JP4233796B2

JP4233796B2 - Indigoid-containing glucuronosyltransferase inducer

Info

Publication number: JP4233796B2
Application number: JP2002046269A
Authority: JP
Inventors: 憲朗山本; 幸太郎室山; 伸二室▲崎▼; 佳弘山本
Original assignee: House Wellness Foods Corp
Current assignee: House Wellness Foods Corp
Priority date: 2002-02-22
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2022-02-22
Also published as: JP2003246734A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は天然由来あるいは合成のインジゴイドを含有してなるグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、それを含有する医薬品あるいは食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の体内における異物代謝は、第１相および第２相解毒酵素により行われ、化学物質を最終的に水溶性の高い物質に変換し体外へ排出されやすくする。第１相解毒酵素に分類されるのは、主にチトクロムＰ４５０系の酵素で、水酸化や酸化、還元反応により化学物質を不活性化する。第２相解毒酵素に分類されるのは、グルクロン酸抱合化、硫酸抱合化、アセチル化、メチル化、グルタチオン抱合化、グルタミン酸抱合化などのアミノ酸抱合化などの各種抱合化反応を行う酵素であり、これらの酵素群は基質の化合物を水溶性のより高い化合物へ変換する。またチトクロム系であるが、２電子還元を行うキノンレダクターゼも第２相に分類される。
【０００３】
グルクロン酸抱合化は、脂溶性の生体異物や代謝産物をより水溶性の高い化合物に変換する反応で、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼにより触媒され、抱合化の対象となる化合物（アグリコン）の酸素（水酸基やカルボキシル基などに含まれている酸素原子）、窒素（アミノ基などに含まれている窒素原子）、硫黄（チオール基などに含まれている硫黄原子）、炭素などを含む親電子官能基に対して糖塩基であるＵＤＰ-グルクロン酸からのグルクロン酸を付加する反応である。反応生成物はグルクロニド（β-D-glucopyranosiduronic acid conjugate）とＵＤＰ（uridine 5’-diphosphate）である。
【０００４】
医薬品として用いられる化合物の多くは、体内に摂取された後、生体異物として認識され解毒酵素により代謝される。その多くは、第１相薬物代謝酵素と第２相薬物代謝酵素の連携により代謝された後体外に排出される。第１相酵素と第２相酵素はあるバランスを持って機能している。このとき第１相酵素により生じた化合物の多くは反応性に富む構造を有しているので、第２相酵素による処理が追いつかなくなると、これらの反応性に富む化合物は、生体構成成分の核酸、糖、たんぱく質などと結合して生体にとって悪影響を及ぼすことがある。したがって第２相酵素が充分に機能しうる状態にあるのが生体異物の代謝において重要である。
【０００５】
インジゴ、インジルビン、イソインジゴといったインジゴイドは、いずれも公知の化合物で、染料として古くから使用されてきた。インジルビンやイソインジゴは、量は少ないがインジゴを調製する際の副生成物として得られる。
【０００６】
生薬では、青黛（せいたい）といわれるものがあり、主要成分としてインジゴを含み、インジルビンやイソインジゴも少量含まている。しかしながら、インジゴイドがグルクロノシルトランスフェラーゼの発現を誘導する作用を有していることは未だ知られていなかった。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況において、体外異物や代謝産物の解毒や活性化、排出機構などに関与しているグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を提供すること、さらにはこのグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を含む、グルクロノシルトランスフェラーゼの欠乏またはグルクロノシルトランスフェラーゼ産生能の低下に起因する疾病の予防ならびに治療、再発防止、合併症予防や健康維持増進に貢献する医薬品や食品を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インジルビンやインジゴ、イソインジゴなどのインジゴイドの生理活性について広範な実験と研究を行ってきたところ、これらの化合物に顕著なグルクロノシルトランスフェラーゼ発現誘導作用があることを突き止めた。すなわち、天然物から単離、精製、あるいは化学合成により調製したインジゴイドをヒト又は動物に投与することにより、生体のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が増大することを見出した。しかも、インジゴイドが比較的安全性の高い物質であることはすでに確かめられているので、ヒトあるいは動物を対象とする安全でかつ優れた医薬品や食品として提供することができる。また、この強い酵素誘導能を利用することで、医薬や食品素材からの代謝産物の毒性試験の際に使用する代謝酵素誘導剤などとしても使用することができる。
【０００９】
すなわち本発明は、
（１）インジゴイドを含有してなるグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（２）インジゴイドがインジルビン、インジゴまたはイソインジゴである（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（３）インジゴイドがインジルビン、インジゴおよびイソインジゴからなる群から選ばれた少なくとも２種の組み合わせからなる（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（４）肝疾患の予防または治療剤である（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（５）肝疾患による合併症の予防または治療剤である（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（６）解毒剤である（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
（７）肝機能亢進剤である（１）記載のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤、
である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるインジゴイドは、化学構造からいえば、２つのインドリンがそれぞれの２位または３位で二重結合手により結合した骨格を有する化合物である。２位と３位が結合したインジルビンは、３−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドインドール−２−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンと表記される化合物（CAS-No. 479-41-4）、２位と２位が結合したインジゴは、２−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，２−ジヒドロ−３−Ｈ−インドール−３−オン（CAS-No. 482-89-3）、３位と３いが結合したイソインジゴは、３−（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（CAS No. 476-34-6）で、これらは互いに構造異性体である。本発明に用いられるインジゴイドには、これらの化合物の一部が他の基、たとえば、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アルキル基などにより置換されたものが含まれる。
【００１１】
インジゴイドの調製は、天然物や天然物の加工物から抽出して単離、精製したり、化学合成したり、あるいは微生物に産生させたりして、公知の技術により行うことができる。
【００１２】
天然物からは、例えば、タデ科のアイ（学名Polygonum tinctorium）やキツネノマゴ科のリュウキュウアイ（学名Storobilanthes tlaccidifolium）、マメ科のタイワンコマツナギ（別名インドアイ、学名Indigofera tinctoria）、ラン科のエビネ（学名Calanthe discolor）、などの植物や、学名Schizophyllum communeなどの真菌類などから、各種の溶剤抽出および各種のクロマト技術、結晶化などを組み合わせて調製することができる。
【００１３】
インジゴイドはまた、天然由来の加工物、例えば、前述の生薬の「青黛（せいたい）」（少なくとも５種類のインジゴ植物から選択された少なくとも１種の植物を加工した生薬）や「すくも」（アイを加工した染料の原料）などのインジゴイドを含有する加工物から調製することもできる。
【００１４】
化学合成においては、例えば、１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（慣用名：イサチン、CAS No. 91-56-5）と酢酸インドキシル（CAS No. 608-08-2）を炭酸ナトリウムなどで弱アルカリ性としたメタノールなどの溶媒中で反応させてインジルビンを合成することができ、生じたインジルビンは、洗浄と再結晶により純度の高いものを得ることができる。イソインジゴは、イサチンとオキシインドールから化学合成することができ、純度の高いものを得ることができる。インジゴも容易に化学合成が可能で、この化合物に関しては色素分野で現在も多量に製造されている。
【００１５】
これらの他にも、例えば細菌類の培養、真菌類の培養、植物カルスの培養等により、インジゴイドを得ることもできる。
【００１６】
このようにして調製したインジゴイドは、その使用目的や剤形、使用方法により、純度の高いものから低いものまで種々の純度のものを使用することができる。また天然物から調製すると、通常複数のインジゴイドが含まれてくるので、あえてそれぞれのインジゴイドを分離せず、混合物としてそのまま使用することもできる。
【００１７】
このようにして得られたインジゴイドは、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、赤外吸収スペクトル、可視紫外線吸収スペクトル、質量スペクトル、^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル、^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルなどにより分析して、同定および定量することができる。また、これらインジゴイドを含有する各種医薬品や食品のインジゴイド含有量も、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの分析法で測定することができる。
【００１８】
本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼと同義であり、ＵＤＰ−グルクロン酸からグルクロン酸基を反応の対象とする化合物（アグリコン）に対して付加する酵素である。グルクロノシルトランスフェラーゼが反応の対象とする化合物は、多種多様のものがあり、それらの化合物の親電子性の官能基に対し、ＳＮ２反応でＵＤＰ−グルクロン酸のＣ１位で転移反応が行われ、グルクロン酸抱合体とＵＤＰを生成する。
【００１９】
前述の通り生体内の異物代謝酵素は第１相と第２相に分類され、グルクロノシルトランスフェラーゼは第２相に分類されるが、第２相酵素による抱合化反応はひとつの化合物に対しひとつの反応だけが存在するわけではなく、一つの化合物に対して例えばグルタチオン抱合やグルクロン酸抱合など複数の抱合化が行われることもあるし、抱合化反応が可能な官能基が複数存在しうる化合物では複数箇所で抱合化される場合もある。
【００２０】
例えば、解熱鎮痛薬として汎用されるアセトアミノフェンでは、その代謝物としてアセトアミノフェンのグルクロン酸抱合体とN-アセチル-ｐ-キノミネンのグルタチオン抱合体が生じ、量的には後者の代謝の方が多い。後者は、アセトアミノフェンが第１相酵素のチトクロムP450により水酸化反応された後生じたキノミネン体がグルタチオン-S-トランスフェラーゼにより抱合化されて生じる。
【００２１】
アセトアミノフェンは汎用される解熱鎮痛薬であるが、時に重篤な中毒症を引き起こすことがある。すなわち、グルタチオン抱合化により代謝される場合は、アセトアミノフェンがまず第１相解毒酵素により水酸化され、生じたキノミネン体がグルタチオン抱合されるのであるが、体内のグルタチオン量が少ない時や消費されて枯渇している時にはキノミネン体を解毒することができず、反応性の高いキノミネン体はDNAやたんぱく質と結合してその結果細胞を死に至らしめ、重篤な中毒症を発症せしめることがある。
【００２２】
アセトアミノフェンの代謝にはグルクロン酸抱合化反応も存在し、直接アセトアミノフェンの水酸基にグルクロン酸を結合させてグルクロン酸抱合体とし、尿や胆汁から体外に排出される。グルクロン酸抱合化されたアセトアミノフェンは炎症部位においては脱抱合されてアセトアミノフェンを再生することがあり、体内に残存していれば薬理効果を再発揮することも可能である。また、アセトアミノフェンの代謝において、グルクロン酸抱合化が亢進したならば、グルタチオン抱合化の割合を減少させるので、結果としてグルクロン酸抱合化のときのような反応性の高い代謝中間産物の生成量を抑え、生体内抗酸化分子としても機能しているグルタチオンの減少を抑えることができる。したがって、アセトアミノフェンの代謝においてはグルタチオン抱合化よりむしろグルクロン酸抱合化で代謝されるほうが生体にとって有利であると考えられる。
【００２３】
このように、本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼは、アセトアミノフェンなどの薬物による中毒症の予防や治療に使用することができ、またグルクロノシルトランスフェラーゼの亢進作用によりグルタチオンの減少を防ぐことで生体抗酸化作用の減衰を防止することが可能である。
【００２４】
ＡＳＴ(Asparatic acid aminotransferase)は、アミノ酸合成の際にアミノ基の転移反応を触媒する酵素で、ほとんど全ての細胞に含有され、細胞が障害を受けることにより漏出してくる逸脱酵素で、心筋、肝臓、骨格筋、腎臓などに多く含まれる。そのため、ＡＳＴは肝疾患、心疾患、骨格筋疾患の程度、臨床経過の指標として用いられる。ＡＬＴ(Alanin aminotransferase)は、ＡＳＴと同様にアミノ酸合成に必要なアミノ基転移酵素であり、細胞が損傷を受けたときに漏出してくる逸脱酵素で、ＡＳＴに比較して特異性が高く特に肝臓での含有量が圧倒的に多く次いで腎臓に多く含有されている。このため、ＡＬＴは肝疾患の指標として用いられる。ＬＤＨ(Lactate dehydrogenase)は、細胞が損傷したときに漏出する逸脱酵素であるが、あらゆる臓器に含まれることから、ＬＤＨが血中に増加していることでどこの組織が損傷を受けているかを特定することは難しい。ＬＤＨによる損傷部位の予測にはＬＤＨのアイソザイムの解析が必要となるが、ＬＤＨはＡＳＴやＡＬＴなどと組み合わせて使用することにより生体内疾患の指標として広く使用されている。
【００２５】
インジルビンは、アセトアミノフェン過剰投与によるＡＬＴの逸脱を顕著に抑制しており、肝障害を抑制することが明らかとなった。また、ＡＳＴおよびＬＤＨの逸脱も顕著に抑制しているので、インジルビンが生体内グルクロノシルトランスフェラーゼを誘導して、肝障害のみならず他の臓器の損傷をも抑制していると考えられる。
【００２６】
発癌に関わる外的因子のうち、約７０％を食事と喫煙が占めているといわれている。つまり発癌には食事がもっとも重要なリスクファクターのひとつであるということである。一方、生体の方には、これら発癌性物質にたいする抵抗性が備わっており、その抵抗性を担う生体機構のひとつが解毒酵素である。特にグルクロノシルトランスフェラーゼを含む一群の第２相解毒酵素は、活性化された究極発癌物質を不活性化する発癌予防酵素である。したがって、本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を食品などにより摂取して体内のグルクロノシルトランスフェラーゼ量を高く維持することは抗癌予防効果に繋がると期待される。
【００２７】
薬物の体内動態の検討や薬物の代謝物の毒性試験などを行うとき、薬物代謝酵素発現作用のある化合物を動物に投与してその肝臓から薬物代謝活性のある画分（Ｓ９画分という）を調製することがあるが、このような目的で本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を使用することもできる。
【００２８】
本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤の具体的な用途としては、グルクロノシルトランスフェラーゼの欠乏に起因する各種疾病の治療剤、治療後の再発予防剤、治療中の合併症予防剤、治療に使用している他の医薬品の効果増強剤、解毒剤、疾病予防剤、健康増進剤などが挙げられる。
より具体的には、肝炎などの肝疾患や薬物中毒症の予防、治療剤、肝疾患に起因する合併症の予防、治療剤、解毒剤、肝機能亢進剤、第２相薬物代謝機能亢進剤、生体の抗酸化機能亢進剤、発癌予防剤、発癌性化学物質不活性化剤、それらを含有する飲食品などである。
【００２９】
本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼの投与形態としては、その摂取または投与を容易ならしめる、例えば医薬形態であれば、エキス剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、チンキ剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、点鼻剤、鼻噴霧剤、外気道用吸入剤などの形態で使用できる。
食品形態では、通常の食品から加工食品、調理食品、半調理食品、さらには、カプセルや錠剤の形態が認められた保健機能食品の形態まで使用できる。
【００３０】
本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を先に述べたような医薬品や食品の形態で用いるにあたり、その加工や摂取を容易ならしめる、例えば、油性基剤、水性基剤、着香料、着色剤、湿潤剤、乳化剤、ゲル化剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、賦形剤などの添加物や食品素材、食品においては、野菜類、穀類、畜肉類、魚介類などの食品素材を含有する形態であっても使用できる。また、本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤およびそれを含有する食品は、ヒトが摂取する医薬品や食品のみならず、家畜、家禽、魚介など飼育動物の飼料および飼料添加物に配合することができる。
【００３１】
本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤を医薬として経口投与する場合、その投与量は成人１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは１．０〜２００ｍｇ程度であり、１日に１回または２〜４回に分けて投与することができる。また食品に添加する場合は、１日摂取量が医薬としての１日投与量の１／１０から２倍量となるような量において使用することができる。
【００３２】
【実施例】
次に、本発明のグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤の機能について、合成例、実施例などをあげて説明するが、それらに限定されるものではない。
実験例にて使用したインジゴイドは、インジルビンとイソインジゴは以下に示した化学合成により調製し、インジゴは和光純薬製の試薬を使用した。
【００３３】
合成例１
インジルビンの合成
酢酸インドキシル５００ｍｇをメタノール２０ｍｌに溶解し、これにイサチン４２５ｍｇと炭酸ナトリウム６３６ｍｇを加えて、室温下にて３０分間攪拌した。これを室温下にて一晩放置した後、吸引濾過して得られた沈殿物をメタノール洗浄、次いで水洗浄した。吸引濾過した際の濾液は酢酸エチルと水で液液分配した。酢酸エチル層を濃縮乾固したものと先に得られた沈殿物を合わせて、少量のジメチルホルムアミドに加熱溶解した。これを冷却した後、少量の水を添加していくことで、結晶が析出した。得られた結晶は、再度ジメチルホルムアミドに溶解して再結晶し、その結果、インジルビンの結晶６６８ｍｇを得た。
【００３４】
合成例２
イソインジゴの合成
オキシインドール２６６ｍｇとイサチン２９４ｍｇを酢酸６０ｍｌに溶解し、濃塩酸を数ｍｌ滴下してから室温下にて反応した。反応の経過は、逆相薄層クロマトグラフィーにて確認してイサチンとオキシインドールの減少と褐色スポットの生成を確認することにより観察した。２４時間後、反応液に水を加えてから濾紙でろ過し、得られた残渣を水と次いでメタノールで洗浄し、洗浄後の残渣を減圧乾燥してイソインジゴの茶色の結晶２８３．６ｍｇを得た。
【００３５】
実施例１
インジゴイドによるグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導（in vitro）
マウス肝由来細胞株Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７を用いて、インジルビン、インジゴ、イソインジゴ処理により誘導されるグルクロノシルトランスフェラーゼを測定した。以下にその操作方法を示す。
活性炭処理した牛胎児血清（ＦＢＳ）を５％含有するα改変イーグル培地（αＭＥＭ）に分散したＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞を１Ｘ１０^５個／ウェルとなるよう４８ウェル培養プレートにまき、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、プレートから培地を除去し、あらかじめジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解しておいた試験サンプルをＤＭＳＯ濃度１％となるよう添加したαＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。培養後、培地を除去してＰＢＳで２回洗浄してからプレートごと凍結保存した。
後日、凍結保存したプレートに２００μｌの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えて撹拌して細胞を溶解した。次に、１００μｌの０．２ｍＭ４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（４ＮＰ），１０ｍＭＭｇＣｌ_２，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加え、さらに１００μｌの０．２ｍＭＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えて反応を開始した。反応は３７℃で２時間行い、５０μｌの６０％ＨＣｌＯ_４を加えて反応を停止した。反応液を遠心分離して、その上清を４．５μｍでろ過後、生成した４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（４ＮＰＧ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。
ＨＰＬＣ分析は、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＯＤＳ８０Ｔｓ（４．６Ｘ１５０ｍｍ）；移動相：Ａ＝２５ｍＭエチルアミン［ｐＨ２．１６０％ＨＣｌＯ_４中］、Ｂ＝アセトニトリル（Ａ：Ｂ＝８：２，ｖ／ｖ）；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ３０５ｎｍ；カラム温度４０℃で行った。
【００３６】
得られた結果を〔図１〕に示した。結果は、生成した4NPGのピーク面積値から、（比活性）＝（処理群）／（対照群）で示す。
【００３７】
実施例２
アセトアミノフェン誘発障害に対する保護作用（in vivo）
アセトアミノフェンの多量投与により誘発される障害に対するインジルビンによる保護作用についてマウスを用いた実験で証明した。実験の詳細について以下に説明する。
【００３８】
１６週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃマウスを５群（対照群；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣと略す）２００ｍｇ／ｋｇ投与群；インジルビン５０ｍｇ／ｋｇ投与群；同２００ｍｇ／ｋｇ投与群；同８００ｍｇ／ｋｇ投与群、１群あたり４〜６匹））に分けて、２４時間絶食させた後、対照群には０.５％メチルセルロースを、正対照群（ＮＡＣ投与群）にはＮＡＣを０.５％メチルセルロースに溶解した水溶液を、試験群（インジルビン投与群）にはインジルビンを０.５％メチルセルロースに溶解した水溶液をそれぞれ経口投与した。その１時間後に生理食塩水に溶解したアセトアミノフェンを１５０ｍｇ／ｋｇの投与量となるよう経口投与して、肝障害を誘発させた。アセトアミノフェン投与の２４時間後に採血を行い、遠心分離して血漿を調製し、血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、それぞれ和光純薬製の「ＧＯＴ−ＵＶテストワコー」、「ＧＰＴ−ＵＶテストワコー」および「ＬタイプワコーＬＤＨ」を用いて日立自動分析装置７０７０で測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】

【００４０】
表１から明らかなように、インジルビン投与群は、対照群に比較して血漿中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ活性の上昇を顕著に抑制し、その作用は用量依存的であった。
【００４１】
【発明の効果】
この発明は、インジゴイドがヒトを含む生体のグルクロノシルトランスフェラーゼの発現を誘導して、多彩な生理作用を発揮するという新知見によるものであり、インジゴイドを含有するグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導剤は、その優れたグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導作用により、医薬品分野、化粧品分野、食品分野において、ヒトのみならず家畜、家禽、魚介類などまでをも対象にした多種多様の用途に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】インジルビン、インジゴおよびイソインジゴによるグルクロノシルトランスフェラーゼ誘導活性
【符号の説明】
シロ抜きダイヤはイソジルビン、
シロ抜き四角はイソジゴおよび
シロ抜き三角はイソインジゴ
を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a glucuronosyltransferase-inducing agent containing a naturally occurring or synthetic indigoid, and a pharmaceutical or food containing the same.
[0002]
[Prior art]
Foreign body metabolism in the human or animal body is carried out by the first and second phase detoxification enzymes, which finally convert the chemical substance into a highly water-soluble substance and make it easily discharged outside the body. The first phase detoxification enzymes are mainly cytochrome P450-based enzymes, which inactivate chemical substances by hydroxylation, oxidation, and reduction reactions. Phase 2 detoxification enzymes are enzymes that perform various conjugation reactions such as glucuronidation, sulfate conjugation, acetylation, methylation, glutathione conjugation, and amino acid conjugation such as glutamate conjugation. These enzyme groups convert substrate compounds into more water soluble compounds. In addition, quinone reductase, which is a cytochrome type but performs two-electron reduction, is also classified as the second phase.
[0003]
Glucuronic acid conjugation is a reaction that converts fat-soluble xenobiotics and metabolites into more water-soluble compounds, catalyzed by UDP-glucuronosyltransferase, and oxygen (Aglycon) of the compound (aglycone) to be conjugated. Electrophilic functional groups including oxygen atoms contained in hydroxyl groups and carboxyl groups), nitrogen (nitrogen atoms contained in amino groups, etc.), sulfur (sulfur atoms contained in thiol groups, etc.), carbon, etc. In this reaction, glucuronic acid from UDP-glucuronic acid, which is a sugar base, is added. The reaction products are glucuronide (β-D-glucopyranosiduronic acid conjugate) and UDP (uridine 5′-diphosphate).
[0004]
Many of the compounds used as pharmaceuticals are recognized as xenobiotics after being taken into the body and metabolized by detoxifying enzymes. Most of them are metabolized by cooperation between the first-phase drug-metabolizing enzyme and the second-phase drug-metabolizing enzyme and then discharged outside the body. The first phase enzyme and the second phase enzyme function in a certain balance. At this time, many of the compounds generated by the first phase enzyme have a structure rich in reactivity. Therefore, if the treatment by the second phase enzyme cannot catch up, these compounds having high reactivity will become nucleic acid nucleic acids. , May combine with sugar, protein, etc. to adversely affect the body. Therefore, it is important in the metabolism of xenobiotics that the second phase enzyme is in a state where it can function sufficiently.
[0005]
Indigoids such as indigo, indirubin, and isoindigo are all known compounds and have long been used as dyes. Although indirubin and isoindigo are small, they are obtained as by-products when preparing indigo.
[0006]
Some herbal medicines are referred to as “Seiai”, which contains indigo as the main ingredient and contains a small amount of indirubin and isoindigo. However, it has not yet been known that indigoid has an effect of inducing the expression of glucuronosyltransferase.
[0007]
[Problems to be solved by the present invention]
In such a situation, the present invention provides a glucuronosyltransferase inducer involved in the detoxification, activation, and excretion mechanism of extraneous foreign substances and metabolites, and further provides this glucuronosyltransferase inducer. Including the prevention and treatment of diseases caused by deficiency of glucuronosyltransferase or reduction of glucuronosyltransferase production ability, prevention of recurrence, prevention of complications and health maintenance, and the provision of pharmaceuticals and foods .
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive experiments and studies on physiological activities of indigoids such as indirubin, indigo, and isoindigo, and have found that these compounds have a remarkable glucuronosyltransferase expression-inducing action. That is, it has been found that glucuronosyltransferase activity in a living body is increased by administering an indigoid isolated from a natural product, purified or chemically synthesized to humans or animals. In addition, since it has already been confirmed that indigoid is a relatively safe substance, it can be provided as a safe and excellent pharmaceutical or food for humans or animals. Further, by utilizing this strong enzyme-inducing ability, it can also be used as a metabolic enzyme inducer used in the toxicity test of metabolites from drugs and food materials.
[0009]
That is, the present invention
(1) a glucuronosyltransferase inducing agent containing indigoid,
(2) The glucuronosyltransferase inducer according to (1), wherein the indigoid is indirubin, indigo or isoindigo,
(3) The glucuronosyltransferase-inducing agent according to (1), wherein the indigoid is composed of at least two combinations selected from the group consisting of indirubin, indigo and isoindigo.
(4) The glucuronosyltransferase-inducing agent according to (1), which is a preventive or therapeutic agent for liver disease,
(5) A glucuronosyltransferase-inducing agent according to (1), which is a preventive or therapeutic agent for complications due to liver disease,
(6) The glucuronosyltransferase inducer according to (1), which is an antidote,
(7) The glucuronosyltransferase inducer according to (1), which is a liver function enhancer,
It is.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The indigoid used in the present invention is a compound having a skeleton in which two indolines are bonded to each other at the 2-position or 3-position by a double bond in terms of chemical structure. Indirubin in which the 2- and 3-positions are bonded is represented as 3- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indoindole-2-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indol-2-one. Compound (CAS-No. 479-41-4) Indigo in which the 2-position and 2-position are bonded is 2- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indole-2-ylidene) -1,2 -Dihydro-3-H-indol-3-one (CAS-No. 482-89-3), the isoindigo in which the 3-position and the 3-position are bonded is 3- (1,2-dihydro-2-oxo-3H- Indol-3-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indol-2-one (CAS No. 476-34-6), which are structural isomers of each other. Indigoids used in the present invention include those in which some of these compounds are substituted with other groups such as a hydroxyl group, an amino group, a halogen, and an alkyl group.
[0011]
Indigoids can be prepared by extraction from natural products or processed products of natural products, isolation, purification, chemical synthesis, or production by microorganisms using known techniques.
[0012]
Natural products include, for example, the scallop eye (Polygonum tinctorium), the foxgill family Ryukyu eye (scientific name Storobilanthes tlaccidifolium), the leguminous taiwan komatsunagi (aka Indian eye, scientific name Indigofera tinctoria), orchid family ebine (scientific name) Calanthe discolor), and fungi such as the scientific name Schizophyllum commune can be prepared by combining various solvent extractions and various chromatographic techniques and crystallization.
[0013]
Indigoids are also naturally-derived processed products, such as the above-mentioned herbal “Seiai” (herbal medicine processed from at least one plant selected from at least 5 types of indigo plants) and “sukumo” (eye It can also be prepared from a processed product containing indigoid such as a dye raw material processed from
[0014]
In chemical synthesis, for example, 1H-indole-2,3-dione (common name: Isatin, CAS No. 91-56-5) and indoxyl acetate (CAS No. 608-08-2) are added with sodium carbonate or the like. Indirubin can be synthesized by reacting in a weakly alkaline solvent such as methanol, and the resulting indirubin can be obtained with high purity by washing and recrystallization. Isoindigo can be chemically synthesized from isatin and oxindole and can be obtained with high purity. Indigo can also be easily chemically synthesized, and this compound is still produced in large quantities in the dye field.
[0015]
In addition to these, indigoids can also be obtained by, for example, bacterial culture, fungal culture, plant callus culture, or the like.
[0016]
The indigoid thus prepared can be used in various purities from high to low purity depending on the purpose, dosage form, and method of use. Moreover, since it usually contains a plurality of indigoids when prepared from natural products, each indigoid can be used as it is as a mixture without being separated.
[0017]
The indigoid thus obtained is obtained by thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, infrared absorption spectrum, visible ultraviolet absorption spectrum, mass spectrum, ¹ H-nuclear magnetic resonance spectrum, ¹³ C-nuclear magnetic resonance spectrum, etc. It can be analyzed and identified and quantified. The indigoid content of various pharmaceuticals and foods containing these indigoids can also be measured by analytical methods such as thin layer chromatography and high performance liquid chromatography.
[0018]
The glucuronosyltransferase of the present invention is synonymous with UDP-glucuronosyltransferase, and is an enzyme that adds a glucuronic acid group from UDP-glucuronic acid to a compound (aglycone) to be reacted. There are a wide variety of compounds to be reacted by glucuronosyltransferase, and a transfer reaction is performed at the C1 position of UDP-glucuronic acid in the SN2 reaction with respect to the electrophilic functional group of these compounds. Glucuronic acid conjugate and UDP are generated.
[0019]
As described above, in vivo foreign body metabolizing enzymes are classified into the first phase and the second phase, and glucuronosyltransferase is classified into the second phase, but one conjugation reaction by the second phase enzyme is performed for one compound. In some cases, multiple conjugations such as glutathione conjugation and glucuronidation may be performed on one compound, and there may be multiple functional groups capable of conjugation reaction. Then, it may be conjugated in multiple places.
[0020]
For example, acetaminophen, which is widely used as an antipyretic analgesic, produces as its metabolite a glucuronide conjugate of acetaminophen and a glutathione conjugate of N-acetyl-p-quinominene, and quantitatively the latter metabolism. There are many. The latter is caused by conjugation of glutaminone-S-transferase to the quinomines formed after hydroxylation of acetaminophen by cytochrome P450 of the first phase enzyme.
[0021]
Acetaminophen is a widely used antipyretic analgesic, but can sometimes cause severe addiction. That is, when metabolized by glutathione conjugation, acetaminophen is first hydroxylated by the first phase detoxification enzyme, and the resulting quinomines are conjugated with glutathione, but are consumed when the amount of glutathione in the body is small. When they are depleted, they cannot detoxify quinomines, and highly reactive quinomines can bind to DNA and proteins, resulting in death of cells and severe toxicosis.
[0022]
Glucuronic acid conjugation reaction also exists in the metabolism of acetaminophen. Glucuronic acid is directly bound to the hydroxyl group of acetaminophen to form a glucuronic acid conjugate, which is excreted from the urine and bile. Glucuronidated acetaminophen may be deconjugated at the inflammatory site to regenerate acetaminophen, and if it remains in the body, the pharmacological effect can be re-executed. In addition, if glucuronidation is enhanced in the metabolism of acetaminophen, the ratio of glutathione conjugation is reduced, resulting in the production of highly reactive metabolic intermediates as in glucuronidation. It is possible to suppress a decrease in glutathione that also functions as an in vivo antioxidant molecule. Therefore, in the metabolism of acetaminophen, it is considered that it is advantageous for the living body to be metabolized by glucuronidation rather than glutathione conjugation.
[0023]
As described above, the glucuronosyltransferase of the present invention can be used for the prevention and treatment of addiction caused by drugs such as acetaminophen, and also prevents the decrease of glutathione by enhancing the action of glucuronosyltransferase. It is possible to prevent attenuation of the antioxidant effect.
[0024]
AST (Asparatic acid aminotransferase) is an enzyme that catalyzes the transfer reaction of an amino group during amino acid synthesis. It is an escape enzyme that is contained in almost all cells and leaks when cells are damaged. It is abundant in skeletal muscles and kidneys. Therefore, AST is used as an indicator of the degree of liver disease, heart disease, skeletal muscle disease, and clinical course. ALT (Alanin aminotransferase) is a transaminase necessary for amino acid synthesis, similar to AST, and is an escape enzyme that leaks out when cells are damaged. The amount in the kidney is overwhelmingly large, followed by the kidney. For this reason, ALT is used as an indicator of liver disease. LDH (Lactate dehydrogenase) is a deviating enzyme that leaks when cells are damaged, but since it is contained in all organs, it is specified which tissue is damaged by the increase of LDH in the blood. Difficult to do. Although LDH isozyme analysis is required for predicting the damage site by LDH, LDH is widely used as an indicator of in vivo diseases when used in combination with AST, ALT, and the like.
[0025]
Indirubin markedly suppressed ALT deviation due to acetaminophen overdose, and was found to suppress liver damage. Moreover, since the deviation of AST and LDH is remarkably suppressed, it is considered that indirubin induces in vivo glucuronosyltransferase to suppress not only liver damage but also damage to other organs.
[0026]
About 70% of external factors related to carcinogenesis are said to be occupied by food and smoking. In other words, diet is one of the most important risk factors for carcinogenesis. On the other hand, the living body has resistance to these carcinogenic substances, and one of the biological mechanisms responsible for the resistance is a detoxification enzyme. A group of phase 2 detoxifying enzymes, including glucuronosyltransferases in particular, are carcinogenic preventing enzymes that inactivate activated ultimate carcinogens. Therefore, ingesting the glucuronosyltransferase inducer of the present invention with food or the like to maintain a high level of glucuronosyltransferase in the body is expected to lead to an anticancer preventive effect.
[0027]
When conducting studies on drug pharmacokinetics or toxicity tests of drug metabolites, a compound having drug metabolizing enzyme-expressing action is administered to an animal, and a fraction having drug metabolic activity (referred to as S9 fraction) is obtained from the liver. The glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention can also be used for such purposes.
[0028]
Specific uses of the glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention include therapeutic agents for various diseases caused by deficiency of glucuronosyltransferase, preventive agents for recurrence after treatment, preventive agents for complications during treatment, and treatment. Examples of such drugs include potentiators, detoxifiers, disease preventives, and health enhancers.
More specifically, prevention and treatment of liver diseases such as hepatitis and drug addiction, treatment, prevention of complications resulting from liver disease, treatment, antidote, liver function enhancer, phase 2 drug metabolism function enhancer , An antioxidant function enhancer for a living body, a carcinogenic preventive agent, a carcinogenic chemical substance inactivating agent, and a food or drink containing them.
[0029]
The administration form of the glucuronosyltransferase of the present invention can be easily taken or administered. For example, in the case of a pharmaceutical form, an extract, an elixir, a granule, a pill, an ointment, a suspension, an emulsion, It can be used in the form of plasters, suppositories, powders, tinctures, tablets, syrups, soaking agents, decoctions, injections, nasal drops, nasal sprays, inhalants for the external airways, and the like.
In the form of food, it can be used from ordinary foods to processed foods, cooked foods, semi-cooked foods, and health functional foods in the form of capsules and tablets.
[0030]
When using the glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention in the form of pharmaceuticals and foods as described above, its processing and intake are facilitated, for example, an oily base, an aqueous base, a flavoring agent, a coloring agent, Additives such as wetting agents, emulsifiers, gelling agents, thickeners, antioxidants, preservatives, excipients, and food materials, including food materials such as vegetables, cereals, livestock, and seafood Even the contained form can be used. In addition, the glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention and foods containing the same can be blended in feeds and feed additives for domestic animals, poultry, fish and other domestic animals, as well as pharmaceuticals and foods consumed by humans. .
[0031]
When the glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention is orally administered as a pharmaceutical, the dose is 0.01 to 1000 mg per day for an adult, preferably about 1.0 to 200 mg, once a day or 2 to 4 Can be administered in divided doses. Moreover, when adding to a foodstuff, it can be used in the quantity whose daily intake is 1/10 to 2 times the daily dosage as a medicine.
[0032]
【Example】
Next, the function of the glucuronosyltransferase-inducing agent of the present invention will be described with reference to synthesis examples, examples and the like, but is not limited thereto.
The indigoid used in the experimental examples was prepared by chemical synthesis as shown below for indirubin and isoindigo, and indigo was a reagent manufactured by Wako Pure Chemical.
[0033]
Synthesis example 1
Synthesis of indirubin 500 mg of indoxyl acetate was dissolved in 20 ml of methanol, 425 mg of isatin and 636 mg of sodium carbonate were added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. This was left overnight at room temperature, and then the precipitate obtained by suction filtration was washed with methanol and then with water. The filtrate upon suction filtration was partitioned between ethyl acetate and water. The ethyl acetate layer was concentrated to dryness and the precipitate obtained earlier was combined and dissolved in a small amount of dimethylformamide by heating. After cooling this, crystals were deposited by adding a small amount of water. The obtained crystals were dissolved again in dimethylformamide and recrystallized, and as a result, 668 mg of indirubin crystals were obtained.
[0034]
Synthesis example 2
Synthesis of isoindigo 266 mg of oxindole and 294 mg of isatin were dissolved in 60 ml of acetic acid, and several ml of concentrated hydrochloric acid was added dropwise, followed by reaction at room temperature. The progress of the reaction was confirmed by reversed-phase thin layer chromatography, and confirmed by confirming the decrease in isatin and oxindole and the formation of brown spots. After 24 hours, water was added to the reaction solution, followed by filtration with filter paper. The resulting residue was washed with water and then with methanol, and the washed residue was dried under reduced pressure to obtain 283.6 mg of isoindigo brown crystals. .
[0035]
Example 1
Glucuronosyltransferase induction by indigoid (in vitro)
Glucuronosyltransferase induced by indirubin, indigo and isoindigo treatment was measured using a mouse liver-derived cell line Hepa-1c1c7. The operation method is shown below.
Seeded in 48-well culture plates at charcoal treated fetal bovine serum (F BS) 5% content to α Modified Eagle Medium (? MEM) in the dispersed Hepa-1c1c7 cells 1X10 ⁵ cells / well, 37 ° C., 5% They were cultured for 24 hours in CO ₂ under. After the culture, the medium was removed from the plate, and the test sample previously dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) was replaced with αMEM added to a DMSO concentration of 1%, followed by further culturing for 24 hours. After culturing, the medium was removed and the plate was washed twice with PBS and then stored frozen with the plate.
Later, 200 μl of 0.5% Triton X-100, 2 mM EDTA-2Na, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added to the cryopreserved plate and stirred to lyse the cells. Next, 100 μl of 0.2 mM 4-nitrophenol (4NP), 10 mM MgCl ₂ , 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added, and further 100 μl of 0.2 mM UDP-glucuronic acid, 10 mM MgCl ₂ , 50 mM Tris-HCl. (PH 7.4) was added to start the reaction. The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours, and the reaction was stopped by adding 50 μl of 60% HClO ₄ . After centrifuging the reaction solution and filtering the supernatant at 4.5 μm, the produced 4-nitrophenyl-β-D-glucuronide (4NPG) was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
HPLC analysis shows column: TSK-gel ODS80Ts (4.6 × 150 mm); mobile phase: A = 25 mM ethylamine [pH 2.1 in 60% HClO ₄ ], B = acetonitrile (A: B = 8: 2, v / v) Flow rate: 1.0 ml / min; detection: UV 305 nm; performed at a column temperature of 40 ° C.
[0036]
The obtained results are shown in FIG. The results are shown as (specific activity) = (treated group) / (control group) from the peak area value of the produced 4NPG.
[0037]
Example 2
Protective effect against acetaminophen-induced damage (in vivo)
The protective effect of indirubin against damage induced by a high dose of acetaminophen was proved by experiments using mice. Details of the experiment will be described below.
[0038]
16-week-old female, BALB / c mice in 5 groups (control group; N-acetyl-L-cysteine (abbreviated as NAC) 200 mg / kg administration group; indirubin 50 mg / kg administration group; 200 mg / kg administration group; Divided into 800 mg / kg administration group, 4 to 6 animals per group)) and fasted for 24 hours, 0.5% methylcellulose was added to the control group, and NAC was 0 to the positive control group (NAC administration group). An aqueous solution in which 0.5% methylcellulose was dissolved was orally administered to the test group (indirubin administration group), an aqueous solution in which indirubin was dissolved in 0.5% methylcellulose, respectively. One hour later, acetaminophen dissolved in physiological saline was orally administered to a dose of 150 mg / kg to induce liver damage. Blood was collected 24 hours after administration of acetaminophen, centrifuged to prepare plasma, and the activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) in the plasma were summed, respectively. Measurement was performed with Hitachi automatic analyzer 7070 using “GOT-UV Test Wako”, “GPT-UV Test Wako”, and “L Type Wako LDH” manufactured by Kojun Pure Chemical Industries. The results are shown in Table 1.
[0039]
[Table 1]

[0040]
As is clear from Table 1, the indirubin administration group markedly suppressed the increase in plasma AST, ALT, and LDH activities compared to the control group, and the effect was dose-dependent.
[0041]
【The invention's effect】
This invention is based on the new finding that indigoid induces the expression of glucuronosyltransferase in living organisms including humans and exerts a variety of physiological functions. A glucuronosyltransferase-inducing agent containing indigoid is Due to its excellent glucuronosyltransferase-inducing action, it can be used in a wide variety of applications not only for humans but also for livestock, poultry, and seafood in the pharmaceutical field, cosmetic field, and food field.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Glucuronosyltransferase-inducing activity by indirubin, indigo and isoindigo
The white diamond is isodirubin,
White squares indicate isodigo and white triangles indicate isoindigo.

Claims

A glucuronosyltransferase-inducing agent comprising indigoid.

The glucuronosyltransferase inducer according to claim 1, wherein the indigoid is indirubin, indigo or isoindigo.

The glucuronosyltransferase inducing agent according to claim 1, wherein the indigoid is composed of at least two kinds selected from the group consisting of indirubin, indigo and isoindigo.

The glucuronosyltransferase-inducing agent according to claim 1, which is a preventive or therapeutic agent for liver disease.

The glucuronosyltransferase-inducing agent according to claim 1, which is a preventive or therapeutic agent for complications due to liver disease.

The glucuronosyltransferase inducing agent according to claim 1, which is an antidote.

The glucuronosyltransferase inducer according to claim 1, which is a liver function enhancer.