JP3744583B2

JP3744583B2 - GENE TRANSFER COMPOSITION AND GENE TRANSFER METHOD USING THE COMPOSITION

Info

Publication number: JP3744583B2
Application number: JP04525296A
Authority: JP
Inventors: 安史金田; 吉和米満; 護長谷川
Original assignee: 株式会社ディナベック研究所; 安史金田; 吉和米満
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1996-03-01
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: JPH09234069A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子工学分野、例えば遺伝子治療の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬物治療において、薬物（特に高分子化合物）を目的とする細胞又は細胞内組織に到達させるシステム、すなわちドラッグデリバリーシステム（Drug Delivery System;以下単にDDSと言う）は重要な技術である。遺伝子治療においても、DDSを利用して遺伝子を所望の細胞に導入することが中心的な技術であることは言うまでもない。細胞内に遺伝子を導入するための方法は大きく二つに分類することができる。
【０００３】
一つは、ウイルスベクターを用いる方法である。これには、所望の外来性遺伝子をゲノム上に有するウイルスを感染させることにより、内部の核酸を細胞内に導入するという方法が含まれる。
【０００４】
もう一つは、人工的なまたは半人工的な輸送担体（キャリアー）に、所望の遺伝子または該遺伝子を含むベクターを封入または担持させる方法である。この方法は、目的物の生体内挙動および輸送に関与する諸過程を、キャリアー自体の物理化学的性質に依存させることにより、生理活性物質を所望の臓器（標的臓器）、細胞（標的細胞）または細胞内器官（標的器官）に到達せしめることを特徴とする。この方法におけるキャリアーとしては例えば、タンパク質（Human Gene Therapy,5,429,1994)、ペプチド（Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America,90,893,1993)、合成高分子化合物（The Journal of Biological Chemistry,269,12918,1994)、リポソーム（Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America,92,1774,1995)およびセンダイウイルス（Exp. Cell Res.,159,399,1985)などを例示することができる。
【０００５】
キャリアとしてリポソームを用いる方法には、様々な工夫が施されてきた。その一つにカチオン性脂質を利用する方法がある。この方法では、通常、リポソーム、カチオン性脂質及び核酸の混合物が利用されている（Felgner,P.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987))。
【０００６】
更に、センダイウイルス（HVJ)は生体に対する毒性が少なく細胞親和性が高いので、キャリアとして大いに有用である。センダイウイルスをキャリアとして用いる際は、通常、不活性化したセンダイウイルス粒子、リポソーム及び核酸を混合した組成物（膜融合リポソーム）が利用されている（金田安史：BIOTHERAPY,8,1265(1994))。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記カチオン性脂質とDNAとの複合体は、DNAの封入効率は高いものの、エンドサイトーシス過程を経て細胞内に取り込まれる。そのため、かなりの比率の脂質／DNA複合体が、細胞内のエンドソーム等で分解されてしまう。また、それを回避するために多量の脂質／DNA複合体を投与した場合には、カチオン性脂質の細胞障害性が顕著に現れるため、実際に使用できる濃度が限られていた。更に、カチオン性脂質は、生体内および培地中の成分と複合体を形成して沈殿を生じるため、生体内に投与する場合および培地中で使用する場合は、遺伝子導入効率が著しく低下してしまった。そこで、細胞質内へ効率良く遺伝子を導入できるシステムの開発が必要とされていた。
【０００８】
一方、センダイウイルスが細胞に融合する性質を利用した、前述のHVJ-膜融合リポソームを利用することで、細胞質内へ効率良く遺伝子を導入することが可能であるが、従来のHVJ-膜融合リポソームはDNAの封入効率が低いため、大量に投与した場合には、宿主細胞同士が細胞融合を起こす可能性が高く、実用に際して問題があった。（なお、封入効率が低いのは、HVJ-膜融合リポソームを作製する際に用いるリポソーム（アニオン性脂質）とＤＮＡとの静電的反発等によって、リポソーム内に効率良くDNAを封入できないことに原因がある。）
そこで、DNAを高い確率で封入すると同時に高い導入効率を達成する遺伝子導入用組成物が希求されていた。
【０００９】
本発明は、効率よく遺伝子を細胞内に導入するための組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、該組成物を用いた遺伝子導入方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ウイルス粒子またはウイルス粒子由来のタンパク質、カチオン性脂質及び核酸を含む組成物またはその溶解物を細胞に適用すると、該核酸が細胞に導入される割合が顕著に上昇することを見いだし、本発明を完成した。即ち、本発明は、以下のものを含む。
（１）ウイルス粒子またはウイルス由来の細胞親和性を有するタンパク質、カチオン性脂質及び核酸を含む遺伝子導入用組成物。
（２）ウイルス粒子がエンベロープを有するものである、（１）記載の組成物。
（３）カチオン性脂質がコレステロール骨格を有するものである、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）カチオン性脂質が［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）である、（３）に記載の組成物。
（５）カチオン性脂質がグルタミン酸骨格を有するものである、（１）または（２）に記載の組成物。
（６）カチオン性脂質が塩化Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタミン酸（TMAG）である、（５）に記載の組成物。
（７）カチオン性脂質が４級アンモニウム塩である、（１）または（２）に記載の組成物。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物を用いることを特徴とする、核酸またはその誘導体を細胞内に導入する方法。
【００１１】
なお、本発明において、ウイルス粒子とは、増殖能を有するウイルス粒子、ウイルス膜タンパク質と脂質により再構成された粒子の他、紫外線照射等によって不活化し、増殖能を失ったウイルス粒子も含まれる。ウイルス粒子の不活化は、紫外線照射、放射線照射等の物理的方法、酵素および抗ウイルス剤による処理等の化学的方法、遺伝子組換え技術を用いた分子生物学的方法等で行うことができる。
【００１２】
更に、本発明において、核酸とは、環状および直鎖状の１本鎖または２本鎖の、DNAおよびRNAもしくはそのキメラ体を意味し、エステル化、チオリン酸化等の方法によって化学的に修飾された核酸を意味する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるウイルス粒子としては、エンベロープタンパク質を有するものが好適である。たとえば、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス科、フィロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ポックスウイルス科、バキュロウイルス科、イリドウイルス科の各種ウイルスのものが好適に用いられる。また、本発明に用いられるウイルス由来のタンパク質としては、エンベロープタンパク質、エンベロープ裏打ちタンパク質、カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質等が用いられる。具体的には、パラミクソウイルス科の各種ウイルスのＨＮタンパク質、Ｆタンパク質、オルソミクソウイルス科の各種ウイルスのＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、ラブドウイルス科の各種ウイルスのＧタンパク質、レトロウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、ヘルペスウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、フィロウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、トガウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質およびペプロマー、フラビウイルス科の各種ウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質およびペプロマー、コロナウイルス科の各種ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質、ブンヤウイルス科の各種ウイルスのＧ１タンパク質およびＧ２タンパク質、アレナウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、ヘパドナウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、ポックスウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、バキュロウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質、イリドウイルス科の各種ウイルスのエンベロープタンパク質等を含むことが好ましい。
【００１４】
本発明に用いられるカチオン性脂質は、核酸と複合体を形成するものであれば特に制限はないが、コレステロール骨格を有するもの、グルタミン酸骨格を有するもの、４級アンモニウム塩等が用いられる。コレステロール骨格を有するカチオン性脂質の例として［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）等、グルタミン酸骨格を有するカチオン性脂質の例として塩化Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタミン酸（TMAG）等、４級アンモニウム塩の例としてDOTMA（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロマイド）、DDAB（ジメチルジオクタクレシルアンモニウムブロマイド）、DOSPA（２，３−ジオレイロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、DOGS（ジオレオイル−Ｄ−グルタメート−Ｎ−２（スペルミンカルボキシアミド）エチル）、DMRIE（１，２−ジミリスチロキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）等が挙げられる。
【００１５】
また、本発明において、遺伝子が導入される細胞としては、インビトロ培養細胞、生体から抽出した細胞、生体内に存在する細胞等が挙げられる。遺伝子を細胞に導入するには、組織に直接注入する、静脈および標的組織の支配動脈等の血管内に投与する、エアロゾル化して呼吸器に投与する、生分解性カプセル等に封入して組織に埋め込む、消化管内で分解可能なカプセル等に封入して経口投与する等の方法が用いられる。インビトロ培養細胞への遺伝子導入には、溶液、凍結乾燥物、エアロゾルの形態の組成物が用いられる。
【００１６】
なお、本発明の組成物は、通常のカチオン性脂質と異なり、生体内および培地中の成分と複合体を形成して沈殿を生じにくいため、生体内に直接投与したり培地に混入して使用することが可能である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
[実施例１] 再構成センダイウイルス粒子の調製
１００個の発育鶏卵（９〜１０日目）を検卵し、希ヨードチンキ液で消毒した後、ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０.２％NaCl、pH７.２）で希釈したセンダイウイルスシードを２６ゲージの注射針を装着した１mlのディスポーザブルのシリンジで０.１mlずつ漿尿膜腔に投与した。十分な湿度を保ちながら３５.５℃で４日間放置し、４℃で６時間以上放置した後、１８ゲージの注射針を装着した１０mlのディスポーザブルのシリンジにてそれぞれの鶏卵から漿尿液を回収した。回収した漿尿液８００mlを、１０００g、４℃で１０分間遠心して上清を回収した。さらにこの上清を、２７０００g、４℃で３０分間遠心しウイルスをペレットとして得た。１０mlのBSS（１３７mMNaCl、５.４mMKCl、１０mMTris-HCl、pH７.６）を加え、４℃で一夜放置した後、ペレットを懸濁し、２本のチューブに集め２７０００g、４℃で３０分間遠心しペレットを回収した。２本のチューブに８mlのBSSを加え、４℃で３時間放置した後懸濁し、１０００g、４℃で１０分間遠心して得られた上清を精製したセンダイウイルスとして回収した。ニワトリ赤血球凝集活性が２００万HAUの精製したセンダイウイルスを含む８mlのBSS溶液に０.５％NP-４０を１mlを加え、４℃で３０分間処理した後、１０５００g、４℃で７５分間遠心し、上清を５mMのリン酸緩衝液（pH６.０）に対して４℃で３日間透析した。１０５００g、４℃で７５分間遠心し、上清をリン酸緩衝液（pH６.０）で平衡したCM-セファロース（CM-Sepharose）にアプライし、ボイドボリューム（void volume）を回収した。F、HN蛋白の精製はSDS-PAGE後のCBB染色で確認した。２mgの凍結乾燥した脂質［ホスファチジルコリン：コレステロール８：１（重量比）］とボイドボリューム画分の１ml（約２mg蛋白含有）を混合し、０.８５％NP-４０を４mlを加えてボルテックスミックスし、０.３Mの蔗糖、１mMのKClを含む１０mMのリン酸緩衝液（pH７.２）に対して４℃で６日間透析した後、ゲルろ過し５４０nmの吸収のピークの画分を回収した。この画分のニワトリ赤血球凝集活性を調べたところ２万HAUであった。この画分は、再構成センダイウイルスであり、この再構成センダイウイルスを用いて膜融合リポソームの調製が可能である。
[実施例２] カチオン性脂質によるDNAの封入
ホスファチディルコリン（PC）、コレステロール（CHO）、及びカチオン性脂質である[N−（N',N'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル]コレステロール（DC-chol)を重量比48:24:6で混合し、この混合物9.75mgに対し160μgのpEBC（InVitrigene社）を加え、BSS0.5ml中において、通常のボルテックス法でリポソームを作成後、CaCl₂及びDNaseIをそれぞれ１mM、100μg/mlになるように添加した。次いで、これをBSSに対して透析後、フェノール／クロロホルム-イソアミルアルコールで抽出し、さらにエタノール沈殿を行って、その沈殿物であるリポソームに封入されていたDNAに対しアガロース電気泳動を行った。その後、泳動したDNAを臭化エチジウム（EtBr)で染色し、デンシトメーターで定量を行った。なお、本実験のコントロールとして、従来法で使用されていたホスファチディルコリン、コレステロール、及びホスファチディルセリン（PS)の重量比48:20:10からなる混合物を等量用いた。
【００１８】
この結果、コントロールでは、DNAの封入率が10〜15%にとどまったのに対し、カチオン性脂質を用いた場合は、50〜60%となり、DNAの封入効率が4〜6倍に上昇した。
[実施例３] カチオン性脂質を含むリポソームのセンダイウイルス（HVJ）への融合
実施例２で調製したPC、CHO、及びDC-cholの混合物9.75mgから作成したリポソームを不活性化したセンダイウイルス溶液0.5mlと融合させ、その後蔗糖密度勾配遠心を行い、融合していないリポソーム及びセンダイウイルスの分離を行った。なお、本実験のコントロールとして、実施例１で用いたコントロールと同じ組成の混合物を等量用いて同様の実験を行った。
【００１９】
この結果、コントロールでは、未反応のセンダイウイルスが認められたが、DC-cholを含むリポソームを用いた場合はほとんど認められなかった。すなわち、カチオン性脂質を含むことによりリポソームのセンダイウイルスに対する融合能が上昇した。
[実施例４] カチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソームを用いたインビトロ(in vitro)での遺伝子導入
重量比48:20:10のPC、CHO及びDC-cholからなる混合物を9.75mg調製し、該混合物に9kbpのルシフェラーゼ遺伝子を発現させるプラスミドであるpcLucを200μg、HMG1タンパク質を65μg、ボルテックス法により混合させリポソームを作成した。次いで、これらの混合物を不活化したセンダイウイルスと融合させた後、直径60mmの細胞培養ディッシュあたり１〜５×１０⁵の293細胞及びBHK細胞にDMEM/FCS10%で遺伝子導入を行った。ルミノフォトメーターで、PicaGene試薬（和光純薬）を用いて４８時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。本実験のコントロールとして、重量比48:20:10のPC、CHO、及びPSからなる混合物を等量用いて同様の実験を行った。
【００２０】
この結果、293細胞では、カチオン性脂質であるDC-cholを含むリポソームを用いた場合、コントロールと比較して約10倍のルシフェラーゼ活性が検出された。一方、BHK細胞を用いた場合には、コントロールと比較して約2倍のルシフェラーゼ活性が検出された。
【００２１】
【表１】

遺伝子導入効率をさらに高めるため、本実験における膜融合リポソームとセンダイウイルスとの融合前に、膜融合リポソームをアセチルセルロースフィルターに通す過程を加えるとともに、PC、CHO、及びDC-cholの重量比の調整を行い、BHK細胞にて同様の実験を行った。
【００２２】
この結果、0.45μmのアセチルセルロースフィルターに通す過程を加えた場合には、該過程がない実験の場合と比較して、約4倍のルシフェラーゼ活性が検出された。該過程に加え、さらに、PC、CHO、及びDC-cholの重量比を48:24:6に改変したところ、ルシフェーゼ活性はさらに約5倍に高まった。PC、CHO、及びDC-cholの重量比を48:24:6に調整し、アセチルセルロースフィルターを0.22μmにしたところ、アセチルセルロースフィルターが0.45μmの場合と比較して、さらに約1.5倍となった。
【００２３】
【表２】

[実施例５] カチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソームを用いたインビボ(in vivo)での遺伝子導入
重量比48:20:10のホスファチディルコリン、コレステロール、及び[N−(α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタミン酸(TMAG）］からなる混合物10mgに、pGL2-Control Vector（Promega 社）200ugを加え、ボルテックス法によりリポソームを調製した。このリポソームを不活化センダイウイルスとOD比で１：５で融合し、「HVJ−TMAG−リポソーム」を作成した。次いで、1mlのHVJ−TMAG−リポソームをコンプレッサー付きネブライザーでラットに噴霧し、ラットの気管内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較対象として、TMAGに代えてホスファチディルセリンを用いた以外は「HVJ−TMAG−リポソーム」と同様の「HVJ−PS−リポソーム」及びセンダイウイルスを含まないこと以外は「HVJ−TMAG−リポソーム」と同様の「TMAG−リポソーム」を用いた。また、コントロールとして、プラスミドを含まないHVJ−TMAG−リポソームを用いた。
【００２４】
この結果、「TMAG−リポソーム」を用いた場合には低いルシフェラーゼ活性が検出されたが、「HVJ−PS−リポソーム」を用いた場合には、コントロールと同様に、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった。一方、「HVJ−TMAG−リポソーム」を用いた場合には高いルシフェラーゼ活性が検出された（図１)。
【００２５】
一方、この実験においてラットの右肺下葉のルシフェラーゼ活性を測定したところ「HVJ−TMAG−リポソーム」を用いた場合にのみ高いルシフェラーゼ活性が検出された。その他の場合には、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった（図２）。
[実施例６] カチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソームを用いたインビボ（in vivo）での遺伝子導入
重量比48:24:6のPC、CHO、及びDC-Cholからなる混合物を9.75mg調製し、該混合物に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-tk）を含むプラスミドを200ug、HMG1タンパク質を65ug、ボルテックス法により混合させリポソームを作成した。次いで、これらの混合物を不活化したセンダイウイルス0.5mlと融合させて「HVJ-DC-Chol-リポソーム」を調製した。比較対象としては、重量比48:20:10のPC、CHO、及びPSからなる「HVJ-PS-リポソーム」及びHSV-tkを含むレトロウイルスベクターを生産する細胞Φを用いた。C3H/NeNマウス脳内に5×10⁶の悪性グリオーマ細胞（RSV-M）を播種した後、２日目にプラスミド10ug相当のHVJ-DC-Chol-リポソーム、HVJ-PS-リポソーム及びΦをそれぞれ５匹の腫瘍内に投与した。Φについては、それ以外に３日目と４日目にも同様の投与を行った群も設定した。その後４日目より、ガンシクロビル10mg/kgの１日１回腹腔内投与を１週間継続した。遺伝子導入効果については、生存数と平均体重により評価を行った（図３、図４）。その結果、レトロウイルス生産細胞であるΦを投与した場合は効果が見られなかった。また、HVJ-DC-Chol-リポソームは、HVJ-PS-リポソームと同等以上の効果が認められた。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、DNAの高い確率で封入すると同時に、封入されたDNAを細胞に高い効率で導入することができる遺伝子導入用組成物が提供され、遺伝子を高頻度で細胞内に導入することが可能となった。また、本発明の組成物は、通常のカチオン性脂質と異なり、生体内および培地中の成分と複合体を形成して沈殿を生じにくいため、生体内に直接投与したり培地に混入して使用することが可能である。本発明による遺伝子導入は、特に遺伝子治療分野における利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソーム及びその比較対象をラットに導入した際のラット気管内におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示す図である。
【図２】本発明のカチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソーム及びその比較対象をラットに導入した際のラット右肺下葉におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示す図である。
【図３】本発明のカチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソーム及びその比較対象をマウス脳内に導入した際のマウスの生存数の経時的な測定結果を示す図である。
【図４】本発明のカチオン性脂質を含むHVJ-膜融合リポソーム及びその比較対象をマウス脳内に導入した際のマウスの平均体重の経時的な測定結果を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to the field of genetic engineering, such as the field of gene therapy.
[0002]
[Prior art]
In drug therapy, a system that allows a drug (particularly a polymer compound) to reach a target cell or intracellular tissue, that is, a drug delivery system (hereinafter simply referred to as DDS) is an important technique. In gene therapy, it goes without saying that introducing a gene into a desired cell using DDS is a central technique. Methods for introducing genes into cells can be broadly classified into two.
[0003]
One is a method using a viral vector. This includes a method of introducing an internal nucleic acid into a cell by infecting a virus having a desired foreign gene on the genome.
[0004]
The other is a method of encapsulating or carrying a desired gene or a vector containing the gene on an artificial or semi-artificial carrier. In this method, by making the processes involved in in vivo behavior and transport of the target substance depend on the physicochemical properties of the carrier itself, the physiologically active substance can be converted into a desired organ (target organ), cell (target cell) or It is characterized by allowing it to reach an intracellular organ (target organ). Examples of carriers in this method include proteins (Human Gene Therapy, 5,429, 1994), peptides (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 90, 893, 1993), synthetic polymer compounds (The Journal of Biological Chemistry, 269 , 12918, 1994), liposomes (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 92, 1774, 1995), Sendai virus (Exp. Cell Res., 159, 399, 1985), and the like.
[0005]
Various methods have been applied to methods using liposomes as carriers. One of them is a method using a cationic lipid. In this method, a mixture of liposome, cationic lipid and nucleic acid is usually used (Felgner, PL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)).
[0006]
Furthermore, Sendai virus (HVJ) is highly useful as a carrier because it has low toxicity to the living body and high cell affinity. When Sendai virus is used as a carrier, a composition (membrane fusion liposome) in which Sendai virus particles, liposomes and nucleic acids that are inactivated are mixed is usually used (Yasufumi Kanada: BIOTHERAPY, 8, 1265 (1994)). .
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Although the complex of the cationic lipid and DNA has high encapsulation efficiency of DNA, it is taken into cells through an endocytosis process. Therefore, a considerable ratio of lipid / DNA complexes is degraded by intracellular endosomes and the like. In addition, when a large amount of lipid / DNA complex is administered in order to avoid this, the cytotoxicity of the cationic lipid appears remarkably, so that the concentration that can actually be used is limited. In addition, since cationic lipids form a complex with components in the living body and in the medium to cause precipitation, gene transfer efficiency is significantly reduced when administered in vivo and when used in the medium. It was. Therefore, it has been necessary to develop a system capable of efficiently introducing genes into the cytoplasm.
[0008]
On the other hand, it is possible to efficiently introduce genes into the cytoplasm by using the aforementioned HVJ-membrane fusion liposome, which utilizes the property that Sendai virus fuses to cells. Since DNA entrapment efficiency is low, there is a high possibility that host cells will cause cell fusion when administered in a large amount, which causes problems in practical use. (Note that the low encapsulation efficiency is due to the fact that DNA cannot be efficiently encapsulated in the liposome due to electrostatic repulsion between the liposome (anionic lipid) used in the preparation of the HVJ-membrane fusion liposome and DNA. There is.)
Therefore, there has been a demand for a composition for gene introduction that encapsulates DNA with high probability and at the same time achieves high introduction efficiency.
[0009]
An object of the present invention is to provide a composition for efficiently introducing a gene into a cell. Another object of the present invention is to provide a gene transfer method using the composition.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that when a composition containing a virus particle or a virus particle-derived protein, a cationic lipid and a nucleic acid or a lysate thereof is applied to a cell, the rate at which the nucleic acid is introduced into the cell is remarkable. As a result, the present invention was completed. That is, the present invention includes the following.
(1) A composition for gene transfer comprising a virus particle or a virus-derived cytophilic protein, a cationic lipid, and a nucleic acid.
(2) The composition according to (1), wherein the virus particles have an envelope.
(3) The composition according to (1) or (2), wherein the cationic lipid has a cholesterol skeleton.
(4) The composition according to (3), wherein the cationic lipid is [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol).
(5) The composition according to (1) or (2), wherein the cationic lipid has a glutamic acid skeleton.
(6) The composition according to (5), wherein the cationic lipid is N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid (TMAG) chloride.
(7) The composition according to (1) or (2), wherein the cationic lipid is a quaternary ammonium salt.
(8) A method for introducing a nucleic acid or a derivative thereof into a cell, comprising using the composition according to any one of (1) to (7).
[0011]
In the present invention, virus particles include virus particles having the ability to proliferate, particles reconstituted with virus membrane proteins and lipids, and virus particles that have been inactivated by ultraviolet irradiation or the like and have lost their ability to grow. . Viral particles can be inactivated by physical methods such as ultraviolet irradiation and radiation irradiation, chemical methods such as treatment with enzymes and antiviral agents, molecular biological methods using gene recombination techniques, and the like.
[0012]
Furthermore, in the present invention, nucleic acid means circular and linear single-stranded or double-stranded DNA and RNA or a chimera thereof, and is chemically modified by a method such as esterification or thiophosphorylation. Nucleic acid.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As the virus particles used in the present invention, those having an envelope protein are suitable. For example, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Retroviridae, Herpesviridae, Filoviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Hepadna Virology, poxviridae, baculoviridae and iridoviridae viruses are preferably used. Examples of the virus-derived protein used in the present invention include an envelope protein, an envelope lining protein, a capsid protein, a nucleocapsid protein, and the like. Specifically, HN protein, F protein of various viruses of the Paramyxoviridae, HA protein of various viruses of the Orthomyxoviridae, NA protein, G protein of various viruses of the Rhabdoviridae, various viruses of Retroviridae Envelope proteins, envelope proteins of various viruses of the herpesviridae, envelope proteins of various viruses of the filoviridae, envelope proteins and peplomers of various viruses of the togaviridae, envelope (E) proteins and pepromers of various viruses of the flaviviridae, E1 and E2 proteins of various viruses of the Coronaviridae family, G1 and G2 proteins of various viruses of the Bunyaviridae family, Contains envelope proteins of seed viruses, envelope proteins of various viruses of the Hepadnaviridae family, envelope proteins of various viruses of the Poxviridae family, envelope proteins of various viruses of the Baculoviridae family, envelope proteins of various viruses of the Iridoviridae family, etc. Is preferred.
[0014]
The cationic lipid used in the present invention is not particularly limited as long as it forms a complex with a nucleic acid, but those having a cholesterol skeleton, those having a glutamic acid skeleton, quaternary ammonium salts and the like are used. Examples of cationic lipids having a cholesterol skeleton include [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and the like, and examples of cationic lipids having a glutamic acid skeleton include N- (α -Trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid (TMAG), etc. DOTMA (N- (1- (2,3-dioleoxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium bromide as an example of a quaternary ammonium salt ), DDAB (dimethyldioctacresyl ammonium bromide), DOSPA (2,3-dioleoxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate), DOGS (Dioleoyl-D-glutamate-N-2 (spermine carboxamide) Le), DMRIE (1,2-di-myristyl Ciro carboxymethyl-3-dimethyl - hydroxyethyl ammonium bromide), and the like.
[0015]
In the present invention, cells into which genes are introduced include in vitro cultured cells, cells extracted from living organisms, cells existing in living organisms, and the like. In order to introduce a gene into a cell, it is injected directly into a tissue, administered into a blood vessel such as a vein or a controlling artery of a target tissue, aerosolized and administered to a respiratory organ, encapsulated in a biodegradable capsule, etc. A method of embedding or encapsulating in a capsule degradable in the digestive tract and orally administering is used. A composition in the form of a solution, a lyophilized product, or an aerosol is used for gene transfer into in vitro cultured cells.
[0016]
The composition of the present invention, unlike ordinary cationic lipids, forms a complex with components in the living body and in the medium, and does not easily precipitate. Therefore, the composition of the present invention is used directly in the living body or mixed with the medium. Is possible.
[0017]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1] Preparation of reconstituted Sendai virus particles 100 eggs (9-10 days) were examined and sterilized with dilute iodine tincture, followed by polypeptone solution (1% polypeptone, 0.2% NaCl, Sendai virus seed diluted with pH 7.2) was administered to the chorioallantoic cavity 0.1 ml at a time using a 1 ml disposable syringe equipped with a 26 gauge needle. After maintaining for 4 days at 35.5 ° C while maintaining sufficient humidity, leave it at 4 ° C for more than 6 hours, and then collect chorioallantoic fluid from each egg with a 10 ml disposable syringe equipped with an 18 gauge needle. did. 800 ml of the collected chorioallantoic fluid was centrifuged at 1000 g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The supernatant was further centrifuged at 27000 g at 4 ° C. for 30 minutes to obtain virus as a pellet. Add 10 ml of BSS (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6) and let stand at 4 ° C. overnight, then suspend the pellet, collect in 2 tubes and centrifuge at 27000 g for 30 minutes at 4 ° C. Was recovered. 8 ml of BSS was added to two tubes, left standing at 4 ° C. for 3 hours, suspended, and the supernatant obtained by centrifugation at 1000 g and 4 ° C. for 10 minutes was recovered as a purified Sendai virus. Add 1 ml of 0.5% NP-40 to 8 ml of BSS solution containing purified Sendai virus whose chicken hemagglutination activity is 2 million HAU, treat at 4 ° C for 30 minutes, and then centrifuge at 10500g for 4 minutes at 4 ° C. The supernatant was dialyzed against 5 mM phosphate buffer (pH 6.0) at 4 ° C. for 3 days. Centrifugation was performed at 10500 g at 4 ° C. for 75 minutes, and the supernatant was applied to CM-Sepharose equilibrated with phosphate buffer (pH 6.0) to recover a void volume. Purification of F and HN proteins was confirmed by CBB staining after SDS-PAGE. Mix 2 mg of lyophilized lipid [phosphatidylcholine: cholesterol 8: 1 (weight ratio)] and 1 ml of void volume fraction (containing about 2 mg protein), add 4 ml of 0.85% NP-40 and vortex mix. Then, the mixture was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.3 M sucrose and 1 mM KCl for 6 days at 4 ° C., followed by gel filtration to collect a fraction having an absorption peak at 540 nm. The chicken hemagglutination activity of this fraction was examined and found to be 20,000 HAU. This fraction is a reconstituted Sendai virus, and membrane-fused liposomes can be prepared using this reconstituted Sendai virus.
Example 2 Encapsulation of DNA with Cationic Lipid Phosphatidylcholine (PC), Cholesterol (CHO), and Cationic Lipid [N- (N ′, N′-Dimethylaminoethane) -Carbamoyl] Cholesterol ( DC-chol) was mixed at a weight ratio of 48: 24: 6, 160 μg of pEBC (InVitrigene) was added to 9.75 mg of this mixture, liposomes were prepared by normal vortex method in 0.5 ml of BSS, and then CaCl ₂ And DNaseI were added to 1 mM and 100 μg / ml, respectively. Subsequently, this was dialyzed against BSS, extracted with phenol / chloroform-isoamyl alcohol, further subjected to ethanol precipitation, and agarose electrophoresis was performed on the DNA encapsulated in liposomes as the precipitate. Thereafter, the electrophoresed DNA was stained with ethidium bromide (EtBr) and quantified with a densitometer. As a control for this experiment, an equal amount of a mixture of phosphatidylcholine, cholesterol, and phosphatidylserine (PS) used in the conventional method having a weight ratio of 48:20:10 was used.
[0018]
As a result, in the control, the encapsulation rate of DNA was only 10 to 15%, but when the cationic lipid was used, it was 50 to 60%, and the DNA encapsulation efficiency was increased 4 to 6 times.
[Example 3] Fusion of liposome containing cationic lipid to Sendai virus (HVJ) Sendai virus solution inactivated liposome prepared from 9.75 mg of the mixture of PC, CHO and DC-chol prepared in Example 2 Fusion with 0.5 ml was followed by sucrose density gradient centrifugation to separate unfused liposomes and Sendai virus. As a control for this experiment, a similar experiment was performed using an equal amount of a mixture having the same composition as the control used in Example 1.
[0019]
As a result, unreacted Sendai virus was observed in the control, but was hardly observed when liposomes containing DC-chol were used. That is, the ability of liposomes to fuse with Sendai virus was increased by including cationic lipids.
[Example 4] 9.75 mg of a mixture of PC, CHO and DC-chol having a gene transfer weight ratio of 48:20:10 in vitro using HVJ-membrane-fused liposomes containing cationic lipids was prepared. Then, 200 μg of pcLuc which is a plasmid for expressing a 9 kbp luciferase gene and 65 μg of HMG1 protein were mixed with the mixture by a vortex method to prepare liposomes. Subsequently, these mixtures were fused with the inactivated Sendai virus, and then introduced into 1-5 × 10 ⁵ 293 cells and BHK cells per 60 mm diameter cell culture dish with DMEM / FCS 10%. The luciferase activity after 48 hours was measured with a luminophotometer using PicaGene reagent (Wako Pure Chemical Industries). As a control for this experiment, a similar experiment was performed using an equal amount of a mixture of PC, CHO, and PS at a weight ratio of 48:20:10.
[0020]
As a result, in 293 cells, when liposomes containing DC-chol, which is a cationic lipid, were used, about 10 times the luciferase activity was detected as compared with the control. On the other hand, when BHK cells were used, about twice as much luciferase activity was detected as compared with the control.
[0021]
[Table 1]

In order to further increase gene transfer efficiency, a process of passing the membrane-fused liposome through an acetylcellulose filter is added before the fusion of the membrane-fused liposome and Sendai virus in this experiment, and the weight ratio of PC, CHO, and DC-chol is adjusted. The same experiment was conducted with BHK cells.
[0022]
As a result, when a process of passing through a 0.45 μm acetylcellulose filter was added, about four times as much luciferase activity was detected as compared to the experiment without the process. In addition to this process, when the weight ratio of PC, CHO, and DC-chol was changed to 48: 24: 6, the luciferase activity was further increased about 5-fold. When the weight ratio of PC, CHO, and DC-chol was adjusted to 48: 24: 6 and the acetylcellulose filter was 0.22 μm, it was about 1.5 times more than when the acetylcellulose filter was 0.45 μm. It was.
[0023]
[Table 2]

Example 5 In Vivo Gene Transfer Weight Ratio 48:20:10 Phosphatidylcholine, Cholesterol, and [N- (α-Trimethyl) Using HVJ-Membrane Fusion Liposomes Containing Cationic Lipid 200 g of pGL2-Control Vector (Promega) was added to 10 mg of a mixture consisting of ammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid (TMAG), and liposomes were prepared by the vortex method. This liposome was fused with inactivated Sendai virus at an OD ratio of 1: 5 to prepare “HVJ-TMAG-liposome”. Subsequently, 1 ml of HVJ-TMAG-liposome was sprayed on the rat with a nebulizer equipped with a compressor, and the luciferase activity in the rat trachea was measured. For comparison, except for using phosphatidylserine in place of TMAG, the same “HVJ-PS-liposome” as in “HVJ-TMAG-liposome” and “HVJ-TMAG-liposome” except that it does not contain Sendai virus. The same “TMAG-liposome” was used. As a control, HVJ-TMAG-liposomes containing no plasmid were used.
[0024]
As a result, low luciferase activity was detected when “TMAG-liposome” was used, but no luciferase activity was detected when “HVJ-PS-liposome” was used, as in the case of the control. On the other hand, when “HVJ-TMAG-liposome” was used, high luciferase activity was detected (FIG. 1).
[0025]
On the other hand, when luciferase activity in the lower right lobe of the rat was measured in this experiment, high luciferase activity was detected only when “HVJ-TMAG-liposome” was used. In other cases, luciferase activity was not detected (FIG. 2).
[Example 6] 9.75 mg of a mixture consisting of PC, CHO, and DC-Chol at a gene transfer weight ratio of 48: 24: 6 in vivo using HVJ-membrane fusion liposomes containing cationic lipids Then, 200 ug of a plasmid containing the herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-tk) and 65 ug of HMG1 protein were mixed with the mixture by a vortex method to prepare liposomes. Next, these mixtures were fused with 0.5 ml of inactivated Sendai virus to prepare “HVJ-DC-Chol-liposomes”. As comparison targets, “HVJ-PS-liposomes” composed of PC, CHO, and PS in a weight ratio of 48:20:10 and cells Φ that produce retroviral vectors containing HSV-tk were used. After seeding 5 × 10 ⁶ malignant glioma cells (RSV-M) in the brain of C3H / NeN mice, on the second day, plasmid 10ug equivalent HVJ-DC-Chol-liposome, HVJ-PS-liposome and Φ, respectively Administration into 5 tumors. For Φ, a group that was similarly administered on the third and fourth days was also set. Thereafter, from the 4th day, intraperitoneal administration of ganciclovir 10 mg / kg once a day was continued for 1 week. The gene transfer effect was evaluated by the survival number and average body weight (FIGS. 3 and 4). As a result, no effect was observed when Φ, which is a retrovirus-producing cell, was administered. In addition, HVJ-DC-Chol-liposomes were found to have the same or better effect than HVJ-PS-liposomes.
[0026]
【The invention's effect】
According to the present invention, a composition for gene introduction that can encapsulate DNA with high probability and simultaneously introduce the encapsulated DNA into cells with high efficiency is provided, and genes can be introduced into cells at high frequency. It became. In addition, the composition of the present invention, unlike ordinary cationic lipids, forms a complex with the components in the living body and in the medium, and does not easily precipitate. Therefore, the composition of the present invention is used directly in the living body or mixed with the medium. Is possible. The gene transfer according to the present invention is expected to be used particularly in the field of gene therapy.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing measurement results of luciferase activity in rat trachea when HVJ-membrane-fused liposomes containing a cationic lipid of the present invention and a comparison target thereof are introduced into rats.
FIG. 2 is a graph showing measurement results of luciferase activity in the lower lobe of the right lung of the rat when the HVJ-membrane-fused liposome containing the cationic lipid of the present invention and a comparison target thereof are introduced into the rat.
FIG. 3 is a graph showing measurement results of the number of surviving mice over time when the HVJ-membrane-fused liposome containing the cationic lipid of the present invention and a comparison target thereof are introduced into the mouse brain.
FIG. 4 is a graph showing the measurement results of the average body weight of mice over time when the HVJ-membrane-fused liposomes containing the cationic lipid of the present invention and the comparison target thereof were introduced into the mouse brain.

Claims

A composition for gene transfer comprising Sendai virus particle or Sendai virus-derived protein, [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol ( DC-Chol ) and nucleic acid.

A composition further comprising phosphatidylcholine and cholesterol, wherein the [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol ( DC-Chol ) Is phosphatidylcholine: cholesterol: [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol ( DC-Chol ) = 48 : twenty four : 6 The composition according to claim 1, wherein the composition is contained in a weight ratio of

The composition has a particle size 0.22 μ m The composition according to claim 2, wherein the composition is adjusted as follows.

Sendai virus particle or Sendai virus derived protein, N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid ( TMAG ) And a nucleic acid composition comprising a nucleic acid.

Further, a composition comprising phosphatidylcholine and cholesterol, wherein the chloride N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid ( TMAG ) Is phosphatidylcholine: cholesterol: N- (α-trimethylammonioacetyl) chloride-didodecyl-D-glutamic acid ( TMAG ) = 48 : 20 : Ten The composition according to claim 4, wherein the composition is contained so as to have a weight ratio of

The composition according to any one of claims 1 to 5 , wherein the virus particles have an envelope.

A method for introducing a nucleic acid or a derivative thereof into cells of a non-human animal , comprising using the composition according to any one of claims 1 to 6 .

A method for introducing a nucleic acid or a derivative thereof into cells in vitro, wherein the composition according to any one of claims 1 to 6 is used.