JP4272824B2 - Quinone reductase inducer - Google Patents

Description

【０００６】
この物質は、IUPAC命名法により３−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドインドール−２−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンと命名される紫色の物質（CAS-No. 479-41-4）で、インジゴ植物（インジゴ色素の原料となる植物）に含有されていることや、インジゴ植物から青色の色素であるインジゴを作る際の副生産物として得られることが知られている。しかし近年、合成色素の登場により次第にその存在が忘れられつつある。
【０００７】
インジゴ植物におけるインジルビン生成は、例えば次の様な経路で生じると考えられている。すなわち、β−グルコシダーゼの作用によりインドキシル配糖体のインジカン（植物型インジカン、３−Ｏ−β−グルコシド）がインドキシルとなり、そのインドキシルが酸化されてイサチンとなり、イサチンとインドキシルが重合してインジルビンとなる。このとき、２分子のインドキシルが酸化重合してインジゴが生成する反応が主反応で、インジルビンや別経路で生じるイソインジゴは微量の副生成物である。
【０００８】
インジルビンは尿中にも見出される物質で、極く希に、尿カテーテルを使用している患者のカテーテルチューブが紫色に染まる現象が知られているが、この着色の本体がインジルビンである。インジルビンが尿中に多く検出される場合は、尿中に排出されたインジカン（動物型インジカン、３−硫酸インドキシル）が尿路に感染した細菌によって酸化されてインジルビンとなった可能性が強いが、トリプトファンなどの代謝により生じたインジカンが体内で加水分解および酸化重合してインジルビンが生じたり、食事からのトリプトファンやインドキシル配糖体などが腸内細菌により代謝されたりしてインジルビンが生成するので、通常の尿中にも微量は存在している。しかし、健常者の尿に検出されるインジルビンの量は、食事や活動状態などの影響を受けているので必ずしも一定ではない。
【０００９】
インジルビン関連化合物については、フランスのＣＮＲＳのグループが精力的に研究を進め、インジルビンがサイクリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）という酵素の活動を妨げること、インジルビンやその誘導体が、ＣＤＫの阻害作用によって腫瘍細胞の増殖を抑制する（Ralph Hoessel et al, Nature Cell Biology, Vol. 1, p 60-67, (1999)）ことが判明し、インジルビンやその誘導体を含有するＣＤＫ阻害剤として、WO 99/62503、EP 0966963A1が提案されている。
【００１０】
ＣＮＲＳのグループはインジルビンのＣＤＫ以外の酵素阻害活性、特にキナーゼ類の阻害について研究を進めて、グリコーゲン合成キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）およびＣＤＫの一種のＣＤＫ５／Ｐ２５の２種のキナーゼをインジルビンが抑制することをみつけた。そしてインジルビンは、ＧＳＫ−３βとＣＤＫ５／Ｐ２５を阻害することにより、アルツハイマー病やその他の神経伝達系疾患の治療剤としての可能性も有していることを見出した（Sophie Leclerc et al．, The Jounal of Biological Chemistry, Vol. 276, p 251-260 (2001)）。
【００１１】
また特開2001-31580には、インジゴ植物であるタデ科のアイ（Polygonum tinctorium）の抽出物から単離精製したインジルビンが、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）などで刺激を受けた際のインターフェロン−γの産生抑制およびインターロイキン−１０の産生促進作用を有することが報告されている。
【００１２】
インジルビンは検討された際に既にその安全性についても調べられており、例えば、イヌに臨床投与量の５〜１０倍量のインジルビンを連続して２〜３ヶ月服用させても、何ら毒性は認められていない。また、多量に投与した場合も副作用を伴うことなく、大部分のインジルビンは糞便に排出される。
【００１３】
上述の通り、インジルビンは、色素として古くから知られた化合物であり、ＣＤＫやＧＳＫ−３βなどのキナーゼ阻害作用や免疫応答細胞の或る種のサイトカイン産生調節作用などが報告されている。しかしながら、インジルビンがキノンレダクターゼの発現を誘導する作用を有していることは未だ全く知られていなかった。
【００１４】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況において、生体内の様々な機能に関与しているキノンレダクターゼの発現を誘導する、安全でかつ優れたキノンレダクターゼ誘導剤を提供すること、さらにはこのキノンレダクターゼ誘導剤をキノンレダクターゼの欠乏またはキノンレダクターゼ産生能の低下に起因する疾病の予防ならびに治療、再発予防、合併症予防や健康維持増進に貢献する医薬品や食品を提供することを課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インジルビンの生理活性について広範な実験と研究を行ってきたところ、インジルビンに優れたキノンレダクターゼ発現誘導作用があることを突き止めた。すなわち天然物から単離精製したインジルビンおよび化学合成により調製したインジルビンを動物に投与することにより、生体のキノンレダクターゼ活性が増大することを見出した。しかも、インジルビンが安全性の高い物質であることは既に確かめられており、ヒトあるいは他の動物を対象とする安全でかつ優れた医薬品や食品を提供できることが判明した。
【００１６】
すなわち本発明は、
（１）インジルビンを含有してなるキノンレダクターゼ誘導剤、
（２）肝疾患の予防または治療剤である（１）記載のキノンレダクターゼ誘導剤、
（３）肝疾患による合併症の予防又は治療剤である（１）記載のキノンレダクターゼ誘導剤、
（４）解毒剤である（１）記載のキノンレダクターゼ誘導剤、
（５）肝機能亢進剤である（１）記載のキノンレダクターゼ誘導剤、
（６）第２相薬物代謝機能亢進剤である（１）記載のキノンレダクターゼ誘導剤、
である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるインジルビンは、IUPAC命名法により、３−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドインドール−２−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンと命名される化合物（CAS-No. 479-41-4）で、２−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，２−ジヒドロ−３−Ｈ−インドール−３−オン（慣用名：インジゴ、CAS-No. 482-89-3）、３−（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（慣用名：イソインジゴ、CAS No. 476-34-6）の構造異性体である。
【００１８】
インジルビンの調製は、天然物や天然物の加工物から抽出して単離精製したり、化学合成したり、あるいは微生物により産出させたりして、公知の技術やそれらの組み合わせにより比較的容易に行うことができる。
【００１９】
天然物からは、例えば、タデ科のアイ（学名Polygonum tinctorium）やキツネノマゴ科のリュウキュウアイ（学名Storobilanthes tlaccidifolium）、マメ科のタイワンコマツナギ（別名インドアイ、学名Indigofera tinctoria）、ラン科のエビネ（学名Calanthe discolor）、などの植物や、スエヒロタケ科のスエヒロタケ（学名Schizophyllum commune）などの真菌類から、各種の溶剤抽出および各種のクロマト技術、結晶化などを組み合わせてインジルビンを調製することができる。
【００２０】
天然由来の加工物からは、例えば、生薬の「青黛（せいたい）」（５種類のインジゴ植物から選択された少なくとも１種の植物を加工した生薬）や「すくも」（アイを加工した染料の原料）などのインジルビンを含有する加工物から調製することもできる。
【００２１】
化学合成においては、例えば、１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（慣用名：イサチン、CAS No. 91-56-5）と酢酸インドキシル（CAS No. 608-08-2）を炭酸ナトリウムなどで弱アルカリ性としたメタノールなどの溶媒中で反応させてインジルビンを合成することができ、生じたインジルビンは、洗浄と再結晶により純度の高いものを得ることができる。
【００２２】
これらの他にも、例えば細菌類の培養、真菌類の培養、植物カルスの培養等によりインジルビンを得ることができる。
【００２３】
このようにして調製したインジルビンは、その使用目的や剤形、使用方法により、純度の高いものから低いものまで用途に合わせた純度のものが使用できる。例えば、化学合成は高純度のインジルビンを調製するために用い、天然物からはインジルビン含有抽出物を得るために用いてもよい。
【００２４】
このようにして得られた精製インジルビンは、紫色の針状結晶として得られ、薄相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、赤外吸収スペクトル、可視紫外線吸収スペクトル、質量スペクトル、１Ｈ−核磁気共鳴分光法、１３Ｃ−核磁気共鳴分光法などにより分析して、同定および定量することができる。インジルビン含有抽出物や精製インジルビンあるいはインジルビン含有抽出物を含む各種医薬品や食品のインジルビン含量も、薄相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの分析法により測定することができる。
【００２５】
キノンレダクターゼは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ、ニコチンアミド−キノンオキシドレダクターゼ、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：メナジオンオキシドレダクターゼ、メナジオンレダクターゼ、ビタミンＫレダクターゼなどと呼ばれる酵素と同義である。
【００２６】
キノンレダクターゼが還元の対象とする物質には、例えば、ベンゾピレンキノン類（例えばベンゾピレンの代謝物）、ベンゾキノン類（例えばベンゼンの代謝物）や、その他の環境由来や合成のキノン類で反応性が高く、１電子あるいは２電子還元されうる化合物が挙げられる。
【００２７】
ベンゾピレンキノン類、ベンゾキノン類は、環境由来の発癌性物質として知られるベンゾピレンやベンゼンが、シトクロームＰ４５０やシトクロームＰ４５０レダクターゼなどの酵素により、キノン類などの代謝物に変換されることにより生じる。また、キノン類やその誘導体は、シトクロームＰ４５０、シトクロームＰ４５０レダクターゼ、ユビキノンオキシドレダクターゼ、キサンチンオキシドレダクターゼやシトクロームｂ_５レダクターゼなどにより還元されて不安定なセミキノン類を生じる。セミキノン類は反応性が高く、ＤＮＡやタンパク質、その他生体内分子と反応して遺伝子の変異や酵素失活などを引き起こす。また、セミキノン類は酸素と反応して活性酸素を生じさせる。活性酸素もまた、ＤＮＡ障害、脂質過酸化、膜障害、細胞毒性、変異、発癌などの原因となる。
【００２８】
キノンレダクターゼは、環境からの毒物やそれらが代謝されて活性化した毒物などを代謝したり、生体内抗酸化物質が酸化して生じた酸化物を還元したりして、毒物除去、生体防御、活性酸素産生抑制などに寄与する。
【００２９】
上述のシトクロームＰ４５０やシトクロームＰ４５０レダクターゼなどは、薬物代謝酵素の一般的な分類では、第１相薬物代謝酵素に分類される。第１相薬物代謝酵素は、基本的に、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを補酵素として基質を酸化あるいは還元する酵素群である。第２相薬物代謝酵素は、薬物あるいは薬物が第１相薬物代謝された代謝物の排出を高めるため、すなわち水溶性を高めて尿などから排出させやすくするための酵素群で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドラーゼ、スルファターゼなどがある。
【００３０】
キノンレダクターゼは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素として基質を還元する酵素であるが、その酵素の働きと、発現メカニズムすなわちその酵素のＤＮＡ相同性の解析から、第２相薬物代謝酵素として分類されている。ピケットらやジャイスワルらは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとキノンレダクターゼの遺伝子にＸＲＥ（xenobiotic response element）とＡＲＥ（antioxidant response element）を見付けだしている（L.V.Favreau,C.B.Pickett,The Journal of Biological Chemistry,Vol.266,4556-4561,(1991)， L.V.Favreau,C.B.Pickett,The Journal of Biological Chemistry,Vol.268, 19875-19881,(1993)， A.K.Jaiswal,Biochemistry,Vol.30,10647-10653,(1991))。
【００３１】
キノンレダクターゼなどの第２相薬物代謝酵素をより多く発現させることの利点は、第１相も第２相も本来は解毒するために働くのであるが、第１相の反応が場合により却って生体にとって毒性の強い物質を作り出してしまうことがあるのに対し、第２相の反応はそうして生成した毒物をも解毒してくれるところにある。
例えば、発癌性の高いことで知られるカビ毒のアフラトキシンは、第１相の反応で活性化されることで変異原性を現す。ベンゾピレンの発癌性も第１相薬物代謝により活性化される。こうして活性化された毒性物質は第２相薬物代謝により解毒されるので、第２相薬物代謝の亢進は発癌予防として重要となる。ダイオキシン類も第１相により活性化されて変異原となり、生じた変異原物質の解毒も第２相によって行われている。
【００３２】
解熱鎮痛薬として良く知られるアセトアミノフェンは、多量に摂取したときや体調により急性中毒症をおこすことがある。アセトアミノフェンの解熱鎮痛効果はアセトアミノフェンそのものによる作用であり、かつアセトアミノフェンそのものの毒性はかなり低い。アセトアミノフェンによる肝機能障害を伴う中毒症は、実はアセトアミノフェンが第１相代謝により毒性物質となることにより引き起こされる。このときも生じた毒物は第２相が働いて解毒する。
【００３３】
変異原性物質のみならず、細胞毒性を有する他の化合物や疾病を誘発する化学物質などを解毒することを亢進させるのにも、キノンレダクターゼなどの第２相薬物代謝酵素の活性化すなわち発現量の増大は極めて重要である。
【００３４】
癌治療において、生還元性抗腫瘍剤が新しいクラスの抗癌剤として重要視されている。その例としてマイトマイシンＣやＥＯ９、プロフィロマイシン、ジアジクオンなどが挙げられ、これらは１電子あるいは２電子還元されて活性化され効果を発揮する。キノンレダクターゼは、これらの生還元性抗腫瘍剤の効果を増大することができる。例えば、キノンレダクターゼを誘導する作用のある化合物の１，２−ジチオールー３−チオンにより、マイトマイシンＣやＥＯ９の抗腫瘍活性が増大することが報告されている。
【００３５】
ＥＯ９の抗腫瘍活性は前述の通り還元されて活性化するのであるが、これはＥＯ９の還元体のセミキノン体やヒドロキノン体が腫瘍細胞の遺伝子に結合して抗腫瘍活性を示すからと考えられている。ＥＯ９の還元化には第１相薬物代謝のシトクロームＰ４５０レダクターゼによっても行うことができる。しかしながら、シトクロームＰ４５０レダクターゼが作用するときには、酸素分子から活性酸素のスーパーオキシドを産生してしまう。このスーパーオキシドは、新たな変異の原因となったり、細胞の機能を失わせる。キノンレダクターゼはＥＯ９を還元して活性化するときにスーパーオキシドを産生させないので、ＥＯ９を使用した治療時にキノンレダクターゼ量を高めておけばスーパーオキシドによる毒性を低減することができる。
【００３６】
キノンレダクターゼの生体内抗酸化作用亢進の機能について説明する。抗酸化性物質（アンチオキシダント）の多くは、その水素供与体としての作用により抗酸化作用を示すのであるが、水素供与した後の物質（酸化物）が水素受容体として働いて、逆に酸化促進物質（プロオキシダント）として作用することがある。こうして生じたプロオキシダントの消去にもキノンレダクターゼが活躍する。
【００３７】
生体内抗酸化物質として良く知られるトコフェロール（ビタミンＥ）は、脂溶性ビタミンであるにも拘わらず副作用のほとんどないことが知られている。ビタミンＥの機能は、その優れた水素供与能により膜脂質やリポ蛋白体での脂質過酸化を防止することにあると考えられている。トコフェロールは水素供与体として働くとその結果トコフェロールラジカルとなるのであるが、これはビタミンＣやチオール化合物などの抗酸化分子により速やかに還元されて再生される。しかし、多量のトコフェロールラジカルが処理（トコフェロールへの再生）できなくなるようなことがあると、副作用のないといわれていたトコフェロールにも副作用がでてくることがある。すなわち、トコフェロールから生じたセミキノン体やキノン体の毒性が生じることがある。例えば、喫煙者に対し過剰のトコフェロール単独をサプリメントととして与え続けると、肺癌の発症リスクが上昇することが知られている。これは、トコフェロールから生じたキノン体によると考えられている。
【００３８】
キノンレダクターゼは、トコフェロールから生じたキノン体のトコフェロールキノンを還元してトコフェロールハイドロキノンに戻すことができる。トコフェロールハイドロキノンは抱合化された後に尿などに排出される。すなわち、キノンレダクターゼは、トコフェロールの抗酸化性を損なうことなく、トコフェロールの副作用の原因となるとトコフェロールキノンの代謝を促進してその毒性を低減することができるのである。
【００３９】
ユビキノンは、ミトコンドリアにおける呼吸鎖の電子伝達や酸化的リン酸化の重要な電子担体であるとともに、膜の安定性や抗酸化に寄与していると考えられている。ユビキノンは、核やミトコンドリア、ミクロソーム、サイトソールなどに多く見られ、特にミトコンドリアに多く、組織別にはミトコンドリアに富む心臓、肝臓、腎臓に多い。ユビキノンは１電子還元でセミキノンラジカル、さらに１電子還元でジヒドロキシ体となり、これらがそれぞれ電子受容体あるいは電子供与体となることで、電子担体として機能している。
【００４０】
ミトコンドリアは、スーパーオキシド産生部位であり、電子伝達に伴って、スーパーオキシドを産生する。生体内で生じる活性酸素のうち一番多いのが、このミトコンドリアから漏れ出るスーパーオキシドである。ユビキノンは、ミトコンドリア膜上にてスーパーオキシドの消去を行っていると考えられる。実際には、ユビキノンが２電子還元されたジヒドロキシユビキノンがスーパーオキシドの消去に働く。
【００４１】
キノンレダクターゼは、ユビキノンを２電子還元してジヒドロキシユビキノンを生じさすことができるので、キノンレダクターゼを誘導すると、ユビキノンによるミトコンドリアからのスーパーオキシドの漏洩を防止する作用が強くなる。すなわち、キノンレダクターゼを誘導することにより、ミトコンドリアからの活性酸素の漏洩を防ぎ、活性酸素毒を低減してくれる。
【００４２】
ビタミンＫは、フィロキノン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）などキノン構造を有するが、その機能の本質は酸化還元反応である。食事由来のビタミンＫ（キノン体）は生体内で還元されてヒドロキノンとなり、このヒドロキノンが各種ビタミンＫ依存性タンパク質をカルボキシル化する際のコファクターとして働く。このとき、ビタミンＫヒドロキノンはビタミンＫエポキシドとなり、ビタミンＫエポキシドはビタミンＫさらにビタミンＫヒドロキノンへと再生される。
【００４３】
キノンレダクターゼは、ビタミンＫからヒドロキノンへの活性化や再生に関与する酵素であり、ビタミンＫの機能を正常に働かせるために必要であるとともに、再生に関与することからビタミンＫ欠乏を予防する効果もある。抗生物質投与時にビタミンＫ欠乏となることがあるが、このような薬物での治療時に、キノンレダクターゼ活性を高めてビタミンＫ欠乏症を予防するためにも本発明のキノンレダクターゼを使用することができる。
【００４４】
赤ワインにより心冠状動脈疾患の発症リスクが低減するフレンチパラドックスで脚光を浴びたワインポリフェノールに代表されるように、フラボノイド類などのポリフェノールの新しい機能が続々と報告されている。ところで、これらのポリフェノール類は、そのフェノール構造による水素供与体としての機能すなわち抗酸化性があるところに共通性があるのであるが、水素供与体として機能すると自らは酸化体となって水素受容体になってしまう。このようにして生じたキノン体などの水素受容体が、かえって酸化を促進したり生体に障害を与えたりする恐れがあることを、既に多くの学者が懸念している。
【００４５】
キノンレダクターゼは、フラボノイドなどのポリフェノールから生じたキノン体などの水素受容体を還元して、その毒性を低減し、それらフラボノイドのさまざまな機能の発現に寄与している。したがって、キノンレダクターゼの発現を誘導することは、生体におけるキノンレダクターゼの機能、作用を強化することに繋がり、キノンレダクターゼの欠乏に起因するあらゆる疾病の予防、治療剤として有用である。
【００４６】
抗酸化作用を有する機能性素材の多くが、ラジカル捕捉活性を有していることとそのラジカル捕捉能すなわち抗酸化活性からなる機能性を期待しているのに対し、本発明のキノンレダクターゼ誘導剤は、ラジカル捕捉活性をもたないインジルビンによってキノンレダクターゼの発現を強力に誘導して、その結果として生体内抗酸化作用を亢進させるという点で他のキノンレダクターゼ誘導剤と異なっている。
【００４７】
本発明の、キノンレダクターゼ誘導剤の具体的な用途としては、キノンレダクターゼの欠乏に起因する各種疾病の治療剤、治療後の再発予防剤、治療中の合併症予防剤、治療に使用している他の医薬品の効果増強剤、解毒剤、疾病予防剤、健康増進剤などが挙げられる。
より具体的には、肝炎などの肝疾患の予防、治療剤、肝疾患に起因する合併症の予防、治療剤、解毒剤、肝機能亢進剤、第２相薬物代謝機能亢進剤、生体の抗酸化機能亢進剤、抗腫瘍剤の活性増強剤、発癌予防剤、発癌性化学物質不活性化剤、それらを含有する飲食品などである。
【００４８】
本発明のキノンレダクターゼ誘導剤の投与形態としては、その摂取または投与を容易ならしめる、例えば医薬形態であれば、エキス剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、チンキ剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、点鼻剤、鼻噴霧剤、外気道用吸入剤などの形態として使用できる。
【００４９】
食品形態では、通常の食品から加工食品、調理食品、半調理食品、さらには、カプセルや錠剤の形態が認められた保健機能食品の形態としても使用できる。
【００５０】
本発明のキノンレダクターゼ誘導剤を先に述べたような医薬品や食品の形態で用いるにあたっては、その加工や摂取を容易ならしめる、例えば、油性基剤、水性基剤、着香料、着色剤、湿潤剤、乳化剤、ゲル化剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、賦形剤などの添加物や食品素材、食品においては、野菜類、穀類、畜肉類、魚介類などの食品素材を含有する形態であってもよい。また、本発明のキノンレダクターゼ誘導剤は、ヒトに投与されまたは摂取する医薬品や食品のみならず、家畜、家禽、魚介など飼育動物の飼料および飼料添加物に配合することもできる。
本発明のキノンレダクターゼ誘導剤を医薬として経口投与する場合、その投与量は成人（５０Ｋｇ）１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは１．０〜２００ｍｇ程度であり、１日に１回または２〜４回に分けて投与することができる。また、食品中に添加する場合は、１日摂取量が医薬としての１日投与量の１／１０から２倍量となるような量において使用することができる。
【００５１】
【実施例】
次に、本発明のキノンレダクターゼ誘導剤の機能について実験例、実施例をあげて説明するが、それらに限定されるものではない。
【００５２】
実験例１ インジゴ植物からのインジルビンの調製
徳島県で栽培されたアイの乾燥葉（福田龍株式会社より入手）２０ｇをエタノール３００ｍｌにて３時間加熱還留抽出し、得られた抽出液をエバポレータにて濃縮し、溶媒を除去して抽出物を得た。得られた抽出物を少量の酢酸エチルに溶解して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーはヘキサン／酢酸エチル（３：２，ｖ／ｖ）にて溶出を行い、赤色色素画分を分画した。この画分を濃縮乾固後、酢酸エチルに溶解して、常温下で放置したところ、結晶が得られた。得られた結晶は、酢酸エチルに再度溶解して再結晶化を行い、少量のメタノール、次いで少量のアセトニトリルにて洗浄した。以上の操作により、紫色の針状結晶４.５ｍｇが得られた。後に行う機器分析により、この結晶はインジルビンであると同定された。
【００５３】
実験例２ インジルビンの同定
実験例１で得られた化合物について各種機器分析を用いて化合物の同定を行った。
【００５４】
質量スペクトル
実験例１で得られた化合物につき、電子衝撃イオン化法による質量スペクトルをイオン化電圧７０ｅＶにて測定したところ、ｍ／ｚ ２６２（Ｍ＋，１００％）、２３４（５０％）、２０５（２３％）、１３１（１０％）、１０３（１０％）にピークが観察された。
【００５５】
核磁気共鳴スペクトル
実験例１で得られた化合物につき、重水素化ジメチルスルホキシドに溶解して、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル、および、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。それぞれの核磁気共鳴スペクトルにより観察されたシグナルの化学シフト並びに水素原子および炭素原子の帰属を〔表１〕、〔表２〕に示す。
【００５６】
【表１】

【００５７】
【表２】

【００５８】
赤外線吸収スペクトル
臭素カリウム錠剤法にて、実験例１で得られた化合物の赤外線吸収スペクトルを測定した。その結果を〔図１〕に示した。得られた赤外線吸収スペクトルは、後述の実験例３で得られた化学合成インジルビンの赤外線吸収スペクトルに一致した。
【００５９】
以上の実験結果に基づき、実験例１で得られた化合物は、３−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドインドール−２−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（通称名インジルビン、分子式Ｃ_１６Ｈ_１０Ｎ_２Ｏ_２、CAS-No. 479-41-4）であると同定された。
【００６０】
実験例３ インジルビンの合成
酢酸インドキシル５００ｍｇをメタノール２０ｍｌに溶解し、これにイサチン４２５ｍｇと炭酸ナトリウム６３６ｍｇを加えて、室温下にて３０分間攪拌した。これを室温下にて一晩放置した後、吸引濾過して得られた沈殿物をメタノール洗浄、次いで水洗浄した。吸引濾過した際の濾液は酢酸エチルと水で液液分配した。酢酸エチル層を濃縮乾固したものと先に得られた沈殿物を合わせて、少量のジメチルホルムアミドに加熱溶解した。これを冷却した後、少量の水を添加していくことで、結晶が析出した。得られた結晶は、再度ジメチルホルムアミドに溶解して再結晶し、その結果、インジルビンの結晶６６８ｍｇを得た。
【００６１】
実施例１ インジルビンによるキノンレダクターゼ誘導作用（in vitro）
マウス肝由来細胞株hepa-1c1c7を用いて、インジルビン処理により細胞に誘導されたキノンレダクターゼ量を測定した。キノンレダクターゼの活性測定原理は、メナジオンがキノンレダクターゼによりヒドロキノンとなること、このヒドロキノンがＭＴＴ試薬[ ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド ]を還元して生じるホルマゾンが発色することによる。以下にその操作方法を示す。
【００６２】
活性炭処理した牛胎児血清を５％含有するα改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）に分散したhepa-1c1c7細胞を１ｘ１０^４個となるよう９６穴培養プレートに撒き、２４時間３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養後、プレートから培地を除去し、インジルビンをあらかじめジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解しておき、ＤＭＳＯ濃度１％となるようにインジルビンを添加したα−ＭＥＭ培地に置換してさらに２４時間培養した。以上の操作は２枚のプレートを用意して同じ操作を行った。
【００６３】
培養後、一方のプレートから培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄を行い、０.８％ジギトニン溶液５０μｌを各ウェルに入れて２０分間攪拌して細胞を溶解した。これに反応液２００μｌを加えて５分から１０分間反応させた後、０.３ｍＭジクマロール溶液を加えて反応を停止した。この反応液の組成は、２５ｍＭ トリス-塩酸（ｐＨ７.４）；０.７％ 牛血清アルブミン；０.０１％ ツイーン２０；５μＭ ＦＡＤ；１ｍＭ グルコース６リン酸；３０μＭ ＮＡＤＰ；２units／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ；０.３ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ；５０μＭ メナジオンである。
反応を停止した後、速やかにマイクロプレートリーダーにて、測定波長６３０ｎｍ、参照波長７００ｎｍで「測定値Ａ」を測定した。この値はウェルあたりのキノンレダクターゼ活性に相関する。
【００６４】
次にもう他方のプレートから培地を除去し、０.２％ クリスタルバイオレットを含有する２％エタノール溶液を１００μｌずつ加えて１０分間放置後、プレートごと水道水に数回浸漬して洗浄し、０.５％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５０％エタノール溶液を２００μｌずつ加えて１時間放置することでウェルに残った色素を可溶化した。このプレートをマイクロプレートリーダーにて、測定波長５５０ｎｍ、参照波長７００ｎｍで「測定値Ｂ」を測定した。この値はウェル上の細胞数に相関する。
【００６５】
以上の操作により得られた値から下記計算式１にて細胞あたりの活性を求め、インジルビンを含有しないＤＭＳＯだけを添加した群（対照群）の値を１として添加群のキノンレダクターゼ誘導比活性を算出した。
計算式１
（添加群の測定値Ａ ÷ 添加群の測定値Ｂ）÷（対照群の測定値Ａ ÷ 対照群の測定値Ｂ）＝ 比活性
【００６６】
得られた結果を〔図２〕に示した。計算式１により求めた比活性と細胞数に相関する測定値Ｂの結果を図示した。
〔図２〕で示すように、インジルビンはhepa-1c1c7細胞に対して用量依存的にキノンレダクターゼを誘導した。また、この試験で用いた濃度範囲においては、ＯＤ（吸光度）５５０−７００ｎｍの値に変化は認められず、細胞毒性が認められていない。以上の結果からインジルビンが優れたキノンレダクターゼ誘導物質であることが明らかとなった。
【００６７】
実施例２ アセトアミノフェン誘発障害に対するインジルビンの保護作用
アセトアミノフェンの多量投与により誘発される障害のインジルビンによる保護作用について、以下に示すマウスを用いた実験で証明した。
【００６８】
１６週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃマウスを５群（対照群；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン「ＮＡＣと略す」２００ｍｇ／ｋｇ投与群；インジルビン５０ｍｇ／ｋｇ投与群；同２００ｍｇ／ｋｇ投与群；同８００ｍｇ／ｋｇ投与群、１群あたり４〜６匹）に分けて、２４時間絶食させた後、対照群には０.５％メチルセルロースを、正対照群（ＮＡＣ投与群）にはＮＡＣを０.５％メチルセルロースに溶解した水溶液を、試験群（インジルビン投与群）にはインジルビンを０.５％メチルセルロースに溶解した水溶液をそれぞれ経口投与した。その１時間後に生理食塩水に溶解したアセトアミノフェンを１５０ｍｇ／ｋｇの投与量となるよう経口投与して、肝障害を誘発させた。アセトアミノフェン投与の２４時間後に採血を行い、遠心分離して血漿を調製し、血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、それぞれ和光純薬製の「ＧＯＴ−ＵＶテストワコー」、「ＧＰＴ−ＵＶテストワコー」および「Ｌタイプワコー ＬＤＨ」を用いて日立自動分析装置７０７０で測定した。
結果を〔表３〕に示す。
【００６９】
【表３】

【００７０】
〔表３〕から明らかなように、インジルビン投与群は、対照群に比較して血漿中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ活性の上昇を顕著に抑制し、その作用は用量依存的であった。
【００７１】
アセトアミノフェンは解熱鎮痛薬として知られ、風邪薬などに使用されている。常用量の服用による副作用は極めて稀であるが、過剰量を摂取すると肝機能障害、腎臓障害、意識障害などを起こすことが知られている。アセトアミノフェンは、肝臓においてシトクロームＰ４５０によりＮ−アセチル−ｐ−キノミネンに変化した後にグルタチオン抱合により不活性化されて排出されるが、多量のアセトアミノフェンを服用すると、グルタチオンが枯渇したりしてＮ−アセチル−ｐ−キノミネンが肝臓に障害を与え、さらに肝臓から漏出したＮ−アセチル−ｐ−キノミネンが腎臓など他の臓器に障害を与える。したがって、このように実験動物に過剰のアセトアミノフェンを投与することにより、比較的容易に肝臓障害を誘発させることができ、肝機能障害の生化学的研究手段として広く使用されている。
【００７２】
ＡＳＴは、アミノ酸合成の際にアミノ基の転移反応を触媒する酵素で、ほとんど全ての細胞に含まれ、細胞が障害を受けることにより漏出してくる逸脱酵素で、心筋、肝臓、骨格筋、腎臓などに多く含まれている。そのため、ＡＳＴは肝疾患、心疾患、骨格筋疾患の程度、臨床経過の指標として用いられる。ＡＬＴは、ＡＳＴと同様にアミノ酸合成に必要なアミノ基転移酵素であり、細胞が損傷を受けたときに漏出してくる逸脱酵素で、ＡＳＴに比較して特異性が高く、特に肝臓での含有量が圧倒的に多く、次いで腎臓に多く含有されている。このため、ＡＬＴは肝疾患の指標として用いられる。ＬＤＨは、細胞が損傷したときに漏出する逸脱酵素であるが、あらゆる臓器に含まれることから、ＬＤＨが血中に増加していることでどの組織が損傷を受けているかを特定することは難しい。ＬＤＨによる損傷部位の予測にはＬＤＨのアイソザイムの解析が必要となるが、ＬＤＨはＡＳＴやＡＬＴなどと組み合わせて使用することにより生体内疾患の指標として広く使用されている。
【００７３】
インジルビンは、アセトアミノフェン過剰投与によるＡＬＴの逸脱を顕著に抑制し、肝障害を抑制することが明らかとなった。また、ＡＳＴおよびＬＤＨの逸脱も顕著に抑制しているので、インジルビンが生体内キノンレダクターゼ発現を誘導して、肝障害のみならず他の臓器の損傷をも抑制していると考えられる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のインジルピンを含んでなるキノンレダクターゼ誘導剤は、ヒトを含む動物生体のキノンレダクターゼの発現を誘導して、多彩な生理作用を発揮させ、例えば肝疾患、それに起因する他の疾病の予防、治療剤として有用であり、医薬品分野、化粧品分野、食品分野において、ヒトのみならず家畜、家禽、魚介類などまでをも対象にした多種多様の用途に使用できる。
このような顕著な効果を奏する本発明は、医療、厚生分野に貢献するとともに、人々の健康な暮らしの向上に寄与する、意義のある発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ３−（１，３−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−インドインドール−２−イリデン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン、（〔化１〕、通称名インジルビン）の赤外線吸収スペクトル。
【図２】 インジルビンによるキノンレダクターゼ誘導活性。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention comprises naturally occurring or synthetic indirubinQuinone reductase inducerIt is about.
[0002]
[Prior art]
The quinone reductase is a flavoprotein named DT diaphorase (EC 1.6.99.2) by Lars Ernster around 1960, and is generally called quinone reductase or quinone oxidoreductase. This quinone reductase is an enzyme that catalyzes the reduction of quinones and compounds that become electron acceptors using NADH or NADPH as a coenzyme, and is an enzyme that is found in any organ or tissue in the body, although there are some amounts. . Substrates that quinone reductase reduces include, for example, quinones, quinoneimines, azo compounds and nitrogen oxides. Quinone reductase has an action of reducing oxides generated by active oxygen, lipid peroxide, etc., oxides generated by metabolism, and compounds taken into the living body from meals, smoking, exhaust gas, and the like. In addition, quinone reductase is also involved in various in vivo reactions such as redox reactions such as vitamin K and ubiquinone, which are functional components of the living body, and reduction of oxidized vitamin E. It seems that they are involved.
[0003]
Quinone reductase is classified as a phase 2 drug metabolizing enzyme, and inducing the expression of quinone reductase is not only an increase in drug metabolism, that is, an increase in detoxification, but also a cause of the onset of various diseases such as cancer and lifestyle-related diseases. It also leads to a disease risk reduction effect by removing the factor, that is, a disease prevention effect, and further a cancer treatment promotion effect by enhancing the activity of reducing antitumor agents such as mitomycin C and EO9.
[0004]
In recent years, research has been focused on finding materials that induce this quinone reductase expression. Sulfur-containing compounds such as dithioretin and isothiocyanates have been found to have this action, and plants belonging to the genus Liliaceae and Brassicaceae containing them are attracting attention as materials for preventing cancer. However, some compounds that induce quinone reductase expression are highly toxic in themselves, and materials with higher safety are required.
[0005]
Indirubin is a substance having the chemical structure represented by the following formula (I).
[Chemical 1]

[0006]
This material has a purple color designated 3- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indoindole-2-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indol-2-one by IUPAC nomenclature. It is a substance (CAS-No. 479-41-4) that is contained in indigo plants (plants that are the raw materials for indigo pigments) and as a by-product when making indigo, a blue pigment from indigo plants. It is known to be obtained. In recent years, however, the existence of synthetic pigments has gradually been forgotten.
[0007]
Indirubin production in indigo plants is considered to occur, for example, through the following pathway. That is, the indoxyl glycoside indican (plant-type indican, 3-O-β-glucoside) becomes indoxyl by the action of β-glucosidase, the indoxyl is oxidized to isatin, and isatin and indoxyl are polymerized. To indirubin. At this time, the reaction in which two molecules of indoxyl are oxidatively polymerized to produce indigo is the main reaction, and indirubin and isoindigo produced by another route are a small amount of by-products.
[0008]
Indirubin is a substance that is also found in urine, and it is very rarely known that a catheter tube of a patient who uses a urinary catheter is stained purple. This colored body is indirubin. If a large amount of indirubin is detected in the urine, there is a strong possibility that indican excreted in the urine (animal type indican, 3-indoxyl sulfate) is oxidized to indirubin by bacteria infected in the urinary tract. Indicans produced by metabolism of tryptophan, etc. are hydrolyzed and oxidatively polymerized in the body to produce indirubin, and tryptophan and indoxyl glycosides from the diet are metabolized by intestinal bacteria to produce indirubin. Trace amounts are also present in normal urine. However, the amount of indirubin detected in the urine of a healthy person is not necessarily constant because it is affected by meals and activity status.
[0009]
With regard to indirubin-related compounds, the French CNRS group has been intensively researching that indirubin interferes with the activity of the enzyme cyclin-dependent protein kinase (CDK), and that indirubin and its derivatives can inhibit tumor cells by inhibiting CDK. (Ralph Hoessel et al, Nature Cell Biology, Vol. 1, p 60-67, (1999)). As a CDK inhibitor containing indirubin and its derivatives, WO 99/62503, EP 0966963A1 has been proposed.
[0010]
The CNRS group has been conducting research on the enzyme inhibitory activity of indirubin other than CDK, especially the inhibition of kinases. Indirubin has two kinases, glycogen synthesis kinase-3β (GSK-3β) and CDK, one of CDK5 / P25. I found it to suppress. Indirubin has also been found to have potential as a therapeutic agent for Alzheimer's disease and other neurotransmitter diseases by inhibiting GSK-3β and CDK5 / P25 (Sophie Leclerc et al., The Jounal of Biological Chemistry, Vol. 276, p 251-260 (2001)).
[0011]
JP 2001-31580 also discloses that indirubin isolated and purified from an extract of Polygonum tinctorium, an indigo plant, is interferon-γ when stimulated with lipopolysaccharide (LPS) or the like. It has been reported to have production-suppressing and interleukin-10 production-promoting actions.
[0012]
Indirubin has already been investigated for its safety at the time of its investigation. For example, even if dogs are given 5-10 times the dose of indirubin continuously for 2-3 months, no toxicity is observed. It is not done. In addition, most indirubin is excreted in the stool without side effects even when administered in large amounts.
[0013]
As described above, indirubin is a compound that has long been known as a pigment, and has been reported to inhibit kinases such as CDK and GSK-3β and to regulate certain cytokine production in immune-responsive cells. However, it has not been known at all that indirubin has an action of inducing the expression of quinone reductase.
[0014]
[Problems to be solved by the present invention]
In such a situation, the present invention provides a safe and excellent quinone reductase inducer that induces the expression of quinone reductase involved in various functions in a living body, and further this quinone reductase inducer. It is an object of the present invention to provide pharmaceuticals and foods that contribute to prevention and treatment of diseases caused by deficiency of quinone reductase or decreased quinone reductase production ability, prevention of recurrence, prevention of complications, and health maintenance.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive experiments and studies on the physiological activity of indirubin and have found that indirubin has an excellent quinone reductase expression-inducing action. That is, it has been found that quinone reductase activity in living body is increased by administering indirubin isolated and purified from natural products and indirubin prepared by chemical synthesis to animals. Moreover, it has already been confirmed that indirubin is a highly safe substance, and it has been found that safe and excellent pharmaceuticals and foods for humans and other animals can be provided.
[0016]
  That is, the present invention
  (1) a quinone reductase inducer containing indirubin,
  (2) The quinone reductase inducer according to (1), which is a preventive or therapeutic agent for liver disease,
  (3) The quinone reductase inducer according to (1), which is a preventive or therapeutic agent for complications due to liver disease,
  (4) The quinone reductase inducer according to (1), which is an antidote,
  (5) The quinone reductase inducer according to (1), which is a liver function enhancer,
  (6) The quinone reductase inducer according to (1), which is a phase II drug metabolic function enhancer,
sois there.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Indirubin used in the present invention is a 3- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indoindole-2-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indole-2-one according to the IUPAC nomenclature. The named compound (CAS-No. 479-41-4) is 2- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indole-2-ylidene) -1,2-dihydro-3-H-indole -3-one (common name: Indigo, CAS-No. 482-89-3), 3- (1,2-dihydro-2-oxo-3H-indole-3-ylidene) -1,3-dihydro-2H -Structural isomer of indol-2-one (common name: isoindigo, CAS No. 476-34-6).
[0018]
Preparation of indirubin is relatively easy by extraction from natural products and processed products of natural products, isolation and purification, chemical synthesis, or production by microorganisms using known techniques and combinations thereof. be able to.
[0019]
Natural products include, for example, the scallop eye (Polygonum tinctorium), the foxgill family Ryukyu eye (scientific name Storobilanthes tlaccidifolium), the leguminous taiwan komatsunagi (aka Indian eye, scientific name Indigofera tinctoria), orchid family ebine (scientific name) Indirubin can be prepared from plants such as Calanthe discolor) and fungi such as Schizophyllum commune, by combining various solvent extraction methods and various chromatographic techniques and crystallization.
[0020]
Naturally-derived processed products include, for example, the crude drug “Seitai” (herbal medicine processed from at least one plant selected from five types of indigo plants) and “sukumo” (the dye that processed the eye). It can also be prepared from a processed product containing indirubin such as a raw material.
[0021]
In chemical synthesis, for example, 1H-indole-2,3-dione (common name: Isatin, CAS No. 91-56-5) and indoxyl acetate (CAS No. 608-08-2) are added with sodium carbonate or the like. Indirubin can be synthesized by reacting in a weakly alkaline solvent such as methanol, and the resulting indirubin can be obtained with high purity by washing and recrystallization.
[0022]
In addition to these, indirubin can be obtained by, for example, bacterial culture, fungal culture, plant callus culture, or the like.
[0023]
The indirubin prepared in this manner can be used in a purity suitable for the use from high to low purity depending on the purpose of use, dosage form, and method of use. For example, chemical synthesis may be used to prepare high purity indirubin and may be used to obtain indirubin-containing extracts from natural products.
[0024]
The purified indirubin thus obtained is obtained as purple needle-like crystals, and is obtained by thin-phase chromatography, high performance liquid chromatography, infrared absorption spectrum, visible ultraviolet absorption spectrum, mass spectrum, 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy. , 13C-nuclear magnetic resonance spectroscopy or the like for identification and quantification. The indirubin content of various pharmaceuticals and foods containing indirubin-containing extract, purified indirubin, or indirubin-containing extract can also be measured by analytical methods such as thin-phase chromatography and high-performance liquid chromatography.
[0025]
The quinone reductase includes NAD (P) H: quinone reductase, NAD (P) H: quinone oxidoreductase, nicotinamide-quinone oxidoreductase, quinone acceptor oxidoreductase, NAD (P) H: menadione oxidoreductase, menadione reductase, vitamin It is synonymous with an enzyme called K reductase.
[0026]
Substances targeted for reduction by quinone reductase include, for example, benzopyrenequinones (for example, benzopyrene metabolites), benzoquinones (for example, benzene metabolites), and other environmentally derived and synthetic quinones. Examples thereof include compounds that can be reduced by one electron or two electrons.
[0027]
Benzopyrenequinones and benzoquinones are produced by converting benzopyrene and benzene, which are known as carcinogenic substances derived from the environment, into metabolites such as quinones by enzymes such as cytochrome P450 and cytochrome P450 reductase. In addition, quinones and derivatives thereof include cytochrome P450, cytochrome P450 reductase, ubiquinone oxidoreductase, xanthine oxidoreductase, and cytochrome b.₅Reduced by reductase or the like to produce unstable semiquinones. Semiquinones are highly reactive and react with DNA, proteins, and other in vivo molecules to cause gene mutation and enzyme deactivation. Semiquinones react with oxygen to generate active oxygen. Reactive oxygen also causes DNA damage, lipid peroxidation, membrane damage, cytotoxicity, mutation, carcinogenesis and the like.
[0028]
The quinone reductase metabolizes poisons from the environment and poisons that have been metabolized and activated, or reduces the oxides produced by the oxidation of in-vivo antioxidants. Contributes to active oxygen production suppression.
[0029]
The above-mentioned cytochrome P450, cytochrome P450 reductase and the like are classified as phase 1 drug metabolizing enzymes in the general classification of drug metabolizing enzymes. The first phase drug-metabolizing enzyme is basically an enzyme group that oxidizes or reduces a substrate using NAD, NADP, NADH, and NADPH as coenzymes. Phase 2 drug-metabolizing enzymes are a group of enzymes for increasing the excretion of a drug or a metabolite obtained by metabolizing the drug in the first phase, that is, increasing the water solubility and facilitating the excretion from urine or the like. Glutathione-S- Examples include transferase, UDP-glucuronosyltransferase, epoxide hydrase, and sulfatase.
[0030]
The quinone reductase is an enzyme that reduces the substrate using NAD (P) H as a coenzyme, but it is classified as a phase 2 drug metabolizing enzyme based on the function of the enzyme and the analysis of its expression mechanism, that is, the DNA homology of the enzyme. ing. Picket et al. And Jaiswald et al. Found XRE (xenobiotic response element) and ARE (antioxidant response element) genes for glutathione-S-transferase and quinone reductase (LVFavreau, CBPickett, The Journal of Biological Chemistry, Vol. .266,4556-4561, (1991), LVFavreau, CBPickett, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 268, 19875-19881, (1993), AKJaiswal, Biochemistry, Vol. 30, 10647-10653, (1991 )).
[0031]
The advantage of expressing more phase II drug metabolizing enzymes such as quinone reductase is that both the first phase and the second phase originally work for detoxification, but the reaction of the first phase is sometimes more difficult for the living body. While it can create highly toxic substances, the reaction in the second phase is to detoxify the toxic substances so produced.
For example, mold toxin aflatoxin, which is known to be highly carcinogenic, is mutagenic by being activated by a first-phase reaction. The carcinogenicity of benzopyrene is also activated by phase 1 drug metabolism. Since the activated toxic substance is detoxified by the second phase drug metabolism, the enhancement of the second phase drug metabolism is important for preventing carcinogenesis. Dioxins are also activated by the first phase to become mutagens, and the resulting mutagen is also detoxified by the second phase.
[0032]
Acetaminophen, which is well known as an antipyretic analgesic, may cause acute poisoning when consumed in large quantities or depending on the physical condition. The antipyretic analgesic effect of acetaminophen is an action of acetaminophen itself, and the toxicity of acetaminophen itself is considerably low. Toxicity associated with hepatic dysfunction due to acetaminophen is actually caused by acetaminophen becoming a toxic substance by phase 1 metabolism. The poison produced at this time is also detoxified by the second phase.
[0033]
Activation or expression level of phase II drug metabolizing enzymes such as quinone reductase enhances the detoxification of not only mutagenic substances but also other cytotoxic compounds and chemicals that induce diseases. The increase in is very important.
[0034]
In the treatment of cancer, bioreducible antitumor agents are regarded as important as a new class of anticancer agents. Examples thereof include mitomycin C, EO9, profilomycin, diaziquan, etc., which are activated by being reduced by one or two electrons and exhibit an effect. Quinone reductase can increase the effects of these bioreducible antitumor agents. For example, it has been reported that 1,2-dithiol-3-thione, a compound having an action of inducing quinone reductase, increases the antitumor activity of mitomycin C and EO9.
[0035]
The antitumor activity of EO9 is reduced and activated as described above, which is thought to be because the reduced semiquinone or hydroquinone of EO9 binds to tumor cell genes and exhibits antitumor activity. Yes. Reduction of EO9 can also be performed by cytochrome P450 reductase of phase 1 drug metabolism. However, when cytochrome P450 reductase acts, superoxide of active oxygen is produced from oxygen molecules. This superoxide causes new mutations and loses cell function. Since quinone reductase does not produce superoxide when EO9 is reduced and activated, toxicity due to superoxide can be reduced by increasing the amount of quinone reductase during treatment using EO9.
[0036]
The function of quinone reductase in enhancing the antioxidant activity in vivo will be described. Many antioxidant substances (antioxidants) exhibit an antioxidant action due to their action as hydrogen donors, but the substances (oxides) after hydrogen donation work as hydrogen acceptors and conversely oxidize. May act as a promoter (prooxidant). Quinone reductase also plays an active role in eliminating the prooxidant thus generated.
[0037]
Tocopherol (vitamin E), which is well known as an in vivo antioxidant, is known to have almost no side effects despite being a fat-soluble vitamin. It is thought that the function of vitamin E is to prevent lipid peroxidation in membrane lipids and lipoproteins due to its excellent hydrogen donating ability. When tocopherol acts as a hydrogen donor, it results in a tocopherol radical, which is rapidly reduced and regenerated by antioxidant molecules such as vitamin C and thiol compounds. However, if a large amount of tocopherol radicals cannot be treated (regeneration to tocopherol), side effects may occur even in tocopherols that were said to have no side effects. That is, the toxicity of semiquinone or quinone derived from tocopherol may occur. For example, it is known that if excessive tocopherol alone is given as a supplement to smokers, the risk of developing lung cancer increases. This is believed to be due to the quinone produced from tocopherol.
[0038]
The quinone reductase can reduce the quinone-like tocopherol quinone produced from tocopherol to return it to tocopherol hydroquinone. Tocopherol hydroquinone is conjugated and then excreted in urine. That is, quinone reductase can promote the metabolism of tocopherol quinone and reduce its toxicity when it causes side effects of tocopherol without impairing the antioxidant properties of tocopherol.
[0039]
Ubiquinone is an important electron carrier for respiratory chain electron transfer and oxidative phosphorylation in mitochondria, and is thought to contribute to membrane stability and antioxidants. Ubiquinone is abundant in the nucleus, mitochondria, microsomes, cytosole, etc., and is particularly abundant in mitochondria, and by tissue, it is abundant in the heart, liver, and kidney, which are rich in mitochondria. Ubiquinone functions as an electron carrier because it becomes a semiquinone radical by one-electron reduction, and further becomes a dihydroxy form by one-electron reduction, and these become electron acceptors or electron donors, respectively.
[0040]
The mitochondria are superoxide production sites, and produce superoxide with electron transfer. The most active oxygen generated in the body is superoxide leaking from the mitochondria. Ubiquinone is thought to eliminate superoxide on the mitochondrial membrane. Actually, dihydroxyubiquinone obtained by two-electron reduction of ubiquinone works to eliminate superoxide.
[0041]
Since quinone reductase can reduce ubiquinone two-electron to produce dihydroxyubiquinone, when quinone reductase is induced, the action of preventing leakage of superoxide from mitochondria by ubiquinone becomes strong. That is, by inducing quinone reductase, leakage of active oxygen from mitochondria is prevented and active oxygen poisoning is reduced.
[0042]
Vitamin K has a quinone structure such as phylloquinone (vitamin K1) and menaquinone (vitamin K2), but its essence is a redox reaction. Dietary vitamin K (quinone form) is reduced in vivo to hydroquinone, which acts as a cofactor when carboxylating various vitamin K-dependent proteins. At this time, vitamin K hydroquinone becomes vitamin K epoxide, and vitamin K epoxide is regenerated into vitamin K and further vitamin K hydroquinone.
[0043]
Quinone reductase is an enzyme involved in activation and regeneration from vitamin K to hydroquinone, and is necessary for normal functioning of vitamin K, and also has an effect of preventing vitamin K deficiency because it is involved in regeneration. is there. Vitamin K deficiency may occur upon administration of antibiotics, but the quinone reductase of the present invention can also be used to prevent vitamin K deficiency by increasing quinone reductase activity during treatment with such drugs.
[0044]
New functions of polyphenols such as flavonoids have been reported one after another, as represented by wine polyphenols that have been highlighted in the French paradox, where red wine reduces the risk of developing coronary artery disease. By the way, these polyphenols have a common function as a hydrogen donor by their phenol structure, that is, an antioxidant property. However, when they function as a hydrogen donor, they themselves become oxidants and become hydrogen acceptors. Become. Many scholars are already concerned that the hydrogen acceptors such as quinone, which are generated in this way, may promote oxidation or damage the living body.
[0045]
Quinone reductase reduces the toxicity of hydrogen acceptors such as quinone derived from polyphenols such as flavonoids and contributes to the expression of various functions of these flavonoids. Therefore, inducing the expression of quinone reductase leads to enhancement of the function and action of quinone reductase in the living body, and is useful as a preventive or therapeutic agent for all diseases caused by deficiency of quinone reductase.
[0046]
While many of functional materials having an antioxidative action have a radical scavenging activity and expect the functionality comprising the radical scavenging ability, that is, the antioxidant activity, the quinone reductase inducer of the present invention Is different from other quinone reductase inducers in that it strongly induces the expression of quinone reductase by indirubin having no radical scavenging activity and, as a result, enhances the in vivo antioxidant action.
[0047]
Specific uses of the quinone reductase inducer of the present invention include therapeutic agents for various diseases caused by deficiency of quinone reductase, preventive agents for recurrence after treatment, preventive agents for complications during treatment, and treatment. Other pharmaceutical effect enhancers, antidotes, disease preventives, health enhancers and the like.
More specifically, prevention of liver diseases such as hepatitis, therapeutic agents, prevention of complications resulting from liver diseases, therapeutic agents, antidote agents, liver function enhancers, phase II drug metabolism enhancers, anti-biological agents Examples thereof include an oxidative function enhancer, an antitumor agent activity enhancer, a carcinogenesis preventive agent, a carcinogenic chemical substance deactivator, and a food and drink containing them.
[0048]
The dosage form of the quinone reductase inducer of the present invention facilitates its ingestion or administration. For example, in the case of a pharmaceutical form, an extract, an elixir, a granule, a pill, an ointment, a suspension, an emulsion, It can be used in the form of plasters, suppositories, powders, tinctures, tablets, syrups, soaking agents, decoction, injections, nasal drops, nasal sprays, inhalants for external airways and the like.
[0049]
In the form of food, it can be used as a form of a health food with recognized forms of capsules and tablets from ordinary foods to processed foods, cooked foods, semi-cooked foods.
[0050]
When the quinone reductase inducer of the present invention is used in the form of pharmaceuticals and foods as described above, it can be easily processed and ingested, for example, oily base, aqueous base, flavoring agent, coloring agent, wet Additives such as additives, emulsifiers, gelling agents, thickeners, antioxidants, preservatives, excipients, and food materials, including food materials such as vegetables, cereals, livestock meat, and seafood It may be a form to do. In addition, the quinone reductase inducer of the present invention can be blended in feeds and feed additives for domestic animals, poultry, fish and other domestic animals, as well as pharmaceuticals and foods that are administered or ingested to humans.
When the quinone reductase inducer of the present invention is orally administered as a medicine, the dosage is 0.01 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 200 mg per day for an adult (50 Kg), and once or twice a day. It can be administered in 4 divided doses. Moreover, when adding in foodstuffs, it can be used in the quantity which a daily intake becomes 1/10 to 2 times the daily dosage as a pharmaceutical.
[0051]
【Example】
Next, the function of the quinone reductase inducer of the present invention will be described with reference to experimental examples and examples, but is not limited thereto.
[0052]
Experimental Example 1 Preparation of indirubin from indigo plants
20g dry eye leaf (obtained from Ryu Fukuda Co., Ltd.) cultivated in Tokushima Prefecture was extracted by heating for 3 hours with 300ml of ethanol, and the resulting extract was concentrated with an evaporator to remove the solvent and extract. I got a thing. The obtained extract was dissolved in a small amount of ethyl acetate and subjected to silica gel column chromatography. Silica gel column chromatography was eluted with hexane / ethyl acetate (3: 2, v / v) to fractionate the red dye fraction. The fraction was concentrated to dryness, dissolved in ethyl acetate, and allowed to stand at room temperature to obtain crystals. The obtained crystals were re-dissolved in ethyl acetate and recrystallized, and washed with a small amount of methanol and then with a small amount of acetonitrile. By the above operation, 4.5 mg of purple needle crystals were obtained. Subsequent instrumental analysis identified the crystal as indirubin.
[0053]
Experimental Example 2 Identification of indirubin
The compound obtained in Experimental Example 1 was identified using various instrumental analysis.
[0054]
Mass spectrum
About the compound obtained in Experimental Example 1, when the mass spectrum by the electron impact ionization method was measured at an ionization voltage of 70 eV, m / z 262 (M +, 100%), 234 (50%), 205 (23%), Peaks were observed at 131 (10%) and 103 (10%).
[0055]
Nuclear magnetic resonance spectrum
The compound obtained in Experimental Example 1 was dissolved in deuterated dimethyl sulfoxide, and 1H-nuclear magnetic resonance spectrum and 13C-nuclear magnetic resonance spectrum were measured. [Table 1] and [Table 2] show chemical shifts of signals and assignments of hydrogen atoms and carbon atoms observed by each nuclear magnetic resonance spectrum.
[0056]
[Table 1]

[0057]
[Table 2]

[0058]
Infrared absorption spectrum
The infrared absorption spectrum of the compound obtained in Experimental Example 1 was measured by the potassium bromide tablet method. The results are shown in FIG. The obtained infrared absorption spectrum coincided with the infrared absorption spectrum of the chemically synthesized indirubin obtained in Experimental Example 3 described later.
[0059]
Based on the above experimental results, the compound obtained in Experimental Example 1 is 3- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indoindole-2-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indole- 2-one (commonly known as indirubin, molecular formula C₁₆H₁₀N₂O₂CAS-No. 479-41-4).
[0060]
Experimental Example 3 Synthesis of indirubin
500 mg of indoxyl acetate was dissolved in 20 ml of methanol, 425 mg of isatin and 636 mg of sodium carbonate were added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. This was left overnight at room temperature, and then the precipitate obtained by suction filtration was washed with methanol and then with water. The filtrate upon suction filtration was partitioned between ethyl acetate and water. The ethyl acetate layer was concentrated to dryness and the precipitate obtained earlier was combined and dissolved in a small amount of dimethylformamide by heating. After cooling this, crystals were deposited by adding a small amount of water. The obtained crystals were dissolved again in dimethylformamide and recrystallized, and as a result, 668 mg of indirubin crystals were obtained.
[0061]
Example 1 Quinone reductase inducing action by indirubin (in vitro)
Using mouse liver-derived cell line hepa-1c1c7, the amount of quinone reductase induced in cells by indirubin treatment was measured. The quinone reductase activity measurement principle is that menadione is converted to hydroquinone by quinone reductase, and this hydroquinone is converted to MTT reagent [3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]. This is because the formazone produced by reduction develops color. The operation method is shown below.
[0062]
1 × 10 hepa-1c1c7 cells dispersed in α-modified Eagle's medium (α-MEM) containing 5% of fetal calf serum treated with activated carbon⁴The cells were seeded in 96-well culture plates and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After culturing, the medium was removed from the plate, and indirubin was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) in advance and replaced with α-MEM medium supplemented with indirubin so that the DMSO concentration was 1%, followed by further culturing for 24 hours. The above operation was performed by preparing two plates.
[0063]
After culturing, the medium was removed from one plate, washed twice with PBS, and 50 μl of 0.8% digitonin solution was placed in each well and stirred for 20 minutes to lyse the cells. 200 μl of the reaction solution was added thereto and reacted for 5 to 10 minutes, and then the reaction was stopped by adding a 0.3 mM dicoumarol solution. The composition of this reaction solution was 25 mM Tris-HCl (pH 7.4); 0.7% bovine serum albumin; 0.01% Tween 20; 5 μM FAD; 1 mM glucose 6 phosphate; 30 μM NADP; 2 units / ml glucose 6 phosphorus Acid dehydrogenase; 0.3 mg / ml MTT; 50 μM menadione.
After stopping the reaction, “measured value A” was measured immediately with a microplate reader at a measurement wavelength of 630 nm and a reference wavelength of 700 nm. This value correlates with quinone reductase activity per well.
[0064]
Next, the medium is removed from the other plate, 100 μl of 2% ethanol solution containing 0.2% crystal violet is added and left for 10 minutes, and the whole plate is immersed in tap water several times for washing. 200 μl of 50% ethanol solution containing 5% sodium dodecyl sulfate was added in portions and left for 1 hour to solubilize the dye remaining in the wells. This plate was measured with a microplate reader at a measurement wavelength of 550 nm and a reference wavelength of 700 nm. This value correlates with the number of cells on the well.
[0065]
From the values obtained by the above operations, the activity per cell is obtained by the following calculation formula 1, and the quinone reductase-inducing specific activity of the added group is set to 1 as the value of the group to which only DMSO not containing indirubin is added (control group). Calculated.
Formula 1
(Measured value A of the additive group ÷ Measured value B of the added group) ÷ (Measured value A of the control group ÷ Measured value B of the control group) = specific activity
[0066]
The obtained results are shown in FIG. The result of the measurement value B correlating with the specific activity and the number of cells determined by the calculation formula 1 is shown in the figure.
As shown in FIG. 2, indirubin induced quinone reductase on hepa-1c1c7 cells in a dose-dependent manner. In the concentration range used in this test, no change was observed in the value of OD (absorbance) 550-700 nm, and no cytotoxicity was observed. The above results revealed that indirubin is an excellent quinone reductase inducer.
[0067]
Example 2 Protective effect of indirubin against acetaminophen-induced injury
The protective effect of indirubin on the damage induced by a high dose of acetaminophen was proved by experiments using mice as shown below.
[0068]
Sixteen-week-old female BALB / c mice (control group; N-acetyl-L-cysteine “abbreviated as NAC” 200 mg / kg administration group; indirubin 50 mg / kg administration group; 200 mg / kg administration group; In the 800 mg / kg administration group, 4-6 animals per group) were fasted for 24 hours, 0.5% methylcellulose was added to the control group, and NAC was added to the positive control group (NAC administration group). An aqueous solution in which 5% methylcellulose was dissolved was orally administered to the test group (indirubin administration group), an aqueous solution in which indirubin was dissolved in 0.5% methylcellulose, respectively. One hour later, acetaminophen dissolved in physiological saline was orally administered to a dose of 150 mg / kg to induce liver damage. Blood was collected 24 hours after administration of acetaminophen, centrifuged to prepare plasma, and the activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) in the plasma were summed, respectively. Measurement was performed with Hitachi automatic analyzer 7070 using “GOT-UV Test Wako”, “GPT-UV Test Wako”, and “L Type Wako LDH” manufactured by Kojun Pure Chemical Industries.
The results are shown in [Table 3].
[0069]
[Table 3]

[0070]
As is apparent from [Table 3], the indirubin administration group markedly suppressed the increase in plasma AST, ALT, and LDH activities compared to the control group, and the effect was dose-dependent.
[0071]
Acetaminophen is known as an antipyretic analgesic and is used as a cold medicine. The side effects of taking regular doses are extremely rare, but it is known that excessive intake may cause liver dysfunction, kidney damage, consciousness disorder, and the like. Acetaminophen is inactivated by glutathione conjugation after being converted to N-acetyl-p-quinominene by cytochrome P450 in the liver, but when a large amount of acetaminophen is taken, glutathione is depleted. N-acetyl-p-quinominene damages the liver, and N-acetyl-p-quinolinen leaked from the liver damages other organs such as the kidney. Therefore, administration of excess acetaminophen to an experimental animal in this way can induce liver damage relatively easily, and is widely used as a biochemical research tool for liver dysfunction.
[0072]
AST is an enzyme that catalyzes the transfer reaction of an amino group during amino acid synthesis. It is a deviating enzyme that is contained in almost all cells and leaks when cells are damaged. Myocardium, liver, skeletal muscle, kidney Many are included. Therefore, AST is used as an indicator of the degree of liver disease, heart disease, skeletal muscle disease, and clinical course. ALT is a transaminase necessary for amino acid synthesis, similar to AST, and is a deviating enzyme that leaks out when cells are damaged. It has higher specificity than AST, and is especially contained in the liver. The amount is overwhelmingly large, followed by a large amount in the kidney. For this reason, ALT is used as an indicator of liver disease. LDH is a deviating enzyme that leaks when cells are damaged, but since it is contained in all organs, it is difficult to identify which tissue is damaged by the increase in LDH in the blood. . Although LDH isozyme analysis is required for predicting the damage site by LDH, LDH is widely used as an indicator of in vivo diseases when used in combination with AST, ALT, and the like.
[0073]
It has been clarified that indirubin significantly suppresses ALT deviation caused by acetaminophen overdose and suppresses liver damage. Moreover, since the deviation of AST and LDH is remarkably suppressed, it is considered that indirubin induces in vivo quinone reductase expression and suppresses not only liver damage but also damage to other organs.
[0074]
【The invention's effect】
The quinone reductase-inducing agent comprising indilpine of the present invention induces the expression of quinone reductase in animal organisms including humans and exerts various physiological functions, for example, prevention of liver diseases and other diseases caused thereby, It is useful as a therapeutic agent, and can be used in a wide variety of applications not only for humans but also for livestock, poultry, seafood and the like in the pharmaceutical field, cosmetic field, and food field.
The present invention having such remarkable effects is a meaningful invention that contributes to the medical and welfare fields and contributes to the improvement of people's healthy lives.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 3- (1,3-dihydro-3-oxo-2H-indoindole-2-ylidene) -1,3-dihydro-2H-indole-2-one, ([Chemical Formula 1], commonly known as indirubin ) Infrared absorption spectrum.
FIG. 2: Quinone reductase induction activity by indirubin.

Claims (6)

A quinone reductase inducer comprising indirubin. The quinone reductase inducer according to claim 1, which is a preventive or therapeutic agent for liver disease. The quinone reductase inducer according to claim 1, which is a preventive or therapeutic agent for complications due to liver disease. The quinone reductase inducer according to claim 1, which is an antidote. The quinone reductase inducer according to claim 1, which is a liver function enhancer. The quinone reductase inducer according to claim 1, which is a phase II drug metabolic function enhancer.

Images