JP4219957B2 - Viral envelope vector for gene transfer - Google Patents
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Description
本発明は、インビトロおよび生体内での遺伝子導入のための安全かつ高効率のベクターに関する。特に、本発明は、ウイルス、不活性化ウイルス、特に不活性化ＨＶＪ（センダイウイルス）を用いて調製する遺伝子導入ベクターに関する。また、本明細書の遺伝子導入ベクターは、遺伝子治療および高スループットスクリーニングにも使用され得る。 The present invention relates to a safe and highly efficient vector for gene transfer in vitro and in vivo. In particular, the present invention relates to a gene transfer vector prepared using a virus, an inactivated virus, particularly an inactivated HVJ (Sendai virus). The gene transfer vectors herein can also be used for gene therapy and high throughput screening.
遺伝子治療のために、遺伝子導入のための多くのウイルスおよび非ウイルス（合成）法が開発されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、９２６〜９３２（１９９３）およびＬｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１２９〜１１４４（１９９５））。一般に、細胞への遺伝子送達のために、ウイルス法は、非ウイルス法より効果的である。しかし、ウイルスベクターは、親ウイルスからの必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子のリーキーな発現、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変のため安全性での問題を生じ得る。一般に、非ウイルスベクターは、細胞傷害性および免疫原性がより少ない。しかし、大部分の非ウイルス法は、ウイルスベクターのいくつかに比べ、特に生体内への遺伝子導入効率はより悪い。 For gene therapy, many viral and non-viral (synthetic) methods for gene transfer have been developed (Mulligan, Science, 260, 926-932 (1993) and Ledley, Human Gene Therapy, Vol. 6, 1129-1144 (1995)). In general, viral methods are more effective than non-viral methods for gene delivery to cells. However, viral vectors can pose safety problems due to co-introduction of essential genetic elements from the parent virus, leaky expression of viral genes, immunogenicity, and alteration of host genome structure. In general, non-viral vectors are less cytotoxic and immunogenic. However, most non-viral methods are particularly poor in gene transfer efficiency into the living body compared to some of the viral vectors.
従って、ウイルスおよび非ウイルスベクターの両方は、制限とともに長所を持っている。それ故、高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子導入ベクターを開発することで、１つのタイプのベクターシステムの制限を、別のタイプのシステムの有利な点を導入することにより補償すべきである。 Thus, both viral and non-viral vectors have advantages with limitations. Therefore, by developing in vivo gene transfer vectors with high efficiency and low toxicity, the limitations of one type of vector system should be compensated by introducing the advantages of another type of system It is.
一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に産生されるとＣＴＬを誘導することが知られている（Ｃｏｌｅ、Ｇ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８、４３０１〜４３０９（１９９７））。また宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。 On the other hand, HVJ is highly immunogenic, and is known to induce CTL when NP protein is produced in large quantities (Cole, GA, et al., J. Immunology 158, 4301-4309 (1997)). ). There is also a concern that protein synthesis of the host may be inhibited.
ＨＶＪについて、ウイルス融合タンパク質を遠心やカラム操作で融合タンパク質を精製して脂質膜に再構成する方法で作成された粒子は、再構成させることによってウイルスの持つ他のタンパク質（主としてＭタンパク質）が失われることにより、融合活性に必要なＦｌとＨＮタンパク質の比率が野生型のウイルスと同様には保たれないために、融合活性が低くなるという欠点もある。また再構成したときに融合タンパク質が脂質膜に挿入される方向性が野生型ウイルスと同様であるとは限らないために未知の抗原提示がなされる可能性もある。 For HVJ, particles produced by reconstitution of the virus fusion protein by centrifugation or column operation and reconstitution into a lipid membrane lose the other proteins (mainly M protein) of the virus by reconstitution. As a result, the ratio between the Fl and HN proteins required for the fusion activity is not maintained in the same manner as in the wild type virus, so that the fusion activity is lowered. In addition, since the direction in which the fusion protein is inserted into the lipid membrane when reconstituted is not always the same as that of the wild-type virus, an unknown antigen may be presented.
また、新たな分子を加えて再構成する方法も報告されているが（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０、１０〜２０、１９７９）、この方法では完成粒子の膜組成は本来のウイルス粒子とは大きく異なるために本来のウイルス機能が喪失される危険性は大きい。 In addition, a method for reconstitution by adding a new molecule has also been reported (Uchida, T., et al., J. Cell. Biol. 80, 10-20, 1979). The risk of losing the original virus function is great because it is very different from the virus particles.
従来のＨＶＪ−リポソームに代表されるように遺伝子やタンパク質をリポソームに封入し、これと不活性化ＨＶＪを融合して作成される融合粒子を用いる方法は、培養細胞や生体組織への非侵襲の遺伝子導入を可能とし、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻用されるようになった（Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５（１９９６）およびＫａｎｅｄａ，Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３（１９９９））。しかしウイルスとリポソームという２つの異なるベシクルを準備する必要があり手法が複雑であること、リポソームと融合することによってウイルス粒子より平均直径が１．３倍大きくなった粒子は融合活性がウイルスの１０％以下に落ちてしまうことなどの欠点も合わせ持つことがわかった。 As represented by conventional HVJ-liposomes, genes and proteins are encapsulated in liposomes and fusion particles prepared by fusing them with inactivated HVJ are non-invasive to cultured cells and living tissues. Gene transfer has become possible, and this technique has been frequently used worldwide at the animal experiment level (Dzau, VJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1412-111425 (1996). And Kaneda, Y. et al., Molecular Medicine Today, 5, 298-303 (1999)). However, it is necessary to prepare two different vesicles, a virus and a liposome, and the method is complicated. A particle whose average diameter is 1.3 times larger than that of a virus particle by fusing with a liposome has a fusion activity of 10% of that of a virus. It has been found that it has some drawbacks such as falling below.
さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織や極めて効率の低い組織も存在した。このことは、従来法に基づく遺伝子治療の対象となる組織を限定し得ることを示す。 Furthermore, with conventional HVJ-based vectors, there were tissues where gene transfer was impossible and tissues with extremely low efficiency. This indicates that the target tissue for gene therapy based on the conventional method can be limited.
ヒト遺伝子治療のために、安全、高効率かつ簡便に調製でき、かつ広範囲の生体内組織に対して遺伝子導入が可能なウイルスベクターの開発が望まれている。 For human gene therapy, it is desired to develop a viral vector that can be prepared safely, highly efficiently and simply, and can be introduced into a wide range of in vivo tissues.
従って、本発明の目的は、従来の再構成ＨＶＪベクター法またはＨＶＪ−リポソーム法の欠点を克服し、広範囲の培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便なウイルスベースの遺伝子導入ベクターを開発することにある。 Therefore, the object of the present invention is to overcome the drawbacks of the conventional reconstituted HVJ vector method or HVJ-liposome method and develop a safe, highly efficient and simple virus-based gene transfer vector for a wide range of cultured cells and biological tissues. There is to do.
本発明の１つの局面において、不活性化ウイルスを使用する安全かつ高効率な遺伝子導入ベクターが提供される。ウイルスのゲノムが不活性化されている不活性化ウイルスでは、ウイルスタンパク質の複製がないため安全で細胞毒性・抗原性も低い。不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクター中に遺伝子を封入することにより、培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便な遺伝子導入ベクターが調製される。 In one aspect of the present invention, a safe and highly efficient gene transfer vector using an inactivated virus is provided. Inactivated viruses in which the viral genome is inactivated are safe and have low cytotoxicity and antigenicity due to the absence of viral protein replication. By enclosing a gene in a virus envelope vector, which is a gene transfer vector using an inactivated virus, a safe, highly efficient and simple gene transfer vector for cultured cells and living tissues is prepared.
本発明のさらなる局面において、広範囲の生体内組織に遺伝子導入が可能であるウイルスエンベロープベクターが提供される。１つの実施態様において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。本発明のウイルスエンベロープベクターによって生体内で遺伝子導入される組織としては、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、癌組織、神経、Ｂリンパ球、および呼吸器官の組織が挙げられるが、これらに限定されない。 In a further aspect of the present invention, a viral envelope vector capable of gene transfer into a wide range of in vivo tissues is provided. In one embodiment, the virus used is HVJ. Tissues that are gene-transferred in vivo by the virus envelope vector of the present invention include liver, skeletal muscle, uterus, brain, eye, carotid artery, skin, blood vessel, lung, heart, kidney, spleen, cancer tissue, nerve, B Examples include, but are not limited to, lymphocytes and respiratory tissues.
本発明の別の局面において、浮遊細胞に簡便に遺伝子導入する方法が提供される。本発明のウイルスエンベロープベクターを使用する、好ましい浮遊細胞への遺伝子導入方法としては、浮遊細胞とウイルスエンベロープベクターとを硫酸プロタミン存在下で混合する工程、およびその混合液に遠心力を加える工程を包含する、遺伝子導入方法が挙げられる。 In another aspect of the present invention, a method for easily introducing a gene into a floating cell is provided. A preferable method for introducing a gene into a floating cell using the virus envelope vector of the present invention includes a step of mixing the floating cell and the virus envelope vector in the presence of protamine sulfate, and a step of applying centrifugal force to the mixture. And a gene transfer method.
本発明の１つの局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて、大量の遺伝子を短時間で封入することによる、高効率で迅速な培養細胞及び生体組織への遺伝子導入が可能となる。従って、本発明のさらなる局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いるゲノムの高スループットの大量迅速解析システムが可能となる。 In one aspect of the present invention, high-efficiency and rapid gene transfer into cultured cells and living tissues can be achieved by encapsulating a large amount of genes in a short time using the gene transfer vector of the present invention. Therefore, in a further aspect of the present invention, a high-throughput mass rapid analysis system for genome using the gene transfer vector of the present invention is possible.
本発明の特定の局面において、遺伝子導入ベクターは、−２０℃で凍結した状態で長期間（少なくとも２〜３ヶ月以上）の保存が可能である。そしてこの遺伝子導入ベクターは、例えば凍結状態で密封し、貯蔵し、輸送することができる。 In a specific aspect of the present invention, the gene transfer vector can be stored for a long period (at least 2 to 3 months or more) in a frozen state at −20 ° C. The gene transfer vector can be sealed, stored and transported in a frozen state, for example.
本発明の別の局面において、インビトロにおいて好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の細胞に遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。 In another aspect of the present invention, a gene transfer vector having gene transfer activity is preferably provided in vitro to 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of cells. Is done.
本発明のある局面において、不活性化ウイルスの調製の２ヶ月後に遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクターを形成した場合に、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の遺伝子導入活性を保持する遺伝子導入ベクターが提供される。 In one aspect of the present invention, when a virus envelope vector that is a gene transfer vector is formed 2 months after the preparation of an inactivated virus, it is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably Provides a gene transfer vector having 90% or more gene transfer activity.
本発明の別の局面において、生体内での局所投与において好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好ましくは６０％以上の組織中の細胞に対して遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。 In another aspect of the present invention, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 50% or more, and most preferably 60% or more of cells in the tissue for local administration in vivo. A gene transfer vector having gene transfer activity is provided.
本発明の局面において、不活性化ウイルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターが提供される。 In an aspect of the present invention, a gene transfer vector comprising an inactivated virus envelope is provided.
本発明の１つの局面において、遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。 In one aspect of the present invention, the virus used for the preparation of the gene transfer vector may be a wild type virus or a recombinant virus.
本発明のさらなる局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。また、本発明のさらなる局面において、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８、２８１３〜２８２０（１９９７））またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、９７０〜９７３（２０００））に記載される組換え型センダイウイルスを用いて、遺伝子導入ベクターが調製される。 In a further aspect of the invention, the viruses used are retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, poxviridae, It is a virus belonging to a family selected from the group consisting of Herpesviridae, Baculoviridae, and Hepadnaviridae. In a specific aspect of the present invention, the virus used is HVJ. In a further aspect of the present invention, Hasan, M. et al. K. (Journal of General Virology, 78, 2813-2820 (1997)) or Yonemitsu, Y. et al. (Nature Biotechnology 18, 970 to 973 (2000)), a recombinant Sendai virus is used to prepare a gene transfer vector.
本発明の別の局面において、動物生体内の組織に遺伝子導入するための遺伝子導入ベクターが提供される。 In another aspect of the present invention, a gene transfer vector for introducing a gene into a tissue in an animal body is provided.
本発明の遺伝子導入ベクターを調製する方法において、ウイルスを不活性化する工程は必ずしも必要ではない。従って、本発明の１つの局面において、ウイルスを不活性化する工程を行わずに、
１）ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
２）この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合する工程、
を包含する方法によって遺伝子導入ベクターを作成し得る。
In the method for preparing the gene transfer vector of the present invention, the step of inactivating the virus is not necessarily required. Thus, in one aspect of the invention, without performing the step of inactivating the virus,
1) mixing a virus with a foreign gene, and 2) freezing and thawing the mixture, or further mixing the mixture with a surfactant,
A gene transfer vector can be prepared by a method comprising
本発明の別の局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；
ウイルスを不活性化する工程、
不活性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
混合液を凍結融解する工程、
を包含する、方法が提供される。
In another aspect of the present invention, a method for preparing an inactivated virus envelope vector for gene transfer, comprising:
Inactivating the virus;
Mixing the inactivated virus with a foreign gene, and freeze-thawing the mixture;
Are provided.
本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；
ウイルスを不活性化する工程、および
不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、
を包含する、方法が提供される。
In a further aspect of the invention, a method of preparing an inactivated viral envelope vector for gene transfer comprising:
Inactivating the virus, and mixing the inactivated virus with a foreign gene in the presence of a surfactant;
Are provided.
本発明のさらなる局面において、使用される界面活性剤は、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよびＮＰ−４０からなる群から選択される。 In a further aspect of the invention, the surfactant used is selected from the group consisting of octyl glucoside, Triton-X100, CHAPS and NP-40.
本発明の特定の局面において、不活性化ウイルスエンベロープとの混合前に、硫酸プロタミンを外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法が提供される。 In a specific aspect of the present invention, there is provided a method for preparing an inactivated virus envelope vector further comprising the step of adding protamine sulfate to a foreign gene before mixing with the inactivated virus envelope.
本発明のさらなる局面において、単離された動物組織に遺伝子を導入する方法であって、以下；
所望の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを調製する工程、
遺伝子導入ベクターによって、該動物組織に遺伝子を導入する工程、
を包含する、方法が提供される。
In a further aspect of the present invention, a method for introducing a gene into an isolated animal tissue comprising:
Preparing a gene transfer vector containing a desired gene;
A step of introducing a gene into the animal tissue by a gene transfer vector;
Are provided.
本発明の別の局面において、浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法が提供され、この方法は、以下：
浮遊細胞と遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミン存在下で混合する工程、
混合液を遠心する工程
を包含する。
In another aspect of the present invention, a method for introducing a foreign gene into a floating cell is provided, the method comprising:
A step of mixing the floating cells and the gene transfer vector in the presence of protamine sulfate,
Centrifuge the mixture.
本発明のさらに別の局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを含有する、遺伝子治療のための薬学的組成物が提供される。 In yet another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for gene therapy containing the gene transfer vector of the present invention.
操作が簡便で、しかも遺伝子導入効率の優れた新しい遺伝子導入方法が提供される。これにより、遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングが可能になると考えられる。本発明のウイルスエンベロープベクターを含む、高スループットスクリーニングのためのキットもまた提供される。また、本出願によって提供されるウイルスエンベロープベクターは長期間の凍結保存が可能であり、要事調製の必要がないため、作業工程が大幅に簡略化できるとともに、導入ベクターの大量調製による均質な遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明の遺伝子導入ベクターは、従来のＨＶＪを基に調製されたベクターよりも、高効率の遺伝子導入を可能にし、かつ従来の方法よりもより広範囲の生体内組織に対する遺伝子導入を可能とする。 Provided is a new gene introduction method that is simple in operation and excellent in gene introduction efficiency. This will enable rapid screening of gene libraries. A kit for high throughput screening comprising the viral envelope vector of the present invention is also provided. In addition, the virus envelope vector provided by the present application can be cryopreserved for a long period of time and does not require preparation. Therefore, the working process can be greatly simplified, and a homogeneous gene can be obtained by mass preparation of the introduced vector. Introduction becomes possible. Furthermore, the gene transfer vector of the present invention enables higher-efficiency gene transfer than conventional vectors prepared based on HVJ, and enables gene transfer to a wider range of in vivo tissues than conventional methods. To do.
本発明の遺伝子導入ベクターを含む、医薬品投与のためのドラッグデリバリーシステム、薬物のスクリーニング系、および遺伝子治療用ベクターも提供される。 Drug delivery systems for drug administration, drug screening systems, and gene therapy vectors comprising the gene transfer vector of the present invention are also provided.
（定義）
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
(Definition)
As used herein, “gene transfer” refers to a natural, synthetic or recombinant desired gene or gene fragment in a target cell in vivo or in vitro, and the introduced gene has its function. Introducing to maintain. The gene or gene fragment introduced in the present invention includes a nucleic acid which is DNA, RNA or a synthetic analog thereof having a specific sequence. Also, as used herein, gene transfer, transfection, and transfection are used interchangeably.
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」、「遺伝子ベクター」または「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。 As used herein, “gene transfer vector”, “gene vector” or “virus envelope vector” refers to a vector in which a foreign gene is encapsulated in a virus envelope. The virus used for the preparation of the gene transfer vector may be a wild type virus or a recombinant virus.
本発明の１つの局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。 In one aspect of the invention, the viruses used are Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae A virus belonging to the family selected from the group consisting of Herpesviridae, Baculoviridae, and Hepadnaviridae. In a specific aspect of the present invention, the virus used is HVJ.
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。 As used herein, “gene transfer activity” refers to the activity of “gene transfer” by a vector, and functions of the introduced gene (for example, in the case of an expression vector, expression of the encoded protein and / or Alternatively, the activity of the protein can be detected as an index.
本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。 As used herein, “inactivation” refers to a virus that has inactivated its genome. This inactivated virus is replication defective. Preferably, this inactivation is done by UV treatment or treatment with an alkylating agent.
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。 As used herein, “foreign gene” refers to a nucleic acid sequence of a non-viral origin contained within a gene transfer vector. In one aspect of the invention, the foreign gene is a regulatory sequence suitable for expression of the gene introduced by the gene transfer vector (eg, a promoter, enhancer, terminator, and poly A addition signal required for transcription, and A ribosome binding site necessary for translation, start codon, stop codon, etc.). In another aspect of the invention, the foreign gene does not contain regulatory sequences for expression of the foreign gene. In a further aspect of the invention, the foreign gene is an oligonucleotide or a decoy nucleic acid.
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。 The foreign gene contained in the gene transfer vector is typically a DNA or RNA nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule to be introduced may include a nucleic acid analog molecule. The molecular species contained in the gene transfer vector may be a single gene molecular species or a plurality of different gene molecular species.
本明細書で使用される場合、「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。 As used herein, a “gene library” is a nucleic acid library comprising nucleic acid sequences isolated from nature or synthetic nucleic acid sequences. Sources of nucleic acid sequences isolated from nature include, but are not limited to, genomic and cDNA sequences derived from eukaryotic cells, prokaryotic cells, or viruses. A library obtained by adding an arbitrary sequence (eg, signal, tag, etc.) to a sequence isolated from nature is also included in the gene library of the present invention. In one embodiment, the gene library includes sequences such as promoters that provide for transcription and / or translation of the nucleic acid sequences contained therein.
本明細書において、「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。 In the present specification, “HVJ” and “Sendai virus” may be used interchangeably.
本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１ ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ４、２０９〜２１３、１９６１）。
As used herein, “HAU” refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes, and 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (Okada, Y. et al.,
（遺伝子治療）
治療的な核酸構築物は、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得る。
(Gene therapy)
Therapeutic nucleic acid constructs can be administered either locally or systemically using the gene transfer vectors of the present invention. Where such a nucleic acid construct includes a coding sequence for a protein, expression of the protein can be induced by use of an endogenous mammalian promoter or a heterologous promoter. The expression of the coding sequence can be constitutive or regulated.
本発明の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、本発明のベクターの投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所（例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内および門脈内）への投与によりなされる。 When the gene transfer vector of the present invention is used as a composition for gene therapy, the vector of the present invention can be administered by suspending a vector suspension suspended in PBS (phosphate buffered saline) or saline. By local injection (eg, into cancer tissue, liver, intramuscular and brain) or by administration into blood vessels (eg, intraarterial, intravenous and portal vein).
１つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。 In one embodiment, the gene transfer vector is generally used in a unit dose injectable form (solution, suspension or emulsion) of the gene transfer vector (ie, a pharmaceutically acceptable carrier (ie, used). Non-toxic to recipients at different dosages and concentrations, and compatible with the other ingredients of the formulation). For example, the formulation preferably does not include oxidizing agents and other compounds that are known to be deleterious to gene transfer vectors.
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含み得る。 The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used, and buffers such as phosphoric acid, citric acid, succinic acid, acetic acid, and other organic acids or their salts An antioxidant such as ascorbic acid; a low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide (eg, polyarginine or tripeptide); a protein (eg, serum albumin, gelatin, or an immunoglobulin); a hydrophilic polymer ( Amino acids (eg, glycine, glutamic acid, aspartic acid, or arginine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including cellulose or derivatives thereof, glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg mannitol) Other sorbitol); counterions (such as sodium); and / or nonionic surfactants (e.g., may include polysorbates, poloxamers), or PEG.
遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。 A pharmaceutical composition comprising a gene transfer vector can typically be stored as an aqueous solution in unit or multi-dose containers, such as sealed ampoules or vials.
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を満たした１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物とともに使用され得る。 The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention. Furthermore, the polypeptides of the present invention can be used with other therapeutic compounds.
本発明の遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防または処置されるべき状態）、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。従って、本明細書の遺伝子導入ベクターの「有効量」または適切な投与量は、このような考慮事項によって決定される。 A pharmaceutical composition comprising a gene transfer vector of the present invention comprises a gene transfer vector in a manner consistent with good medical practice, an individual patient's clinical condition (eg, a condition to be prevented or treated). It will be formulated and administered taking into account the site of delivery of the composition, the target tissue, the method of administration, the dosage regimen and other factors known to those of skill in the art. Accordingly, the “effective amount” or appropriate dosage of the gene transfer vector herein is determined by such considerations.
例えば、マウスに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、２０〜２０，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは６０〜６，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは２００〜２，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、０．１〜１００μｇ、好ましくは０．３〜３０μｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。 For example, when the gene vector of the present invention is administered to a mouse, a gene vector equivalent to 20 to 20,000 HAU, preferably equivalent to 60 to 6,000 HAU, more preferably equivalent to 200 to 2,000 HAU per mouse. Be administered. The amount of the foreign gene contained in the administered gene vector is 0.1-100 μg, preferably 0.3-30 μg, more preferably 1-10 μg per mouse.
また、ヒトに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇである。 In addition, when the gene vector of the present invention is administered to a human, it corresponds to 400 to 400,000 HAU per subject, preferably 1,200 to 120,000 HAU, more preferably 4,000 to 40,000 HAU. A gene vector is administered. The amount of the foreign gene contained in the administered gene vector is 2 to 2,000 μg, preferably 6 to 600 μg, more preferably 20 to 200 μg per subject.
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。 The following examples are illustrative and are not intended to limit the invention.
（１．凍結融解を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用）
（参考例１：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製）
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換えＨＶＪウイルスを様々な回数で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。
(1. Preparation of gene transfer vector using freeze-thaw and its use)
( Reference Example 1: Preparation of HVJ envelope vector by freeze-thawing)
Using a luciferase gene as a foreign gene, the recombinant HVJ virus was freeze-thawed at various times and then introduced into cultured cells.
ＴＥ５００μ１に、７５０μｇのルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（ＳａｅｋｉおよびＫａｎｅｄａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１、４７１〜４７９（２０００））と様々な濃度のＨＶＪウイルスを混合した。ＨＶＪウイルス濃度は、１０、２５、５０、１００ＨＡＵ／μｌに調製した。この溶液を１２分割し、それぞれをドライアイスによって４℃に保存して凍結させた後、融解することを最大３０回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、ＢＨＫ−２１細胞（２４ウェルディッシュ、４×１０4細胞／ディッシュ、０．５ｍｌ ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ2にて２０分間反応後、ＰＢＳにより洗浄し、新たに培養液を０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。 TE500 μl was mixed with 750 μg of luciferase expression vector pcOriPLuc (Saeki and Kaneda et al., Human Gene Therapy, 11, 471-479 (2000)) and various concentrations of HVJ virus. The HVJ virus concentration was adjusted to 10, 25, 50, 100 HAU / μl. This solution was divided into 12 parts, each was stored at 4 ° C. with dry ice, frozen, and thawed repeatedly up to 30 times. The solution that has been frozen and thawed a predetermined number of times is added to a medium of BHK-21 cells (24-well dish, 4 × 10 4 cells / dish, 0.5 ml DMEM, 10% FCS), 37 ° C., 5% CO 2. After 20 minutes of reaction, the plate was washed with PBS, 0.5 ml of a new culture solution was newly added, and cultured for 24 hours.
培地を除去し、１×Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５００μｌを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清２０μｌから、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍとＬｕｍａｔ ＬＢ９５０１ Ｌｕｍｉｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液について３回行い、平均値を求めた。 After removing the medium and adding 500 μl of 1 × Cell Culture Lys Reagent (Promega) onto the cells to lyse the cells, the cells were transferred to a microtube and centrifuged. From 20 μl of the obtained supernatant, Promega Luciferase Assay System and Lumat Luciferase activity was measured using LB9501 Luminophotometer. The measurement was performed 3 times for each solution, and the average value was obtained.
結果は図１に示したとおりである。組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、３回の凍結融解に比べ２０回の凍結融解では１０倍以上のルシフェラーゼ発現が観察された。この結果から、この参考例に用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は好ましくは５回以上、さらに好ましくは１５〜２０回程度であることが確認された。 The results are as shown in FIG. Luciferase activity increased as the number of times of freezing and thawing of the recombinant HVJ virus increased, and 10 times or more of luciferase expression was observed in 20 times of freezing and thawing compared to 3 times of freezing and thawing. From this result, it was confirmed that the number of times of freeze-thawing of the recombinant HVJ virus was preferably 5 times or more, more preferably about 15 to 20 times under the conditions used in this reference example.
（参考例２：凍結融解により調製されたＨＶＪエンベロープベクターの遺伝子導入効率）
参考例１と同様の組換えＨＶＪウイルスを３０回凍結融解した後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。
( Reference Example 2: Gene transfer efficiency of HVJ envelope vector prepared by freeze-thawing)
After freezing and
結果は図２に示したとおりである。この図２において、例えばＸ軸が５００ＨＡＵの場合では、ウイルス濃度１０ＨＡＵ／μｌの溶液の添加量は５０μｌであり、１００ＨＡＵ／μｌの溶液は５μｌとなる。この図２に示したとおり、ウイルス濃度が１００ＨＡＵ／μｌの溶液は１０〜５０ＨＡＵ／μｌ濃度の場合に比較して遺伝子発現の効率が約５０％低下した。この結果から、この参考例の条件では、組換えウイルス濃度はｌ０〜５０ＨＡＵ／μｌの範囲とすることが好ましいことが確認された。 The results are as shown in FIG. In FIG. 2, for example, when the X axis is 500 HAU, the addition amount of the solution having a virus concentration of 10 HAU / μl is 50 μl, and the solution of 100 HAU / μl is 5 μl. As shown in FIG. 2, the gene expression efficiency of the solution with the virus concentration of 100 HAU / μl was reduced by about 50% compared to the case of the concentration of 10 to 50 HAU / μl. From this result, it was confirmed that the recombinant virus concentration is preferably in the range of 10 to 50 HAU / μl under the conditions of this reference example.
また、組換えＨＶＪウイルスを２９回凍結融解した後、３０回目の凍結を行い、その凍結状態で１週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この１週間冷凍保存した組換えＨＶＪウイルスも、３０回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。 The recombinant HVJ virus was thawed 29 times and then thawed 30 times, stored in that frozen state for 1 week, thawed and added to the cells. As a result, the recombinant HVJ virus stored frozen for 1 week also showed the same level of luciferase gene expression as that of the virus that had been thawed thirty times continuously.
（参考例３：ルシフェラーゼ発現ベクターを用いる遺伝子導入効率の測定）
ルシフェラーゼ発現ベクターの量を様々に変えてＨＶＪエンベロープベクターを調製し、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
( Reference Example 3: Measurement of gene transfer efficiency using a luciferase expression vector)
HVJ envelope vectors were prepared with various amounts of luciferase expression vectors, and the efficiency of gene transfer into host cells was examined.
ＨＶＪウイルス量は１μｌ ＴＥ当たり５０ＨＡＵとした。ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃの量は、１μｌのＴＥ当たり０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、５．５μｇとした。最終溶液量を１００μｌとして２０回の凍結融解を行った後、参考例１と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
The amount of HVJ virus was 50 HAU per 1 μl TE. The amount of the luciferase expression vector pcOriPLuc was 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 5.5 μg per 1 μl of TE. After freeze-
結果は図３に示したとおりである。外来遺伝子である発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（約９．５ｋｂ）の添加量が１．５μｇまでは量依存的に発現量が増加し、これ以降は発現量にはほとんど変化はなかった。以上の結果から、この参考例で用いた条件では、１．５μｇ／μｌ以上の外来遺伝子ＤＮＡを遺伝子導入に用いることが好ましいことが確認された。 The results are as shown in FIG. The expression level increased in an amount-dependent manner up to 1.5 μg of the addition amount of the expression vector pcOriPLuc (about 9.5 kb), which was a foreign gene, and the expression level was hardly changed thereafter. From the above results, it was confirmed that 1.5 μg / μl or more of exogenous gene DNA is preferably used for gene introduction under the conditions used in this reference example.
（参考例４：遺伝子導入効率に対する緩衝液の種類の影響）
ＨＶＪエンベロープベクター調製に用いる緩衝液の種類を変えて、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
( Reference Example 4: Effect of buffer type on gene transfer efficiency)
The efficiency of gene transfer into host cells was examined by changing the type of buffer used for preparing the HVJ envelope vector.
ＨＶＪウイルス量は緩衝液１μｌ当たり５０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ量は１５μｇ／μｌとした。緩衝液はＴＥ、ＰＢＳ、ＢＳＳ（１３７ｍＭ
ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、並びにこれらの緩衝液に最終濃度０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭのショ糖を添加したものを使用した。最終溶液量を１００μｌとして２０回の凍結融解を行った後、参考例１と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
The amount of HVJ virus was 50 HAU per 1 μl of buffer, and the amount of luciferase expression vector pcOriPLuc was 15 μg / μl. Buffers are TE, PBS, BSS (137 mM)
NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5), and these buffers with final concentrations of 0 mM, 20 mM, 40 mM, and 60 mM sucrose were used. After freeze-
結果は図４に示したとおりであり、この参考例で用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの調製のための緩衝液としてはＴＥ単独が好ましいことが確認された。 The results are as shown in FIG. 4, and it was confirmed that TE alone was preferable as a buffer for the preparation of recombinant HVJ virus under the conditions used in this reference example.
（参考例５：ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）型のベクターと本願発明のＨＶＪエンベロープベクターとの比較）
従来の遺伝子導入ベクターである不活性化ＨＶＪ−リポソーム（最も遺伝子導入効率の優れたＡＶＥ型（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、２１３３〜２１４１（１９９７））を用いた遺伝子導入と、この発明の方法とを比較した。
( Reference Example 5: Comparison of AVE (Artificial Viral Envelop) type vector and HVJ envelope vector of the present invention)
Gene transfer using an inactivated HVJ-liposome that is a conventional gene transfer vector (AVE type having the highest gene transfer efficiency (Saeki, Y. et al., Human Gene Therapy, 8, 2133-2141 (1997)), The method of the present invention was compared.
ＨＶＪ一リポソームまたはＨＶＪウイルス量はＴＥ １μｌ当たり５０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃの量は１．５μｇ／μｌとした。また、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は２回または１５回とした。その他の条件は、宿主細胞をヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３とした以外は参考例１と同様とした。 The amount of HVJ liposome or HVJ virus was 50 HAU per μl of TE, and the amount of luciferase expression vector pcOriPLuc was 1.5 μg / μl. In addition, the number of times of freezing and thawing of the recombinant HVJ virus was 2 or 15. Other conditions were the same as in Reference Example 1 except that the host cell was human fetal kidney cell line HEK293.
結果は図５に示したとおりである。ＨＶＪエンベロープベクターの凍結融解を１５回繰り返すこの発明の方法は、遺伝子導入効率においてＨＶＪ一リポソームを用いた従来方法よりはるかに優れていることが確認された。 The results are as shown in FIG. It was confirmed that the method of the present invention in which the freeze-thawing of the HVJ envelope vector was repeated 15 times was far superior to the conventional method using the HVJ single liposome in terms of gene transfer efficiency.
（参考例６：合成オリゴヌクレオチドの導入効率）
ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレッセイン）で蛍光標識した合成オリゴヌクレオチド（２０ｂｐ）を１ｍｇ／ｍ１の濃度で不活性化ＨＶＪウイルスと混合し、この溶液を２０回凍結融解した後、ＢＨＫ−２１細胞と２０分間反応させた。１７時間後に蛍光シグナルを観察した結果、ほぼ１００％の細胞の核内に蛍光の集積が認められた。この結果から、この発明の方法は、合成核酸の細胞内導入にも有効であることが確認された。
( Reference Example 6: Efficiency of introduction of synthetic oligonucleotide)
A synthetic oligonucleotide (20 bp) fluorescently labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) was mixed with an inactivated HVJ virus at a concentration of 1 mg / m1, and this solution was freeze-thawed 20 times, and then BHK-21 cells and 20 Reacted for 1 minute. As a result of observing the fluorescence signal after 17 hours, accumulation of fluorescence was recognized in the nucleus of almost 100% of the cells. From these results, it was confirmed that the method of the present invention is also effective for introducing a synthetic nucleic acid into cells.
（参考例７：ＧＦＰ遺伝子の導入効率）
ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）遺伝子と不活性化ＨＶＪウイルスの混合溶液を２０回凍結融解した後、２ｎｇ−５μ１をラット大脳に注入した。その結果、注入部位に蛍光シグナルが観察された。また、ＧＦＰ遺伝子によるＨＶＪエンベロープベクターを凍結して３ヶ月保存した後、ラット大脳に注入したが、同じく注入部位にＧＦＰ遺伝子発現による蛍光シグナルが観察された。
( Reference Example 7: GFP gene introduction efficiency)
A mixed solution of GFP (green fluorescent protein) gene and inactivated HVJ virus was freeze-thawed 20 times, and then 2 ng-5 μ1 was injected into the rat cerebrum. As a result, a fluorescence signal was observed at the injection site. In addition, the HVJ envelope vector based on the GFP gene was frozen and stored for 3 months and then injected into the rat cerebrum. Similarly, a fluorescence signal due to GFP gene expression was observed at the injection site.
以上の結果から、この発明の方法は、生体内においても確実に遺伝子導入が可能であることが確認された。また、ＨＶＪエンベロープベクターの凍結保存が可能であることも確認された。 From the above results, it was confirmed that the method of the present invention can reliably introduce a gene even in vivo. It was also confirmed that the HVJ envelope vector could be stored frozen.
（２．界面活性剤を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用）
（参考例８：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製）
界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製方法の概略を図６に示す。
(2. Preparation of gene transfer vector using surfactant and use thereof)
( Reference Example 8: Preparation of inactivated HVJ envelope vector using surfactant)
An outline of a method for preparing an inactivated HVJ envelope vector using a surfactant is shown in FIG.
（１：ＨＶＪの増殖）
ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
(1: Growth of HVJ)
HVJ can be generally used by inoculating a fertilized egg of a chicken by inoculation with a seed virus. However, cultured cells such as monkeys and humans, and a system for continuously infecting cultured tissues with a virus (cultivating a hydrolase such as trypsin). Any of those that are propagated by using a solution added to the liquid and those that are propagated by infecting a cultured cell with a cloned viral genome and causing persistent infection can be used.
本参考例において、ＨＶＪの増殖を以下のようにおこなった。 In this reference example, HVJ was propagated as follows.
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。 HVJ seeds of HVJ grown using SPF (Specific pathogen free) fertilized eggs, separated and purified, are dispensed into cell storage tubes, and 10% DMSO is added and stored in liquid nitrogen And prepared.
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃，湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ ＮａＣｌを混合し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．ｌｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。 Chicken eggs immediately after fertilization were received and placed in an incubator (SHOWA-FURANKI P-03 type; accommodating about 300 chicken eggs) and reared for 10-14 days under conditions of 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. In the dark room, use an ophthalmoscope (light bulb light exits through a window with an aperture of about 1.5 cm) to check embryo survival and air chamber and chorioallantoic membrane. About 5 mm above, the location of the virus injection was marked with a pencil (select the location excluding the thick blood vessels). Seed virus (taken from liquid nitrogen) 500 times with polypeptone solution (mixed with 1% polypeptone, 0.2% NaCl, adjusted to pH 7.2 with 1M NaOH, autoclaved and stored at 4 ° C) Diluted to 4 ° C. Eggs were sterilized with isodine and alcohol, and a small hole was made in a thousand holes at the site of virus injection. 1 ml was injected into the chorioallantoic cavity using a 1 ml syringe with a 26 gauge needle. Dissolved paraffin (melting point: 50-52 ° C.) was placed on the hole using a Pasteur pipette to close it. The eggs were placed in an incubator and bred for 3 days under conditions of 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. The inoculated eggs were then placed at 4 ° C. overnight. The next day, the air space of the egg was split with tweezers, a 10 ml syringe with an 18 gauge needle was placed in the chorioallantoic membrane, the chorioallantoic fluid was aspirated, collected in a sterile bottle, and stored at 4 ° C.
（２：ＨＶＪの精製）
ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ，３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ，９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。
(2: Purification of HVJ)
HVJ can be purified by purification methods by centrifugation, column purification methods, or other purification methods known in the art.
(2.1: Purification method by centrifugation)
Briefly, the grown virus solution was collected, and the tissue and cell debris in the culture solution and chorioallantoic fluid were removed by low speed centrifugation. The supernatant was purified by high-speed centrifugation (27,500 × g, 30 minutes) and ultracentrifugation (62,800 × g, 90 minutes) using a sucrose density gradient (30-60% w / v). It should be noted that the virus should be handled as gently as possible during purification and stored at 4 ° C.
本参考例において、具体的には、以下の方法によってＨＶＪを精製した。 In this reference example, specifically, HVJ was purified by the following method.
ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−１ｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５，１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。 About 100 ml of HVJ-containing chorioallantoic fluid (collecting HVJ-containing chicken egg chorioallantoic fluid and storing at 4 ° C.) was placed in two 50 ml centrifuge tubes with a wide Komagome pipette (Saeki, Y., and Kaneda, Y: Protein modified liposomes (HVJ-1 iposomes) for the delivery of genes, volume of oligonucleotides and proteins, 27th edition, Cell biology; A. laboratory handbook, E. c. ~ 135, 1998), centrifuged in a low speed centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C (brake off) to remove egg tissue debris.
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣ１、５．４ｍＭ ＫＣ１；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。 After centrifugation, the supernatant was dispensed into four 35 ml centrifuge tubes (for high-speed centrifugation) and centrifuged with an angle rotor at 27,000 g for 30 minutes (accelerator and brake on). The supernatant was removed, and about 5 ml of BSS (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 137 mM NaC1, 5.4 mM KC1; autoclaved and stored at 4 ° C.) (PBS instead of BSS) was added to the precipitate, It left still at 4 degreeC as it was. Gently pipetted with a Komagome pipette, widened to loosen the precipitate, collected in a single tube, and centrifuged at 27,000 g for 30 minutes in the same manner. Excluding the supernatant, about 10 ml of BSS was added to the precipitate, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The precipitate was loosened by gently pipetting with a wide-bottom Komagome pipette, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. (brake off) with a low-speed centrifuge (the brake was off). The supernatant is placed in a new sterile tube and stored as purified virus at 4 ° C.
このウイルス液０．ｌｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。
This
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロ一ルと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。
Furthermore, purification of HVJ using a sucrose density gradient can be performed as necessary. Specifically, the virus suspension is placed in a centrifuge tube overlaid with 60% and 30% sucrose solutions (autoclaved), and density gradient centrifugation is performed at 62,800 × g for 120 minutes. After centrifugation, the band seen on the 60% sucrose solution layer is collected. The collected virus suspension is dialyzed overnight at 4 ° C. using BSS or PBS as an external solution to remove sucrose. If not used immediately, add glycerol (autoclave sterilization) and 0.5M EDTA solution (autoclave sterilization) to the virus suspension to a final concentration of 10% and 2-10 mM, respectively, and gently at −80 ° C. Frozen and finally stored in liquid nitrogen (cryopreservation is possible with 10 mM DMSO instead of glycerol and 0.5 M EDTA solution).
(2.2: Purification method by column and ultrafiltration)
Instead of the purification method by centrifugation, purification of HVJ using a column is also applicable to the present invention.
手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜ｌＭ ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。 In brief, purification was performed using concentration by ultrafiltration with a filter having a molecular weight cut-off of 50,000 (about 10 times) and elution by ion exchange chromatography (0.3 M to 1 M NaCl).
具体的には、本参考例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。 Specifically, in this reference example, HVJ was purified by a column using the following method.
漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％ ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。 After the chorioallantoic fluid was collected, it was filtered through an 80 μm to 10 μm membrane filter. 0.006-0.008% BPL (final concentration) was added to chorioallantoic fluid (4 ° C., 1 hour) to inactivate HVJ. BPL was inactivated by incubating chorioallantoic fluid at 37 ° C. for 2 hours.
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２％マンニトール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられた。 The solution was concentrated about 10 times by tangential flow ultrafiltration using 500 KMWCO (A / G Technology, Needham, Massachusetts). As a buffer solution, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 2% mannitol, 20 mM Tris (pH 7.5) was used. The HAU assay gave excellent results with almost 100% HVJ recovery.
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。 HVJ was purified by column chromatography (buffer solution: 20 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.2 to 1 M NaCl) by QSepharoseFF (Amersham Pharmacia Biotech KK, Tokyo). The recovery was 40 to 50%, and the purity was 99% or more.
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮した。 The HVJ fraction was concentrated by tangential flow ultrafiltration using 500 KMWCO (A / G Technology).
（３：ＨＶＪの不活性化）
ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。
(3: Inactivation of HVJ)
When inactivation of HVJ was required, it was performed by ultraviolet irradiation or alkylating agent treatment as described below.
（３．１：紫外線照射法）
ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ2を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。
(3.1: UV irradiation method)
1 ml of the HVJ suspension was placed in a petri dish having a diameter of 30 mm and irradiated with 99 or 198 millijoules / cm 2 . Gamma irradiation can also be used (5-20 gray), but complete inactivation does not occur.
（３．２：アルキル化剤による処理）
使用直前に、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ中に０．０１％ β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
(3.2: Treatment with alkylating agent)
Immediately before use, 0.01% β-propiolactone was prepared in 10 mM KH 2 PO. During the work, it was kept at a low temperature and worked quickly.
精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ，１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。 Β-propiolactone was added to a suspension of HVJ immediately after purification to a final concentration of 0.01% and incubated on ice for 60 minutes. Thereafter, it was incubated at 37 ° C. for 2 hours. Dispense 10,000 HAU per tube into an Eppendorf tube, centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, and store the precipitate at -20 ° C. Regardless of the inactivation method described above, the precipitate can be stored at -20 ° C., and the DNA can be directly incorporated by treatment with a surfactant to prepare a vector.
（４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）
保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。
(4: Creation of HVJ envelope vector)
92 μl of a solution containing 200 to 800 μg of foreign DNA was added to the preserved HVJ and well suspended by pipetting. This solution can be stored at −20 ° C. for at least 3 months. When protamine sulfate was added to DNA before mixing with HVJ, the expression efficiency was enhanced by a factor of 2 or more.
この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。 This mixed solution was placed on ice for 1 minute, 8 μl of octyl glucoside (10%) was added, the tube was shaken on ice for 15 seconds, and left on ice for 45 seconds. The treatment time with the surfactant is preferably 1 to 5 minutes. In addition to octylglucoside, Triton-X100 (t-octylphenoxypolyethoxyethanol), CHAPS (3-[(3-colamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid), NP-40 (nonylphenoxypoly) Surfactants such as ethoxyethanol may also be used. Preferred final concentrations of Triton-X100, NP-40 and CHAPS are 0.24-0.80%, 0.04-0.12% and 1.2-2.0%, respectively.
冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。 1 ml of cold BSS was added and immediately centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes. 300 μl of PBS or physiological saline was added to the resulting precipitate and suspended by vortexing and pipetting. The suspension can be used directly for gene transfer or can be used for gene transfer after storage at −20 ° C. This HVJ envelope vector maintained comparable gene transfer efficiency after storage for at least 2 months.
（参考例９：ＨＶＪエンベロープベクターにおけるＦｌとＨＮタンパク質の比率）
（１：サンプルの調製）
（ｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃に保存した。
（ｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外線照射（１９８ミリジュール／ｃｍ2）後、１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。
（ｉｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外線照射（１９８ミリジュール／ｃｍ2）後、１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿にｐｃＬｕｃｉＤＮＡ２００μｇ（溶液９２μｌ）を加えて、ピペッテングで懸濁した。氷上に置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μ１加えて、１５秒間、手でチューブを振盪し、４５秒間氷上静置し、冷ＢＳＳを１ｍｌ加えて、すぐに１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。
( Reference Example 9: Ratio of Fl and HN protein in HVJ envelope vector)
(1: Sample preparation)
(I) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the precipitate was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
(Ii) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent was irradiated with ultraviolet light (198 millijoule / cm 2 ), centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, the precipitate was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
(Iii) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent was irradiated with ultraviolet light (198 millijoule / cm 2 ), centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, 200 μg of pcLuciDNA (92 μl of solution) was added to the precipitate, and suspended by pipetting. Place on ice, add 8 μl of octylglucoside (10%), shake the tube by hand for 15 seconds, leave on ice for 45 seconds, add 1 ml of cold BSS, immediately centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, It was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
（２：タンパク質電気泳動）
３種類のサンプルの５、１０、２０μｌに×５のＬａｅｍｌｉサンプル緩衝液を加え１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動終了後、クマシーブルーで染色し、脱染色後、セロファン紙に張り付けて乾燥させた。
(2: Protein electrophoresis)
A 5% Laemli sample buffer was added to 5, 10, and 20 μl of the three types of samples, and 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After the electrophoresis, it was stained with Coomassie blue, destained, pasted on cellophane paper and dried.
（３：タンパク質同定）
電気泳動し、染色したサンプルをＬＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ）に取り込ませ（図７）、Ｆ１，ＨＮ相当のタンパク質バンドの濃度を測定した。１種類のサンプルにつき、３つの異なる量を泳動し、各々のＦ１／ＨＮ密度を算出し、サンプル毎に平均と標準偏差を求めた。
(3: Protein identification)
The electrophoresed and stained sample was incorporated into LAS2000 (Fuji Film, Tokyo) (FIG. 7), and the concentration of the protein band corresponding to F1 and HN was measured. Three different amounts were run per sample, the F1 / HN density of each was calculated, and the average and standard deviation were determined for each sample.
（４：結果）
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のサンプルでＦ１／ＨＮは、ほぼ１．７で一致した。Ｆ１ ５１ｋＤ、ＨＮ ６８ｋＤａの分子量を考慮すれば、モル比は約２．３となる。Ｆ１、ＨＮを用いた再構成リポソームでの融合の最適値が、Ｆ１／ＨＮが約２で与えられるという報告（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１４２、９５〜１０１、１９８５）とも矛盾しない。他の研究者から報告のある再構成型ではこの比が野生型ウイルスのものと異なる（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、３３１２〜３３１８、１９９３）。その他のタンパク質組成もＨＶＪとＨＶＪエンベロープベクターではほぼ同じであった。
(4: Result)
In the samples (i), (ii), and (iii), the F1 / HN was almost equal to 1.7. Considering the molecular weights of F1 51 kDa and HN 68 kDa, the molar ratio is about 2.3. The optimal value of fusion with reconstituted liposomes using F1 and HN is consistent with the report (Exp. Cell Res. 142, 95-101, 1985) that F1 / HN is given at about 2. This ratio is different from that of the wild-type virus in the rearranged form reported by other researchers (J. Virol. 67, 3312-3318, 1993). Other protein compositions were almost the same for the HVJ and HVJ envelope vectors.
（参考例１０：ＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡの封入及び封入率）
（１：ＨＶＪエンベロープベクター（ＤＮＡ封入、未封入）の電子顕微鏡像）
前述のようにしてｐＳＦＶ−ＬａｃＺ（１４．５ｋｂ）１３０μｇを１０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線不活性化）に封入しＨＶＪエンベロープベクターを作成した。
( Reference Example 10: Encapsulation of DNA in HVJ envelope vector and encapsulation rate)
(1: electron microscope image of HVJ envelope vector (DNA encapsulated, unencapsulated))
As described above, 130 μg of pSFV-LacZ (14.5 kb) was enclosed in 10,000 HAU HVJ (UV-inactivated) to prepare an HVJ envelope vector.
封入後のＨＶＪエンベロープベクターを３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。１０日後、１μｌの懸濁液をグリッド上にのせ、陰性染色法にて電子顕微鏡を用いて観察した。コントロールとしてＤＮＡ未封入のＨＶＪエンベロープベクターを用いた。 The encapsulated HVJ envelope vector was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C. Ten days later, 1 μl of the suspension was placed on a grid and observed with a negative staining method using an electron microscope. As a control, an HVJ envelope vector without DNA encapsulation was used.
（結果）
結果を、図８に示す。ＨＶＪエンベロープベクターは、かつて観察されたＨＶＪウイルスそのものとほぼ外郭は同型のものが多かった。ＤＮＡ未封入のものに比較し、ＤＮＡを用いたものはＨＶＪエンベロープベクター内に電子密度の濃い構造物を認めた。一方、未封入のものは内部の透過性は高く、ウイルスゲノムが破壊されたか、喪失されたと推定された。
(result)
The results are shown in FIG. Many HVJ envelope vectors were of the same type as the HVJ virus itself observed in the past. Compared with DNA-unencapsulated ones, those using DNA showed structures with a higher electron density in the HVJ envelope vector. On the other hand, the unencapsulated one had high internal permeability, and it was estimated that the viral genome was destroyed or lost.
（２：ＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡ封入率）
前述のようにしてｐｃＬｕｃｉ（７．４ｋｂ）１５７μｇを６，７００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線不活性化）に封入して、ＨＶＪエンベロープベクターを作成した。ＨＶＪエンベロープベクターを、３００μｌのＢＳＳに懸濁し、ミクロコッカルヌクレアーゼ１５単位、ＣａＣｌ2 ２ｍＭ、ＲＮａｓｅＡ ２０μｇ／ｍｌ、２０℃、３０分間処理し、ＰＢＳ １リットルに対して透析した（４℃、オーバーナイト）。１％ＳＤＳ、３７℃で、ｌ分間処理した。５００μｌのフェノール、５００μｌクロロホルム−イソアミルアルコールで処理し、その後、エタノール沈殿した。１００μｌのＢＳＳに懸濁し、分光光度計で２６０ｎｍ，２８０ｎｍを測定した。
(2: DNA encapsulation rate in HVJ envelope vector)
As described above, 157 μg of pcLuci (7.4 kb) was encapsulated in HVJ (UV-inactivated) of 6,700 HAU to prepare an HVJ envelope vector. The HVJ envelope vector was suspended in 300 μl of BSS, treated with 15 units of micrococcal nuclease, 2 mM of CaCl 2 , 20 μg / ml of RNase A, 20 ° C., 30 minutes, and dialyzed against 1 liter of PBS (4 ° C., overnight ). Treated with 1% SDS at 37 ° C. for 1 minute. Treatment with 500 μl phenol, 500 μl chloroform-isoamyl alcohol, followed by ethanol precipitation. The sample was suspended in 100 μl of BSS, and 260 nm and 280 nm were measured with a spectrophotometer.
（結果）
回収率が８５．７％であったので、換算すると、ＨＶＪエンベロープベクター中へのＤＮＡの取り込み効率は、３．８％であった。１０，０００ＨＡＵのＨＶＪに、２７９μｇのｐｃＬｕｃｉを取り込ませた場合の取り込み効率は、７．２％であった。
(result)
Since the recovery rate was 85.7%, the conversion efficiency of DNA into the HVJ envelope vector was 3.8%. The uptake efficiency when 279 μg of pcLuci was taken into 10,000 HAU HVJ was 7.2%.
以上より１０，０００ＨＡＵのＨＶＪへのＤＮＡ取り込み効率は、オクチルグルコシドを用いた場合約６〜７％であろうと推定されるが、用いるＤＮＡ量によって多少変化する可能性がある。また硫酸プロタミンをＤＮＡ、ＨＶＪエンベロープベクターと共存させると導入効率が上昇することがわかっているが、これはＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡ封入効率が上昇したためではないかと考えられる。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，ＮＰ−４０ではさらに効率が上がり１０〜４０％程度と推定される。 From the above, the DNA uptake efficiency of 10,000 HAU into HVJ is estimated to be about 6 to 7% when octyl glucoside is used, but it may change somewhat depending on the amount of DNA used. In addition, it has been known that the efficiency of introduction of protamine sulfate in the presence of DNA and HVJ envelope vector increases, but this is considered to be due to the increased efficiency of DNA encapsulation into the HVJ envelope vector. With Triton-X100 and NP-40, the efficiency is further increased, and it is estimated that it is about 10 to 40%.
（参考例１１：ＨＶＪエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
（１：遺伝子導入方法）
１，０００ＨＡＵ分をエッペンドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）５μ１を加えた。ＢＨＫ−２１細胞（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加した。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーター中に１０分間放置した。
( Reference Example 11: Gene transfer into cells using HVJ envelope vector)
(1: Gene transfer method)
1,000 HAU was placed in an Eppendorf tube (30 μl), and 5 μl of protamine sulfate (1 mg / ml) was added. The medium of BHK-21 cells (200,000 per well and spread in 6 wells the day before) was changed, and 0.5 ml of medium (10% FCS-DMEM) was added per well. To each well, add a mixture of the above-mentioned vector (equivalent to 1,000 HAU) and protamine sulfate, mix the vector and cells well by shaking the plate back and forth and left and right for 10 minutes at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. I left it alone.
培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。 The medium was changed, and it was left overnight (16 hr to 24 hr) in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. to examine gene expression. In the case of luciferase (pcLuci; luciferase gene having a CMV promoter), the cells were lysed with 0.5 ml of Cell Lysis Buffer (Promega), and the activity in a 20 μl solution was measured using a luciferase assay kit (Promega). In the case of green fluorescent protein (pCMV-GFPE; Promega), it was directly observed with a fluorescence microscope, 5 to 8 fields were observed at 400 magnifications, and the ratio of cells that emitted fluorescence was calculated.
（２：培養細胞における導入効率に与える条件の検討）
培養細胞はＢＨＫ−２１細胞を用いた。
(2: Examination of conditions for introduction efficiency in cultured cells)
BHK-21 cells were used as cultured cells.
（２．１：ＨＶＪエンベロープベクター作成におけるオクチルグルコシド（ＯＧ）濃度の検討）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、各濃度（ＨＶＪエンベロープベクターの作成時に用いたＯＧの最終濃度）のオクチルグルコシド（ＯＧ）の影響を調べた：
（Ａ）オクチルグルコシド濃度：１、２、３％；
ＨＶＪエンベロープベクター作成時に、不活性化ＨＶＪをＯＧによって処理した時間：１分間、５分間、１０分間；
超音波処理を行ったか（ｓｏｎｉｃ）、または行わなかった。
（Ｂ）オクチルグルコシド濃度：０．１２５〜１．２５％；
トランスフェクションに用いたベクターの容量：１０μｌ、１００μｌ。（Ｃ）オクチルグルコシド：０．５５〜０．８％；
トランスフェクションの時間：３０分間、オーバーナイト（Ｏ／Ｎ）。
結果を図９に示す。
(2.1: Examination of octylglucoside (OG) concentration in HVJ envelope vector preparation)
The effect of octyl glucoside (OG) at each concentration (final concentration of OG used when creating the HVJ envelope vector) on gene transfer using the HVJ envelope vector was investigated by making the following changes to the gene transfer method of (1). Was:
(A) Octyl glucoside concentration: 1, 2, 3%;
Time when inactivated HVJ was treated with OG when creating the HVJ envelope vector: 1 minute, 5 minutes, 10 minutes;
Sonication was performed or not performed.
(B) Octyl glucoside concentration: 0.125-1.25%;
Volume of vector used for transfection: 10 μl, 100 μl. (C) Octyl glucoside: 0.55 to 0.8%;
Transfection time: 30 minutes, overnight (O / N).
The results are shown in FIG.
（２．２：細胞への遺伝子導入条件、硫酸プロタミン（ＰＳ）の濃度・処理時間）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、硫酸プロタミンの影響を調べた：
（Ａ）硫酸プロタミン：０〜１００μｇ／ｍｌ培地；
トランスフェクションの時間：２０、４０、６０分間。
（Ｂ）硫酸プロタミン：０〜４０μｇ／ｍｌ培地；
トランスフェクションの時間：５、１０、２０分間。
結果を図１０に示す。
(2.2: Conditions for gene introduction into cells, concentration of protamine sulfate (PS) and treatment time)
The effect of protamine sulfate on gene transfer using the HVJ envelope vector was examined by making the following changes to the gene transfer method of (1):
(A) Protamine sulfate: 0-100 μg / ml medium;
Transfection time: 20, 40, 60 minutes.
(B) Protamine sulfate: 0 to 40 μg / ml medium;
Transfection time: 5, 10, 20 minutes.
The results are shown in FIG.
（２．３：ＨＶＪエンベロープベクターに封入するＤＮＡ濃度の遺伝子発現量に対する効果）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、実験に使用したＤＮＡ量の影響を調べた：
（Ａ）ＤＮＡ量：２０〜２００μｇ；
ＨＶＪエンベロープベクターを−２０℃または−８０℃で５日間保存した。
（Ｂ）ＤＮＡ量：１８０〜３６０μｇ／ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ。
結果を図１１に示す。
(2.3: Effect of DNA concentration enclosed in HVJ envelope vector on gene expression level)
The effect of the amount of DNA used in the experiment on the gene expression level by the HVJ envelope vector was investigated by making the following changes to the gene introduction method of (1):
(A) DNA amount: 20-200 μg;
The HVJ envelope vector was stored at -20 ° C or -80 ° C for 5 days.
(B) DNA amount: 180-360 μg / HVJ 10,000 HAU.
The results are shown in FIG.
（２．４：遺伝子導入に用いるＨＶＪ力価の、遺伝子発現量に対する影響）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、遺伝子導入に用いるＨＶＪ力価の影響を調べた：
５，０００、１０，０００、２０，０００ＨＡＵの力価のＨＶＪを用いてＨＶＪエンベロープベクターを調製し、その各々の、２５０、５００、１，０００、２，０００ＨＡＵに相当する量を用いて、ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。
結果を図１２に示す。
(2.4: Effect of HVJ titer used for gene transfer on gene expression level)
The effect of the HVJ titer used for gene introduction on the gene expression level by the HVJ envelope vector was examined by making the following changes to the gene introduction method of (1):
HVJ envelope vectors were prepared using HVJ with titers of 5,000, 10,000, and 20,000 HAU, and amounts corresponding to 250, 500, 1,000, and 2,000 HAU of each were used for BHK. -21 cells were transfected.
The results are shown in FIG.
（２．５：ＨＶＪエンベロープベクター遺伝子導入効率に対する、ＨＶＪ不活性化条件の影響）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＢＨＫ−２１細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現に対する、ＨＶＪの不活性化方法（ＵＶまたはβ−プロピオラクトン）の効果を調べた。
（Ａ）ＵＶ不活性化のための照射量：０〜２３１ミリジュール／ｃｍ2。
（Ｂ）ＨＶＪ処理に用いたβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）濃度：０〜０．０２５％。
結果を図１３に示す。
(2.5: Effect of HVJ inactivation conditions on HVJ envelope vector gene transfer efficiency)
The effect of the HVJ inactivation method (UV or β-propiolactone) on luciferase gene expression in BHK-21 cells was examined by making the following changes to the gene introduction method of (1).
(A) Irradiation dose for UV inactivation: 0 to 231 millijoules / cm 2 .
(B) β-propiolactone (BPL) concentration used for HVJ treatment: 0 to 0.025%.
The results are shown in FIG.
（参考例１２：ＨＶＪエンベロープベクターの各種細胞への遺伝子導入）
ヒト舌部の扁平上皮癌（ＳＡＳ）へ、参考例１１に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図１４に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図１４に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、２００μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使用し、６０分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。
( Reference Example 12: Gene transfer of HVJ envelope vector into various cells)
The gene was transferred to squamous cell carcinoma (SAS) of the human tongue by the method described in Reference Example 11. The results are shown in FIG. The concentration of protamine sulfate and the incubation time at the time of transfection during gene introduction were changed as shown in FIG. 14, and the efficiency of gene introduction was measured by the expression of the luciferase gene. Within the range of transfection conditions, 200 μg / ml of protamine sulfate was used, and when transfection was performed for 60 minutes, the gene transfer efficiency was maximum, but if the protamine sulfate concentration was further increased, Further increase in gene transfer efficiency is expected.
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）へ、参考例１１に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図１５に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図１５に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、１００μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使用し、６０分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。 Genes were introduced into human aortic endothelial cells (HAEC) by the method described in Reference Example 11. The results are shown in FIG. The concentration of protamine sulfate and the incubation time at the time of transfection during gene introduction were varied as shown in FIG. 15, and the efficiency of gene introduction was measured by the expression of the luciferase gene. Within the range of the transfection conditions, 100 μg / ml protamine sulfate was used and the transfection treatment was performed for 60 minutes, but the gene transfer efficiency was maximum. However, if the protamine sulfate concentration was further increased, Further increase in gene transfer efficiency is expected.
（参考例１３：ＨＶＪエンベロープベクターの各種生体組織内への遺伝子導入）
本参考例では、参考例１１に記載のＨＶＪエンベロープベクターを用いる、種々の生体内組織への遺伝子導入を例示する。
( Reference Example 13: Gene transfer of HVJ envelope vector into various living tissues)
In this reference example, gene introduction into various in vivo tissues using the HVJ envelope vector described in Reference Example 11 is exemplified.
（１３．１：マウス肝臓）
ＨＶＪエンベロープベクターを、０．８％のオクチルグルコシドおよび２００μｇのｐｃＬｕｃｉを氷上に１分間放置し、そして３００μｌのＰＢＳに懸濁することによって調製した。調製懸濁液の１／１０量（１，０００ＨＡＵに相当）３０μｌを、７０μｌのＰＢＳで希釈し（全量１００μｌ）、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂｅ）の１つに注入した。
(13.1: Mouse liver)
The HVJ envelope vector was prepared by leaving 0.8% octyl glucoside and 200 μg pcLuci on ice for 1 minute and suspending in 300 μl PBS. 30 μl of 1/10 volume of the prepared suspension (corresponding to 1,000 HAU) was diluted with 70 μl PBS (
ＨＶＪ−ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）リポソームを、２００μｇのｐｃＬｕｃｉを用いて、ボルテックス／排出（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ／ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、その後のスクロース勾配遠心分離（６２，０００ｇ、９０分間）によって調製した。次に、この調製物を、遠心分離（２７，０００ｇ、３０分間）によってペッレトとし、そして５００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。このサンプルの１００μｌをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂｅ）の１つに注入した。 HVJ-AVE (Artificial Viral Envelop) liposomes were prepared by vortexing / extrusion followed by sucrose gradient centrifugation (62,000 g, 90 min) using 200 μg pcLuci. The preparation was then pelleted by centrifugation (27,000 g, 30 minutes) and suspended in 500 μl of PBS. 100 μl of this sample was injected into one of the mouse (C57BL / 6) liver lobes.
２４時間後、注入された肝臓葉を単離して、その葉のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてアッセイした。結果を図１６Ａに示す。この結果から、明らかなように、本発明のＨＶＪエンベロープベクターは、従来のＨＶＪ−ＡＶＥリポソームと比べて約２倍の顕著に高い遺伝子導入効率を示した。 After 24 hours, injected liver lobes were isolated and the luciferase activity of the leaves was assayed using the Promega Luciferase Assay System. The results are shown in FIG. 16A. As is clear from this result, the HVJ envelope vector of the present invention showed a gene transfer efficiency that was significantly higher than that of the conventional HVJ-AVE liposome by about 2 times.
（１３．２：マウス子宮）
１３．１と同様にＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌと１００μｌのサンプルを、ＰＢＳで希釈して５００μｌとし、マウスのファローピウス管に注入し、子宮頸を１０分間結紮した。２４時間後、マウス子宮を単離して、葉および子宮のルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてアッセイした。結果を図１６Ｂに示す。本発明のＨＶＪエンベロープベクターによって、マウス子宮への遺伝子導入が可能であったが、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを用いた方法では、検出可能な程度の子宮組織への遺伝子導入が見出されなかった。
(13.2: Mouse uterus)
An HVJ envelope vector was prepared in the same manner as in 13.1. 50 μl and 100 μl samples were diluted with PBS to 500 μl, injected into the mouse fallopian tube, and the cervix was ligated for 10 minutes. Twenty-four hours later, mouse uterus was isolated and leaf and uterine luciferase activity was assayed using the Promega Luciferase Assay System. The results are shown in FIG. 16B. Although gene transfer into the mouse uterus was possible with the HVJ envelope vector of the present invention, no detectable gene transfer into the uterine tissue was found by the method using HVJ-AVE liposomes.
ｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを１３．１と同様に調製した。ＬａｃＺ発現のために、ｐＥＢ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ（１３ｋｂ）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを、２００μｇのプラスミドを使用して調製した。これら各ベクターを含有するＨＶＪエンベロープベクターを上記のように子宮に注入した。結果を、図１６Ｃに示す。ＬａｃＺ染色によって、主に子宮内膜の腺上皮でのＬａｃＺ遺伝子の発現が検出された。 An HVJ envelope vector containing pcLuci was prepared as in 13.1. For LacZ expression, an HVJ envelope vector containing pEB-CMV-LacZ (13 kb) was prepared using 200 μg of plasmid. HVJ envelope vectors containing each of these vectors were injected into the uterus as described above. The results are shown in FIG. 16C. LacZ staining detected the expression of the LacZ gene mainly in the endometrial glandular epithelium.
（１３．３：ラット脳）
上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ｐＥＧＦＰ−１（クラゲのグリーン蛍光タンパク質遺伝子（約０．７ｋｂ）を、サイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクターに組み込んだベクター；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡより入手可能）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製した。３０μｌのベクター（調製物の１／１０であり、１，０００ＨＡＵに相当）をＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）に、頸動脈注入、または大槽より髄腔内注入した。遺伝子導入の３〜４日後、ラットを屠殺し、脳切片を固定化することなく調製し、そして蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。図１６Ｄに示される結果のように、頚動脈注入及び大槽より髄腔内注入のいずれの場合も、脳内におけるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現が認められた。これに対して、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを用いて、同様の遺伝子導入をラット頚動脈より行った場合、脳内でのＧＦＰ発現は、認められなかった。
(13.3: Rat brain)
PEGFP-1 (the jellyfish green fluorescent protein gene (approximately 0.7 kb) was incorporated into an expression vector having a cytomegalovirus promoter by a method similar to the preparation of the HVJ envelope vector containing pcLuci described above. HVJ envelope vector containing vector (available from Clontech, Palo Alto, CA) was prepared. 30 μl of vector (1/10 of the preparation, equivalent to 1,000 HAU) was injected into SD rats (Sprague-Dawley rats) via carotid artery injection or intrathecal injection from the cisterna magna. Three to four days after gene transfer, rats were sacrificed, brain sections were prepared without fixation, and fluorescence was observed under a fluorescence microscope. As in the results shown in FIG. 16D, expression of green fluorescent protein (GFP) in the brain was observed in both cases of carotid artery injection and intrathecal injection from the cisterna. In contrast, when HVJ-AVE liposomes were used to introduce the same gene from the rat carotid artery, GFP expression in the brain was not observed.
（１３．４：ウサギ眼）
ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にヒトＨＧＦ（肝細胞増殖因子）遺伝子の変異体であるＮＫ４ ｃＤＮＡ（１．４ｋｂ）をクローニングして構築されたｐＣＭＶ−ＮＫ４を、大阪大学医学系研究科の中村敏一教授らより分与していただいた。
(13.4: Rabbit eyes)
pCMV-NK4 constructed by cloning NK4 cDNA (1.4 kb), which is a mutant of the human HGF (hepatocyte growth factor) gene, at the HindIII / XbaI site of pCDNA3 (In Vitrogen, San Diego, Calif.) Produced by Prof. Toshikazu Nakamura, Graduate School of Medicine.
４００μｇまたは８００μｇいずれかのｐＣＭＶ−ＮＫ４を用いて、１０，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪを用いた以外は、上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ＨＶＪエンベロープベクターを調製した。ｐＣＭＶ−ＮＫ４は、ＨＧＦ機能を阻害する変異型ＨＧＦを発現するベクターである。５０μｌのベクター（調製物の１／６）を、新血管形成を誘導するために組換えＶＥＧＦのペレットで処理した、ウサギの角膜組織中に注入した。処置の７日後、ウサギを、屠殺し、目の中の新血管形成を観察した。結果を図１６Ｅに示す。ｐＣＭＶ−ＮＫ４が容量依存的にＶＥＧＦによって誘導された血管新生を抑制した。 The HVJ envelope was prepared in the same manner as the HVJ envelope vector containing pcLuci described above, except that 10,000 HAU inactivated HVJ was used with either 400 μg or 800 μg pCMV-NK4. Vector was prepared. pCMV-NK4 is a vector that expresses mutant HGF that inhibits HGF function. 50 μl of vector (1/6 of the preparation) was injected into rabbit corneal tissue treated with a pellet of recombinant VEGF to induce neovascularization. Seven days after treatment, the rabbits were sacrificed and observed for neovascularization in the eyes. The result is shown in FIG. 16E. pCMV-NK4 suppressed angiogenesis induced by VEGF in a dose-dependent manner.
（１３．５：ラット肺動脈）
上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＬａｃＺ遺伝子を有するｐＳＶ−ＬａｃＺ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌのベクター（調製物の１／６）をラットの気管に注入した。遺伝子導入の３日後、ラットを屠殺し、組織を１％のグルタルアルデヒドを用いて固定化し、動脈中のＬａｃＺの発現を、Ｘ−ｇａｌを用いて可視化した。結果を図１６Ｆに示す。気管支上皮にＬａｃＺ染色を認めた。また、肺動脈からＨＶＪエンベロープベクターを導入したときも気管支上皮に遺伝子発現を認めた（データを示さず）。
(13.5: Rat pulmonary artery)
An HVJ envelope vector containing pSV-LacZ (Promega, Madison, WI) having a LacZ gene under the control of the SV40 promoter was prepared in the same manner as the HVJ envelope vector containing pcLuci described above was prepared. did. 50 μl of vector (1/6 of the preparation) was injected into the rat trachea. Three days after gene transfer, the rats were sacrificed, the tissues were fixed with 1% glutaraldehyde, and the expression of LacZ in the arteries was visualized with X-gal. The results are shown in FIG. 16F. LacZ staining was observed in the bronchial epithelium. In addition, gene expression was also observed in bronchial epithelium when HVJ envelope vector was introduced from pulmonary artery (data not shown).
（参考例１４：ウイルスエンベロープベクターのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としての機能）
本発明の遺伝子導入ベクターは、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸治療のためのドラッグデリバリーシステムとしても有用である。
( Reference Example 14: Function as a drug delivery system (DDS) of a virus envelope vector)
The gene transfer vector of the present invention is also useful as a drug delivery system for oligonucleotide or decoy nucleic acid therapy.
（１４．１：蛍光オリゴヌクレオチドの導入）
本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入を行った。
(14.1: Introduction of fluorescent oligonucleotide)
Using the virus envelope vector of the present invention, fluorescently labeled oligonucleotides were introduced into cells.
ＦＩＴＣで５’をラベルした２０マーのオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＴＴｇＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’）１９４μｇ／９２μ１ ＢＳＳを１０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線１９８ミリジュール／ｃｍ2で不活性化）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を添加し、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿に１００μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃保存した。１ヶ月後、融解し、１０μｌ分を５μｇの硫酸プロタミンと混合し、５００万個のＢＨＫ−２１細胞（０．５ｍｌ倍地中）とインキュベート（１０分、６０分）した。導入翌日に蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察したところ、図１７Ｂに示すように、１０分では１０％程度のオリゴヌクレオチド導入効率であったが、図１７Ａに示すように、６０分では８０％以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた。
20-mer oligonucleotide labeled 5 ′ with FITC (5′-CCTTgAAGGGATTCCCTCC-3 ′) 194 μg / 92 μl BSS was mixed with a precipitate of 10,000 HAU HVJ (inactivated with
（１４．２：Ｓｔａｔ６デコイ核酸による接触性皮膚炎の治療）
本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞へのデコイ核酸の導入を行った。
(14.2: Treatment of contact dermatitis with Stat6 decoy nucleic acid)
The viral envelope vector of the present invention was used to introduce decoy nucleic acid into cells.
Ｓｔａｔ６のＤＮＡ結合配列をもつ二重鎖核酸（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＡＴ−３’および３’−ＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡ−５’、（Ｗａｎｇ，ＬＨら、：Ｂｌｏｏｄ ９５、１２４９〜１２５７、 ２０００））２５０μｇ／３００μｌ ＢＳＳを３０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2で不活性化）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終濃度 ０．２４％）を添加し、氷上で１分間処理し、ｌｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えて−２０℃保存した。このＨＶＪエンベロープベクターを、マウスの皮下注入に用いたところ、ＩｇＥ誘発のアレルギーと遅延型皮膚反応を抑制した。
Double-stranded nucleic acid (5′-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT-3 ′ and 3′-CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA-5 ′, (Wang, LH et al., Blood 95, 1249 to 1257, 2000)) 250 μg / 300 μl with Stat6 DNA binding sequence Mix with precipitation of 30,000 HAU HVJ (inactivated with
（参考例１５：浮遊系細胞への遺伝子導入）
ヒト白血病細胞様であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６、Ｋ−５６２を対象として遺伝子導入実験を行った。
( Reference Example 15: Gene transfer to suspension cells)
Gene transfer experiments were conducted on human leukemia cell-like CCRF-CEM, NALM-6, and K-562.
ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ２００μｇ（９２μｌ）を１０，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を加え、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えてＨＶＪエンベロープベクターを調製した。ベクター６０μｌ（２，０００ＨＡＵ相当）、硫酸プロタミン、および４００万個の浮遊系細胞を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で混合し、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分、２０℃の遠心を行った。その後、沈殿に培養液を加え、培養皿に移し、１日後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。
200 μg (92 μl) of pCMV-Luciferase is mixed with 10,000 HAU of inactivated HVJ (99 millijoules / cm 2 UV), Triton X-100 (0.24%, final concentration) is added and on ice for 1 minute After treatment, 1 ml of BSS was added and centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). HVJ envelope vector was prepared by adding 300 μl of PBS to the precipitate.
使用した細胞株は、ＨＶＪ−リポソームや既存のリポソーム試薬（Ｇｉｂｃ ＢＲＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなど）を用いた場合には導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）であるが、図１８に示すように、これら細胞株に対する高効率の遺伝子導入が観察された。 The cell line used is a cell line (especially CCRF-CEM, NALM-6) with very low introduction efficiency when HVJ-liposomes or existing liposome reagents (Gibc BRL Lipofectin, Lipofectamine, etc.) are used. As shown in FIG. 18, highly efficient gene transfer into these cell lines was observed.
好ましい遺伝子導入の条件は、硫酸プロタミン６００〜１，０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１０，０００ｒｐｍまたは１５，０００ｒｐｍで、１０分間、２０℃での遠心をする条件であった。ＨＶＪエンベロープベクターによる有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンの添加の両方が、遺伝子導入に必要であった。 The preferable conditions for gene transfer were conditions in which 600 to 1,000 μg / ml of protamine sulfate was added and the centrifugation was performed at 10,000 rpm or 15,000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. No significant cytotoxicity was observed with the HVJ envelope vector. Moreover, both centrifugation and addition of protamine sulfate were necessary for gene transfer.
（参考例１６：癌組織への遺伝子導入）
ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ３５４μｇ（９２μｌ）を３４，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を添加して、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分間、２０℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃で保存した。１日後、硫酸プロタミン５００μｇ／ｍｌ、または１０００μｇ／ｍｌと混合し、その１００μ１をマウスメラノーマＢ１６−Ｆｌの腫瘍塊（径７〜８ｍｍ）に注入し、１日後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１９に示すように、腫瘍塊での遺伝子発現がみられた。好ましい硫酸プロタミン濃度は、５００μｇ／ｍｌであった。しかし、これより低い硫酸プロタミン濃度では、遺伝子発現を検出できなかった。
( Reference Example 16: Gene transfer to cancer tissue)
354 μg (92 μl) of pCMV-Luciferase is mixed with 34,000 HAU of inactivated HVJ (99 millijoules / cm 2 UV), Triton X-100 (0.24%, final concentration) is added, and 1 on ice. 1 minute of BSS was added and centrifuged (10,000-15,000 rpm, 10 minutes, 20 ° C.). 300 μl of PBS was added to the precipitate and stored at −20 ° C. One day later, protamine sulfate was mixed with 500 μg / ml or 1000 μg / ml, and 100 μl thereof was injected into a tumor mass (diameter: 7 to 8 mm) of mouse melanoma B16-Fl, and luciferase activity was measured one day later. As shown in FIG. 19, gene expression was observed in the tumor mass. A preferred protamine sulfate concentration was 500 μg / ml. However, gene expression could not be detected at lower protamine sulfate concentrations.
（実施例１：ヘルペスウイルスエンベロープベクターの調製）
（１．１：不活性化ウイルスの調製）
１型単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）（１０10プラーク形成単位／ｍ１）を大阪大学医学系研究科細菌学講座の山西教授より供与された。このウイルスの不活性化条件を培養サル細胞（Ｖｅｒｏ細胞）におけるウイルスのプラーク形成により検討した。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）０．０５％を用いたウイルスの不活性化では、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークの出現頻度が、９．ｌ×ｌ０-4（プラーク／Ｖｅｒｏ細胞）であった。一方、紫外線２００および４００ミリジュール／ｃｍ2照射でのウイルスの不活性化は、それぞれ４．
３×１０-4、２．２×１０-6（プラーク／Ｖｅｒｏ細胞）であった。
(Example 1 : Preparation of herpesvirus envelope vector)
(1.1: Preparation of inactivated virus)
They were 3 × 10 −4 and 2.2 × 10 −6 (plaque / Vero cells).
（１．２：不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入）
１００μ１のＨＳＶ−１（１０9粒子）を６２０μ１のＰＢＳで希釈後、紫外線４００ミリジュール／ｃｍ2照射し、その１０％量（７２μ１）とＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ８．８３μｇ／μｌ）と混合し、氷上で３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を８μ１加え（最終濃度、０．２４％）、その１、２、３、４、５、６分後に１ｍｌのＰＢＳを添加して希釈した。各サンプルの１００μ１をそのままＢＨＫ−２１細胞（６ウェルプレート中）に導入した。細胞は１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥ）０．５ｍ１／ウェルで培養した。また、別の実験において、各サンプルの１００μｌを硫酸プロタミン５μｇと混合後、ＢＨＫ−２１に導入した。３７℃、５％ ＣＯ2のインキュベーター中で６０分問放置後、培養液を１０％ＦＣＳ−ＤＭＥと交換した。２２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図２０に示すように、本発明の方法を用いて調製されたヘルペスウイルスエンベロープベクターによる高効率の遺伝子導入が確認された。各サンプルとも形態学的な観察による細胞毒性は認められなかった。
(1.2: Gene Transfer using inactivated virus)
100 μl HSV-1 (10 9 particles) was diluted with 620 μl PBS, irradiated with 400 millijoules / cm 2 of ultraviolet light, mixed with 10% amount (72 μl) and DNA (pCMV-Luciferase 8.83 μg / μl). Then, 8 μl of 3% Triton-X100 was added on ice (final concentration, 0.24%), and 1, 2, 3, 4, 5 and 6 minutes later, 1 ml of PBS was added for dilution. 100 μl of each sample was directly introduced into BHK-21 cells (in a 6-well plate). The cells were cultured in Dulbecco's minimal essential medium (DME) 0.5 ml / well containing 10% fetal calf serum (FCS). In another experiment, 100 μl of each sample was mixed with 5 μg of protamine sulfate and then introduced into BHK-21. After leaving to stand for 60 minutes in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 , the culture medium was replaced with 10% FCS-DME. The luciferase activity was measured after 22 hours. As shown in FIG. 20, high-efficiency gene transfer was confirmed using a herpesvirus envelope vector prepared using the method of the present invention. In each sample, no cytotoxicity was observed by morphological observation.
次に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で５分間処理したヘルペスウイルスエンベロープベクターを−８０℃で２日間保存後、解凍し、再度ＢＨＫ−２１細胞に添加して導入効率を測定した。今回は導入６０分後に１０％ＦＣＳ−ＤＭＥ ２．５ｍｌ／ウェルを加えて一晩培養して活性を測定した。血清の影響、ベクター量について検討した。 Next, the herpesvirus envelope vector treated with Triton-X100 for 5 minutes was stored at −80 ° C. for 2 days, thawed, added again to BHK-21 cells, and the introduction efficiency was measured. In this case, 60 minutes after introduction, 2.5 ml / well of 10% FCS-DME was added and cultured overnight to measure the activity. The influence of serum and the amount of vector were examined.
図２１に示すように、−８０℃で２日間保存後であっても、なお高効率の遺伝子導入が確認された。血清１０％を加えた培地を用いたものが、無血清培地よりも導入効率が高く、ベクター溶液２００μ１（推定量：２．８×１０7ウイルス粒子／ウェル）が１００μ１溶液（推定量：１．４×１０7ウイルス粒子／ウェル）より遺伝子導入活性が高かった
。
As shown in FIG. 21, highly efficient gene transfer was still confirmed even after storage at −80 ° C. for 2 days. The medium using 10% serum added has higher introduction efficiency than the serum-free medium, and the
（１．３：不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入）
上記の開示より、この界面活性剤を用いてエンベロ一プベクターを作成する技術はＨＶＪのみでなく、広く脂質膜を有するエンベロープウイルスに適用可能であることが当業者に明らかである。従って、当業者が本発明の開示に従って、他のエンベロープウイルスを用いて、容易に遺伝子導入のためのエンベロ一プベクターを調製し得ることが明らかである。従って、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、ヘパドナウイルス科などのウイルスのエンベロープベクターが作成可能である。これによりウイルスの有する組織指向性を利用した特定の臓器への標的導入が実現可能と考えられる。たとえば単純疱疹ウイルスのエンベロープベクターは神経指向性のベクターとして、エプスタイン−バーウイルスのエンベロープベクターはＢリンパ球指向性のベクターとして、インフルエンザのエンベロープベクターは呼吸器指向性ベクターとして応用し得る。
(1.3: Gene Transfer using inactivated virus)
From the above disclosure, it will be apparent to those skilled in the art that the technique for producing an envelope vector using this surfactant is applicable not only to HVJ but also to envelope viruses having a wide lipid membrane. Therefore, it is clear that those skilled in the art can easily prepare an envelope vector for gene transfer using other enveloped viruses according to the disclosure of the present invention. Therefore, Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae, Hepadnavirus Envelope vectors for viruses such as families can be created. Thus, it is considered possible to introduce a target into a specific organ using the tissue directivity of the virus. For example, the herpes simplex virus envelope vector can be applied as a neurotrophic vector, the Epstein-Barr virus envelope vector as a B lymphocyte-directed vector, and the influenza envelope vector as a respiratory directional vector.
上記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的について本明細書に記載されるが、種々の改変が、本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得ることは、明らかである。具体的には、本明細書の参考例は、不活性化ＨＶＪを用いた遺伝子導入ベクターについて記載されてきたが、同様の調製方法を用いて、ＨＶＪ以外のウイルスを不活性化して本発明の遺伝子導入ベクターを調製すること、および不活性化工程を行わずに本発明の遺伝子導入ベクターを調製することは、本明細書の開示から当業者に明らかである。したがって、本発明は、添付の請求の範囲以外によっては限定されない。 From the foregoing, it will be apparent that while particular embodiments of the invention are described herein for purposes of illustration, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Specifically, the reference example of the present specification has been described for a gene transfer vector using inactivated HVJ. However, by using a similar preparation method, a virus other than HVJ is inactivated and the present invention is used. It will be apparent to those skilled in the art from the disclosure herein that the gene transfer vector is prepared and the gene transfer vector of the present invention is prepared without performing an inactivation step. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
Claims (8)
所望の外来遺伝子を含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクターを調製する工程、
該遺伝子導入ベクターによって、該単離された動物組織に遺伝子を導入する工程、
を包含する、方法。 A method for introducing a gene into an isolated animal tissue, comprising:
A step of preparing the gene transfer vector according to any one of claims 1 to 4 , which contains a desired foreign gene.
Introducing a gene into the isolated animal tissue with the gene transfer vector;
Including the method.
該浮遊細胞と請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミン存在下で混合する工程、
該混合液を遠心する工程
を包含する、方法。
A method for introducing a foreign gene into a floating cell, comprising:
A step of mixing the floating cells and the gene transfer vector according to any one of claims 1 to 4 in the presence of protamine sulfate,
A method comprising centrifuging the mixture.
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