JP4228095B2 - Immunoassay method and immunoassay reagent - Google Patents
Immunoassay method and immunoassay reagent Download PDFInfo
- Publication number
- JP4228095B2 JP4228095B2 JP35939099A JP35939099A JP4228095B2 JP 4228095 B2 JP4228095 B2 JP 4228095B2 JP 35939099 A JP35939099 A JP 35939099A JP 35939099 A JP35939099 A JP 35939099A JP 4228095 B2 JP4228095 B2 JP 4228095B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- hapten
- water
- immune complex
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は低分子物質であるハプテンを免疫学的に測定する方法に関するものであり、抗ハプテン抗体を水不溶性担体に直接結合せず、抗体等を介して間接的に結合し又は結合することにより、標識抗免疫複合体抗体の担体への非特異的な結合を減少させて非特異的なシグナルを低減し、シグナル／ノイズ比（ハプテンに依存したシグナルとハプテンが非存在の場合に観察されるノイズシグナルの比）を向上したハプテン測定を行うための免疫測定方法等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
低分子物質であるハプテンは、通常、競合法とよばれる免疫測定方法にて測定されている。競合法では、抗ハプテン抗体に対し、試料中のハプテンと酵素、化学発光物質或いは放射性同位元素で標識したハプテン（標識ハプテン）を競争的に結合させた後、結合した標識ハプテンの割合から前記試料中のハプテンの存在及び／又は存在量（濃度）を推定する。
【０００３】
競合法では、抗ハプテン抗体の性質が測定結果に大きく影響を与える。例えば、抗ハプテン抗体が試料中に存在するハプテン類似物等と交差反応すると、正確なハプテンの測定は不可能である。このため、前記ハプテン類似体との交差反応性の低い抗ハプテン抗体の取得が必須となるが、このような抗体を取得するのは困難である。
【０００４】
上記のような競合法による免疫測定における課題を解決し得る測定方法として、抗免疫複合体を用いたハプテンの疑似サンドイッチ免疫測定方法が提案されている（例えば特公平６−１０２０３７号公報、特許第２７９３５８７号参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記ハプテンの擬似サンドイッチ免疫測定方法は、抗ハプテン抗体とハプテンとの免疫複合体に対する対する抗体（抗免疫複合体抗体）を用いることにより達成されるものである。この測定では、水不溶性担体に結合した抗ハプテン抗体とハプテンとの間で免疫複合体を形成させ、形成された免疫複合体を免疫複合体に対する標識した抗体（標識抗免疫複合体抗体）と反応させることにより担体上に標識を固定することからなる。
【０００６】
上記のように抗免疫複合体抗体を用いることでハプテンの疑似サンドイッチ免疫測定が可能となるが、しかし、抗免疫複合体抗体は遊離の（免疫複合体を形成していない）抗ハプテン抗体との反応性を有しているため、なおも改善されるべき課題がある。
【０００７】
すなわち、抗免疫複合体抗体とはいうものの、該抗体は遊離のハプテンや遊離の抗ハプテン抗体との反応性を有していないわけではなく、遊離のハプテンや遊離の抗ハプテン抗体との結合と比較した場合、免疫複合体との結合が極めて大きいというものである。このため特に、抗ハプテン抗体の担体への結合に際して何らかの理由によりハプテンとの結合能を失ってしまった場合には、ハプテンとは結合していないにもかかわらずに標識抗免疫複合体抗体と結合してノイズ、すなわちハプテンの存在に依存しないシグナルの原因となる。また、担体に結合した抗ハプテン抗体の量が試料中のハプテン量と比較して大過剰であると、余剰の抗ハプテン抗体が標識抗免疫複合体抗体と結合してしまい、結果的には前記同様にハプテンの存在に依存しないシグナルの原因となってしまうのである。
【０００８】
そこで本発明は上記に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗免疫複合体抗体を用いるハプテンの疑似サンドイッチ免疫測定方法において、抗ハプテン抗体をハプテンと反応可能な状態で担体上に結合することで前記ノイズシグナルの低減を図ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、ハプテンの免疫測定方法に係り、ハプテンを、水不溶性担体に間接的に結合した抗ハプテン抗体及びハプテンと抗ハプテン抗体との免疫複合体に対する標識した抗体（標識抗免疫複合体抗体）を用いて測定することを特徴とする。
【００１０】
本願請求項２の発明は、前記請求項１の発明に係り、前記ハプテンがステロイドホルモン又は薬物であることを特徴とする。
【００１１】
本願請求項３の発明は、前記請求項２の発明に係り、前記ハプテンがエストラジオールであることを特徴とする。
【００１２】
本願請求項４の発明は、前記請求項１の発明に係り、前記抗ハプテン抗体が親和結合を形成する一対の物質の一方と結合し、前記水不溶性担体は前記一対の物質の他方と結合し、当該一対の物質の結合により抗ハプテン抗体は水不溶性担体に間接的に結合したことを特徴とする。
【００１３】
本願請求項５の発明は、前記請求項４の発明に係り、前記抗ハプテン抗体と結合される親和結合を形成する一対の物質の一方がフルオレセイン、ビオチン又はペプチドであることを特徴とする。
【００１４】
本願請求項６の発明は、前記請求項１の発明に係り、前記水不溶性担体には前記抗ハプテン抗体中のハプテンとの結合に関与しない部分と特異的に結合する物質が結合し、該物質の抗ハプテン抗体との結合により抗ハプテン抗体は水不溶性担体に間接的に結合したことを特徴とする。
【００１５】
本願請求項７の発明は、前記抗ハプテン抗体中のハプテンとの結合に関与しない部分に特異的に結合する物質がプロテインＡ又は抗体であることを特徴とする。
【００１６】
本願請求項８の発明はハプテンを測定するための試薬であって、水不溶性担体に間接的に結合した又は結合する抗ハプテン抗体及びハプテンと抗ハプテン抗体との免疫複合体に対する標識した抗体（標識抗免疫複合体抗体）を含むことを特徴とする。
【００１７】
そして本願請求項９の発明は、前記請求項８の発明に係り、エストラジオールを測定するための試薬であって、水不溶性担体に間接的に結合した又は結合する抗エストラジオール抗体及びエストラジオールと抗エストラジオール抗体との免疫複合体に対する標識した抗体（標識抗免疫複合体抗体）を含むこと、更にはエストロン又はエストリオールとの交差反応性が１％以下であることを特徴とする。
【００１８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、（１）親和結合を形成する一対の物質、又は、（２）抗ハプテン抗体中のハプテンとの結合に関与しない部分と特異的に結合する物質、のいずれかを用いることにより、抗ハプテン抗体を水不溶性担体に間接的に結合し又は結合することを特徴とする。
【００２０】
水不溶性担体は、従来の免疫学的測定方法で使用されている多種多様の担体のうち、前記（１）の一方又は（２）の物質を直接結合し得る表面を提供し得れば特に制限なく使用できる。例えばスチレンやラテックス等の熱可塑性樹脂で製造された、ポリマー粒子又は板状の担体や、時には９６穴マイクロタイタープレートや試験管等に代表される適当容量の反応容器の内壁自体を本願発明における水不溶性担体とすることもできる。また本願発明では、それ自体は前記物質を直接結合し得ない材料から製造された担体であっても、その表面を例えば適当な樹脂等でコーティングすることにより直接結合し得るように変換し得れば特に制限はない。また水不溶性担体は、例えばその内部に鉄やフェライト等の磁性物質を担持させ、外部から磁力を作用させることによって試料との混合を効率的に実施し得るようにすることもできる。
【００２１】
水不溶性担体の大きさや形状には制限がなく、例えば粒子径が直径数百μｍ程度の比較的小さいものから、粒子径が直径１ｃｍ程度の比較的大きなものまで、任意に選択することができる。形状についても、前記した板状のものや粒子（球）状のもの、容器の内壁状のもの以外にも、楕円、錐状等、任意に選択することができる。
【００２２】
水不溶性担体は、懸濁可能なものであっても懸濁不能なものであっても特に制限はなく、本願発明の免疫測定方法をいわゆる１ステップ方式で行うか２ステップ方式で行うか、等を考慮して適宜決定すれば良い。
【００２３】
本願発明において測定対象とされるハプテンは、例えばテストステロン、エストラジオール、エストリオール、コルチゾール等のステロイドホルモンや、例えばジゴキシン等の薬物等に代表される低分子物質であって、マウス等の哺乳動物に投入することによってそれに対する抗体を誘導し得る物質である。
【００２４】
本願発明において前記担体に間接的に結合し又は結合する抗ハプテン抗体は、前記ハプテンを免疫原として得られるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかであるが、ハプテンとの反応性の均一さや均一な抗体の継続的製造が容易であることからモノクローナル抗体が特に好ましい。このような、モノクローナル抗体を含む抗ハプテン抗体の製造は従来既知の方法に従うことができる。ポリクローナル抗体を使用する場合には、事前に精製操作を行っておくことが好ましい。なお本願方法に関する開示において、抗ハプテン抗体が担体と「結合した」とは、抗体ハプテン抗体が担体に間接的に結合した状態でハプテン等との免疫反応が生じる場合はもちろん、抗ハプテン抗体が当初は遊離の状態で存在し、免疫反応の過程で担体に間接的に結合するか場合をも包合する意味である。
【００２５】
水不溶性担体と抗ハプテン抗体との間接的結合は、以下（ａ）又は（ｂ）のようにして達成される；
（ａ）親和結合を形成する一対の物質の一方を抗ハプテン抗体と結合しておき、該一対の物質の他方を水不溶性担体に結合しておく、
（ｂ）抗ハプテン抗体中のハプテンとの結合に関与しない部分と特異的に結合する物質を水不溶性担体に結合しておく。
【００２６】
上記（ａ）の一対の物質としては、例えばアジビンとビオチン、フルオレセインと抗フルオレセイン抗体、ルミノールと抗ルミノール抗体、ペプチドと該ペプチドのレセプター、ペプチドと該ペプチドに対する抗体、そして相補的な２本の核酸等を例示できる。これら一対の物質の一方を抗ハプテン抗体と結合し、他方を担体と結合することにより、最終的には抗ハプテン抗体を該一対の物質を介して担体と間接的に結合した状態とすることができる。抗ハプテン抗体と一対の物質の一方との結合は、例えば抗体中のアミノ基等を利用して化学的に結合すれば良い。また担体と一対の物質の他方との結合も、担体表面の適当な官能基を利用して化学的に結合すれば良い。
【００２７】
上記（ｂ）の物質としては、例えば抗体やプロテインＡ、プロテインＧを例示できる。より具体的には、例えば抗ハプテン抗体がマウスＩｇＧであれば水不溶性担体に抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ領域特異的抗体を結合しておくことが例示できる。これら物質を担体に結合しておくことにより、最終的には抗ハプテン抗体を該物質を介して担体と間接的に結合した状態とすることができる。担体と物質との結合は、例えば物理的な吸着や前記（ａ）の場合と同様の化学的な結合等を利用すれば良い。
【００２８】
本願発明には、標識抗免疫複合体抗体と抗ハプテン抗体とがハプテン存在・非存在にかかわりなく結合してしまい、結果的にハプテンに依存しないシグナル（ノイズ）が発生し、測定感度が低下することを防止するという効果があるが、標識抗免疫複合体抗体が（抗ハプテン抗体と結合することなく）単に水不溶性担体に吸着等してしまうのを防止するうえで、担体には、前記一対の物質の一方等を結合した後に通常のブロッキング処理を施しておくことが好ましい。このブロッキング処理は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等、検出しようとするハプテンと特異的に結合しない蛋白質等の溶液を用い、この溶液に担体を一定時間浸漬する等して実施できる。
【００２９】
本願発明で使用する抗免疫複合体抗体は、例えば特公平６−１０２０３７号公報や特許第２７９３５８７号の開示に基づき、免疫原としてハプテンと抗ハプテン抗体との免疫複合体を用いることで製造できる。抗免疫複合体抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良いが、均一性が高く、かつ、いったんハイブリドーマを確立した後は同一の抗体を継続的に製造し得ることからモノクローナル抗体であることが好ましい。標識は、酵素、化学発光物質、蛍光物質、放射性同位元素などの通常の免疫測定で使用されるものであれば良く、特に制限はない。ここで標識は、抗免疫複合体抗体と化学的に結合しても良いし、例えば抗免疫複合体抗体と特異的に結合する抗体と結合しておき、該抗体と抗免疫複合体抗体とを反応させることによって間接的に結合させても良い。後者の場合、以下に説明する本願発明の具体的な操作において、Ｂ／Ｆ分離を行って遊離の抗免疫複合体抗体を分離した後、分離された抗免疫複合体抗体又は水不溶性担体上に形成された免疫複合体中の抗免疫複合体抗体に標識を間接結合し、標識の測定を行うことも可能である。
【００３０】
以下、本願発明の測定方法について具体的な操作例を説明する。なお説明では、抗ハプテン抗体が免疫反応の過程で水不溶性担体と間接的に結合する例を示すが、これは、前記したように免疫反応に供する以前に担体と混合して間接的に結合しておいても良い。
【００３１】
まず親和結合を形成する一対の物質の一方を抗ハプテン抗体と化学的に結合させる。また前記一対の物質の他方を水不溶性担体と化学的に結合させた後、ブロッキング処理を行う。次に、水不溶性担体及び抗ハプテン抗体を、測定対象であるハプテンを含有すると思われる試料及び標識抗免疫複合体抗体と混合し、免疫反応を生じさせると共に水不溶性担体と抗ハプテン抗体を間接的に結合させ、担体上に抗ハプテン抗体・ハプテン・標識抗免疫複合体抗体からなる免疫複合体を形成させる。これら各成分の混合は、試料の不存在下で抗ハプテン抗体と標識抗免疫複合体抗体が接触しないようにすることが好ましく、このためには前記以外に、（ｉ）まず水不溶性担体、抗ハプテン抗体及び試料を混合し、次いでこの混合物に標識抗免疫複合体抗体を混合する、（ｉｉ）まず抗ハプテン抗体及び試料を混合し、次いでこの混合物に水不溶性担体と標識抗免疫複合体抗体を混合する、等することが例示できる。
【００３２】
測定に供する試料は、測定対象であるハプテンの含有が疑われるものであれば制限はなく、血清等の生体液を例示できるが、この生体液はヒト由来のものに制限されず、例えばヒト以外の動物に由来する生体液であっても良い。
【００３３】
上記免疫反応は、例えば室温下で２〜３時間放置することで充分に生じさせることができるが、放置時間は主として測定しようとするハプテンと抗ハプテン抗体間の親和力、及び、ハプテンと抗ハプテン抗体からなる免疫複合体と標識抗免疫複合体抗体間の親和力により変動し、一般的に該親和力が高いほど短い時間とすることができる。また水不溶性担体を攪拌するなどして混合液を攪拌できれば、免疫反応を促進することによりより短時間化することもできる。
【００３４】
免疫反応に充分な時間放置した混合液について、いわゆるＢ／Ｆ分離を行う。ここで免疫反応に充分な時間とは、必ずしも免疫反応が平衡状態に達するのに要する時間をいうわけではなく、免疫反応が平衡状態に達してなくとも、反応の結果形成される免疫複合体の量に再現性があれば良い。Ｂ／Ｆ分離は、詳しくは混合液中に遊離状態で存在する標識抗免疫複合体抗体を、水不溶性担体上に形成された免疫複合体から分離する操作である。この操作は、混合液のうちの液相成分、即ち水不溶性担体以外の成分を吸引除去することで容易に実施できる。これ以外にも、例えば遠心分離操作を行って上清を除去したり、フィルターを使用して通過成分を除去したりする操作によってもＢ／Ｆ分離は実施し得る。前者は、水不溶性担体として水に非懸濁性のものを使用した場合に容易に実施可能であり、後者は懸濁性・非懸濁性のいずれの水不溶性担体を使用した場合にも実施可能である。また更には、水不溶性担体に磁性物質を担持しておき、磁石を利用して水不溶性担体を混合液から分離したり、磁石によって水不溶性担体を容器の底部に固定しつつ上清をデカンテーションすることも例示できる。
【００３５】
Ｂ／Ｆ分離操作後には、分離された標識抗免疫複合体抗体又は水不溶性担体上に形成された免疫複合体中の標識抗免疫複合体抗体のいずれかについて、その標識を測定する。標識が酵素であれば酵素基質を添加して基質分解物の増加速度を測定等すれば良いし、標識が蛍光物質であれば蛍光測定を行えば良い。そしてこの測定結果を、既知量（既知濃度）の測定しようとするハプテンを含有する標準液について同一条件下で同一操作を行った結果に基づいて作成される標準曲線と比較等することにより、試料中に測定対象としたハプテンが存在しているか、更にはその存在量を知ることができる。
【００３６】
以上の説明は、いわゆるＢ／Ｆ分離操作を１度行う１ステップ法として本願発明を実施した例であるが、本願発明はＢ／Ｆ分離を２回行ういわゆる２ステップ法として実施することも可能である。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を更に詳細に説明するために発明の実施形態である実施例を記載するが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１ 抗免疫複合体抗体の調製
エストラジオール（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ８８７５）とマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体とを予め免疫反応させて結合させた免疫複合体を抗原とし、フロイント・アジュバンドと共にＢａｌｂ／ｃマウスに免役した。最初の免疫から１５日、３５日、９７日後に追加免疫を行い、最終免疫を行った３日後に常法に従ってモノクローナル抗体産生能を有するハイブリドーマを樹立した。
【００３９】
樹立したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について結合試験を行い、前記マウス抗エストラジオール抗体に対してエストラジオール存在下で反応性を示し、エストラジオール非存在下で反応性を示さないクローンを選択した。選択されたクローンが産生する抗免疫複合体抗体は、プロテインＡ固定化担体で精製後Ｆａｂ化し、ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）を用いてアルカリ性フォスファターゼと結合して標識抗免疫複合体抗体とした。
【００４０】
実施例２
水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）に抗フルオレセインモノクローナル抗体を１００ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させ、ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。一方、実施例１で使用したマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体を６−（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒと混合してフルオレセインと結合させた。なお前記水不溶性担体については、１個当たり約１００ｎｇの蛋白質を物理的に吸着可能であることを事前に確認した。
【００４１】
磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、各７５、１５０、３００ｎｇのフルオレセイン結合マウス抗エストラジオールモノクローナル抗体と１５０ｎｇの標識抗免疫複合体抗体含有液（５％水溶性ゼラチン−トリス緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、凍結乾燥した。
【００４２】
上記のようにして調製した試薬に０ｎｇ／ｌのエストラジオールを含む血清（ゼロ濃度血清）又は１０００ｎｇ／ｌのエストラジオールを含む血清を１００μｌ加え、３７℃で１０分間、水不溶性担体を磁石を用いて運動させ、混合液を攪拌した状態で免疫反応させた。反応後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗免疫複合体抗体を分離・除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸を加え、該基質添加後２０秒から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。なお以上の操作は、市販の全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−２１）とその専用試薬を用いて実施した。
【００４３】
比較のため、各３００、６００、１２００ｎｇのマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体を前記と同一の担体１２個と混合し、担体に物理的に吸着させ、ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。この１２個の担体を前記と同一の容器に入れた後、１５０ｎｇの標識抗免疫複合体抗体含有液（５％水溶性ゼラチン−トリス緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、凍結乾燥した。
【００４４】
上記のようにして調製した比較試薬に０ｎｇ／ｌのエストラジオールを含む血清（ゼロ濃度血清）又は１０００ｎｇ／ｌのエストラジオールを含む血清を１００μｌ加え、前記同様にして４メチルウンベリフェロンの生成速度を測定した。
【００４５】
本願発明による測定結果を表１に、比較のための試薬を用いた測定結果を表２に、それぞれ示す。比較の結果を示す表２からは、水不溶性担体に結合したマウス抗エストラジオール抗体の量に比例して０ｎｇ／ｌ血清、１０００ｎｇ／ｌ血清とも測定値は上昇し、シグナル／ノイズ比は１２００ｎｇのマウス抗エストラジオール抗体を結合したときに最大（２８．１）となることが分かる。これに対して本願発明の結果を示す表１では、マウス抗エストラジオール抗体の結合量を低減しても、１０００ｎｇ／ｌ血清の測定結果が飛躍的に大きくなり、表２に示した結果と比較してシグナル／ノイズ比は７倍に向上したことが分かる。
【００４６】
【表１】
【表２】
実施例３
担体に間接的に結合させたマウス抗エストラジオール抗体の量を３００ｎｇとし、容器に加えた標識抗免疫複合体抗体量をそれぞれ７５、１５０又は３００ｎｇとした以外は実施例２における本願発明の試薬と同様の操作で試薬を製造し、同様の測定に供した。
【００４９】
比較のため、担体に吸着させたマウス抗エストラジオール抗体の量を１００ｎｇとし、容器に加えた標識抗免疫複合体抗体量をそれぞれ７５、１５０又は３００ｎｇとした以外は実施例２における比較のための試薬と同様の操作で試薬を製造し、同様の測定に供した。
【００５０】
本願発明による測定結果を表３に、比較のための試薬を用いた測定結果を表４に、それぞれ示す。比較の結果を示す表４からは、標識抗免疫複合体抗体量を増加するにしたがって０ｎｇ／ｌ血清及び１０００ｎｇ／ｌ血清の測定値は上昇したが、実施例２における比較のための試薬を用いた結果からみてシグナル／ノイズ比の大幅な改善は観察されず、約３０で一定であった。これに対して本願発明の結果を示す表３でも、標識抗免疫複合体抗体量を増加するにしたがって０ｎｇ／ｌ血清及び１０００ｎｇ／ｌ血清の測定値は上昇したが、シグナル／ノイズ比は平均値で２１７となり、比較用の試薬を用いた場合に比べて良好であった。
【００５１】
【表３】
【表４】
実施例４
担体に間接的に結合させたマウス抗エストラジオール抗体の量及び容器に加えた標識抗免疫複合体抗体量をそれぞれ２８５ｎｇとした以外は実施例２における本願発明の試薬と同様の操作で試薬を製造し、エストラジオール濃度が既知の血清６種類（濃度；０、２２、６２、９９、４９３、１０４０ｎｇ／ｌ）を同様の操作で３回ずつ（ゼロ濃度血清は１０回）測定した。結果を表５に示す。
【００５４】
測定結果を３次回帰させて図１に示す検量線を得た。ゼロ濃度血清測定値＋（２×標準偏差）を図１の検量線から求めた結果、最小検出感度（ＭＤＣ）は１．５ｎｇ／ｌであった。
【００５５】
【表５】
実施例５
実施例４で製造した本願発明の試薬を用いて、エストロン又はエストリオールを含む、エストラジオールゼロ濃度血清を前記同様の操作で測定した。結果を表６に示す。
【００５７】
表６からは、本願発明の免疫測定試薬のエストロン又はエストリオールとの交差反応性は１％以下であることが分かる。
【００５８】
【表６】
実施例６
市販の試薬（ＶＥＣＴＯＲ社製、商品名；ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を用いてマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体にビオチンを結合した。市販のプレート（ＮＵＮＫ社製、商品名；Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌ）にそれぞれエストラジオール濃度が０、５又は１０ｎｇ／ｌの血清５０μｌと前記のようにしてビオチンを結合したマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体溶液５０μｌ（７ｎｇ）を加え、３７℃にて１０分間免疫反応させた。反応後、実施例１で調製した標識抗免疫複合体抗体溶液５０μｌ（１０ｎｇ）を加えて３７℃で更に５分間反応させた。
【００６０】
反応後、ストレプトアビジンを結合した水不溶性担体（Ｄｙｎａｌ社製、商品名；Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｄｙｎａｂｅａｄｓ）を３０μｌ（担体重量で５０μｇ）加えて３７℃で５分間反応させ、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体を間接的に結合した。洗浄液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％（ｗ／ｗ）ＮａＮ３を含む、ｐＨ８．０の溶液）を用いてＢ／Ｆ分離操作後、市販の化学発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社製、商品名；ＣＳＰＤ Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ）を加え、検出装置（ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製、ＬＢ９６Ｖ）により基質を添加してから６分間の発光量をカウントした。
【００６１】
図２にエストラジオール量と発光量カウントの結果を示す。図２の結果から求めたＭＤＣは約１．１ｎｇ／ｌであった。
【００６２】
実施例７
エストラジオール濃度が０又は１０ｎｇ／ｌの血清５０μｌ、ビオチンを結合したマウス抗エストラジオールモノクローナル抗体溶液５０μｌ（７ｎｇ）及び標識抗免疫複合体抗体溶液５０μｌ（１０ｎｇ）を市販のプレート（ＮＵＮＫ社製、商品名；Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌ）に一度に加え、３７℃で５分間反応させた以外は実施例６と同様の操作を行って基質を添加してから６分間の発光量をカウントした。
【００６３】
図３にエストラジオール量と発光量カウントの結果を示す。図２の結果から求めたＭＤＣは約１．８ｎｇ／ｌであった。
【００６４】
【発明の効果】
本願発明では、抗ハプテン抗体を水不溶性担体に間接的に結合させることにより、抗ハプテン抗体をハプテンと反応可能な状態で担体上に結合することが可能となる。この結果、ハプテンの測定に有効な抗ハプテン抗体量を自由に制御可能となり、不要な抗ハプテン抗体の使用を抑制することができる。この結果、使用する試薬量を低減できるという効果以外に、標識抗免疫複合体抗体がハプテンと結合していない（過剰の）抗ハプテンと結合し、ノイズシグナルを発生することも抑制できる。
【００６５】
また抗ハプテン抗体をハプテンと反応可能な状態で担体上に結合することが可能な本願発明では、標識抗免疫複合体抗体がハプテンとは無関係に抗ハプテンと結合した結果生じるノイズシグナルを抑制することにつながり、最終的にはシグナル／ノイズ比の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例４の結果に基づいて作成した検量線である。
【図２】図２は、実施例６の結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例７の結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for immunologically measuring a hapten, which is a low molecular weight substance, and does not directly bind an anti-hapten antibody to a water-insoluble carrier, but indirectly binds or binds via an antibody or the like. Reduce the non-specific binding of the labeled anti-immunoconjugate antibody to the carrier to reduce the non-specific signal and the signal / noise ratio (observed in the absence of hapten-dependent signal and hapten) The present invention relates to an immunoassay method for performing hapten measurement with improved noise signal ratio.
[0002]
[Prior art]
A hapten, which is a low molecular weight substance, is usually measured by an immunoassay method called a competitive method. In the competitive method, a hapten in a sample and a hapten labeled with an enzyme, a chemiluminescent substance, or a radioisotope (labeled hapten) are competitively bound to an anti-hapten antibody, and then the sample is determined from the ratio of the bound labeled hapten. Estimate the presence and / or abundance (concentration) of the hapten in it.
[0003]
In the competitive method, the properties of the anti-hapten antibody greatly affect the measurement results. For example, when an anti-hapten antibody cross-reacts with a hapten analog or the like present in a sample, accurate hapten measurement is impossible. For this reason, it is essential to obtain an anti-hapten antibody having low cross-reactivity with the hapten analog, but it is difficult to obtain such an antibody.
[0004]
A hapten pseudo sandwich immunoassay method using an anti-immune complex has been proposed as a measurement method capable of solving the problems in immunoassay by the competitive method as described above (for example, Japanese Patent Publication No. 6-102037, Patent No. No. 2793587).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The hapten pseudo sandwich immunoassay method is achieved by using an antibody (anti-immune complex antibody) against an immune complex of an anti-hapten antibody and a hapten. In this measurement, an immune complex is formed between an anti-hapten antibody bound to a water-insoluble carrier and a hapten, and the formed immune complex is reacted with a labeled antibody against the immune complex (labeled anti-immune complex antibody). To fix the label on the carrier.
[0006]
By using an anti-immunoconjugate antibody as described above, a hapten pseudo-sandwich immunoassay can be performed. However, the anti-immunoconjugate antibody is free from a free (non-immunocomplex) anti-hapten antibody. Because of the reactivity, there are still issues to be improved.
[0007]
That is, although it is an anti-immunoconjugate antibody, the antibody does not necessarily have reactivity with a free hapten or a free anti-hapten antibody, and does not bind to a free hapten or a free anti-hapten antibody. When compared, the binding to the immune complex is extremely large. Therefore, in particular, when the binding ability of the anti-hapten antibody to the carrier has lost its ability to bind to the hapten for some reason, it binds to the labeled anti-immunocomplex antibody even though it is not bound to the hapten. And cause noise, a signal that does not depend on the presence of a hapten. In addition, if the amount of anti-hapten antibody bound to the carrier is excessively large compared to the amount of hapten in the sample, excess anti-hapten antibody binds to the labeled anti-immune complex antibody, resulting in the above-mentioned Similarly, it causes a signal that does not depend on the presence of the hapten.
[0008]
Accordingly, the present invention has been made in view of the above, and an object thereof is to bind an anti-hapten antibody on a carrier in a state capable of reacting with the hapten in a hapten pseudo sandwich immunoassay method using an anti-immune complex antibody. This is to reduce the noise signal.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The invention of claim 1 of the present invention made to achieve the above object relates to a hapten immunoassay method, an anti-hapten antibody in which a hapten is indirectly bound to a water-insoluble carrier, and an immunocomplex of the hapten and the anti-hapten antibody. Measured using a labeled antibody against the body (labeled anti-immune complex antibody).
[0010]
The invention of claim 2 of the present application relates to the invention of claim 1, wherein the hapten is a steroid hormone or a drug.
[0011]
A third aspect of the present invention relates to the second aspect of the present invention, wherein the hapten is estradiol.
[0012]
The invention of claim 4 relates to the invention of claim 1, wherein the anti-hapten antibody binds to one of a pair of substances forming an affinity bond, and the water-insoluble carrier binds to the other of the pair of substances. The anti-hapten antibody is indirectly bound to the water-insoluble carrier by binding of the pair of substances.
[0013]
The invention of
[0014]
The invention of claim 6 relates to the invention of claim 1, wherein a substance that specifically binds to a portion that does not participate in binding to the hapten in the anti-hapten antibody binds to the water-insoluble carrier, and the substance The anti-hapten antibody is indirectly bound to the water-insoluble carrier by binding to the anti-hapten antibody.
[0015]
The invention according to claim 7 is characterized in that the substance that specifically binds to a portion of the anti-hapten antibody that does not participate in binding with hapten is protein A or an antibody.
[0016]
The invention of claim 8 is a reagent for measuring a hapten, which is an anti-hapten antibody indirectly bound to or bound to a water-insoluble carrier and a labeled antibody against an immune complex of a hapten and an anti-hapten antibody (label) Anti-immune complex antibody).
[0017]
The invention of claim 9 relates to the invention of claim 8 and relates to the reagent for measuring estradiol, which is an anti-estradiol antibody indirectly bound to or bound to a water-insoluble carrier, and estradiol and an anti-estradiol antibody. And a cross-reactivity with estrone or estriol is 1% or less.
[0018]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0019]
The present invention uses either (1) a pair of substances that form an affinity bond, or (2) a substance that specifically binds to a portion that does not participate in binding to a hapten in an anti-hapten antibody, An anti-hapten antibody is indirectly bound or bound to a water-insoluble carrier.
[0020]
The water-insoluble carrier is particularly limited as long as it can provide a surface capable of directly binding one of the above-mentioned (1) or (2) among a wide variety of carriers used in conventional immunoassay methods. Can be used without For example, polymer particles or a plate-like carrier made of a thermoplastic resin such as styrene or latex, and sometimes an inner wall of a reaction vessel having an appropriate capacity represented by a 96-well microtiter plate or a test tube is used in the present invention. It can also be an insoluble carrier. Further, in the present invention, even a carrier itself made of a material that cannot directly bind the substance can be converted so that it can be directly bonded by coating the surface with an appropriate resin, for example. There are no particular restrictions. The water-insoluble carrier can also be made to be efficiently mixed with the sample by, for example, supporting a magnetic substance such as iron or ferrite in the inside and applying a magnetic force from the outside.
[0021]
The size and shape of the water-insoluble carrier are not limited, and can be arbitrarily selected, for example, from a relatively small particle diameter of about several hundred μm to a relatively large particle diameter of about 1 cm. The shape can be arbitrarily selected from an elliptical shape, a conical shape, and the like other than the above-described plate-like shape, particle (spherical) -like shape, and inner wall shape of the container.
[0022]
The water-insoluble carrier is not particularly limited, whether it is suspendable or non-suspendable. Whether the immunoassay method of the present invention is performed by a so-called one-step method or a two-step method, etc. May be determined as appropriate.
[0023]
The hapten to be measured in the present invention is a low-molecular substance typified by a steroid hormone such as testosterone, estradiol, estriol, cortisol, or a drug such as digoxin, and is introduced into a mammal such as a mouse. It is a substance that can induce antibodies against it.
[0024]
In the present invention, the anti-hapten antibody that indirectly binds to or binds to the carrier is either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody obtained using the hapten as an immunogen, and it has a uniform reactivity with the hapten and a uniform antibody. Monoclonal antibodies are particularly preferred because they can be easily produced continuously. Such a production of an anti-hapten antibody including a monoclonal antibody can follow a conventionally known method. When using a polyclonal antibody, it is preferable to carry out a purification operation in advance. In the disclosure relating to the method of the present application, the anti-hapten antibody is “bound” to the carrier, and of course, when the antibody hapten antibody is indirectly bound to the carrier and an immune reaction occurs with the hapten or the like, the anti-hapten antibody is initially Means in a free state and includes whether it binds indirectly to the carrier during the immune reaction.
[0025]
Indirect binding between the water-insoluble carrier and the anti-hapten antibody is achieved as follows (a) or (b);
(A) One of a pair of substances forming an affinity bond is bound to an anti-hapten antibody, and the other of the pair of substances is bound to a water-insoluble carrier.
(B) A substance that specifically binds to a portion that does not participate in binding to hapten in the anti-hapten antibody is bound to a water-insoluble carrier.
[0026]
Examples of the pair of substances (a) include adivine and biotin, fluorescein and anti-fluorescein antibody, luminol and anti-luminol antibody, peptide and receptor for the peptide, peptide and antibody against the peptide, and two complementary nucleic acids Etc. can be illustrated. By binding one of the pair of substances to the anti-hapten antibody and the other to the carrier, the anti-hapten antibody may eventually be indirectly bound to the carrier via the pair of substances. it can. The anti-hapten antibody and one of the pair of substances may be chemically bonded using, for example, an amino group in the antibody. The bond between the carrier and the other of the pair of substances may be chemically bonded using an appropriate functional group on the surface of the carrier.
[0027]
Examples of the substance (b) include antibodies, protein A, and protein G. More specifically, for example, when the anti-hapten antibody is mouse IgG, it can be exemplified that an anti-mouse IgG-Fc region-specific antibody is bound to a water-insoluble carrier. By binding these substances to a carrier, the anti-hapten antibody can finally be indirectly bound to the carrier via the substance. For the bonding between the carrier and the substance, for example, physical adsorption or chemical bonding similar to the case of (a) may be used.
[0028]
In the present invention, the labeled anti-immunocomplex antibody and the anti-hapten antibody bind to each other regardless of the presence or absence of the hapten, and as a result, a signal (noise) independent of the hapten is generated, resulting in a decrease in measurement sensitivity. In order to prevent the labeled anti-immunocomplex antibody from simply adsorbing to the water-insoluble carrier (without binding to the anti-hapten antibody), the carrier includes It is preferable to perform a normal blocking treatment after bonding one of the substances. This blocking treatment can be performed by using a solution such as bovine serum albumin (BSA) or the like that does not specifically bind to the hapten to be detected and immersing the carrier in this solution for a certain period of time.
[0029]
The anti-immune complex antibody used in the present invention can be produced by using an immune complex of a hapten and an anti-hapten antibody as an immunogen based on, for example, the disclosures of Japanese Patent Publication No. 6-102037 and Japanese Patent No. 2779387. The anti-immunoconjugate antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but it is highly uniform, and once the hybridoma is established, the same antibody can be continuously produced. Preferably there is. The label is not particularly limited as long as it is used in normal immunoassay such as enzymes, chemiluminescent substances, fluorescent substances, and radioisotopes. Here, the label may be chemically bound to the anti-immune complex antibody, for example, bound to an antibody that specifically binds to the anti-immune complex antibody, and the antibody and the anti-immune complex antibody are combined. You may make it couple | bond indirectly by making it react. In the latter case, in the specific operation of the present invention described below, B / F separation is performed to separate the free anti-immune complex antibody, and then the separated anti-immune complex antibody or the water-insoluble carrier is separated. It is also possible to measure the label by indirectly binding a label to the anti-immune complex antibody in the formed immune complex.
[0030]
Hereinafter, specific operation examples of the measurement method of the present invention will be described. In the description, an example is shown in which an anti-hapten antibody indirectly binds to a water-insoluble carrier in the course of an immune reaction. However, as described above, this may be indirectly combined with a carrier before being subjected to an immune reaction. You can keep it.
[0031]
First, one of a pair of substances that form an affinity bond is chemically bound to an anti-hapten antibody. Further, after the other of the pair of substances is chemically bonded to the water-insoluble carrier, a blocking treatment is performed. Next, the water-insoluble carrier and the anti-hapten antibody are mixed with the sample that is supposed to contain the hapten to be measured and the labeled anti-immune complex antibody to cause an immune reaction and the water-insoluble carrier and the anti-hapten antibody indirectly. To form an immune complex comprising an anti-hapten antibody / hapten / labeled anti-immunocomplex antibody on a carrier. It is preferable to mix these components so that the anti-hapten antibody and the labeled anti-immunocomplex antibody do not contact in the absence of a sample. For this purpose, in addition to the above, (i) first, a water-insoluble carrier, anti-antibody Mix hapten antibody and sample, then mix labeled anti-immunocomplex antibody with this mixture, (ii) mix anti-hapten antibody and sample first, then mix water-insoluble carrier and labeled anti-immunocomplex antibody with this mixture It can be exemplified that they are mixed.
[0032]
The sample to be used for measurement is not limited as long as it is suspected of containing the hapten as a measurement target, and examples thereof include biological fluids such as serum. However, this biological fluid is not limited to those derived from humans, for example, other than human It may be a biological fluid derived from this animal.
[0033]
The above-mentioned immune reaction can be sufficiently caused, for example, by leaving it to stand for 2 to 3 hours at room temperature, but the standing time is mainly the affinity between the hapten and anti-hapten antibody to be measured, and the hapten and anti-hapten antibody. It varies depending on the affinity between the immune complex consisting of the above and the labeled anti-immune complex antibody. Generally, the higher the affinity, the shorter the time. Further, if the mixed solution can be stirred by stirring the water-insoluble carrier, the time can be shortened by promoting the immune reaction.
[0034]
So-called B / F separation is performed on the mixed solution that has been allowed to stand for an immune reaction. Here, the time sufficient for the immune reaction does not necessarily mean the time required for the immune reaction to reach an equilibrium state, and the immune complex formed as a result of the reaction even if the immune reaction does not reach the equilibrium state. If the amount is reproducible. Specifically, the B / F separation is an operation for separating the labeled anti-immunocomplex antibody present in a free state in the mixed solution from the immune complex formed on the water-insoluble carrier. This operation can be easily performed by sucking and removing liquid phase components of the mixed solution, that is, components other than the water-insoluble carrier. In addition to this, for example, the B / F separation can also be performed by performing an operation such as centrifugation to remove the supernatant, or to remove a passing component using a filter. The former can be easily carried out when a water-insoluble carrier that is non-suspended in water is used, and the latter is carried out when either a suspending or non-suspending water-insoluble carrier is used. Is possible. Furthermore, a magnetic substance is supported on a water-insoluble carrier, and the water-insoluble carrier is separated from the liquid mixture using a magnet, or the supernatant is decanted while the water-insoluble carrier is fixed to the bottom of the container with a magnet. It can also be exemplified.
[0035]
After the B / F separation operation, the label is measured for either the separated labeled anti-immunocomplex antibody or the labeled anti-immunocomplex antibody in the immune complex formed on the water-insoluble carrier. If the label is an enzyme, an enzyme substrate may be added to measure the rate of increase of the substrate degradation product, and if the label is a fluorescent substance, fluorescence measurement may be performed. By comparing this measurement result with a standard curve created based on the result of performing the same operation under the same conditions for a standard solution containing a hapten to be measured in a known amount (known concentration), a sample is obtained. It is possible to know whether or not the hapten targeted for measurement is present.
[0036]
The above explanation is an example in which the present invention is implemented as a one-step method in which a so-called B / F separation operation is performed once, but the present invention can also be implemented as a so-called two-step method in which B / F separation is performed twice. It is.
[0037]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the present invention will be described below in order to describe the present invention in more detail, but the present invention is not limited to these examples.
[0038]
Example 1 Preparation of anti-immune complex antibody
An immunocomplex in which estradiol (Sigma, Cat. No. E8875) and a mouse anti-estradiol monoclonal antibody were previously immunoreacted and bound was used as an antigen and immunized to Balb / c mice together with Freund's adjuvant. Booster immunization was performed 15 days, 35 days, and 97 days after the first immunization, and 3 days after the final immunization, hybridomas capable of producing monoclonal antibodies were established according to a conventional method.
[0039]
A monoclonal antibody produced by the established hybridoma was subjected to a binding test, and clones were selected that showed reactivity with the mouse anti-estradiol antibody in the presence of estradiol and no reactivity in the absence of estradiol. The anti-immunocomplex antibody produced by the selected clone is purified with a protein A-immobilized carrier and then converted into a Fab, and bound to alkaline phosphatase using SMCC (Succinimidyl-4- [N-maleimidemethyl] -cyclohexane-1-carboxyllate). Thus, a labeled anti-immune complex antibody was obtained.
[0040]
Example 2
Anti-fluorescein monoclonal antibody was physically adsorbed to 100 ng / carrier on a water-insoluble carrier (manufactured by EVA having a particle diameter of about 1.5 mm with ferrite kneaded inside), and a blocking treatment was performed using BSA. On the other hand, the mouse anti-estradiol monoclonal antibody used in Example 1 was mixed with 6- (fluorescein-5-carboxamido) hexanoic acid succinimidyl ester and bound to fluorescein. In addition, about the said water-insoluble support | carrier, it confirmed beforehand that about 100 ng protein could adsorb | suck physically.
[0041]
After 12 carriers were placed in a magnetically permeable container (capacity 1.2 ml), 75, 150, 300 ng of fluorescein-conjugated mouse anti-estradiol monoclonal antibody and 150 ng of labeled anti-immunocomplex antibody-containing solution (5% aqueous solution) Gelatin-Tris buffer (pH 7.5) was added and lyophilized.
[0042]
Add 100 μl of serum containing 0 ng / l estradiol (zero concentration serum) or 1000 ng / l estradiol to the reagent prepared as described above, and move the water-insoluble carrier using a magnet for 10 minutes at 37 ° C. The mixture was stirred and the immune reaction was carried out. After the reaction, B / F separation operation is performed to separate and remove the free labeled anti-immune complex antibody, 4 methylumbelliferyl phosphate which is a substrate of alkaline phosphatase is added, and 20 to 295 seconds after the addition of the substrate The production rate (nM / sec) of the enzymatic reaction degradation product (4 methylumbelliferone) was measured. The above operation was carried out using a commercially available fully automated immunoassay device (trade name AIA-21, manufactured by Tosoh Corporation) and its dedicated reagent.
[0043]
For comparison, 300, 600, and 1200 ng of mouse anti-estradiol monoclonal antibody were mixed with 12 of the same carrier as described above, physically adsorbed on the carrier, and subjected to blocking treatment using BSA. After putting these 12 carriers in the same container as described above, 150 ng of a labeled anti-immune complex antibody-containing solution (5% water-soluble gelatin-Tris buffer, pH 7.5) was added and lyophilized.
[0044]
100 μl of serum containing 0 ng / l estradiol (zero concentration serum) or serum containing 1000 ng / l estradiol was added to the comparative reagent prepared as described above, and the production rate of 4-methylumbelliferone was measured in the same manner as described above. did.
[0045]
Table 1 shows the measurement results according to the present invention, and Table 2 shows the measurement results using the reagents for comparison. Table 2 showing the results of the comparison shows that the measured values rose in proportion to the amount of mouse anti-estradiol antibody bound to the water-insoluble carrier in both 0 ng / l serum and 1000 ng / l serum, and the signal / noise ratio was 1200 ng. It can be seen that the maximum (28.1) is obtained when the anti-estradiol antibody is bound. On the other hand, in Table 1 showing the results of the present invention, even when the binding amount of the mouse anti-estradiol antibody was reduced, the measurement result of 1000 ng / l serum increased dramatically, and compared with the results shown in Table 2. It can be seen that the signal / noise ratio was improved by 7 times.
[0046]
[Table 1]
[Table 2]
Example 3
Similar to the reagent of the present invention in Example 2 except that the amount of mouse anti-estradiol antibody indirectly bound to the carrier was 300 ng and the amount of labeled anti-immune complex antibody added to the container was 75, 150 or 300 ng, respectively. The reagent was produced by the above procedure and subjected to the same measurement.
[0049]
For comparison, the reagent for comparison in Example 2 except that the amount of the mouse anti-estradiol antibody adsorbed on the carrier was 100 ng and the amount of the labeled anti-immune complex antibody added to the container was 75, 150 or 300 ng, respectively. Reagents were produced in the same manner as described above and subjected to the same measurement.
[0050]
Table 3 shows measurement results according to the present invention, and Table 4 shows measurement results using reagents for comparison. From Table 4 showing the results of comparison, the measured values of 0 ng / l serum and 1000 ng / l serum increased as the amount of labeled anti-immunocomplex antibody was increased, but the comparison reagent in Example 2 was used. From the results, no significant improvement in signal / noise ratio was observed, and it was constant at about 30. On the other hand, in Table 3 showing the results of the present invention, the measured values of 0 ng / l serum and 1000 ng / l serum increased as the amount of labeled anti-immunocomplex antibody was increased, but the signal / noise ratio was an average value. This was 217, which was better than when a comparative reagent was used.
[0051]
[Table 3]
[Table 4]
Example 4
A reagent was produced in the same manner as the reagent of the present invention in Example 2 except that the amount of mouse anti-estradiol antibody indirectly bound to the carrier and the amount of labeled anti-immune complex antibody added to the container were 285 ng, respectively. Six types of sera with known estradiol concentrations (concentrations: 0, 22, 62, 99, 493, 1040 ng / l) were measured three times in a similar manner (10 times for zero concentration serum). The results are shown in Table 5.
[0054]
The measurement result was subjected to cubic regression to obtain a calibration curve shown in FIG. As a result of obtaining the zero concentration serum measurement value + (2 × standard deviation) from the calibration curve of FIG. 1, the minimum detection sensitivity (MDC) was 1.5 ng / l.
[0055]
[Table 5]
Example 5
Using the reagent of the present invention produced in Example 4, the estradiol zero concentration serum containing estrone or estriol was measured in the same manner as described above. The results are shown in Table 6.
[0057]
From Table 6, it can be seen that the cross-reactivity of the immunoassay reagent of the present invention with estrone or estriol is 1% or less.
[0058]
[Table 6]
Example 6
Biotin was bound to the mouse anti-estradiol monoclonal antibody using a commercially available reagent (VECTOR, trade name: NHS-Biotin). 50 μl of serum with an estradiol concentration of 0, 5 or 10 ng / l and 50 μl (7 ng) of a mouse anti-estradiol monoclonal antibody solution to which biotin was bound as described above were placed on a commercially available plate (trade name: Black well) manufactured by NUNK. In addition, an immunoreaction was performed at 37 ° C. for 10 minutes. After the reaction, 50 μl (10 ng) of the labeled anti-immune complex antibody solution prepared in Example 1 was added, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 5 minutes.
[0060]
After the reaction, 30 μl (50 μg by weight of carrier) of a water-insoluble carrier to which streptavidin is bound (manufactured by Dynal, trade name; Streptavidindynabeads) is added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Estradiol monoclonal antibody was indirectly bound. Using a washing solution (0.15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0.05% (w / w) Tween20 and 0.05% (w / w) NaN3, pH 8.0 solution) After the F separation operation, a commercially available chemiluminescent substrate (manufactured by Tropix, trade name: CSPD Emerald II) was added, and the substrate was added by a detection apparatus (BERTHOLD, LB96V), and the amount of luminescence for 6 minutes was counted.
[0061]
FIG. 2 shows the results of estradiol amount and luminescence amount count. The MDC obtained from the results of FIG. 2 was about 1.1 ng / l.
[0062]
Example 7
50 μl of serum with an estradiol concentration of 0 or 10 ng / l, 50 μl (7 ng) of a mouse anti-estradiol monoclonal antibody solution conjugated with biotin, and 50 μl (10 ng) of a labeled anti-immune complex antibody solution are commercially available plates (trade name; manufactured by NUNK); The amount of luminescence for 6 minutes was counted after adding the substrate by performing the same operation as in Example 6 except that it was added to Black well) at a time and reacted at 37 ° C. for 5 minutes.
[0063]
FIG. 3 shows the results of estradiol amount and luminescence count. The MDC obtained from the results of FIG. 2 was about 1.8 ng / l.
[0064]
【The invention's effect】
In the present invention, by indirectly binding the anti-hapten antibody to the water-insoluble carrier, the anti-hapten antibody can be bound to the carrier in a state capable of reacting with the hapten. As a result, the amount of anti-hapten antibody effective for hapten measurement can be freely controlled, and the use of unnecessary anti-hapten antibody can be suppressed. As a result, in addition to the effect that the amount of reagent to be used can be reduced, it is also possible to inhibit the labeled anti-immunocomplex antibody from binding to (excess) anti-hapten not bound to the hapten and generating a noise signal.
[0065]
In the present invention in which the anti-hapten antibody can be bound to the carrier in a state capable of reacting with the hapten, the labeled anti-immune complex antibody suppresses a noise signal generated as a result of binding to the anti-hapten regardless of the hapten. In the end, it is possible to improve the signal / noise ratio.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a calibration curve created based on the results of Example 4. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the results of Example 6.
FIG. 3 is a graph showing the results of Example 7.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35939099A JP4228095B2 (en) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Immunoassay method and immunoassay reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35939099A JP4228095B2 (en) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Immunoassay method and immunoassay reagent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001174460A JP2001174460A (en) | 2001-06-29 |
| JP4228095B2 true JP4228095B2 (en) | 2009-02-25 |
Family
ID=18464269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35939099A Expired - Fee Related JP4228095B2 (en) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Immunoassay method and immunoassay reagent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4228095B2 (en) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002097197A (en) * | 2000-07-18 | 2002-04-02 | Yanaihara Kenkyusho:Kk | Estradiol derivative and assaying method using the same |
| FI20022048A0 (en) * | 2002-11-18 | 2002-11-18 | Valtion Teknillinen | Non-competitive immunoassay for small assays |
| ES2443065T3 (en) * | 2008-04-02 | 2014-02-17 | Vivacta Limited | A method to detect a chemical |
| CN103827145A (en) | 2011-09-21 | 2014-05-28 | 富士瑞必欧株式会社 | Antibody against affinity complex |
| JP6031944B2 (en) * | 2012-10-30 | 2016-11-24 | 東ソー株式会社 | Anti-immunocomplex antibody, hybridoma producing the same, and production method thereof |
| JP6221466B2 (en) * | 2013-07-29 | 2017-11-01 | 東ソー株式会社 | Hapten measurement method |
| CN110749737A (en) * | 2019-09-26 | 2020-02-04 | 南京市产品质量监督检验院 | Quantum dot immunochromatography test paper for quantitatively detecting estradiol in milk |
| JP7434824B2 (en) | 2019-11-20 | 2024-02-21 | 東ソー株式会社 | Measurement method using anti-immunocomplex antibody |
| CN114746754A (en) * | 2019-11-20 | 2022-07-12 | 东曹株式会社 | Assay methods using anti-immune complex antibodies |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8408193D0 (en) * | 1984-03-30 | 1984-05-10 | Cambridge Patent Dev | Antibodies |
| JPH0480657A (en) * | 1990-07-24 | 1992-03-13 | Hitachi Ltd | Immune measurement method and apparatus |
| US5342760A (en) * | 1992-06-10 | 1994-08-30 | Abbott Laboratories | Determination of estradiol by competitive immunoassay |
| JPH11125634A (en) * | 1996-12-06 | 1999-05-11 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Solid phase for immunoassay |
-
1999
- 1999-12-17 JP JP35939099A patent/JP4228095B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001174460A (en) | 2001-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1226215A (en) | Immunoassay of antigens | |
| CA1118345A (en) | F(ab')2 immunoglobulin fragments for assay of antigen | |
| EP0105714B1 (en) | Immunoassay of antigens | |
| AU612907B2 (en) | Process and reagent for the determination of a specifically bindable substance | |
| JPH06258325A (en) | Antigen measuring method using two or three kinds of different monoclonal antibodies and test kit utilizing said monoclonal antibodies | |
| JP2009085753A (en) | Sandwich immunoassay | |
| JPS6112224B2 (en) | ||
| CA2098549C (en) | Two step process for coating of antibodies to a solid phase | |
| US4468470A (en) | Method and a kit for the assay of antibodies to soluble antigens | |
| US5283176A (en) | Reagents for use in competition assays for progesterone | |
| JP4228095B2 (en) | Immunoassay method and immunoassay reagent | |
| JP2009517652A (en) | Sensitive magnetic capture analysis by construction of strong binding pairs | |
| JPS6112547B2 (en) | ||
| JP3413415B2 (en) | Immunoassay reagent and immunoassay using the same | |
| JP2002504994A (en) | Immunoassay using anti-allotype monoclonal antibody | |
| JPH0658937A (en) | Immunochemical measuring method for specimen to be checked | |
| JPS6342229B2 (en) | ||
| WO2021100459A1 (en) | Measurement method using anti-immunocomplex antibody | |
| JP4839530B2 (en) | Method and reagent composition for reducing measurement interference | |
| JPS6020149A (en) | Immunochemical measurement method and its reagent | |
| JP7434824B2 (en) | Measurement method using anti-immunocomplex antibody | |
| JP5701666B2 (en) | Method for producing high affinity anti-hapten polyclonal antibody | |
| JPH11304801A (en) | Autoantibody detecting method by indirect antigen immobilization | |
| JPS63158460A (en) | Testing method | |
| JP2003302401A (en) | Quick and highly sensitive measuring method using high- performance monoclonal antihapten antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061023 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080717 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080729 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081028 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081110 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111212 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121212 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131212 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |