囲であれば、特に制約されるものでなく、使用する生産菌に応じて選択できるが、好ましくは、25−30℃の範囲内の温度、特に27℃を挙げることができる。
【００３８】
パレイン酸Ａ生産のために培地に接種される接種物としては、寒天培地上、ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株の斜面培養から得た生育物を使用する。
【００３９】
このパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株の生育は通常は２ないし３日で最高に達するが、一般に充分な抗菌活性が培地に付与されるまで続ける。この培養液中のパレイン酸Ａの力価の経時変化は、パスツレラ・ヘモリティカ BBP0102 N811を被検菌とする円筒平板法により測定できる。
【００４０】
第２の本発明の方法においては、上記のようにして得られた培養物からパレイン酸Ａを採取するが、採取法としては微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる手段を適宜利用することからなる。例えば、水と混ざらない溶媒による抽出の手段、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィー等を単独または組み合わせて利用しパレイン酸Ａを採取できる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体からパレイン酸Ａを抽出し上記と同様に精製して採取することができる。かくして、前記した抗生物質パレイン酸Ａが得られる。培養物から得られたパレイン酸Ａは、これにきわめて構造の類似した数種の化合物群との混合物の形で得られることが多い。 パレイン酸Ａを単離お よび精製するためには、化学変換によって単離し易いパレイン酸Ａ誘導体に変換し、これを分離して精製後、化学変換によって再びパレイン酸Ａの純品にすることが便利である。
【００４１】
例えば、パレイン酸Ａ生産菌の培養物からパレイン酸Ａを採取するに当たっては、次の採取および精製法を用いるのが便利である。 すなわち、得られた培養液を遠心分離にかけて菌体と培養ろ液とに分け、培養ろ液は酢酸ブチルで抽出した。菌体はメタノール抽出した後、濃縮し、少量の水を加えて、酢酸ブチルで抽出した。得られたそれぞれの酢酸ブチル抽出液を合わせて濃縮乾固し、得られた油状残さをヘキサン−メタノール−アセトニトリル（70：20：30容量比）で分配し、その下層を濃縮乾固してパレイン酸Ａを含む粗製オイル状物質を収得し、次いでこのオイル状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム）にかけてパレイン酸Ａの一次精製物を収得し、さらにこれを遠心液液分配クロマトグラフィー（溶媒系：ヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル、７：２：３容量比）にかけてパレイン酸Ａの二次精製オイルを収得し、さらに該オイル中のパレイン酸Ａにジアゾジフェニルメタンを反応させてパレイン酸Ａのジフェニルメチルエステルを生成し、これを含む反応液を濃縮乾固して、得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン−酢酸エチルで溶出）にかけ、次いで、得られたパレイン酸Ａジフェニルメチルエステルよりなる油状物質を塩化ｐ−ニトロベンゾイルで処理してＯ−ｐ−ニトロベンゾイル−パレイン酸Ａジフェニルメチルエステルの粗生成物を採取し、次いでこれをシリカゲルカラムクロマトグラフィーならびにシリカゲル薄層クロマトグラフィーにかけてＯ-ｐ−ニトロベンゾイル−パレイン酸Ａジフェニルメチルエステルの精製品を取得した。次いで該化合物をＮａＯＨ水溶液による加水分解反応にかけ、次いで酸性条件下で遊離酸のパレイン酸Ａを酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽出液を水洗し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、さらに濃縮乾固し、得られたオイル状残さを遠心液液分配クロマトグラフィー（溶媒系：ヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル、５：１：４容量比）による精製にかけることから成る方法を用いることによって、目的のパレイン酸Ａを純品として収得できる。
【００４２】
さらに、第３の本発明（請求項２の発明）では、FERM P−16999の受託番号で寄託されたパエニバチルス・アルベイ BMK771-AF3株により生産される物質であって、牛の呼吸器病起炎菌のパスツレラ・ヘモリテイカに対して抗菌活性を有し且つ比旋光度〔α〕_Ｄ ^２８＝-5°（c 0.2,クロロホルム）をもつ無色オイル状物質の形で得られて次式（Ｉ）

で表される化合物であるパレイン酸Ａまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤が提供される。
【００４３】
この抗菌剤においては、有効成分としてのパレイン酸Ａまたはその塩を製薬学的に許容できる常用の固体または液状担体、例えばエタノール、水、でん粉等と混和してなる組成物の形であることができる。
【００４４】
また、第４の本発明（請求項３の発明）では、FERM P−16999の受託番号で寄託されてあり且つ前記に記載のパレイン酸Ａを生産する特性を持つパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株が提供される。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
抗生物質パレイン酸Ａの製造
寒天斜面培地に培養したパエニバチルス・アルベイ ＢＭＫ７７１−ＡＦ３株（FERM P-16999）を、コーン・スターチ ２％、コーン・グルテン・ミール ２％、グルコース １％、コーン・スティープ・リカー １％、塩化アンモニウム0.25％、塩化ナトリウム 0.3％、炭酸カルシウム 0.6％を含む液体培地1000ml（pH 6.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110 mlずつ分注して且つ常法に より 120℃で20分滅菌したものに接種した。その後27℃で３日間回転振とう培養した。
【００４６】
このようにして得られた培養液を遠心分離して菌体を分離した。得られた培養ろ液（800 ml）を酢酸ブチル（800 ml）で抽出し、その抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、濃縮乾固した。残さをヘキサン−メタノール−アセトニトリル（70ml：20ml：30ml）で分配し、その下層を濃縮乾固し、175 mgのオイル状物質を得た。
【００４７】
また、菌体にはメタノール（200 ml）を加え、攪拌ろ過し、濃縮した後、水（200 ml）を加えて、酢酸ブチル（200 ml）で抽出し、その抽出液を培養ろ液と同様の方法で処理してパレイン酸Ａを含む粗製オイル状物質64mgを得た。上記で得たこれらのオイル状の物質を合わせて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Wakogel C200,18g）によって、クロロホルムを展開溶媒として精製してパレイン酸Ａの一次精製物を得た（収量；46mg）。さらに遠心液液分配クロマトグラフィーによりヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル（７：２：３）の溶媒系を用いて該一次精製物を精製し、パレイン酸Ａ含有の二次精製オイル34.7mgを得た。このパレイン酸Ａ含有の二次精製オイルをメタノール５mlに溶解させ、その溶液にジアゾジフェニルメタン50mgを加え、室温で20時間反応させた。反応を完結させるべく、ジアゾジフェニルメタン９mgを加えさらに９時間反応させた。生成されたパレイン酸Ａのジフェニルメチルエステルを含む反応液を濃縮乾固し、その残さをシリカゲル（Wakogel C200,10g）カラムを用いるクロマトグラフィーにかけて精製した。すなわち、トルエン10mlでシリカゲルカラムを洗浄後、トルエン−酢酸エチル（30：１）で溶出せしめ、パレイン酸Ａのジフェニルメチルエステルよりなる油状物質44mgを得た。
【００４８】
このジフェニルメチルエステルをピリジン４mlに溶解せしめ、塩化ｐ−ニトロベンゾイル30mgを加え29時間室温で反応させてパレイン酸Ａジフェニルメチルエステルの水酸基をｐ−ニトロベンゾイル基で保護した。反応を完結させるべく、塩化ｐ−ニトロベンゾイル20mgを加え19時間反応させた後、さらに塩化ｐ−ニトロベンゾイル10mgを加え８時間反応させた。生成されたＯ−ｐ−ニトロベンゾイルパレイン酸Ａジフェニルメチルエステルを含む反応液に水10μｌ加えて、１時間放置後、濃縮乾固した。残さをシリカゲル（Wakogel C200, ２ｇ）カラムを用いるクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン−酢酸エチル（20：１）で溶出せしめ、油状物質54mgを得た。得られた油状物質をシリカゲルプレート（Merck社製、Art11798）を用いるクロマトグラフィーにかけて、ヘキサン−ジイソプロピルエーテル（10：１）で10回展開し、かきとり分離し、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルパレイン酸Ａジフェニルメチルエステルである単一のパレイン酸Ａ誘導体11.7mgを得た。
【００４９】
この誘導体11.7 mgをエタノール５mlに溶解せしめ、0.5Ｎ ＮａＯＨ １mlを加え、室温で14時間反応させた。この加水分解によりｐ−ニトロベンゾイル基とジフェニルメチルエステル基が脱離した。さらにその濃縮物に水４mlと１Ｎ ＨＣl 0.1 mlを加えて得られた水層から、酢酸エチル４mlで三回抽出した。酢酸エチ ル層（抽出液）を水洗後、無水硫酸ナトリウムで脱水し濃縮乾固した。残さを遠心液液分配クロマトグラフィーによりヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル （５：１：４）の溶媒系を用いて精製し、パレイン酸Ａの純品5.5 mgを無色オイルとして得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はパレイン酸ＡのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図２】図２はパレイン酸Ａの重クロロホルム溶液中にて室温で測定した500ＭＨｚに おけるプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図３】図３はパレイン酸Ａの重クロロホルム溶液中にて室温で測定した125ＭＨｚに おける炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to Paleic Acid A or a salt thereof, which is a novel antibiotic having excellent antibacterial activity specifically against Pasteurella haemolytica which is a causative agent of respiratory diseases of cattle. It relates to the production method of A. Furthermore, this invention relates to the antibacterial agent which uses pareic acid A or its salt as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain, which is a novel microorganism capable of producing pareic acid A.
[0002]
[Prior art]
The emergence of multidrug-resistant bacteria is a serious problem in chemotherapy for bacterial infections. Known compounds that are conventionally known or used for cattle respiratory disease are macrolide antibiotics or β-lactam antibiotics, etc., which are used for human treatment Have the same molecular structure skeleton. Vancomycin analogues, which have been used in large quantities in the animal husbandry as animal medicine, have produced vancomycin-resistant bacteria, and the cases where these vancomycin-resistant bacteria have threatened human chemotherapy for bacterial infection are in agreement. Therefore, it has always been desired to discover or create a new compound having a molecular structure skeleton that is completely different from the antibacterial agent used in the treatment of human bacterial infections and exhibiting excellent antibacterial activity. Is being researched.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel antibiotic having excellent antibacterial activity that can meet the above-mentioned demand.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, in order to achieve the above object, the present inventors have conducted research to discover useful antibiotics. As a result, we succeeded in isolating Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain as a novel microorganism. The present inventors have also found that this strain produces several types of antibiotics having a new structural skeleton. And one of them was succeeded in isolating and purifying antibiotics and was named Parenic acid A. It has been found that this pareic acid A exhibits an excellent antibacterial activity specifically for Pasteurella haemolytica, a causative agent of cattle respiratory disease. By further research and analyzing pareic acid A, the chemical structure of pareic acid A was determined. And it confirmed that pareic acid A was a novel compound. And it discovered that pareic acid A can be expressed by the following formula (I).
[0005]
Thus, the present invention provides an antibiotic obtained by culturing Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain as a novel microorganism and named by the present inventors as Parenic acid A, and provides a method for producing the same. It is. Furthermore, the present invention provides an antibacterial agent comprising palenic acid A or a salt thereof as an active ingredient.
[0006]
  That is, according to the first aspect of the present invention, a substance produced by the Paenibacillus albei strain BMK771-AF3 deposited under the deposit number of FERM P-16999, which is produced by Pasteurella haemolytica, a respiratory pathogen of cattle Antibacterial activity and specific rotation [α]_D ²⁸Obtained in the form of a colorless oily substance with -5 ° (c 0.2, chloroform)

Parenic acid A, which is a compound represented by the formula: or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0007]
The physicochemical properties of the pareic acid A of the formula (I) according to the first invention are as follows.
(1) Appearance
Colorless oil
(2) Molecular formula
C₁₈H₃₄O_Three
(3) High resolution mass spectrometry (HRFABMS: negative ion mode)
Experimental value: m / z 297.2459 (M-H)^-
Calculated value: m / z 297.2430
(4) Specific rotation
[Α]_D ²⁸= -5 ° (c 0.2, chloroform)
(5) Infrared absorption spectrum
As shown in FIG. 1 of the accompanying drawings.
[0008]
(6) Proton nuclear magnetic resonance spectrum
The proton NMR spectrum measured at room temperature in deuterated chloroform at 500 MHz is as shown in FIG. 2 of the accompanying drawings.
(7) Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum
The carbon 13 NMR spectrum measured at room temperature in deuterated chloroform at 125 MHz is as shown in FIG. 3 of the accompanying drawings.
(8) Thin layer chromatography
Silica gel 60F₂₅₄When developed with chloroform-ethanol (20: 1) as a developing solvent in thin-layer chromatography (Merck), the Rf value is 0.42.
[0009]
The fact that the novel antibiotic pareic acid A according to the present invention has the chemical structure represented by the above formula (I) was determined as described above by examining the analysis of proton NMR, carbon 13 NMR and the like in detail.
[0010]
Pharmaceutically acceptable salts of pareic acid A include, for example, sodium salt, potassium salt, ammonium salt
Paleic acid A of formula (I) according to the present invention has the biological properties described below.
That is, pareic acid A exhibits excellent antibacterial activity specifically against Pasteurella haemolytica, and also exhibits antibacterial activity against several strains of Pasteurella maltoside. Parenic acid A has low acute toxicity to mammals.
[0011]
Test example 1
The antibacterial spectrum of Parenic acid A against various microorganisms is diluted on Muller Hinton Agar (Difco) and Brain Heart Infusion Agar (Difco) based on the Japanese Society of Chemotherapy Standard Method Measured by the method. The results are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
[0012]

[0013]

[0014]

[0015]
Test example 2
In testing the acute toxicity of Paleic acid A of formula (I) using mice, Parenic acid A is dissolved in physiological saline containing 10% dimethyl sulfoxide and Tween 80, and the solution is injected intraperitoneally. Mice were observed for 14 days. As a result, paraleic acid A was not toxic even at a dose of 65 mg / kg.
[0016]
  Further, the second present invention(Invention of Claim 1)According to culturing Paenibacillus albei BMK771-AF3 deposited under the deposit number FERM P-16999, the specific rotation [α] from the culture_D ²⁸Obtained in the form of a colorless oily substance with -5 ° (c 0.2, chloroform)

A method for producing antibiotic valeric acid A is provided, which comprises collecting pareic acid A which is a compound represented by the formula:
[0017]
As the bacterium producing pareic acid A used in the method of the present invention, any bacterium belonging to the genus Paenibacillus can be used as long as it has the ability to produce pareic acid A which is an antibiotic having the above-mentioned physicochemical and biological properties. Therefore, an appropriate microorganism can be selected regardless of the species. Among these microorganisms, a specific and preferred example of a palate acid A-producing bacterium was isolated by the present inventors from the soil of Iwatake Ski Resort, Hakuba-mura, Kitazumi-gun, Nagano Prefecture, in May 1997 at the Institute of Microbial Chemistry. Among these bacteria, there is a strain having the strain number of Paenibacillus albei BMK771-AF3.
[0018]
The mycological properties of the Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain are described below.
1. Form
(1) The cells of this strain are Neisseria gonorrhoeae, and the size is 0.7 × 0.8 to 1.6 × 2.5 microns.
(2) No cell polymorphism is observed.
(3) Has peripheral flagella and exhibits motility.
(4) It has spores. Its shape is oval, the size is 0.45-0.55 × 1.0 microns, the position is central, and the bulge of the cells is observed.
[0019]
2. Growth conditions in various media
Except for the broth gelatin puncture culture, all were cultured and tested at 30 ° C.
(1) Meat broth agar plate culture
The colony is a slightly glossy, opaque circle with irregular edges from around day 3 after culture. The color is colorless to light brownish gray. No diffusible dye is observed.
(2) Meat broth liquid culture
Slight growth of the bacteria was observed in 1 day after the culture, and a small amount of bacteria was found on the bottom of the tube on the 2nd day. One week after culturing, it grows slightly white on the surface of the test tube and precipitates at the bottom of the tube. Even after 2 weeks of culturing, there is no significant change in the turbidity of the medium.
[0020]
(3) Broth gelatin puncture culture
In the 20 ° C. culture, the growth of the bacteria was observed along the surface of the medium and the puncture line, and liquefaction started on the second day after the culture, and then proceeded slowly, and about 2/3 of the medium was liquefied in 4 weeks. The liquefaction action is moderate. In the culture at 30 ° C., good bacterial growth is observed on the whole surface of the culture medium, and a bacterial membrane is formed on the second day after the culture. Liquefaction started around day 2 after culturing and was completed after culturing for 4 weeks. Its action is moderate.
(4) Milk culture
milkInculturedidIn some cases, it grows slightly on the tube wall near the surface of the medium from the second day after culturing. Coagulation is not observed in 2 weeks after culturing and coagulation starts after 3 weeks. Peptone formation began immediately after the end of clotting and was almost complete after 4 weeks of culture. The reaction is weakly acidic.
[0021]
3. Physiological properties (unless otherwise noted, all culture temperatures are 30 ° C)
(1) Gram staining: indefinite (positive in juvenile culture, negative bacteria mixed in 48 hours culture, negative after 72 hours in culture).)
(2) Reduction of nitrate: negative
(3) Denitrification (Method of Komagata et al., Edited by Takeharu Hasegawa; Classification and identification of microorganisms, 223 pages, University of Tokyo Press, 1975): Negative
(4) MR test: negative
(5) VP test: negative
(6) Indole production: negative
(7) Production of hydrogen sulfide: negative
(8) Starch hydrolysis: positive
(9) Utilization of citric acid: Negative in both Koser and Christensen media
[0022]
(10) Use of inorganic nitrogen source: Both sodium nitrate and ammonium sulfate are positive
(11) Production of pigment: No soluble pigment is observed in either King A medium or King B medium.
(12) Urease (urea medium, Eiken Chemical): Negative
(13) Oxidase: positive
(14) Catalase: positive
(15) Growth range: Growth is recognized in the range of pH 6.0 to 9.0, and the optimum pH is 7.0. Moreover, growth is recognized in the range of 20 degreeC-37 degreeC, and the optimal temperature is 30 degreeC.
(16) Attitude toward oxygen: facultative anaerobic
(17) OF test (by Hugh Leifson method): Fermentation type
[0023]
(18) Acid production from saccharides and gas production (in sugar-added ammonium salt medium) Acid production from 15 sugars was examined with BCP indicator and BTB indicator, and the results are shown in Table 3.
[0024]

[0025]
Although the production | generation of the gas from the saccharide | sugar shown in Table 3 was investigated, gas is not produced | generated in any of the said 15 types of saccharides.
(19) Casein hydrolysis: positive
(20) Esculin hydrolysis: Positive
(21) Lysozyme sensitivity (meat broth liquid medium containing 0.001% lysozyme): Resistance
(22) Tyrosine degradation: negative
(23) Lecithinase: positive
(24) Non-acidic.
[0026]
4). Chemical taxonomic properties
(1) DNA base composition (G + C content): 44.9%
[0027]
To summarize the above properties, the BMK771-AF3 strain is a facultative anaerobic spore-forming bacilli with indefinite Gram stainability.orIt has peripheral flagella and exhibits motility. The spores are oval, central, bulging, and non-acidic. Growth on an agar medium is opaque, the edges are irregular, and the surface of the colony is brightly shiny. Gelatin is liquefied and milk is coagulated and peptized. Nitrate is not reduced and denitrification, MR test and VP test are negative. Indole is not detected and does not produce hydrogen sulfide. Decomposes starch and does not use citric acid. The urease reaction is negative and the oxidase reaction and catalase reaction are positive.
[0028]
This strain grows in the range of pH 6.0 to 9.0, and the optimum pH is 7.0. Moreover, growth is recognized in the range of 20 degreeC-37 degreeC, and the optimal temperature is 30 degreeC. Glucose is decomposed oxidatively to produce acid, but no gas is produced. In addition, as shown above, although acid is produced | generated also from saccharides other than glucose, gas is not produced | generated. It is resistant to lysozyme and degrades casein and esculin, not tyrosine.
[0029]
Based on the above properties, searching for BMK771-AF3 strain in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2 (1986)Bacillus) Belonging to the genus Bacillus albei (Bacillus alvei), Bacillus Laterosporus (Bacillus laterosporus) And Bacillus brevis (Bacillus brevis) Was given. At present, the genus Bacillus is divided into a plurality of genera that reflect the lineage.Paenibacillus) Genus (literature, Antonie von Leeuwenhock, 64, 243-260, 1993), Brevibacillus (1996)Brevibacillus) And Anurinibacillus (Aneurinibacillus) Was proposed as a new genus (literature, International Journal of Systematic Bacteriology, 46, 937-946, 1996). In other words, the above three strains proposed in the search are Paenibacillus albei (Paenibacillus alvei), Brevibacillus Laterosporus (Brevibacillus laterosporus) And Brevibacillus brevis (Brevibacillus brevis). Properties of BMK771-AF3 strain and the above three strainsPaenibacillus alvei IMC B-0925 (IFO 3343^T),Brevibacillus laterosporus IMC B-0514 (sold by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Livestock Sanitation Laboratory in 1979) andBrevibacillus brevis Table 4 below shows a comparison between IMC B-0115 (IAM 1031) and the actual site.
[0030]

[0031]

[0032]
(Note): Each symbol in Table 4 has the following meaning.
*:Experimental result
±: Probably positive.
1), 2), 3): Literature values (+: positive in 90% or more strains, d: positive in 11-89% strains,-: negative in 90% or more strains)
^a ： Measured by high pressure liquid chromatography (HPLC method)^b : Measured by Thermal Denaturation Method (Tm method)^c: It is the result measured by Buoyant Density Method (BD method).
1), 2) and 3) shown in Table 4 show the following cited references.
1): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2, 1122-1123, Williams & Wilkins, Baltimore, 1986
2): The genusBacillus, Agriculture Handbook No. 427, United States Department of Agriculture, Washington, D.C., 1973
3): Topley & Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 6th edition, Volume 1, 1103, Edward Arnold, London, 1975
[0033]
As is apparent from Table 4 above, Brevibacillus laterosporus is significantly different from the BMK771-AF3 strain in that the spore position is canoe-type, starch hydrolysis is negative, and nitrate is reduced.orBrevibacillus brevis is distinguished from the BMK771-AF3 strain in that the pH of VP broth after growth is 7.0 or higher, does not grow under anaerobic conditions, and may grow even at 50 ° C. On the other hand, the BMK771-AF3 strain was different from Paenibacillus albei in that indole production was negative. However, the BMK771-AF3 strain showed very close properties in the following points. That is,
The BMK771-AF3 strain has a pH of 6.0 or less after growth, positive star hydrolysis, no reduction of nitrate, no tyrosine degradation, and so on. In addition, as a result of comparative examination in the field, the VP test is negative for both. Reference 2) The genusBacillusAccording to Agriculture Handbook No.427, it is described as negative with a probability of 1/4.orThe Egg-yolk lecithinase reaction is described as positive by Paenibacillus albei in reference 3) Topley & Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, and is consistent with the results of the BMK771-AF3 strain. Both G + C contents were extremely close to each other.
From these results, BMK771-AF3 strain was identified as Paenibacillus albei.Paenibacillus alvei Identified as BMK771-AF3.
[0034]
The BMK771-AF3 strain was applied for deposit at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and was deposited as FERM P-16999 on September 17, 1998.
[0035]
In the method of the second invention, the production of pareic acid A is performed as follows. That is, the production of pareic acid A is preferably carried out by inoculating a pareic acid A-producing bacterium into a nutrient medium and culturing while aerobically shaking at a temperature of 25 ° C to 30 ° C. A culture containing A is obtained. As the nutrient medium used for such a purpose, those which can be used for bacterial culture are used. As a nutrient source, for example, commercially available nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, ammonium sulfate, ammonium chloride, corn gluten meal can be used, and glycerin, starch, glucose, galactose Carbon sources such as carbohydrates such as dextrin and corn starch or fats can be used. Further, inorganic salts such as sodium chloride and calcium carbonate can be added and used. In addition, a trace amount of metal salt can be added as necessary. Any of these can be used as long as they are utilized by the pareic acid A-producing bacteria and are useful for the production of pareic acid A, and all known actinomycetes or bacterial culture materials can be used.
[0036]
For the production of pareic acid A, a bacterium belonging to the genus Paenibacillus and widely present in nature and having the ability to produce pareic acid A is used. Specifically, it has been clarified by the present inventors that the isolated Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain produced by the present inventors produces pareic acid A. It can be separated from the natural world by conventional methods of isolation. In addition, there remains room for increasing the ability to produce pareic acid A by subjecting the pareic acid A-producing bacterium to irradiation and other mutation treatments, including the Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain. Furthermore, it is also possible to modify the bacterium producing pareic acid A by genetic engineering techniques.
[0037]
Parenic acid A can be produced by aerobically cultivating a strain that produces pareic acid A, preferably Paenibacillus albei BMK771-AF3, in an appropriate medium and collecting it from the culture solution. The culture temperature is not particularly limited as long as it can produce this substance without substantially inhibiting the growth of Parenic acid A-producing bacteria, and can be selected according to the producing bacteria used. May include temperatures in the range of 25-30 ° C, especially 27 ° C.
[0038]
As an inoculum inoculated into the medium for the production of pareic acid A, a growth obtained from the slope culture of the BMK771-AF3 strain on an agar medium is used.
[0039]
Growth of this Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain usually reaches its maximum in 2 to 3 days, but generally continues until sufficient antimicrobial activity is imparted to the medium. The change with time of the titer of Parenic acid A in the culture can be measured by a cylindrical plate method using Pasteurella hemolytica BBP0102 N811 as a test bacterium.
[0040]
In the method of the second aspect of the present invention, pareic acid A is collected from the culture obtained as described above. As the collection method, means used for collecting metabolites produced by microorganisms are appropriately used. Made up of. For example, using a solvent that is not mixed with water, using a difference in adsorption affinity for various adsorbents, gel filtration, chromatography using countercurrent distribution, or the like, and collecting palate A it can. Further, from the separated cells, pareic acid A can be extracted from the cells by a solvent extraction method using an appropriate organic solvent or an elution method by disrupting the cells, and purified and collected in the same manner as described above. Thus, the antibiotic paraleic acid A described above is obtained. Paleic acid A obtained from the culture is often obtained in the form of a mixture with several compound groups having very similar structures. In order to isolate and purify the pareic acid A, it is necessary to convert it into a pareic acid A derivative that is easy to isolate by chemical transformation, separate it and purify it, and then repurify the pure acid of pareic acid A by chemical transformation. Convenient.
[0041]
For example, in order to collect pareic acid A from a culture of a pareic acid A-producing bacterium, it is convenient to use the following collection and purification method. That is, the obtained culture solution was centrifuged to separate the cells and the culture filtrate, and the culture filtrate was extracted with butyl acetate. The cells were extracted with methanol, concentrated, added with a small amount of water, and extracted with butyl acetate. The obtained butyl acetate extracts were combined and concentrated to dryness, and the resulting oily residue was partitioned with hexane-methanol-acetonitrile (70:20:30 volume ratio). A crude oily substance containing acid A was obtained, and then this oily substance was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent chloroform) to obtain a primary purified product of pareic acid A, which was further subjected to centrifugal liquid-liquid distribution chromatography.Graphic(Solvent system: hexane-ethyl acetate-acetonitrile, 7: 2: 3 volume ratio) to obtain a secondary purified oil of pareic acid A, and further reacting the pareic acid A in the oil with diazodiphenylmethane to treat the pareic acid A Of diphenylmethyl ester, the reaction solution containing this was concentrated to dryness, and the resulting residue was subjected to silica gel column chromatography.Graphic(Elution with toluene-ethyl acetate), and then treating the obtained oily substance composed of paleic acid A diphenylmethyl ester with p-nitrobenzoyl chloride to give crude O-p-nitrobenzoyl-paleic acid A diphenylmethyl ester. The product is collected and then purified by silica gel column chromatography.FAnd purified by silica gel thin layer chromatography to obtain a purified product of Op-nitrobenzoyl-paleic acid A diphenylmethyl ester. The compound is then subjected to a hydrolysis reaction with an aqueous NaOH solution, then the free acid pareic acid A is extracted with ethyl acetate under acidic conditions, and the resulting ethyl acetate extract is washed with water, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and further concentrated. By using a method consisting of drying and purifying the resulting oily residue by centrifugal liquid-liquid partition chromatography (solvent system: hexane-ethyl acetate-acetonitrile, 5: 1: 4 volume ratio) Can be obtained as a pure product.
[0042]
  Furthermore, the third present invention(Invention of Claim 2)Is a substance produced by Paenibacillus albei strain BMK771-AF3 deposited under the deposit number of FERM P-16999, which has antibacterial activity against Pasteurella haemolytica, a respiratory pathogen of cattle, and Specific rotation [α]_D ²⁸Obtained in the form of a colorless oily substance with -5 ° (c 0.2, chloroform)

The antibacterial agent which uses as an active ingredient the pareic acid A which is a compound represented by this, or its pharmaceutically acceptable salt is provided.
[0043]
In this antibacterial agent, it may be in the form of a composition obtained by mixing pareic acid A or a salt thereof as an active ingredient with a pharmaceutically acceptable conventional solid or liquid carrier such as ethanol, water, starch, etc. it can.
[0044]
  Also, the fourth invention(Invention of Claim 3)In the deposit number of FERM P-16999 andAs described abovePaenibacillus albei BMK771-AF3 strain having characteristics of producing pareic acid A is provided.
[0045]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Example 1
Production of antibiotic pareic acid A
Paenibacillus albei BMK771-AF3 strain (FERM P-16999) cultured on an agar slant medium was prepared using corn starch 2%, corn gluten meal 2%, glucose 1%, corn steep liquor 1%, ammonium chloride 0.25. Of liquid medium containing 0.1% sodium chloride 0.3% and calcium carbonate 0.6% (adjusted to pH 6.4) in 110 ml aliquots (500 ml) and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes by conventional methods Inoculated. Thereafter, the cells were cultured with shaking at 27 ° C. for 3 days.
[0046]
The culture solution thus obtained was centrifuged to separate the cells. The obtained culture filtrate (800 ml) was extracted with butyl acetate (800 ml), and the extract was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated to dryness. The residue was partitioned with hexane-methanol-acetonitrile (70 ml: 20 ml: 30 ml), and the lower layer was concentrated to dryness to obtain 175 mg of an oily substance.
[0047]
Also, add methanol (200 ml) to the cells, stir filter, concentrate, add water (200 ml), extract with butyl acetate (200 ml), and use the extract as the culture filtrate. The crude oily substance containing pareic acid A was obtained by the above method. These oily substances obtained above were combined and purified by silica gel column chromatography (Wakogel C200, 18 g) using chloroform as a developing solvent to obtain a primary purified product of pareic acid A (yield: 46 mg). Further, the primary purified product was purified by centrifugal liquid-liquid distribution chromatography using a solvent system of hexane-ethyl acetate-acetonitrile (7: 2: 3) to obtain 34.7 mg of secondary purified oil containing pareic acid A. This secondary purified oil containing pareic acid A was dissolved in 5 ml of methanol, and 50 mg of diazodiphenylmethane was added to the solution and reacted at room temperature for 20 hours. In order to complete the reaction, 9 mg of diazodiphenylmethane was added and reacted for another 9 hours. The produced reaction solution containing diphenylmethyl ester of pareic acid A was concentrated to dryness, and the residue was purified by chromatography using a silica gel (Wakogel C200, 10 g) column. That is, the silica gel column was washed with 10 ml of toluene and eluted with toluene-ethyl acetate (30: 1) to obtain 44 mg of an oily substance consisting of diphenylmethyl ester of pareic acid A.
[0048]
This diphenylmethyl ester was dissolved in 4 ml of pyridine, 30 mg of p-nitrobenzoyl chloride was added and reacted at room temperature for 29 hours to protect the hydroxyl group of pareic acid A diphenylmethyl ester with the p-nitrobenzoyl group. In order to complete the reaction, 20 mg of p-nitrobenzoyl chloride was added and reacted for 19 hours, and further 10 mg of p-nitrobenzoyl chloride was added and reacted for 8 hours. O-p-nitrobenzoy producedLupa10 μl of water was added to the reaction solution containing oleic acid A diphenylmethyl ester, allowed to stand for 1 hour, and concentrated to dryness. The residue was chromatographed using a silica gel (Wakogel C200, 2 g) column and eluted with hexane-ethyl acetate (20: 1) to give 54 mg of an oily substance. The obtained oily substance was used on a silica gel plate (Merck, Art11798).RuChromatographically developed 10 times with hexane-diisopropyl ether (10: 1), scraped and separated, and O-p-nitrobenzoic acid.Lupa11.7 mg of a single palaic acid A derivative, which is oleic acid A diphenylmethyl ester, was obtained.
[0049]
  11.7 mg of this derivative was dissolved in 5 ml of ethanol, 1 ml of 0.5N NaOH was added and reacted at room temperature for 14 hours. This hydrolysis eliminated the p-nitrobenzoyl group and the diphenylmethyl ester group.. TheFurther, 4 ml of water and 0.1 ml of 1N HCl were added to the concentrate, and the mixture was extracted three times with 4 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer (extract) was washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to dryness. The residue was purified by centrifugal liquid-liquid partition chromatography using a solvent system of hexane-ethyl acetate-acetonitrile (5: 1: 4) to obtain 5.5 mg of pure Parenic acid A as a colorless oil.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an infrared absorption spectrum of pareic acid A measured by the KBr tablet method.
FIG. 2 is a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in a deuterated chloroform solution of pareic acid A at room temperature.
FIG. 3 is a carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum at 125 MHz measured at room temperature in a deuterated chloroform solution of pareic acid A.

Claims (3)

Paenibacillus albei strain BMK771-AF3 deposited under the accession number FERM P - 16999 is cultured, and from the culture, a colorless oil having a specific rotation [α] _D ²⁸ = −5 ° ( c 0.2, chloroform) Obtained in the form of a substance of formula (I)

A method for producing antibiotic valeric acid A, which comprises collecting pareic acid A, which is a compound represented by the formula: FERM P - 16 Substance produced by Paenibacillus albei strain BMK771-AF3 deposited under the deposit number of 999999, which has antibacterial activity against bovine respiratory pathogenic fungus Pasteurella haemolytica and specific rotation Obtained in the form of a colorless oily substance having a degree [α] _D ²⁸ = −5 ° ( c 0.2, chloroform)

An antibacterial agent comprising, as an active ingredient, pareic acid A, which is a compound represented by the formula: FERM P − 16999 Paenibacillus albei having the property of producing pareic acid A according to claim 1  BMK771-AF3 stock.

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