JP3942362B2 - Viral envelope vector for gene transfer - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロおよび生体内での遺伝子導入のための安全かつ高効率のベクターに関する。特に、本発明は、ウイルス、不活性化ウイルス、特に不活性化HVJ(センダイウイルス)を用いて調製する遺伝子導入ベクターに関する。また、本明細書の遺伝子導入ベクターは、遺伝子治療および高スループットスクリーニングにも使用され得る。
【0002】
【従来の技術】
遺伝子治療のために、遺伝子導入のための多くのウイルスおよび非ウイルス(合成)法が開発されている(Mulligan、Science、260、926〜932(1993)およびLedley、Human Gene Therapy、第6巻、1129〜1144(1995))。一般に、細胞への遺伝子送達のために、ウイルス法は、非ウイルス法より効果的である。しかし、ウイルスベクターは、親ウイルスからの必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子のリーキーな発現、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変のため安全性での問題を生じ得る。一般に、非ウイルスベクターは、細胞傷害性および免疫原性がより少ない。しかし、大部分の非ウイルス法は、ウイルスベクターのいくつかに比べ、特に生体内への遺伝子導入効率はより悪い。
【0003】
従って、ウイルスおよび非ウイルスベクターの両方は、制限とともに長所を持っている。それ故、高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子導入ベクターを開発することで、1つのタイプのベクターシステムの制限を、別のタイプのシステムの有利な点を導入することにより補償すべきである。
【0004】
一方、HVJは免疫原性が高く、特にNPタンパク質が大量に産生されるとCTLを誘導することが知られている(Cole、G.A.ら、J.Immunology 158、4301〜4309(1997))。また宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。
【0005】
HVJについて、ウイルス融合タンパク質を遠心やカラム操作で精製して脂質膜に再構成する方法で作成された粒子は、再構成させることによってウイルスの持つ他のタンパク質(主としてMタンパク質)が失われることにより、融合活性に必要なFlとHNタンパク質の比率が野生型のウイルスと同様には保たれないために、融合活性が低くなるという欠点もある。また再構成したときに融合タンパク質が脂質膜に挿入される方向性が野生型ウイルスと同様であるとは限らないために未知の抗原提示がなされる可能性もある。
【0006】
また、新たな分子を加えて再構成する方法も報告されているが(Uchida,T.ら、J.Cell.Biol.80、10〜20、1979)、この方法では完成粒子の膜組成は本来のウイルス粒子とは大きく異なるために本来のウイルス機能が喪失される危険性は大きい。
【0007】
従来のHVJ−リポソームに代表されるように遺伝子やタンパク質をリポソームに封入し、これと不活性化HVJを融合して作成される融合粒子を用いる方法は、培養細胞や生体組織への非侵襲の遺伝子導入を可能とし、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻用されるようになった(Dzau,V.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93、11421〜11425(1996)およびKaneda,Y.ら、Molecular Medicine Today、5、298〜303(1999))。しかしウイルスとリポソームという2つの異なるベシクルを準備する必要があり手法が複雑であること、リポソームと融合することによってウイルス粒子より平均直径が1.3倍大きくなった粒子は融合活性がウイルスの10%以下に落ちてしまうことなどの欠点も合わせ持つことがわかった。
【0008】
さらに、従来のHVJに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織や極めて効率の低い組織も存在した。このことは、従来法に基づく遺伝子治療の対象となる組織を限定し得ることを示す。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
ヒト遺伝子治療のために、安全、高効率かつ簡便に調製でき、かつ広範囲の生体内組織に対して遺伝子導入が可能なウイルスベクターの開発が望まれている。
【0010】
従って、本発明の目的は、従来の再構成HVJベクター法またはHVJ−リポソーム法の欠点を克服し、広範囲の培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便なウイルスベースの遺伝子導入ベクターを開発することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の1つの局面において、不活性化ウイルスを使用する安全かつ高効率な遺伝子導入ベクターが提供される。ウイルスのゲノムが不活性化されている不活性化ウイルスでは、ウイルスタンパク質の複製がないため安全で細胞毒性・抗原性も低い。不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクター中に遺伝子を封入することにより、培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便な遺伝子導入ベクターが調製される。
【0012】
本発明のさらなる局面において、広範囲の生体内組織に遺伝子導入が可能であるウイルスエンベロープベクターが提供される。1つの実施態様において、使用されるウイルスは、HVJである。本発明のウイルスエンベロープベクターによって生体内で遺伝子導入される組織としては、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、癌組織、神経、Bリンパ球、および呼吸器官の組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
本発明の別の局面において、浮遊細胞に簡便に遺伝子導入する方法が提供される。本発明のウイルスエンベロープベクターを使用する、好ましい浮遊細胞への遺伝子導入方法としては、浮遊細胞とウイルスエンベロープベクターとを硫酸プロタミン存在下で混合する工程、およびその混合液に遠心力を加える工程を包含する、遺伝子導入方法が挙げられる。
【0014】
本発明の1つの局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて、大量の遺伝子を短時間で封入することによる、高効率で迅速な培養細胞及び生体組織への遺伝子導入が可能となる。従って、本発明のさらなる局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いるゲノムの高スループットの大量迅速解析システムが可能となる。
【0015】
本発明の特定の局面において、遺伝子導入ベクターは、−20℃で凍結した状態で長期間(少なくとも2〜3ヶ月以上)の保存が可能である。そしてこの遺伝子導入ベクターは、例えば凍結状態で密封し、貯蔵し、輸送することができる。
【0016】
本発明の別の局面において、インビトロにおいて好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の細胞に遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。
【0017】
本発明のある局面において、不活性化ウイルスの調製の2ヶ月後に遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクターを形成した場合に、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上の遺伝子導入活性を保持する遺伝子導入ベクターが提供される。
【0018】
本発明の別の局面において、生体内での局所投与において好ましくは30%以上、より好ましくは40%以上、さらにより好ましくは50%以上、最も好ましくは60%以上の組織中の細胞に対して遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。
【0019】
本発明の局面において、不活性化ウイルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターが提供される。
【0020】
本発明の1つの局面において、遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。
【0021】
本発明のさらなる局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、HVJである。また、本発明のさらなる局面において、Hasan,M.K.ら(Journal of General Virology,78、2813〜2820(1997))またはYonemitsu,Y.ら(Nature Biotechnology 18、970〜973(2000))に記載される組換え型センダイウイルスを用いて、遺伝子導入ベクターが調製される。
【0022】
本発明の別の局面において、動物生体内の組織に遺伝子導入するための遺伝子導入ベクターが提供される。
【0023】
本発明の遺伝子導入ベクターを調製する方法において、ウイルスを不活性化する工程は必ずしも必要ではない。従って、本発明の1つの局面において、ウイルスを不活性化する工程を行わずに、
1)ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
2)この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合する工程、
を包含する方法によって遺伝子導入ベクターを作成し得る。
【0024】
本発明の別の局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下;
ウイルスを不活性化する工程、
不活性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
混合液を凍結融解する工程、
を包含する、方法が提供される。
【0025】
本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下;
ウイルスを不活性化する工程、および
不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、
を包含する、方法が提供される。
【0026】
本発明のさらなる局面において、使用される界面活性剤は、オクチルグルコシド、Triton−X100、CHAPSおよびNP−40からなる群から選択される。
【0027】
本発明の特定の局面において、不活性化ウイルスエンベロープとの混合前に、硫酸プロタミンを外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法が提供される。
【0028】
本発明のさらなる局面において、単離された動物組織に遺伝子を導入する方法であって、以下;
所望の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを調製する工程、
遺伝子導入ベクターによって、該動物組織に遺伝子を導入する工程、
を包含する、方法が提供される。
【0029】
本発明の別の局面において、浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法が提供され、この方法は、以下:
浮遊細胞と遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミン存在下で混合する工程、
混合液を遠心する工程
を包含する。
【0030】
本発明のさらに別の局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを含有する、遺伝子治療のための薬学的組成物が提供される。
【0031】
【発明の実施の形態】
(定義)
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するDNA、RNAまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」、「遺伝子ベクター」または「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。
【0033】
本発明の1つの局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、HVJである。
【0034】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能(例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および/またはそのタンパク質の活性など)を指標として検出され得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、UV処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の1つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列(例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリA付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど)と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
【0037】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはDNAまたはRNAの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【0038】
本明細書で使用される場合、「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、cDNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列(例えば、シグナル、タグなど)を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。1つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および/または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
【0039】
本明細書において、「HVJ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。
【0040】
本明細書において、「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性をいい、1 HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する(Okada,Y.ら、Biken Journal 4、209〜213、1961)。
【0041】
(遺伝子治療)
治療的な核酸構築物は、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得る。
【0042】
本発明の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、本発明のベクターの投与は、PBS(リン酸緩衝化生理食塩水)または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所(例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など)への直接注入か、または血管内(例えば、動脈内、静脈内および門脈内)への投与によりなされる。
【0043】
1つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量注入可能な形態(溶液、懸濁液または乳濁液)で、薬学的に受容可能なキャリア(すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの)とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【0044】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤;アスコルビン酸のような抗酸化剤;低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド(例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン);単糖、二糖および他の炭水化物(セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む);キレート剤(例えば、EDTA);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール);対イオン(例えば、ナトリウム);および/または非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート、ポロキサマー)、またはPEGを含み得る。
【0045】
遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。
【0046】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1以上の成分を満たした1以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物とともに使用され得る。
【0047】
本発明の遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準(good medical practice)に一致した様式で、個々の患者の臨床状態(例えば、予防または処置されるべき状態)、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。従って、本明細書の遺伝子導入ベクターの「有効量」または適切な投与量は、このような考慮事項によって決定される。
【0048】
例えば、マウスに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、20〜20,000HAU相当の、好ましくは60〜6,000HAU相当の、より好ましくは200〜2,000HAU相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、0.1〜100μg、好ましくは0.3〜30μg、より好ましくは1〜10μgである。
【0049】
また、ヒトに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、被験体あたり、400〜400,000HAU相当の、好ましくは1,200〜120,000HAU相当の、より好ましくは4,000〜40,000HAU相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、2〜2,000μg、好ましくは6〜600μg、より好ましくは20〜200μgである。
【0050】
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
【0051】
【実施例】
(1.凍結融解を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用)
(実施例1:凍結融解によるHVJエンベロープベクターの調製)
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換えHVJウイルスを様々な回数で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。
【0052】
TE500μ1に、750μgのルシフェラーゼ発現ベクターpcOriPLuc(SaekiおよびKanedaら、Human Gene Therapy、11、471〜479(2000))と様々な濃度のHVJウイルスを混合した。HVJウイルス濃度は、10、25、50、100HAU/μlに調製した。この溶液を12分割し、それぞれをドライアイスによって4℃に保存して凍結させた後、融解することを最大30回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、BHK−21細胞(24ウェルディッシュ、4×104細胞/ディッシュ、0.5ml DMEM,10%FCS)の培地に添加し、37℃、5%CO2にて20分間反応後、PBSにより洗浄し、新たに培養液を0.5ml加えて24時間培養した。
【0053】
培地を除去し、1×Cell Culture Lysis Reagent(Promega社)500μlを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清20μlから、Promega Luciferase Assay SystemとLumat LB9501 Luminophotometerを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液について3回行い、平均値を求めた。
【0054】
結果は図1に示したとおりである。組換えHVJウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、3回の凍結融解に比べ20回の凍結融解では10倍以上のルシフェラーゼ発現が観察された。この結果から、この実施例に用いた条件では、組換えHVJウイルスの凍結融解の回数は好ましくは5回以上、さらに好ましくは15〜20回程度であることが確認された。
【0055】
(実施例2:凍結融解により調製されたHVJエンベロープベクターの遺伝子導入効率)
実施例1と同様の組換えHVJウイルスを30回凍結融解した後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【0056】
結果は図2に示したとおりである。この図2において、例えばX軸が500HAUの場合では、ウイルス濃度10HAU/μlの溶液の添加量は50μlであり、100HAU/μlの溶液は5μlとなる。この図2に示したとおり、ウイルス濃度が100HAU/μlの溶液は10〜50HAU/μl濃度の場合に比較して遺伝子発現の効率が約50%低下した。この結果から、この実施例の条件では、組換えウイルス濃度はl0〜50HAU/μlの範囲とすることが好ましいことが確認された。
【0057】
また、組換えHVJウイルスを29回凍結融解した後、30回目の凍結を行い、その凍結状態で1週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この1週間冷凍保存した組換えHVJウイルスも、30回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。
【0058】
(実施例3:ルシフェラーゼ発現ベクターを用いる遺伝子導入効率の測定)
ルシフェラーゼ発現ベクターの量を様々に変えてHVJエンベロープベクターを調製し、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【0059】
HVJウイルス量は1μl TE当たり50HAUとした。ルシフェラーゼ発現ベクターpcOriPLucの量は、1μlのTE当たり0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.5μgとした。最終溶液量を100μlとして20回の凍結融解を行った後、実施例1と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
【0060】
結果は図3に示したとおりである。外来遺伝子である発現ベクターpcOriPLuc(約9.5kb)の添加量が1.5μgまでは量依存的に発現量が増加し、これ以降は発現量にはほとんど変化はなかった。以上の結果から、この実施例で用いた条件では、1.5μg/μl以上の外来遺伝子DNAを遺伝子導入に用いることが好ましいことが確認された。
【0061】
(実施例4:遺伝子導入効率に対する緩衝液の種類の影響)
HVJエンベロープベクター調製に用いる緩衝液の種類を変えて、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【0062】
HVJウイルス量は緩衝液1μl当たり50HAU、ルシフェラーゼ発現ベクターpcOriPLuc量は15μg/μlとした。緩衝液はTE、PBS、BSS(137mM NaCl、5.4mM KCl、10mM Tris−HCl、pH7.5)、並びにこれらの緩衝液に最終濃度0mM、20mM、40mM、60mMのショ糖を添加したものを使用した。最終溶液量を100μlとして20回の凍結融解を行った後、実施例1と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
【0063】
結果は図4に示したとおりであり、この実施例で用いた条件では、組換えHVJウイルスの調製のための緩衝液としてはTE単独が好ましいことが確認された。
【0064】
(実施例5:AVE(Artificial Viral Envelop)型のベクターと本願発明のHVJエンベロープベクターとの比較)
従来の遺伝子導入ベクターである不活性化HVJ−リポソーム(最も遺伝子導入効率の優れたAVE型(Saeki,Y.ら、Human Gene Therapy、8、2133〜2141(1997))を用いた遺伝子導入と、この発明の方法とを比較した。
【0065】
HVJ一リポソームまたはHVJウイルス量はTE 1μl当たり50HAU、ルシフェラーゼ発現ベクターpcOriPLucの量は1.5μg/μlとした。また、組換えHVJウイルスの凍結融解の回数は2回または15回とした。その他の条件は、宿主細胞をヒト胎児腎細胞株HEK293とした以外は実施例1と同様とした。
【0066】
結果は図5に示したとおりである。HVJエンベロープベクターの凍結融解を15回繰り返すこの発明の方法は、遺伝子導入効率においてHVJ一リポソームを用いた従来方法よりはるかに優れていることが確認された。
【0067】
(実施例6:合成オリゴヌクレオチドの導入効率)
FITC(イソチオシアン酸フルオレッセイン)で蛍光標識した合成オリゴヌクレオチド(20bp)を1mg/m1の濃度で不活性化HVJウイルスと混合し、この溶液を20回凍結融解した後、BHK−21細胞と20分間反応させた。17時間後に蛍光シグナルを観察した結果、ほぼ100%の細胞の核内に蛍光の集積が認められた。この結果から、この発明の方法は、合成核酸の細胞内導入にも有効であることが確認された。
【0068】
(実施例7:GFP遺伝子の導入効率)
GFP(グリーン蛍光タンパク質)遺伝子と不活性化HVJウイルスの混合溶液を20回凍結融解した後、2ng/5μ1をラット大脳に注入した。その結果、注入部位に蛍光シグナルが観察された。また、GFP遺伝子によるHVJエンベロープベクターを凍結して3ヶ月保存した後、ラット大脳に注入したが、同じく注入部位にGFP遺伝子発現による蛍光シグナルが観察された。
【0069】
以上の結果から、この発明の方法は、生体内においても確実に遺伝子導入が可能であることが確認された。また、HVJエンベロープベクターの凍結保存が可能であることも確認された。
【0070】
(2.界面活性剤を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用)
(実施例8:界面活性剤を用いる不活性化HVJエンベロープベクターの調製)
界面活性剤を用いる不活性化HVJエンベロープベクターの調製方法の概略を図6に示す。
【0071】
(1:HVJの増殖)
HVJは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系(トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加)を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
【0072】
本実施例において、HVJの増殖を以下のようにおこなった。
【0073】
HVJの種ウイルスを、SPF(Specific pathogen free)の受精卵を使って増殖させ分離・精製したHVJ(Z種)を細胞保存用チューブに分注し、10% DMSOを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
【0074】
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター(SHOWA−FURANKI P−03型;約300鶏卵収容)にいれ、36.5℃,湿度40%以上の条件で10〜14日飼育した。暗室中で、検卵器(電球の光が口径約1.5cmの窓を通して出るようになっているもの)を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約5mm上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた(太い血管を除いた場所を選定する)。ポリペプトン溶液(1%ポリペプトン、0.2% NaClを混合し、1M NaOHでpH7.2に調整してオートクレーブ滅菌し、4℃保存したもの)で種ウイルス(液体窒素からとりだしたもの)を500倍に希釈し、4℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス0.lmlを26ゲージの針付き1mlシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン(融点50〜52℃)をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、36.5℃、湿度40%以上の条件で3日飼育した。次に、接種卵を一晩4℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、18ゲージの針を付けた10mlシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、4℃に保存した。
【0075】
(2:HVJの精製)
HVJは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
(2.1:遠心分離による精製方法)
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心(27,500×g,30分間)とショ糖密度勾配(30〜60%w/v)を利用した超遠心(62,800×g,90分間)により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、4℃で保存することに注意すべきである。
【0076】
本実施例において、具体的には、以下の方法によってHVJを精製した。
【0077】
HVJ含有漿尿液(HVJ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め4℃にて保存)の約100m1を広ロの駒込ピペットで50mlの遠心チューブ2本に入れ(Saeki,Y.,およびKaneda,Y:Protein modified liposomes(HVJ−1iposomes)for the delivery of genes,oligonucleotides and proteins. Cell Biology;A laboratory handbook(第2版)J.E.Celis編(Acadcmic Press Inc.,SanDiego)第4巻、127〜135,1998を参照のこと)、低速遠心機で3000rpm,10分、4℃で遠心し(ブレーキはオフ)、卵の組織片を除去した。
【0078】
遠心後、上清を35ml遠心チューブ4本(高速遠心用)に分注し、アングルローターで27,000g,30分遠心した(アクセル、ブレーキはオン)。上清を除き、沈殿にBSS(10mM Tris−HCl(pH7.5)、137mM NaC1、5.4mM KC1;オートクレーブし、4℃保存)(BSSのかわりにPBSでも可能)をチューブ当たり約5ml加え、そのまま4℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし1本のチューブに集め、同様にアングルローターで27,000g、30分遠心した。上清をのぞき沈殿にBSS約10mlを加え、同様に4℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で3000rpm,10分、4℃で遠心し(ブレーキはオフ)、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして4℃で保存する。
【0079】
このウイルス液0.lmlにBSSを0.9ml加え、分光光度計で540nmの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性(HAU)に換算した。540nmの吸収値1がほぼ15,000HAUに相当した。HAUは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液(0.5%)を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい(動物細胞利用実用化マニュアル、REALIZE INC.(内田、大石、古沢編集)P259〜268、1984を参照のこと)。
【0080】
さらにショ糖密度勾配を用いたHVJの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を60%、30%のショ糖溶液(オートクレーブ滅菌)を重層した遠心チューブにのせ、62,800×gで120分間密度勾配遠心を行う。遠心後、60%ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をBSSもしくはPBSを外液として4℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール(オートクレーブ滅菌)と0.5M EDTA液(オートクレーブ滅菌)をそれぞれ最終濃度が10%と2〜10mMになるように加えて−80℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する(凍結保存はグリセロ一ルと0.5M EDTA液の代わりに10mM DMSOでも可能)。
(2.2:カラムおよび限外濾過による精製方法)
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるHVJの精製も本発明に適用可能である。
【0081】
手短には、分子量カットオフが50,000のフィルターによる限外濾過による濃縮(約10倍)とイオン交換クロマトグラフィー(0.3M〜lM NaCl)による溶出を用いて精製した。
【0082】
具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、HVJをカラムによって精製した。
【0083】
漿尿液を採集した後、80μm〜10μmのメンブランフィルターにてろ過した。0.006〜0.008% BPL(最終濃度)を漿尿液に加え(4℃、1時間)、HVJを不活性化した。漿尿液を37℃、2時間インキュベートすることによって、BPLを不活性化した。
【0084】
500KMWCO(A/G Technology、Needham、Massachusetts)を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約10倍濃縮した。緩衝液として、50mM NaCl、1mM MgCl2、2%マンニトール、20mM Tris(pH 7.5)を用いた。HAUアッセイにより、ほぼ100%のHVJ回収率であり優れた結果がえられた。
【0085】
QSepharoseFF(アマシャムファルマシアバイオテクKK、Tokyo)によるカラムクロマトグラフィー法(緩衝液:20mM TrisHCl(pH7.5)、0.2〜1M NaCl)でHVJを精製した。40〜50%の回収率であり、純度は99%以上であった。
【0086】
500KMWCO(A/G Technology)を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりHVJの画分を濃縮した。
【0087】
(3:HVJの不活性化)
HVJの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。
【0088】
(3.1:紫外線照射法)
HVJ懸濁液1mlを30mm径のシャーレにとり、99または198ミリジュール/cm2を照射した。ガンマー線照射も利用可能である(5〜20グレイ)が完全な不活性化がおこらない。
【0089】
(3.2:アルキル化剤による処理)
使用直前に、10mM KH2PO中に0.01% β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
【0090】
精製直後のHVJの懸濁液に最終0.01%になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で60分間でインキュベートした。その後2時間、37℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり10,000HAU分ずつ分注し、15,000rpm,15分遠心し、沈殿を−20℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−20℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりDNAを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。
【0091】
(4:HVJエンベロープベクターの作成)
保存してあったHVJに外来DNA200〜800μgを含む溶液92μlを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−20℃で、少なくとも、3ヶ月保存可能である。HVJとの混合前にDNAに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が2倍以上増強した。
【0092】
この混合液を氷上に1分間置き、オクチルグルコシド(10%)を8μl加えて15秒氷上でチューブを振盪し、45秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、1〜5分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Triton−X100(t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)、CHAPS(3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸)、NP−40(ノニルフェノキシポリエトキシエタノール)などの界面活性剤も使用し得る。Triton−X100、NP−40およびCHAPSの好ましい最終濃度は、それぞれ、0.24〜0.80%、0.04〜0.12%および1.2〜2.0%である。
【0093】
冷BSSを1ml添加し、すぐに15,000rpmで15分遠心した。生じた沈殿にPBSまたは生理食塩水などを300μl加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−20℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このHVJエンベロープベクターは、少なくとも2ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。
【0094】
(実施例9:HVJエンベロープベクターにおけるFlとHNタンパク質の比率)
(1:サンプルの調製)
(i)精製HVJ 10,000HAU相当を15,000rpm,15分間遠心し、沈殿を300μlのPBSに懸濁し−20℃に保存した。
(ii)精製HVJ 10,000HAU相当を紫外線照射(198ミリジュール/cm2)後、15,000rpm,15分間遠心し、沈殿を300μlのPBSに懸濁し−20℃で保存した。
(iii)精製HVJ 10,000HAU相当を紫外線照射(198ミリジュール/cm2)後、15,000rpm,15分間遠心し、沈殿にpcLuciDNA200μg(溶液92μl)を加えて、ピペッテングで懸濁した。氷上に置き、オクチルグルコシド(10%)を8μ1加えて、15秒間、手でチューブを振盪し、45秒間氷上静置し、冷BSSを1ml加えて、すぐに15,000rpm、15分間遠心後、300μlのPBSに懸濁し−20℃で保存した。
【0095】
(2:タンパク質電気泳動)
3種類のサンプルの5、10、20μlに×5のLaemliサンプル緩衝液を加え10% SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動終了後、クマシーブルーで染色し、脱染色後、セロファン紙に張り付けて乾燥させた。
【0096】
(3:タンパク質同定)
電気泳動し、染色したサンプルをLAS2000(Fuji Film、Tokyo)に取り込ませ(図7)、F1,HN相当のタンパク質バンドの濃度を測定した。1種類のサンプルにつき、3つの異なる量を泳動し、各々のF1/HN密度を算出し、サンプル毎に平均と標準偏差を求めた。
【0097】
(4:結果)
(i)、(ii)、(iii)のサンプルでF1/HNは、ほぼ1.7で一致した。F1 51kD、HN 68kDaの分子量を考慮すれば、モル比は約2.3となる。F1、HNを用いた再構成リポソームでの融合の最適値が、F1/HNが約2で与えられるという報告(Exp.Cell Res.142、95〜101、1985)とも矛盾しない。他の研究者から報告のある再構成型ではこの比が野生型ウイルスのものと異なる(J.Virol.67、3312〜3318、1993)。その他のタンパク質組成もHVJとHVJエンベロープベクターではほぼ同じであった。
【0098】
(実施例10:HVJエンベロープベクターへのDNAの封入及び封入率)
(1:HVJエンベロープベクター(DNA封入、未封入)の電子顕微鏡像)
前述のようにしてpSFV−LacZ(14.5kb)130μgを10,000HAUのHVJ(紫外線不活性化)に封入しHVJエンベロープベクターを作成した。
【0099】
封入後のHVJエンベロープベクターを300μlのPBSに懸濁し−20℃で保存した。10日後、1μlの懸濁液をグリッド上にのせ、陰性染色法にて電子顕微鏡を用いて観察した。コントロールとしてDNA未封入のHVJエンベロープベクターを用いた。
【0100】
(結果)
結果を、図8に示す。HVJエンベロープベクターは、かつて観察されたHVJウイルスそのものとほぼ外郭は同型のものが多かった。DNA未封入のものに比較し、DNAを用いたものはHVJエンベロープベクター内に電子密度の濃い構造物を認めた。一方、未封入のものは内部の透過性は高く、ウイルスゲノムが破壊されたか、喪失されたと推定された。
【0101】
(2:HVJエンベロープベクターへのDNA封入率)
前述のようにしてpcLuci(7.4kb)157μgを6,700HAUのHVJ(紫外線不活性化)に封入して、HVJエンベロープベクターを作成した。HVJエンベロープベクターを、300μlのBSSに懸濁し、ミクロコッカルヌクレアーゼ15単位、CaCl2 2mM、RNaseA 20μg/ml、20℃、30分間処理し、PBS 1リットルに対して透析した(4℃、オーバーナイト)。1%SDS、37℃で、l分間処理した。500μlのフェノール、500μlクロロホルム−イソアミルアルコールで処理し、その後、エタノール沈殿した。100μlのBSSに懸濁し、分光光度計で260nm,280nmを測定した。
【0102】
(結果)
回収率が85.7%であったので、換算すると、HVJエンベロープベクター中へのDNAの取り込み効率は、3.8%であった。10,000HAUのHVJに、279μgのpcLuciを取り込ませた場合の取り込み効率は、7.2%であった。
【0103】
以上より10,000HAUのHVJへのDNA取り込み効率は、オクチルグルコシドを用いた場合約6〜7%であろうと推定されるが、用いるDNA量によって多少変化する可能性がある。また硫酸プロタミンをDNA、HVJエンベロープベクターと共存させると導入効率が上昇することがわかっているが、これはHVJエンベロープベクターへのDNA封入効率が上昇したためではないかと考えられる。Triton−X100,NP−40ではさらに効率が上がり10〜40%程度と推定される。
【0104】
(実施例11:HVJエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入)
(1:遺伝子導入方法)
1,000HAU分をエッペンドルフチューブにとり(30μl)、硫酸プロタミン(1mg/ml)5μ1を加えた。BHK−21細胞(前日に、ウェルあたり200,000個で、6つのウェルにまいたもの)の培地を交換し、1ウェルあたり0.5mlの培地(10%FCS−DMEM)を添加した。各ウェルに、上記のベクター(1,000HAU相当)と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、37℃で、5%CO2インキュベーター中に10分間放置した。
【0105】
培地交換し、37℃で、5%CO2インキュベーター中でオーバーナイト(16hr〜24hr)放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ(pcLuci;CMVプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子)の場合は、Cell Lysis Buffer(Promega)0.5mlで細胞を溶解し、その20μl溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質(pCMV−GFPE;Promega)の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、400倍率で5〜8視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。
【0106】
(2:培養細胞における導入効率に与える条件の検討)
培養細胞はBHK−21細胞を用いた。
【0107】
(2.1:HVJエンベロープベクター作成におけるオクチルグルコシド(OG)濃度の検討)
(1)の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、HVJエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、各濃度(HVJエンベロープベクターの作成時に用いたOGの最終濃度)のオクチルグルコシド(OG)の影響を調べた:
(A)オクチルグルコシド濃度:1、2、3%;
HVJエンベロープベクター作成時に、不活性化HVJをOGによって処理した時間:1分間、5分間、10分間;
超音波処理を行ったか(sonic)、または行わなかった。
(B)オクチルグルコシド濃度:0.125〜1.25%;
トランスフェクションに用いたベクターの容量:10μl、100μl。
(C)オクチルグルコシド:0.55〜0.8%;
トランスフェクションの時間:30分間、オーバーナイト(O/N)。
結果を図9に示す。
【0108】
(2.2:細胞への遺伝子導入条件、硫酸プロタミン(PS)の濃度・処理時間)
(1)の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、HVJエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、硫酸プロタミンの影響を調べた:
(A)硫酸プロタミン:0〜100μg/ml培地;
トランスフェクションの時間:20、40、60分間。
(B)硫酸プロタミン:0〜40μg/ml培地;
トランスフェクションの時間:5、10、20分間。
結果を図10に示す。
【0109】
(2.3:HVJエンベロープベクターに封入するDNA濃度の遺伝子発現量に対する効果)
(1)の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、HVJエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、実験に使用したDNA量の影響を調べた:
(A)DNA量:20〜200μg;
HVJエンベロープベクターを−20℃または−80℃で5日間保存した。
(B)DNA量:180〜360μg/HVJ 10,000HAU。
結果を図11に示す。
【0110】
(2.4:遺伝子導入に用いるHVJ力価の、遺伝子発現量に対する影響)
(1)の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、HVJエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、遺伝子導入に用いるHVJ力価の影響を調べた:
5,000、10,000、20,000HAUの力価のHVJを用いてHVJエンベロープベクターを調製し、その各々の、250、500、1,000、2,000HAUに相当する量を用いて、BHK−21細胞にトランスフェクションした。
結果を図12に示す。
【0111】
(2.5:HVJエンベロープベクター遺伝子導入効率に対する、HVJ不活性化条件の影響)
(1)の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、BHK−21細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現に対する、HVJの不活性化方法(UVまたはβ−プロピオラクトン)の効果を調べた。
(A)UV不活性化のための照射量:0〜231ミリジュール/cm2。
(B)HVJ処理に用いたβ−プロピオラクトン(BPL)濃度:0〜0.025%。
結果を図13に示す。
【0112】
(実施例12:HVJエンベロープベクターの各種細胞への遺伝子導入)
ヒト舌部の扁平上皮癌(SAS)へ、実施例11に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図14に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図14に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、200μg/mlの硫酸プロタミンを使用し、60分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。
【0113】
ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)へ、実施例11に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図15に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図15に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、100μg/mlの硫酸プロタミンを使用し、60分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。
【0114】
(実施例13:HVJエンベロープベクターの各種生体組織内への遺伝子導入)
本実施例では、実施例11に記載のHVJエンベロープベクターを用いる、種々の生体内組織への遺伝子導入を例示する。
【0115】
(13.1:マウス肝臓)
HVJエンベロープベクターを、0.8%のオクチルグルコシドおよび200μgのpcLuciを氷上に1分間放置し、そして300μlのPBSに懸濁することによって調製した。調製懸濁液の1/10量(1,000HAUに相当)30μlを、70μlのPBSで希釈し(全量100μl)、マウス(C57BL/6)肝臓の葉(lobe)の1つに注入した。
【0116】
HVJ−AVE(Artificial Viral Envelop)リポソームを、200μgのpcLuciを用いて、ボルテックス/排出(vortexing/extrusion)、その後のスクロース勾配遠心分離(62,000g、90分間)によって調製した。次に、この調製物を、遠心分離(27,000g、30分間)によってペレットとし、そして500μlのPBS中に懸濁した。このサンプルの100μlをマウス(C57BL/6)肝臓の葉(lobe)の1つに注入した。
【0117】
24時間後、注入された肝臓葉を単離して、その葉のルシフェラーゼ活性をPromega社のLuciferase Assay Systemを用いてアッセイした。結果を図16Aに示す。この結果から、明らかなように、本発明のHVJエンベロープベクターは、従来のHVJ−AVEリポソームと比べて約2倍の顕著に高い遺伝子導入効率を示した。
【0118】
(13.2:マウス子宮)
13.1と同様にHVJエンベロープベクターを調製した。50μlと100μlのサンプルを、PBSで希釈して500μlとし、マウスのファローピウス管に注入し、子宮頸を10分間結紮した。24時間後、マウス子宮を単離して、葉および子宮のルシフェラーゼ活性を、Promega社のLuciferase Assay Systemを用いてアッセイした。結果を図16Bに示す。本発明のHVJエンベロープベクターによって、マウス子宮への遺伝子導入が可能であったが、HVJ−AVEリポソームを用いた方法では、検出可能な程度の子宮組織への遺伝子導入が見出されなかった。
【0119】
pcLuciを含有するHVJエンベロープベクターを13.1と同様に調製した。LacZ発現のために、pEB−CMV−LacZ(13kb)を含有するHVJエンベロープベクターを、200μgのプラスミドを使用して調製した。これら各ベクターを含有するHVJエンベロープベクターを上記のように子宮に注入した。結果を、図16Cに示す。LacZ染色によって、主に子宮内膜の腺上皮でのLacZ遺伝子の発現が検出された。
【0120】
(13.3:ラット脳)
上記に記載のpcLuciを含有するHVJエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、pEGFP−1(クラゲのグリーン蛍光タンパク質遺伝子(約0.7kb)を、サイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクターに組み込んだベクター;Clontech社、Palo Alto,CAより入手可能)を含有するHVJエンベロープベクターを調製した。30μlのベクター(調製物の1/10であり、1,000HAUに相当)をSDラット(Sprague−Dawleyラット)に、頸動脈注入、または大槽より髄腔内注入した。遺伝子導入の3〜4日後、ラットを屠殺し、脳切片を固定化することなく調製し、そして蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。図16Dに示される結果のように、頚動脈注入及び大槽より髄腔内注入のいずれの場合も、脳内におけるグリーン蛍光タンパク質(GFP)の発現が認められた。これに対して、HVJ−AVEリポソームを用いて、同様の遺伝子導入をラット頚動脈より行った場合、脳内でのGFP発現は、認められなかった。
【0121】
(13.4:ウサギ眼)
pCDNA3(In Vitrogen社、SanDiego,CA)のHindIII/XbaI部位にヒトHGF(肝細胞増殖因子)遺伝子の変異体であるNK4 cDNA(1.4kb)をクローニングして構築されたpCMV−NK4を、大阪大学医学系研究科の中村敏一教授らより分与していただいた。
【0122】
400μgまたは800μgいずれかのpCMV−NK4を用いて、10,000HAUの不活性化HVJを用いた以外は、上記に記載のpcLuciを含有するHVJエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、HVJエンベロープベクターを調製した。pCMV−NK4は、HGF機能を阻害する変異型HGFを発現するプラスミドである。50μlのベクター(調製物の1/6)を、新血管形成を誘導するために組換えVEGFのペレットで処理した、ウサギの角膜組織中に注入した。処置の7日後、ウサギを、屠殺し、目の中の新血管形成を観察した。結果を図16Eに示す。pCMV−NK4が容量依存的にVEGFによって誘導された血管新生を抑制した。
【0123】
(13.5:ラット肺動脈)
上記に記載のpcLuciを含有するHVJエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、SV40プロモーターの制御下のLacZ遺伝子を有するpSV−LacZ(Promega社、Madison、WI)を含有するHVJエンベロープベクターを調製した。50μlのベクター(調製物の1/6)をラットの気管に注入した。遺伝子導入の3日後、ラットを屠殺し、組織を1%のグルタルアルデヒドを用いて固定化し、動脈中のLacZの発現を、X−galを用いて可視化した。結果を図16Fに示す。気管支上皮にLacZ染色を認めた。また、肺動脈からHVJエンベロープベクターを導入したときも気管支上皮に遺伝子発現を認めた(データを示さず)。
【0124】
(実施例14:ウイルスエンベロープベクターのドラッグデリバリーシステム(DDS)としての機能)
本発明の遺伝子導入ベクターは、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸治療のためのドラッグデリバリーシステムとしても有用である。
【0125】
(14.1:蛍光オリゴヌクレオチドの導入)
本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入を行った。
【0126】
FITCで5’をラベルした20マーのオリゴヌクレオチド(5’−CCTTgAAGGGATTTCCCTCC−3’)194μg/92μ1 BSSを10,000HAUのHVJ(紫外線198ミリジュール/cm2で不活性化)の沈殿と混合し、TritonX−100(0.24%、最終濃度)を添加し、氷上で1分間処理し、1mlのBSSを加えて、遠心(15,000rpm、15分、4℃)した。沈殿に100μlのPBSを加えて、−20℃保存した。1ヶ月後、融解し、10μl分を5μgの硫酸プロタミンと混合し、500万個のBHK−21細胞(0.5ml倍地中)とインキュベート(10分、60分)した。導入翌日に蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察したところ、図17Bに示すように、10分では10%程度のオリゴヌクレオチド導入効率であったが、図17Aに示すように、60分では80%以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた。
【0127】
(14.2:Stat6デコイ核酸による接触性皮膚炎の治療)
本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞へのデコイ核酸の導入を行った。
【0128】
Stat6のDNA結合配列をもつ二重鎖核酸(5’−GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT−3’および3’−CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA−5’、(Wang,LHら、:Blood 95、1249〜1257、 2000))250μg/300μl BSSを30,000HAUのHVJ(紫外線99ミリジュール/cm2で不活性化)の沈殿と混合し、TritonX−100(最終濃度 0.24%)を添加し、氷上で1分間処理し、lmlのBSSを加えて、遠心(15,000rpm、15分間、4℃)した。沈殿に300μlのPBSを加えて−20℃保存した。このHVJエンベロープベクターを、マウスの皮下注入に用いたところ、IgE誘発のアレルギーと遅延型皮膚反応を抑制した。
【0129】
(実施例15:浮遊系細胞への遺伝子導入)
ヒト白血病細胞様であるCCRF−CEM、NALM−6、K−562を対象として遺伝子導入実験を行った。
【0130】
pCMV−Luciferase 200μg(92μl)を10,000HAUの不活性化HVJ(紫外線99ミリジュール/cm2)の沈殿と混合し、TritonX−100(0.24%、最終濃度)を加え、氷上で1分間処理し、1mlのBSSを加えて、遠心(15,000rpm、15分、4℃)した。沈殿に300μlのPBSを加えてHVJエンベロープベクターを調製した。ベクター60μl(2,000HAU相当)、硫酸プロタミン、および400万個の浮遊系細胞を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中で混合し、10,000〜15,000rpm、10分、20℃の遠心を行った。その後、沈殿に培養液を加え、培養皿に移し、1日後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。
【0131】
使用した細胞株は、HVJ−リポソームや既存のリポソーム試薬(Gibc BRLのLipofectin、Lipofectamineなど)を用いた場合には導入効率が極めて低い細胞株(特にCCRF−CEM、NALM−6)であるが、図18に示すように、これら細胞株に対する高効率の遺伝子導入が観察された。
【0132】
好ましい遺伝子導入の条件は、硫酸プロタミン600〜1,000μg/mlを添加し、遠心は10,000rpmまたは15,000rpmで、10分間、20℃での遠心をする条件であった。HVJエンベロープベクターによる有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンの添加の両方が、遺伝子導入に必要であった。
【0133】
(実施例16:癌組織への遺伝子導入)
pCMV−Luciferase354μg(92μl)を34,000HAUの不活性化HVJ(紫外線99ミリジュール/cm2)の沈殿と混合し、TritonX−100(0.24%、最終濃度)を添加して、氷上で1分間処理し、1mlのBSSを加えて、遠心(10,000〜15,000rpm、10分間、20℃)した。沈殿に300μlのPBSを加えて、−20℃で保存した。1日後、硫酸プロタミン500μg/ml、または1000μg/mlと混合し、その100μ1をマウスメラノーマB16−Flの腫瘍塊(径7〜8mm)に注入し、1日後にルシフェラーゼ活性を測定した。図19に示すように、腫瘍塊での遺伝子発現がみられた。好ましい硫酸プロタミン濃度は、500μg/mlであった。しかし、これより低い硫酸プロタミン濃度では、遺伝子発現を検出できなかった。
【0134】
(実施例17:ヘルペスウイルスエンベロープベクターの調製)
(17.1:不活性化ウイルスの調製)
1型単純疱疹ウイルス(HSV−1)(1010プラーク形成単位/m1)を大阪大学医学系研究科細菌学講座の山西教授より供与された。このウイルスの不活性化条件を培養サル細胞(Vero細胞)におけるウイルスのプラーク形成により検討した。β−プロピオラクトン(BPL)0.05%を用いたウイルスの不活性化では、Vero細胞でのプラークの出現頻度が、9.l×l0-4(プラーク/Vero細胞)であった。一方、紫外線200および400ミリジュール/cm2照射でのウイルスの不活性化は、それぞれ4.3×10-4、2.2×10-6(プラーク/Vero細胞)であった。
【0135】
(17.2:不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入)
100μ1のHSV−1(109粒子)を620μ1のPBSで希釈後、紫外線400ミリジュール/cm2照射し、その10%量(72μ1)とDNA(pCMV−Luciferase 8.83μg/μl)と混合し、氷上で3% Triton−X100を8μ1加え(最終濃度、0.24%)、その1、2、3、4、5、6分後に1mlのPBSを添加して希釈した。各サンプルの100μ1をそのままBHK−21細胞(6ウェルプレート中)に導入した。細胞は10%のウシ胎児血清(FCS)含有ダルベッコ最少必須培地(DME)0.5m1/ウェルで培養した。また、別の実験において、各サンプルの100μlを硫酸プロタミン5μgと混合後、BHK−21に導入した。37℃、5% CO2のインキュベーター中で60分問放置後、培養液を10%FCS−DMEと交換した。22時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図20に示すように、本発明の方法を用いて調製されたヘルペスウイルスエンベロープベクターによる高効率の遺伝子導入が確認された。各サンプルとも形態学的な観察による細胞毒性は認められなかった。
【0136】
次に、Triton−X100で5分間処理したヘルペスウイルスエンベロープベクターを−80℃で2日間保存後、解凍し、再度BHK−21細胞に添加して導入効率を測定した。今回は導入60分後に10%FCS−DME 2.5ml/ウェルを加えて一晩培養して活性を測定した。血清の影響、ベクター量について検討した。
【0137】
図21に示すように、−80℃で2日間保存後であっても、なお高効率の遺伝子導入が確認された。血清10%を加えた培地を用いたものが、無血清培地よりも導入効率が高く、ベクター溶液200μ1(推定量:2.8×107ウイルス粒子/ウェル)が100μ1溶液(推定量:1.4×107ウイルス粒子/ウェル)より遺伝子導入活性が高かった。
【0138】
(17.3:不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入)
上記の開示より、この界面活性剤を用いてエンベロ一プベクターを作成する技術はHVJのみでなく、広く脂質膜を有するエンベロープウイルスに適用可能であることが当業者に明らかである。従って、当業者が本発明の開示に従って、他のエンベロープウイルスを用いて、容易に遺伝子導入のためのエンベロ一プベクターを調製し得ることが明らかである。従って、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、ヘパドナウイルス科などのウイルスのエンベロープベクターが作成可能である。これによりウイルスの有する組織指向性を利用した特定の臓器への標的導入が実現可能と考えられる。たとえば単純疱疹ウイルスのエンベロープベクターは神経指向性のベクターとして、エプスタイン−バーウイルスのエンベロープベクターはBリンパ球指向性のベクターとして、インフルエンザのエンベロープベクターは呼吸器指向性ベクターとして応用し得る。
【0139】
上記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的について本明細書に記載されるが、種々の改変が、本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得ることは、明らかである。具体的には、本明細書の実施例は、不活性化HVJを用いた遺伝子導入ベクターについて記載されてきたが、同様の調製方法を用いて、HVJ以外のウイルスを不活性化して本発明の遺伝子導入ベクターを調製すること、および不活性化工程を行わずに本発明の遺伝子導入ベクターを調製することは、本明細書の開示から当業者に明らかである。したがって、本発明は、添付の請求の範囲以外によっては限定されない。
【0140】
【発明の効果】
操作が簡便で、しかも遺伝子導入効率の優れた新しい遺伝子導入方法が提供される。これにより、遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングが可能になると考えられる。本発明のウイルスエンベロープベクターを含む、高スループットスクリーニングのためのキットもまた提供される。また、本出願によって提供されるウイルスエンベロープベクターは長期間の凍結保存が可能であり、要事調製の必要がないため、作業工程が大幅に簡略化できるとともに、導入ベクターの大量調製による均質な遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明の遺伝子導入ベクターは、従来のHVJを基に調製されたベクターよりも、高効率の遺伝子導入を可能にし、かつ従来の方法よりもより広範囲の生体内組織に対する遺伝子導入を可能とする。
【0141】
本発明の遺伝子導入ベクターを含む、医薬品投与のためのドラッグデリバリーシステム、薬物のスクリーニング系、および遺伝子治療用ベクターも提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、HVJエンベロープベクターを様々な回数で凍結融解し、培養細胞にトランスフェクションして外来遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子)の発現(ルシフェラーゼ活性)の程度を測定した結果である。
【図2】図2は、培養細胞に添加するHVJエンベロープベクターの調製に使用したウイルス数を同一として培養細胞にトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。
【図3】図3は、HVJエンベロープベクターの外来遺伝子(ルシフェラーゼ発現ベクター)の量を様々に変えた場合のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。
【図4】図4は、HVJエンベロープベクター調製のための緩衝液の種類を変えた場合のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。
【図5】図5は、従来の遺伝子導入ベクター不活性化HVJ−リポソームを用いた遺伝子導入と、この発明の方法とを比較した結果である。
【図6】図6は、界面活性剤を用いる不活性化HVJエンベロープベクターの調製方法の概略を示す図である。
【図7】図7は、界面活性剤を用いて調製したHVJエンベロープベクター中に含まれるタンパク質の、SDS−PAGEパターンを示す図である。
【図8】図8は、HVJエンベロープベクターの陰性染色法を用いた電子顕微鏡写真である。(1)未処理のHVJ;(2)DNAを含まないオクチルグルコシド処理したHVJ;(3)オクチルグルコシド処理した、DNAを含有するHVJ。
【図9A】図9A〜Cは、図面に示した各オクチルグルコシド濃度、オクチルグルコシドによるHVJの各処理時間、超音波処理有り(sonic)または超音波処理なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図9B】図9A〜Cは、図面に示した各オクチルグルコシド濃度、オクチルグルコシドによるHVJの各処理時間、超音波処理有り(sonic)または超音波処理なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図9C】図9A〜Cは、図面に示した各オクチルグルコシド濃度、オクチルグルコシドによるHVJの各処理時間、超音波処理有り(sonic)または超音波処理なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図10A】図10Aおよび10Bは、図面に示した各硫酸プロタミン(PS)の濃度および各トランスフェクト時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図10B】図10Aおよび10Bは、図面に示した各硫酸プロタミン(PS)の濃度および各トランスフェクト時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図11A】図11Aおよび11Bは、図面に示した各DNA量(実験に使用した量)、および各保存温度における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図11B】図11Aおよび11Bは、図面に示した各DNA量(実験に使用した量)、および各保存温度における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図12】図12は、図面に示した各HAUの力価のHVJを用いてHVJエンベロープベクターを調製し、遺伝子導入を行った場合の遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図13A】図13Aは、図面に示した各UV照射量における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図13B】図13Bは、図面に示した各β−プロピオラクトン(BPL)濃度における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図14】図14は、ヒト舌部の扁平上皮癌(SAS)に対する、図面に示した各硫酸プロタミン濃度および各トランスフェクションのインキュベーション時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図15】図15は、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)に対する、図面に示した各硫酸プロタミン濃度および各トランスフェクションのインキュベーション時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図16A】図16Aは、マウス肝臓に対する、本発明のHVJエンベロープベクターおよびHVJ−AVE(Artificial Viral Envelop)リポソームを用いた遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図16B】図16Bは、マウス子宮に対する、本発明のHVJエンベロープベクターおよびHVJ−AVE(Artificial Viral Envelop)リポソームを用いた遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
【図16C】図16Cは、マウス子宮に対する、本発明のHVJエンベロープベクターを用いたpEB−CMV−LacZの遺伝子導入後に、子宮組織のLacZ染色を行った結果である。LacZ染色によって、主に子宮内膜の腺上皮でのLacZ遺伝子の発現が検出された。
【図16D】図16Dは、SDラット(雄性、体重300〜400g)に対して、10,000HAUのpEGFP−1を含むHVJエンベロープベクターを、大槽経由、頚動脈経由で投与した結果である。投与後3〜4日目に屠殺し、生切片を作製し、蛍光顕微鏡下で観察した。▲1▼大槽経由での投与
脳の表面への、遺伝子導入が確認された。一方、脳深部への遺伝子導入は、確認されなかった。脈絡叢への遺伝子導入も確認されなかった。
▲2▼、▲3▼頚動脈経由での投与
投与を行った左側において、有意に高い発現が確認された。脳表面部分のみではなく、基底核部にも、発現が確認された。また、対脳の脳表にも、確認された。対脳の脳表での発現は、側副流(colateral flow)によって、対側に流れたものと考えられた。
【図16E】図16Eは、HGF機能を阻害する変異型HGFを発現するベクターであるpCMV−NK4が、容量依存的にVEGFによって誘導された血管新生を抑制した結果を示す図である。
【図16F】図16Fは、HVJエンベロープベクターを気管に注入して行った遺伝子導入の結果を示す図である。
【図17】図17Aおよび17Bは、細胞へのオリゴヌクレオチド導入の翌日に、蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察した結果を示す。10分間のインキュベーションでは10%程度のオリゴヌクレオチド導入効率であった(図17B)。一方、60分間のインキュベーションでは80%以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた(図17A)。
【図18A】図18は、ヒト白血病細胞株であるCCRF−CEM、NALM−6、K−562を対象として導入実験を行った結果である。これら細胞株は、HVJ−リポソームや既存のリポソーム試薬(Gibc BRLのLipofectin、Lipofectamineなど)では導入効率が極めて低い細胞株(特にCCRF−CEM、NALM−6)である。硫酸プロタミン600〜1000μg/mlを添加し、遠心は10000rpmまたは15000rpmで、10分間、20℃での遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。
【図18B】図18は、ヒト白血病細胞株であるCCRF−CEM、NALM−6、K−562を対象として導入実験を行った結果である。これら細胞株は、HVJ−リポソームや既存のリポソーム試薬(Gibc BRLのLipofectin、Lipofectamineなど)では導入効率が極めて低い細胞株(特にCCRF−CEM、NALM−6)である。硫酸プロタミン600〜1000μg/mlを添加し、遠心は10000rpmまたは15000rpmで、10分間、20℃での遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。
【図18C】図18は、ヒト白血病細胞株であるCCRF−CEM、NALM−6、K−562を対象として導入実験を行った結果である。これら細胞株は、HVJ−リポソームや既存のリポソーム試薬(Gibc BRLのLipofectin、Lipofectamineなど)では導入効率が極めて低い細胞株(特にCCRF−CEM、NALM−6)である。硫酸プロタミン600〜1000μg/mlを添加し、遠心は10000rpmまたは15000rpmで、10分間、20℃での遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。
【図19】図19は、癌組織への遺伝子導入の結果を示す。癌組織である腫瘍塊における遺伝子発現がみられ、特に、硫酸プロタミン500μg/mlの時に高い遺伝子導入活性が得られた。これより低い濃度の硫酸プロタミンを用いた場合、遺伝子発現を検出できなかった。
【図20】図20は、ヘルペスウイルスエンベロープベクターを用いる細胞への遺伝子導入の結果を示す。総ルシフェラーゼ活性は低いが、Triton−X100での5分間の処理によって、最も導入効率の高いベクターが作製できたと判断された。また硫酸プロタミンを用いない調製方法が、導入効率が高かった。各サンプルとも形態学的な観察によって細胞毒性は認められなかった。
【図21】図21は、−80℃での保存後のヘルペスウイルスエンベロープベクターを用いる細胞への遺伝子導入の結果を示す。血清10%を加えた培地を用いた場合、無血清培地よりも導入効率が高く、ベクター溶液200μ1(推定量:2.8×107ウイルス粒子/ウェル)が100μ1溶液(推定量:1.4×107ウイルス粒子/ウェル)より活性が高かった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a safe and highly efficient vector for gene transfer in vitro and in vivo. In particular, the present invention relates to a gene transfer vector prepared using a virus, an inactivated virus, particularly an inactivated HVJ (Sendai virus). The gene transfer vectors herein can also be used for gene therapy and high throughput screening.
[0002]
[Prior art]
For gene therapy, many viral and non-viral (synthetic) methods for gene transfer have been developed (Mulligan, Science, 260, 926-932 (1993) and Ledley, Human Gene Therapy, Vol. 6, 1129-1144 (1995)). In general, viral methods are more effective than non-viral methods for gene delivery to cells. However, viral vectors can pose safety problems due to co-introduction of essential genetic elements from the parent virus, leaky expression of viral genes, immunogenicity, and alteration of host genome structure. In general, non-viral vectors are less cytotoxic and immunogenic. However, most non-viral methods are particularly poor in gene transfer efficiency into the living body compared to some of the viral vectors.
[0003]
Thus, both viral and non-viral vectors have advantages with limitations. Therefore, by developing in vivo gene transfer vectors with high efficiency and low toxicity, the limitations of one type of vector system should be compensated by introducing the advantages of another type of system It is.
[0004]
On the other hand, HVJ is highly immunogenic, and is known to induce CTL when NP protein is produced in large quantities (Cole, GA, et al., J. Immunology 158, 4301-4309 (1997)). ). There is also a concern that protein synthesis of the host may be inhibited.
[0005]
For HVJ, centrifugation and column operation of virus fusion protein In Particles made by the method of making and reconstituting a lipid membrane lose the other protein (mainly M protein) possessed by the virus by reconstitution, so that the ratio of Fl to HN protein required for fusion activity Is not maintained in the same manner as the wild-type virus, so that the fusion activity is low. In addition, since the direction in which the fusion protein is inserted into the lipid membrane when reconstituted is not always the same as that of the wild-type virus, an unknown antigen may be presented.
[0006]
In addition, a method for reconstitution by adding a new molecule has also been reported (Uchida, T., et al., J. Cell. Biol. 80, 10-20, 1979). The risk of losing the original virus function is great because it is very different from the virus particles.
[0007]
As represented by conventional HVJ-liposomes, genes and proteins are encapsulated in liposomes and fusion particles prepared by fusing them with inactivated HVJ are non-invasive to cultured cells and living tissues. Gene transfer has become possible, and this technique has been frequently used worldwide at the animal experiment level (Dzau, VJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1412-111425 (1996). And Kaneda, Y. et al., Molecular Medicine Today, 5, 298-303 (1999)). However, it is necessary to prepare two different vesicles, a virus and a liposome, and the method is complicated. A particle whose average diameter is 1.3 times larger than that of a virus particle by fusing with a liposome has a fusion activity of 10% of that of a virus. It has been found that it has some drawbacks such as falling below.
[0008]
Furthermore, with conventional HVJ-based vectors, there were tissues where gene transfer was impossible and tissues with extremely low efficiency. This indicates that the target tissue for gene therapy based on the conventional method can be limited.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
For human gene therapy, it is desired to develop a viral vector that can be prepared safely, highly efficiently and simply, and can be introduced into a wide range of in vivo tissues.
[0010]
Therefore, the object of the present invention is to overcome the drawbacks of the conventional reconstituted HVJ vector method or HVJ-liposome method and develop a safe, highly efficient and simple virus-based gene transfer vector for a wide range of cultured cells and biological tissues. There is to do.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In one aspect of the present invention, a safe and highly efficient gene transfer vector using an inactivated virus is provided. Inactivated viruses in which the viral genome is inactivated are safe and have low cytotoxicity and antigenicity due to the absence of viral protein replication. By enclosing a gene in a virus envelope vector, which is a gene transfer vector using an inactivated virus, a safe, highly efficient and simple gene transfer vector for cultured cells and living tissues is prepared.
[0012]
In a further aspect of the present invention, a viral envelope vector capable of gene transfer into a wide range of in vivo tissues is provided. In one embodiment, the virus used is HVJ. Tissues that are gene-transferred in vivo by the virus envelope vector of the present invention include liver, skeletal muscle, uterus, brain, eye, carotid artery, skin, blood vessel, lung, heart, kidney, spleen, cancer tissue, nerve, B Examples include, but are not limited to, lymphocytes and respiratory tissues.
[0013]
In another aspect of the present invention, a method for easily introducing a gene into a floating cell is provided. A preferable method for introducing a gene into a floating cell using the virus envelope vector of the present invention includes a step of mixing the floating cell and the virus envelope vector in the presence of protamine sulfate, and a step of applying centrifugal force to the mixture. And a gene transfer method.
[0014]
In one aspect of the present invention, high-efficiency and rapid gene transfer into cultured cells and living tissues can be achieved by encapsulating a large amount of genes in a short time using the gene transfer vector of the present invention. Therefore, in a further aspect of the present invention, a high-throughput mass rapid analysis system for genome using the gene transfer vector of the present invention is possible.
[0015]
In a specific aspect of the present invention, the gene transfer vector can be stored for a long period (at least 2 to 3 months or more) in a frozen state at −20 ° C. The gene transfer vector can be sealed, stored and transported in a frozen state, for example.
[0016]
In another aspect of the present invention, a gene transfer vector having gene transfer activity is preferably provided in vitro to 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of cells. Is done.
[0017]
In one aspect of the present invention, when a virus envelope vector that is a gene transfer vector is formed 2 months after the preparation of an inactivated virus, it is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably Provides a gene transfer vector having 90% or more gene transfer activity.
[0018]
In another aspect of the present invention, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 50% or more, and most preferably 60% or more of cells in the tissue for local administration in vivo. A gene transfer vector having gene transfer activity is provided.
[0019]
In an aspect of the present invention, a gene transfer vector comprising an inactivated virus envelope is provided.
[0020]
In one aspect of the present invention, the virus used for the preparation of the gene transfer vector may be a wild type virus or a recombinant virus.
[0021]
In a further aspect of the invention, the viruses used are retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, poxviridae, It is a virus belonging to a family selected from the group consisting of Herpesviridae, Baculoviridae, and Hepadnaviridae. In a specific aspect of the present invention, the virus used is HVJ. In a further aspect of the present invention, Hasan, M. et al. K. (Journal of General Virology, 78, 2813-2820 (1997)) or Yonemitsu, Y. et al. (Nature Biotechnology 18, 970 to 973 (2000)), a recombinant Sendai virus is used to prepare a gene transfer vector.
[0022]
In another aspect of the present invention, a gene transfer vector for introducing a gene into a tissue in an animal body is provided.
[0023]
In the method for preparing the gene transfer vector of the present invention, the step of inactivating the virus is not necessarily required. Thus, in one aspect of the invention, without performing the step of inactivating the virus,
1) mixing the virus with a foreign gene, and
2) Freezing and thawing the mixed solution or further mixing the mixed solution with a surfactant;
A gene transfer vector can be prepared by a method comprising
[0024]
In another aspect of the present invention, a method for preparing an inactivated virus envelope vector for gene transfer, comprising:
Inactivating the virus;
Mixing the inactivated virus with a foreign gene; and
Freezing and thawing the mixture,
Are provided.
[0025]
In a further aspect of the invention, a method of preparing an inactivated viral envelope vector for gene transfer comprising:
Inactivating the virus; and
Mixing the inactivated virus with a foreign gene in the presence of a detergent,
Are provided.
[0026]
In a further aspect of the invention, the surfactant used is selected from the group consisting of octyl glucoside, Triton-X100, CHAPS and NP-40.
[0027]
In a specific aspect of the present invention, there is provided a method for preparing an inactivated virus envelope vector further comprising the step of adding protamine sulfate to a foreign gene before mixing with the inactivated virus envelope.
[0028]
In a further aspect of the present invention, a method for introducing a gene into an isolated animal tissue comprising:
Preparing a gene transfer vector containing a desired gene;
A step of introducing a gene into the animal tissue by a gene transfer vector;
Are provided.
[0029]
In another aspect of the present invention, a method for introducing a foreign gene into a floating cell is provided, the method comprising:
A step of mixing the floating cells and the gene transfer vector in the presence of protamine sulfate,
Step of centrifuging the mixture
Is included.
[0030]
In yet another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for gene therapy containing the gene transfer vector of the present invention.
[0031]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Definition)
As used herein, “gene transfer” refers to a natural, synthetic or recombinant desired gene or gene fragment in a target cell in vivo or in vitro, and the introduced gene has its function. Introducing to maintain. The gene or gene fragment introduced in the present invention includes a nucleic acid which is DNA, RNA or a synthetic analog thereof having a specific sequence. Also, as used herein, gene transfer, transfection, and transfection are used interchangeably.
[0032]
As used herein, “gene transfer vector”, “gene vector” or “virus envelope vector” refers to a vector in which a foreign gene is encapsulated in a virus envelope. The virus used for the preparation of the gene transfer vector may be a wild type virus or a recombinant virus.
[0033]
In one aspect of the invention, the viruses used are Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae A virus belonging to the family selected from the group consisting of Herpesviridae, Baculoviridae, and Hepadnaviridae. In a specific aspect of the present invention, the virus used is HVJ.
[0034]
As used herein, “gene transfer activity” refers to the activity of “gene transfer” by a vector, and functions of the introduced gene (for example, in the case of an expression vector, expression of the encoded protein and / or Alternatively, the activity of the protein can be detected as an index.
[0035]
As used herein, “inactivation” refers to a virus that has inactivated its genome. This inactivated virus is replication defective. Preferably, this inactivation is done by UV treatment or treatment with an alkylating agent.
[0036]
As used herein, “foreign gene” refers to a nucleic acid sequence of a non-viral origin contained within a gene transfer vector. In one aspect of the invention, the foreign gene is a regulatory sequence suitable for expression of the gene introduced by the gene transfer vector (eg, a promoter, enhancer, terminator, and poly A addition signal required for transcription, and A ribosome binding site necessary for translation, start codon, stop codon, etc.). In another aspect of the invention, the foreign gene does not contain regulatory sequences for expression of the foreign gene. In a further aspect of the invention, the foreign gene is an oligonucleotide or a decoy nucleic acid.
[0037]
The foreign gene contained in the gene transfer vector is typically a DNA or RNA nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule to be introduced may include a nucleic acid analog molecule. The molecular species contained in the gene transfer vector may be a single gene molecular species or a plurality of different gene molecular species.
[0038]
As used herein, a “gene library” is a nucleic acid library comprising nucleic acid sequences isolated from nature or synthetic nucleic acid sequences. Sources of nucleic acid sequences isolated from nature include, but are not limited to, genomic and cDNA sequences derived from eukaryotic cells, prokaryotic cells, or viruses. A library obtained by adding an arbitrary sequence (eg, signal, tag, etc.) to a sequence isolated from nature is also included in the gene library of the present invention. In one embodiment, the gene library includes sequences such as promoters that provide for transcription and / or translation of the nucleic acid sequences contained therein.
[0039]
In the present specification, “HVJ” and “Sendai virus” may be used interchangeably.
[0040]
As used herein, “HAU” refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes, and 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (Okada, Y. et al.,
[0041]
(Gene therapy)
Therapeutic nucleic acid constructs can be administered either locally or systemically using the gene transfer vectors of the present invention. Where such a nucleic acid construct includes a coding sequence for a protein, expression of the protein can be induced by use of an endogenous mammalian promoter or a heterologous promoter. The expression of the coding sequence can be constitutive or regulated.
[0042]
When the gene transfer vector of the present invention is used as a composition for gene therapy, the vector of the present invention can be administered by suspending a vector suspension suspended in PBS (phosphate buffered saline) or saline. By local injection (eg, into cancer tissue, liver, intramuscular and brain) or by administration into blood vessels (eg, intraarterial, intravenous and portal vein).
[0043]
In one embodiment, the gene transfer vector is generally used in a unit dose injectable form (solution, suspension or emulsion) of the gene transfer vector (ie, a pharmaceutically acceptable carrier (ie, used). Non-toxic to recipients at different dosages and concentrations, and compatible with the other ingredients of the formulation). For example, the formulation preferably does not include oxidizing agents and other compounds that are known to be deleterious to gene transfer vectors.
[0044]
The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used, and buffers such as phosphoric acid, citric acid, succinic acid, acetic acid, and other organic acids or their salts An antioxidant such as ascorbic acid; a low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide (eg, polyarginine or tripeptide); a protein (eg, serum albumin, gelatin, or an immunoglobulin); a hydrophilic polymer ( Amino acids (eg, glycine, glutamic acid, aspartic acid, or arginine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including cellulose or derivatives thereof, glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg mannitol) Other sorbitol); counterions (such as sodium); and / or nonionic surfactants (e.g., may include polysorbates, poloxamers), or PEG.
[0045]
A pharmaceutical composition comprising a gene transfer vector can typically be stored as an aqueous solution in unit or multi-dose containers, such as sealed ampoules or vials.
[0046]
The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention. Furthermore, the polypeptides of the present invention can be used with other therapeutic compounds.
[0047]
A pharmaceutical composition comprising a gene transfer vector of the present invention comprises a gene transfer vector in a manner consistent with good medical practice, an individual patient's clinical condition (eg, a condition to be prevented or treated). It is formulated and administered taking into account the site of delivery of the composition, the target tissue, the method of administration, the dosing schedule and other factors known to those of skill in the art. Accordingly, the “effective amount” or appropriate dosage of the gene transfer vector herein is determined by such considerations.
[0048]
For example, when the gene vector of the present invention is administered to a mouse, a gene vector equivalent to 20 to 20,000 HAU, preferably equivalent to 60 to 6,000 HAU, more preferably equivalent to 200 to 2,000 HAU per mouse. Be administered. The amount of the foreign gene contained in the administered gene vector is 0.1-100 μg, preferably 0.3-30 μg, more preferably 1-10 μg per mouse.
[0049]
In addition, when the gene vector of the present invention is administered to a human, it corresponds to 400 to 400,000 HAU per subject, preferably 1,200 to 120,000 HAU, more preferably 4,000 to 40,000 HAU. A gene vector is administered. The amount of the foreign gene contained in the administered gene vector is 2 to 2,000 μg, preferably 6 to 600 μg, more preferably 20 to 200 μg per subject.
[0050]
The following examples are illustrative and are not intended to limit the invention.
[0051]
【Example】
(1. Preparation of gene transfer vector using freeze-thaw and its use)
(Example 1: Preparation of HVJ envelope vector by freeze-thawing)
Using a luciferase gene as a foreign gene, the recombinant HVJ virus was freeze-thawed at various times and then introduced into cultured cells.
[0052]
TE500 μl was mixed with 750 μg of luciferase expression vector pcOriPLuc (Saeki and Kaneda et al., Human Gene Therapy, 11, 471-479 (2000)) and various concentrations of HVJ virus. The HVJ virus concentration was adjusted to 10, 25, 50, 100 HAU / μl. This solution was divided into 12 parts, each was stored at 4 ° C. with dry ice, frozen, and thawed repeatedly up to 30 times. A solution having been frozen and thawed a predetermined number of times was added to BHK-21 cells (24-well dish, 4 × 10 4 Four Cells / dish, 0.5 ml DMEM, 10% FCS) at 37 ° C., 5% CO 2 After 20 minutes of reaction, the plate was washed with PBS, 0.5 ml of a new culture solution was newly added, and cultured for 24 hours.
[0053]
After removing the medium and adding 500 μl of 1 × Cell Culture Lys Reagent (Promega) onto the cells to lyse the cells, the cells were transferred to a microtube and centrifuged. From 20 μl of the obtained supernatant, Promega Luciferase Assay System and Lumat Luciferase activity was measured using LB9501 Luminophotometer. The measurement was performed 3 times for each solution, and the average value was obtained.
[0054]
The results are as shown in FIG. Luciferase activity increased as the number of times of freezing and thawing of the recombinant HVJ virus increased, and 10 times or more of luciferase expression was observed in 20 times of freezing and thawing compared to 3 times of freezing and thawing. From this result, it was confirmed that the number of times of freezing and thawing of the recombinant HVJ virus is preferably 5 times or more, more preferably about 15 to 20 times under the conditions used in this example.
[0055]
(Example 2: Gene transfer efficiency of HVJ envelope vector prepared by freeze-thawing)
The same recombinant HVJ virus as in Example 1 was freeze-thawed 30 times, and then the efficiency of gene transfer into the cells was examined under the same conditions as the number of viruses added to the host cells.
[0056]
The results are as shown in FIG. In FIG. 2, for example, when the X axis is 500 HAU, the addition amount of the solution having a virus concentration of 10 HAU / μl is 50 μl, and the solution of 100 HAU / μl is 5 μl. As shown in FIG. 2, the gene expression efficiency of the solution with the virus concentration of 100 HAU / μl was reduced by about 50% compared to the case of the concentration of 10 to 50 HAU / μl. From this result, it was confirmed that the recombinant virus concentration is preferably in the range of 10 to 50 HAU / μl under the conditions of this example.
[0057]
The recombinant HVJ virus was thawed 29 times and then thawed 30 times, stored in that frozen state for 1 week, thawed and added to the cells. As a result, the recombinant HVJ virus stored frozen for 1 week also showed the same level of luciferase gene expression as that of the virus that had been thawed thirty times continuously.
[0058]
(Example 3: Measurement of gene transfer efficiency using luciferase expression vector)
HVJ envelope vectors were prepared with various amounts of luciferase expression vectors, and the efficiency of gene transfer into host cells was examined.
[0059]
The amount of HVJ virus was 50 HAU per 1 μl TE. The amount of the luciferase expression vector pcOriPLuc was 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 5.5 μg per 1 μl of TE. After freeze-
[0060]
The results are as shown in FIG. The expression level increased in an amount-dependent manner up to 1.5 μg of the addition amount of the expression vector pcOriPLuc (about 9.5 kb), which was a foreign gene, and the expression level was hardly changed thereafter. From the above results, it was confirmed that 1.5 μg / μl or more of exogenous gene DNA is preferably used for gene introduction under the conditions used in this example.
[0061]
(Example 4: Effect of buffer type on gene transfer efficiency)
The efficiency of gene transfer into host cells was examined by changing the type of buffer used for preparing the HVJ envelope vector.
[0062]
The amount of HVJ virus was 50 HAU per 1 μl of buffer, and the amount of luciferase expression vector pcOriPLuc was 15 μg / μl. Buffers are TE, PBS, BSS (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5), and those obtained by adding sucrose at final concentrations of 0 mM, 20 mM, 40 mM, and 60 mM to these buffers. used. After freeze-
[0063]
The results are as shown in FIG. 4. Under the conditions used in this example, it was confirmed that TE alone was preferable as a buffer for the preparation of recombinant HVJ virus.
[0064]
(Example 5: Comparison of AVE (Artificial Viral Envelop) type vector and HVJ envelope vector of the present invention)
Gene transfer using an inactivated HVJ-liposome that is a conventional gene transfer vector (AVE type having the highest gene transfer efficiency (Saeki, Y. et al., Human Gene Therapy, 8, 2133-2141 (1997)), The method of the present invention was compared.
[0065]
The amount of HVJ liposome or HVJ virus was 50 HAU per μl of TE, and the amount of luciferase expression vector pcOriPLuc was 1.5 μg / μl. In addition, the number of times of freezing and thawing of the recombinant HVJ virus was 2 or 15. Other conditions were the same as in Example 1 except that the host cells were human fetal kidney cell line HEK293.
[0066]
The results are as shown in FIG. It was confirmed that the method of the present invention in which the freeze-thawing of the HVJ envelope vector was repeated 15 times was far superior to the conventional method using the HVJ single liposome in terms of gene transfer efficiency.
[0067]
(Example 6: Introduction efficiency of synthetic oligonucleotide)
A synthetic oligonucleotide (20 bp) fluorescently labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) was mixed with an inactivated HVJ virus at a concentration of 1 mg / m1, and this solution was freeze-thawed 20 times, and then BHK-21 cells and 20 Reacted for 1 minute. As a result of observing the fluorescence signal after 17 hours, accumulation of fluorescence was recognized in the nucleus of almost 100% of the cells. From these results, it was confirmed that the method of the present invention is also effective for introducing a synthetic nucleic acid into cells.
[0068]
(Example 7: Introduction efficiency of GFP gene)
After freezing and thawing the mixed solution of GFP (green fluorescent protein) gene and
[0069]
From the above results, it was confirmed that the method of the present invention can reliably introduce a gene even in vivo. It was also confirmed that the HVJ envelope vector could be stored frozen.
[0070]
(2. Preparation of gene transfer vector using surfactant and use thereof)
(Example 8: Preparation of inactivated HVJ envelope vector using surfactant)
An outline of a method for preparing an inactivated HVJ envelope vector using a surfactant is shown in FIG.
[0071]
(1: Growth of HVJ)
HVJ can be generally used by inoculating a fertilized egg of a chicken by inoculation with a seed virus. However, cultured cells such as monkeys and humans, and a system for continuously infecting cultured tissues with a virus (cultivating a hydrolase such as trypsin). Any of those that are propagated by using a solution added to the liquid and those that are propagated by infecting a cultured cell with a cloned viral genome and causing persistent infection can be used.
[0072]
In this example, HVJ was propagated as follows.
[0073]
HVJ seeds of HVJ grown using SPF (Specific pathogen free) fertilized eggs, separated and purified, are dispensed into cell storage tubes, and 10% DMSO is added and stored in liquid nitrogen And prepared.
[0074]
Chicken eggs immediately after fertilization were received and placed in an incubator (SHOWA-FURANKI P-03 type; accommodating about 300 chicken eggs) and reared for 10-14 days under conditions of 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. In the dark room, use an ophthalmoscope (light bulb light exits through a window with an aperture of about 1.5 cm) to check embryo survival and air chamber and chorioallantoic membrane. About 5 mm above, the location of the virus injection was marked with a pencil (select the location excluding the thick blood vessels). Seed virus (taken from liquid nitrogen) 500 times with polypeptone solution (mixed with 1% polypeptone, 0.2% NaCl, adjusted to pH 7.2 with 1M NaOH, autoclaved and stored at 4 ° C) Diluted to 4 ° C. Eggs were sterilized with isodine and alcohol, and a small hole was made in a thousand holes at the site of virus injection. 1 ml was injected into the chorioallantoic cavity using a 1 ml syringe with a 26 gauge needle. Dissolved paraffin (melting point: 50-52 ° C.) was placed on the hole using a Pasteur pipette to close it. The eggs were placed in an incubator and bred for 3 days under conditions of 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. The inoculated eggs were then placed at 4 ° C. overnight. The next day, the air space of the egg was split with tweezers, a 10 ml syringe with an 18 gauge needle was placed in the chorioallantoic membrane, the chorioallantoic fluid was aspirated, collected in a sterile bottle, and stored at 4 ° C.
[0075]
(2: Purification of HVJ)
HVJ can be purified by purification methods by centrifugation, column purification methods, or other purification methods known in the art.
(2.1: Purification method by centrifugation)
Briefly, the grown virus solution was collected, and the tissue and cell debris in the culture solution and chorioallantoic fluid were removed by low speed centrifugation. The supernatant was purified by high-speed centrifugation (27,500 × g, 30 minutes) and ultracentrifugation (62,800 × g, 90 minutes) using a sucrose density gradient (30-60% w / v). It should be noted that the virus should be handled as gently as possible during purification and stored at 4 ° C.
[0076]
In this example, specifically, HVJ was purified by the following method.
[0077]
About 100 ml of HVJ-containing chorioallantoic fluid (collecting HVJ-containing chicken egg chorioallantoic fluid and storing at 4 ° C.) was placed in two 50 ml centrifuge tubes with a wide Komagome pipette (Saeki, Y., and Kaneda, Y: Protein modified liposomes (HVJ-1 iposomes) for the delivery of genes, volume of oligonucleotides and proteins, 27th edition, Cell biology; A. laboratory handbook, E. c. ~ 135, 1998), centrifuged in a low speed centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C (brake off) to remove egg tissue debris.
[0078]
After centrifugation, the supernatant was dispensed into four 35 ml centrifuge tubes (for high-speed centrifugation) and centrifuged with an angle rotor at 27,000 g for 30 minutes (accelerator and brake on). The supernatant was removed, and about 5 ml of BSS (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 137 mM NaC1, 5.4 mM KC1; autoclaved and stored at 4 ° C.) (PBS instead of BSS) was added to the precipitate, It left still at 4 degreeC as it was. Gently pipetted with a Komagome pipette, widened to loosen the precipitate, collected in a single tube, and centrifuged at 27,000 g for 30 minutes in the same manner. Excluding the supernatant, about 10 ml of BSS was added to the precipitate, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The precipitate was loosened by gently pipetting with a wide-bottom Komagome pipette, centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. (brake off) with a low-speed centrifuge, and the tissue fragments and virus clumps that could not be removed were removed. The supernatant is placed in a new sterile tube and stored as purified virus at 4 ° C.
[0079]
This
[0080]
Furthermore, purification of HVJ using a sucrose density gradient can be performed as necessary. Specifically, the virus suspension is placed in a centrifuge tube overlaid with 60% and 30% sucrose solutions (autoclaved), and density gradient centrifugation is performed at 62,800 × g for 120 minutes. After centrifugation, the band seen on the 60% sucrose solution layer is collected. The collected virus suspension is dialyzed overnight at 4 ° C. using BSS or PBS as an external solution to remove sucrose. If not used immediately, add glycerol (autoclave sterilization) and 0.5M EDTA solution (autoclave sterilization) to the virus suspension to a final concentration of 10% and 2-10 mM, respectively, and gently at −80 ° C. Frozen and finally stored in liquid nitrogen (cryopreservation is possible with 10 mM DMSO instead of glycerol and 0.5 M EDTA solution).
(2.2: Purification method by column and ultrafiltration)
Instead of the purification method by centrifugation, purification of HVJ using a column is also applicable to the present invention.
[0081]
In brief, purification was performed using concentration by ultrafiltration with a filter having a molecular weight cut-off of 50,000 (about 10 times) and elution by ion exchange chromatography (0.3 M to 1 M NaCl).
[0082]
Specifically, in this example, HVJ was purified by column using the following method.
[0083]
After the chorioallantoic fluid was collected, it was filtered through an 80 μm to 10 μm membrane filter. 0.006-0.008% BPL (final concentration) was added to chorioallantoic fluid (4 ° C., 1 hour) to inactivate HVJ. BPL was inactivated by incubating chorioallantoic fluid at 37 ° C. for 2 hours.
[0084]
The solution was concentrated about 10 times by tangential flow ultrafiltration using 500 KMWCO (A / G Technology, Needham, Massachusetts). As buffer, 50 mM NaCl, 1
[0085]
HVJ was purified by column chromatography (buffer solution: 20 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.2 to 1 M NaCl) by QSepharoseFF (Amersham Pharmacia Biotech KK, Tokyo). The recovery was 40 to 50%, and the purity was 99% or more.
[0086]
The HVJ fraction was concentrated by tangential flow ultrafiltration using 500 KMWCO (A / G Technology).
[0087]
(3: Inactivation of HVJ)
When inactivation of HVJ was required, it was performed by ultraviolet irradiation or alkylating agent treatment as described below.
[0088]
(3.1: UV irradiation method)
Take 1 ml of HVJ suspension in a petri dish with a diameter of 30 mm, 99 or 198 millijoules / cm 2 Was irradiated. Gamma irradiation can also be used (5-20 gray), but complete inactivation does not occur.
[0089]
(3.2: Treatment with alkylating agent)
Immediately before use, 10 mM KH 2 0.01% β-propiolactone was prepared in PO. During the work, it was kept at a low temperature and worked quickly.
[0090]
Β-propiolactone was added to a suspension of HVJ immediately after purification to a final concentration of 0.01% and incubated on ice for 60 minutes. Thereafter, it was incubated at 37 ° C. for 2 hours. Dispense 10,000 HAU per tube into an Eppendorf tube, centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, and store the precipitate at -20 ° C. Regardless of the inactivation method described above, the precipitate can be stored at -20 ° C., and the DNA can be directly incorporated by treatment with a surfactant to prepare a vector.
[0091]
(4: Creation of HVJ envelope vector)
92 μl of a solution containing 200 to 800 μg of foreign DNA was added to the preserved HVJ and well suspended by pipetting. This solution can be stored at −20 ° C. for at least 3 months. When protamine sulfate was added to DNA before mixing with HVJ, the expression efficiency was enhanced by a factor of 2 or more.
[0092]
This mixed solution was placed on ice for 1 minute, 8 μl of octyl glucoside (10%) was added, the tube was shaken on ice for 15 seconds, and left on ice for 45 seconds. The treatment time with the surfactant is preferably 1 to 5 minutes. In addition to octylglucoside, Triton-X100 (t-octylphenoxypolyethoxyethanol), CHAPS (3-[(3-colamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid), NP-40 (nonylphenoxypoly) Surfactants such as ethoxyethanol may also be used. Preferred final concentrations of Triton-X100, NP-40 and CHAPS are 0.24-0.80%, 0.04-0.12% and 1.2-2.0%, respectively.
[0093]
1 ml of cold BSS was added and immediately centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes. 300 μl of PBS or physiological saline was added to the resulting precipitate and suspended by vortexing and pipetting. The suspension can be used directly for gene transfer or can be used for gene transfer after storage at −20 ° C. This HVJ envelope vector maintained comparable gene transfer efficiency after storage for at least 2 months.
[0094]
(Example 9: Ratio of Fl and HN protein in HVJ envelope vector)
(1: Sample preparation)
(I) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the precipitate was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
(Ii) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent is irradiated with ultraviolet rays (198 mJ / cm 2 Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the precipitate was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
(Iii) Purified HVJ 10,000 HAU equivalent is irradiated with ultraviolet rays (198 mJ / cm 2 After that, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and 200 μg of pcLuciDNA (92 μl of the solution) was added to the precipitate and suspended by pipetting. Place on ice, add 8 μl of octylglucoside (10%), shake the tube by hand for 15 seconds, leave on ice for 45 seconds, add 1 ml of cold BSS, immediately centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, It was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C.
[0095]
(2: Protein electrophoresis)
A 5% Laemli sample buffer was added to 5, 10, and 20 μl of the three types of samples, and 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After the electrophoresis, it was stained with Coomassie blue, destained, pasted on cellophane paper and dried.
[0096]
(3: Protein identification)
The electrophoresed and stained sample was incorporated into LAS2000 (Fuji Film, Tokyo) (FIG. 7), and the concentration of the protein band corresponding to F1 and HN was measured. Three different amounts were run per sample, the F1 / HN density of each was calculated, and the average and standard deviation were determined for each sample.
[0097]
(4: Result)
In the samples (i), (ii), and (iii), the F1 / HN was almost equal to 1.7. Considering the molecular weights of F1 51 kDa and HN 68 kDa, the molar ratio is about 2.3. The optimal value of fusion with reconstituted liposomes using F1 and HN is consistent with the report (Exp. Cell Res. 142, 95-101, 1985) that F1 / HN is given at about 2. This ratio is different from that of the wild-type virus in the rearranged form reported by other researchers (J. Virol. 67, 3312-3318, 1993). Other protein compositions were almost the same for the HVJ and HVJ envelope vectors.
[0098]
(Example 10: Encapsulation of DNA in HVJ envelope vector and encapsulation rate)
(1: electron microscope image of HVJ envelope vector (DNA encapsulated, unencapsulated))
As described above, 130 μg of pSFV-LacZ (14.5 kb) was enclosed in 10,000 HAU HVJ (UV-inactivated) to prepare an HVJ envelope vector.
[0099]
The encapsulated HVJ envelope vector was suspended in 300 μl of PBS and stored at −20 ° C. Ten days later, 1 μl of the suspension was placed on a grid and observed with a negative staining method using an electron microscope. As a control, an HVJ envelope vector without DNA encapsulation was used.
[0100]
(result)
The results are shown in FIG. Many HVJ envelope vectors were of the same type as the HVJ virus itself observed in the past. Compared with DNA-unencapsulated ones, those using DNA showed structures with a higher electron density in the HVJ envelope vector. On the other hand, the unencapsulated one had high internal permeability, and it was estimated that the viral genome was destroyed or lost.
[0101]
(2: DNA encapsulation rate in HVJ envelope vector)
As described above, 157 μg of pcLuci (7.4 kb) was encapsulated in HVJ (UV-inactivated) of 6,700 HAU to prepare an HVJ envelope vector. The HVJ envelope vector is suspended in 300 μl of BSS, 15 units of micrococcal nuclease,
[0102]
(result)
Since the recovery rate was 85.7%, the conversion efficiency of DNA into the HVJ envelope vector was 3.8%. The uptake efficiency when 279 μg of pcLuci was taken into 10,000 HAU HVJ was 7.2%.
[0103]
From the above, the DNA uptake efficiency of 10,000 HAU into HVJ is estimated to be about 6-7% when octyl glucoside is used, but it may vary somewhat depending on the amount of DNA used. In addition, it has been known that the introduction efficiency increases when protamine sulfate coexists with DNA and HVJ envelope vector, but this is considered to be due to the increased efficiency of DNA encapsulation into the HVJ envelope vector. With Triton-X100 and NP-40, the efficiency is further increased, and it is estimated that it is about 10 to 40%.
[0104]
(Example 11: Gene transfer into cells using HVJ envelope vector)
(1: Gene transfer method)
1,000 HAU was placed in an Eppendorf tube (30 μl), and 5 μl of protamine sulfate (1 mg / ml) was added. The medium of BHK-21 cells (200,000 per well and spread in 6 wells the day before) was changed, and 0.5 ml of medium (10% FCS-DMEM) was added per well. To each well, a mixture of the above-mentioned vector (equivalent to 1,000 HAU) and protamine sulfate is added, and the vector and cells are mixed well by shaking the plate back and forth and left and right. 2 It was left in the incubator for 10 minutes.
[0105]
Change the medium, 5% CO at 37 ° C 2 The gene expression was examined by standing overnight (16-24 hours) in an incubator. In the case of luciferase (pcLuci; luciferase gene having a CMV promoter), cells were lysed with 0.5 ml of Cell Lysis Buffer (Promega), and the activity in a 20 μl solution was measured using a luciferase assay kit (Promega). In the case of green fluorescent protein (pCMV-GFPE; Promega), it was directly observed with a fluorescence microscope, 5 to 8 fields were observed at 400 magnifications, and the ratio of cells that emitted fluorescence was calculated.
[0106]
(2: Examination of conditions for introduction efficiency in cultured cells)
BHK-21 cells were used as cultured cells.
[0107]
(2.1: Examination of octylglucoside (OG) concentration in HVJ envelope vector preparation)
The effect of octyl glucoside (OG) at each concentration (final concentration of OG used when creating the HVJ envelope vector) on gene transfer using the HVJ envelope vector was investigated by making the following changes to the gene transfer method of (1). Was:
(A) Octyl glucoside concentration: 1, 2, 3%;
Time when inactivated HVJ was treated with OG when creating the HVJ envelope vector: 1 minute, 5 minutes, 10 minutes;
Sonication was performed or not performed.
(B) Octyl glucoside concentration: 0.125-1.25%;
Volume of vector used for transfection: 10 μl, 100 μl.
(C) Octyl glucoside: 0.55 to 0.8%;
Transfection time: 30 minutes, overnight (O / N).
The results are shown in FIG.
[0108]
(2.2: Conditions for gene introduction into cells, concentration of protamine sulfate (PS) and treatment time)
The effect of protamine sulfate on gene transfer using the HVJ envelope vector was examined by making the following changes to the gene transfer method of (1):
(A) Protamine sulfate: 0-100 μg / ml medium;
Transfection time: 20, 40, 60 minutes.
(B) Protamine sulfate: 0 to 40 μg / ml medium;
Transfection time: 5, 10, 20 minutes.
The results are shown in FIG.
[0109]
(2.3: Effect of DNA concentration enclosed in HVJ envelope vector on gene expression level)
The effect of the amount of DNA used in the experiment on the gene expression level by the HVJ envelope vector was investigated by making the following changes to the gene introduction method of (1):
(A) DNA amount: 20-200 μg;
The HVJ envelope vector was stored at -20 ° C or -80 ° C for 5 days.
(B) DNA amount: 180-360 μg / HVJ 10,000 HAU.
The results are shown in FIG.
[0110]
(2.4: Effect of HVJ titer used for gene transfer on gene expression level)
The effect of the HVJ titer used for gene introduction on the gene expression level by the HVJ envelope vector was examined by making the following changes to the gene introduction method of (1):
HVJ envelope vectors were prepared using HVJ with titers of 5,000, 10,000, and 20,000 HAU, and amounts corresponding to 250, 500, 1,000, and 2,000 HAU of each were used for BHK. -21 cells were transfected.
The results are shown in FIG.
[0111]
(2.5: Effect of HVJ inactivation conditions on HVJ envelope vector gene transfer efficiency)
The effect of the HVJ inactivation method (UV or β-propiolactone) on luciferase gene expression in BHK-21 cells was examined by making the following changes to the gene introduction method of (1).
(A) Irradiation dose for UV inactivation: 0 to 231 millijoules / cm 2 .
(B) β-propiolactone (BPL) concentration used for HVJ treatment: 0 to 0.025%.
The results are shown in FIG.
[0112]
(Example 12: Gene transfer of HVJ envelope vector into various cells)
The gene was transferred to squamous cell carcinoma (SAS) of the human tongue by the method described in Example 11. The results are shown in FIG. The concentration of protamine sulfate and the incubation time at the time of transfection during gene introduction were changed as shown in FIG. 14, and the efficiency of gene introduction was measured by the expression of the luciferase gene. Within the range of transfection conditions, 200 μg / ml of protamine sulfate was used, and when transfection was performed for 60 minutes, the gene transfer efficiency was maximum, but if the protamine sulfate concentration was further increased, Further increase in gene transfer efficiency is expected.
[0113]
Gene transfer was performed on human aortic endothelial cells (HAEC) by the method described in Example 11. The results are shown in FIG. The concentration of protamine sulfate and the incubation time at the time of transfection during gene introduction were varied as shown in FIG. 15, and the efficiency of gene introduction was measured by the expression of the luciferase gene. Within the range of the transfection conditions, 100 μg / ml protamine sulfate was used and the transfection treatment was performed for 60 minutes. The gene transfer efficiency was maximum, but if the protamine sulfate concentration was further increased, Further increase in gene transfer efficiency is expected.
[0114]
(Example 13: Gene transfer of HVJ envelope vector into various living tissues)
In this example, gene transfer into various in vivo tissues using the HVJ envelope vector described in Example 11 is exemplified.
[0115]
(13.1: Mouse liver)
The HVJ envelope vector was prepared by leaving 0.8% octyl glucoside and 200 μg pcLuci on ice for 1 minute and suspending in 300 μl PBS. 30 μl of 1/10 volume of the prepared suspension (corresponding to 1,000 HAU) was diluted with 70 μl PBS (
[0116]
HVJ-AVE (Artificial Viral Envelop) liposomes were prepared by vortexing / extrusion followed by sucrose gradient centrifugation (62,000 g, 90 min) with 200 μg pcLuci. The preparation is then centrifuged by centrifugation (27,000 g, 30 minutes) pellet And suspended in 500 μl of PBS. 100 μl of this sample was injected into one of the mouse (C57BL / 6) liver lobes.
[0117]
After 24 hours, injected liver lobes were isolated and the luciferase activity of the leaves was assayed using the Promega Luciferase Assay System. The results are shown in FIG. 16A. As is clear from this result, the HVJ envelope vector of the present invention showed a gene transfer efficiency that was significantly higher than that of the conventional HVJ-AVE liposome by about 2 times.
[0118]
(13.2: Mouse uterus)
An HVJ envelope vector was prepared in the same manner as in 13.1. 50 μl and 100 μl samples were diluted with PBS to 500 μl, injected into the mouse fallopian tube, and the cervix was ligated for 10 minutes. Twenty-four hours later, mouse uterus was isolated and leaf and uterine luciferase activity was assayed using the Promega Luciferase Assay System. The results are shown in FIG. 16B. Although gene transfer into the mouse uterus was possible with the HVJ envelope vector of the present invention, no detectable gene transfer into the uterine tissue was found by the method using HVJ-AVE liposomes.
[0119]
An HVJ envelope vector containing pcLuci was prepared as in 13.1. For LacZ expression, an HVJ envelope vector containing pEB-CMV-LacZ (13 kb) was prepared using 200 μg of plasmid. HVJ envelope vectors containing each of these vectors were injected into the uterus as described above. The results are shown in FIG. 16C. LacZ staining detected the expression of the LacZ gene mainly in the endometrial glandular epithelium.
[0120]
(13.3: Rat brain)
PEGFP-1 (the jellyfish green fluorescent protein gene (approximately 0.7 kb) was incorporated into an expression vector having a cytomegalovirus promoter by a method similar to the preparation of the HVJ envelope vector containing pcLuci described above. HVJ envelope vector containing vector (available from Clontech, Palo Alto, CA) was prepared. 30 μl of vector (1/10 of the preparation, equivalent to 1,000 HAU) was injected into SD rats (Sprague-Dawley rats) via carotid artery injection or intrathecal injection from the cisterna magna. Three to four days after gene transfer, rats were sacrificed, brain sections were prepared without fixation, and fluorescence was observed under a fluorescence microscope. As in the results shown in FIG. 16D, expression of green fluorescent protein (GFP) in the brain was observed in both cases of carotid artery injection and intrathecal injection from the cisterna. In contrast, when HVJ-AVE liposomes were used to introduce the same gene from the rat carotid artery, GFP expression in the brain was not observed.
[0121]
(13.4: Rabbit eyes)
pCMV-NK4 constructed by cloning NK4 cDNA (1.4 kb), a mutant of human HGF (hepatocyte growth factor) gene, at the HindIII / XbaI site of pCDNA3 (In Vitrogen, San Diego, Calif.) Produced by Prof. Toshikazu Nakamura, Graduate School of Medicine.
[0122]
The HVJ envelope was prepared in the same manner as the HVJ envelope vector containing pcLuci described above, except that 10,000 HAU inactivated HVJ was used with either 400 μg or 800 μg pCMV-NK4. Vector was prepared. pCMV-NK4 expresses mutant HGF that inhibits HGF function Plasmid It is. 50 μl of vector (1/6 of the preparation) was injected into rabbit corneal tissue treated with a pellet of recombinant VEGF to induce neovascularization. Seven days after treatment, the rabbits were sacrificed and observed for neovascularization in the eyes. The result is shown in FIG. 16E. pCMV-NK4 suppressed angiogenesis induced by VEGF in a dose-dependent manner.
[0123]
(13.5: Rat pulmonary artery)
An HVJ envelope vector containing pSV-LacZ (Promega, Madison, WI) having a LacZ gene under the control of the SV40 promoter was prepared in the same manner as the above-described HVJ envelope vector containing pcLuci was prepared. did. 50 μl of vector (1/6 of the preparation) was injected into the rat trachea. Three days after gene transfer, the rats were sacrificed, the tissues were fixed with 1% glutaraldehyde, and the expression of LacZ in the arteries was visualized with X-gal. The results are shown in FIG. 16F. LacZ staining was observed in the bronchial epithelium. In addition, gene expression was also observed in bronchial epithelium when HVJ envelope vector was introduced from pulmonary artery (data not shown).
[0124]
(Example 14: Function of virus envelope vector as drug delivery system (DDS))
The gene transfer vector of the present invention is also useful as a drug delivery system for oligonucleotide or decoy nucleic acid therapy.
[0125]
(14.1: Introduction of fluorescent oligonucleotide)
Using the virus envelope vector of the present invention, fluorescently labeled oligonucleotides were introduced into cells.
[0126]
20-mer oligonucleotide labeled 5 ′ with FITC (5′-CCTTgAAGGGATTCCCTCC-3 ′) 194 μg / 92 μ1 BSS in 10,000 HAU HVJ (
[0127]
(14.2: Treatment of contact dermatitis with Stat6 decoy nucleic acid)
The viral envelope vector of the present invention was used to introduce decoy nucleic acid into cells.
[0128]
Double-stranded nucleic acid (5′-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT-3 ′ and 3′-CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA-5 ′, (Wang, LH et al., Blood 95, 1249 to 1257, 2000)) 250 μg / 300 μl with Stat6 DNA binding sequence 30,000 HAU HVJ (UV 99 mJ / cm 2 Inactive), add Triton X-100 (final concentration 0.24%), treat on ice for 1 min, add 1 ml BSS, centrifuge (15,000 rpm, 15 min, 4 min). ° C). 300 μl of PBS was added to the precipitate and stored at −20 ° C. When this HVJ envelope vector was used for subcutaneous injection in mice, it suppressed IgE-induced allergies and delayed skin reactions.
[0129]
(Example 15: Gene transfer to suspension cells)
Gene transfer experiments were conducted on human leukemia cell-like CCRF-CEM, NALM-6, and K-562.
[0130]
200 μg (92 μl) of pCMV-Luciferase was used to inactivate 10,000 HAU of HVJ (UV 99 mJ / cm 2 ), And Triton X-100 (0.24%, final concentration) was added, treated on ice for 1 minute, 1 ml of BSS was added, and centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). HVJ envelope vector was prepared by adding 300 μl of PBS to the precipitate.
[0131]
The cell line used is a cell line (especially CCRF-CEM, NALM-6) with very low introduction efficiency when HVJ-liposomes or existing liposome reagents (Gibc BRL Lipofectin, Lipofectamine, etc.) are used. As shown in FIG. 18, highly efficient gene transfer into these cell lines was observed.
[0132]
The preferable conditions for gene transfer were conditions in which 600 to 1,000 μg / ml of protamine sulfate was added and the centrifugation was performed at 10,000 rpm or 15,000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. No significant cytotoxicity was observed with the HVJ envelope vector. Moreover, both centrifugation and addition of protamine sulfate were necessary for gene transfer.
[0133]
(Example 16: Gene transfer to cancer tissue)
354 μg (92 μl) of pCMV-Luciferase was used to inactivate 34,000 HAU of HVJ (UV 99 mJ / cm 2 ), Add TritonX-100 (0.24%, final concentration), treat on ice for 1 minute, add 1 ml BSS, and centrifuge (10,000-15,000 rpm, 10 minutes) , 20 ° C.). 300 μl of PBS was added to the precipitate and stored at −20 ° C. One day later, protamine sulfate was mixed with 500 μg / ml or 1000 μg / ml, and 100 μl thereof was injected into a tumor mass (diameter: 7 to 8 mm) of mouse melanoma B16-Fl, and luciferase activity was measured one day later. As shown in FIG. 19, gene expression was observed in the tumor mass. A preferred protamine sulfate concentration was 500 μg / ml. However, gene expression could not be detected at lower protamine sulfate concentrations.
[0134]
(Example 17: Preparation of herpesvirus envelope vector)
(17.1: Preparation of inactivated virus)
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (10 Ten Plaque formation unit / m1) was provided by Prof. Yamanishi of the Department of Bacteriology, Osaka University Graduate School of Medicine. The virus inactivation conditions were examined by virus plaque formation in cultured monkey cells (Vero cells). In inactivation of the virus with β-propiolactone (BPL) 0.05%, the frequency of plaque appearance in Vero cells is 9. l × l0 -Four (Plaque / Vero cells). On the other hand, ultraviolet rays 200 and 400 millijoules / cm 2 Inactivation of the virus by irradiation is 4.3 × 10 respectively. -Four 2.2 × 10 -6 (Plaque / Vero cells).
[0135]
(17.2: Gene transfer using inactivated virus)
100 μl of HSV-1 (10 9 Particles) diluted with 620 μl of PBS, and ultraviolet rays of 400 millijoules / cm 2 Irradiate, mix 10% amount (72 μl) with DNA (pCMV-Luciferase 8.83 μg / μl), add 8 μl of 3% Triton-X100 on ice (final concentration, 0.24%), After 3, 4, 5, 6 minutes, 1 ml of PBS was added for dilution. 100 μl of each sample was directly introduced into BHK-21 cells (in a 6-well plate). The cells were cultured in Dulbecco's minimal essential medium (DME) 0.5 ml / well containing 10% fetal calf serum (FCS). In another experiment, 100 μl of each sample was mixed with 5 μg of protamine sulfate and then introduced into BHK-21. 37 ° C, 5% CO 2 After standing for 60 minutes in the incubator, the culture medium was replaced with 10% FCS-DME. The luciferase activity was measured after 22 hours. As shown in FIG. 20, high-efficiency gene transfer was confirmed using a herpesvirus envelope vector prepared using the method of the present invention. In each sample, no cytotoxicity was observed by morphological observation.
[0136]
Next, the herpesvirus envelope vector treated with Triton-X100 for 5 minutes was stored at −80 ° C. for 2 days, thawed, added again to BHK-21 cells, and the introduction efficiency was measured. In this case, 60 minutes after introduction, 2.5 ml / well of 10% FCS-DME was added and cultured overnight to measure the activity. The influence of serum and the amount of vector were examined.
[0137]
As shown in FIG. 21, highly efficient gene transfer was still confirmed even after storage at −80 ° C. for 2 days. The one using a medium supplemented with 10% serum has higher introduction efficiency than the serum-free medium, and the
[0138]
(17.3: Gene transfer using inactivated virus)
From the above disclosure, it will be apparent to those skilled in the art that the technique for producing an envelope vector using this surfactant is applicable not only to HVJ but also to envelope viruses having a wide lipid membrane. Therefore, it is clear that those skilled in the art can easily prepare an envelope vector for gene transfer using other enveloped viruses according to the disclosure of the present invention. Therefore, Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae, Hepadnavirus Envelope vectors for viruses such as families can be created. Thus, it is considered possible to introduce a target into a specific organ using the tissue directivity of the virus. For example, the herpes simplex virus envelope vector can be applied as a neurotrophic vector, the Epstein-Barr virus envelope vector as a B lymphocyte-directed vector, and the influenza envelope vector as a respiratory directional vector.
[0139]
From the foregoing, it will be apparent that while particular embodiments of the invention are described herein for purposes of illustration, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Specifically, although the examples of the present specification have been described for gene transfer vectors using inactivated HVJ, viruses other than HVJ can be inactivated by using a similar preparation method. It will be apparent to those skilled in the art from the disclosure herein that the gene transfer vector is prepared and the gene transfer vector of the present invention is prepared without performing an inactivation step. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
[0140]
【The invention's effect】
Provided is a new gene introduction method that is simple in operation and excellent in gene introduction efficiency. This will enable rapid screening of gene libraries. A kit for high throughput screening comprising the viral envelope vector of the present invention is also provided. In addition, the virus envelope vector provided by the present application can be cryopreserved for a long period of time and does not require preparation. Introduction becomes possible. Furthermore, the gene transfer vector of the present invention enables higher-efficiency gene transfer than conventional vectors prepared based on HVJ, and enables gene transfer to a wider range of in vivo tissues than conventional methods. To do.
[0141]
Drug delivery systems for drug administration, drug screening systems, and gene therapy vectors comprising the gene transfer vector of the present invention are also provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of measuring the degree of expression of a foreign gene (luciferase gene) (luciferase activity) by freezing and thawing an HVJ envelope vector at various times and transfecting the cultured cells.
FIG. 2 shows the results of measurement of luciferase activity when transfected into cultured cells with the same number of viruses used to prepare the HVJ envelope vector added to the cultured cells.
FIG. 3 shows the results of measurement of luciferase activity when the amount of a foreign gene (luciferase expression vector) of the HVJ envelope vector is variously changed.
FIG. 4 shows the results of measurement of luciferase activity when the type of buffer for preparing the HVJ envelope vector was changed.
FIG. 5 shows the result of comparison between gene transfer using a conventional gene transfer vector-inactivated HVJ-liposome and the method of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing an outline of a method for preparing an inactivated HVJ envelope vector using a surfactant.
FIG. 7 is a diagram showing an SDS-PAGE pattern of a protein contained in an HVJ envelope vector prepared using a surfactant.
FIG. 8 is an electron micrograph using a negative staining method for the HVJ envelope vector. (1) Untreated HVJ; (2) octylglucoside-treated HVJ not containing DNA; (3) octylglucoside-treated HVJ containing DNA.
FIGS. 9A-C show gene transfer at each octyl glucoside concentration, HVJ treatment time with octyl glucoside, sonicated or not sonicated, and sonicated sonication, and vector volume used, respectively. It is the graph which showed efficiency by luciferase activity.
FIGS. 9A-C show gene transfer at each octyl glucoside concentration, HVJ treatment time with octyl glucoside, sonication or sonication, and sonication, and each vector volume used, as shown in the figure. It is the graph which showed efficiency by luciferase activity.
FIGS. 9A-C show gene transfer at each octyl glucoside concentration, HVJ treatment time with octyl glucoside, sonicated or not sonicated, and sonicated sonication, and each vector volume used. It is the graph which showed efficiency by luciferase activity.
FIGS. 10A and 10B are graphs showing luciferase activity of the concentration of each protamine sulfate (PS) shown in the drawings and the gene transfer efficiency at each transfection time.
FIGS. 10A and 10B are graphs showing luciferase activity with the concentration of each protamine sulfate (PS) shown in the drawings and the gene transfer efficiency at each transfection time.
11A and 11B are graphs showing the amount of each DNA shown in the drawings (the amount used in the experiment) and the gene transfer efficiency at each storage temperature in terms of luciferase activity.
11A and 11B are graphs showing the amount of each DNA shown in the drawings (the amount used in the experiment) and the gene transfer efficiency at each storage temperature in terms of luciferase activity.
FIG. 12 is a graph showing the gene transfer efficiency in terms of luciferase activity when an HVJ envelope vector was prepared using HVJ having the titer of each HAU shown in the drawing and gene transfer was performed.
FIG. 13A is a graph showing the gene transfer efficiency at each UV irradiation dose shown in the drawing in terms of luciferase activity.
FIG. 13B is a graph showing the gene transfer efficiency at each β-propiolactone (BPL) concentration shown in the drawing in terms of luciferase activity.
FIG. 14 is a graph showing luciferase activity of gene transduction efficiency at each protamine sulfate concentration and incubation time of each transfection shown in the figure for squamous cell carcinoma (SAS) of human tongue.
FIG. 15 is a graph showing luciferase activity of the gene transfer efficiency in human aortic endothelial cells (HAEC) at each protamine sulfate concentration and incubation time of each transfection shown in the drawing.
FIG. 16A is a graph showing the gene transfer efficiency using HVJ envelope vector of the present invention and HVJ-AVE (Artificial Viral Envelop) liposome to mouse liver in terms of luciferase activity.
FIG. 16B is a graph showing the gene transfer efficiency using the HVJ envelope vector of the present invention and the HVJ-AVE (Artificial Viral Envelop) liposome to the mouse uterus as luciferase activity.
FIG. 16C shows the result of LacZ staining of uterine tissue after gene transfer of pEB-CMV-LacZ using the HVJ envelope vector of the present invention to the mouse uterus. LacZ staining detected the expression of the LacZ gene mainly in the endometrial glandular epithelium.
FIG. 16D shows the results of administration of an HVJ envelope vector containing 10,000 HAU of pEGFP-1 via the cisterna and the carotid artery to SD rats (male,
Gene transfer to the surface of the brain was confirmed. On the other hand, gene transfer into the deep brain was not confirmed. No gene transfer to the choroid plexus was confirmed.
(2), (3) Administration via the carotid artery
Significantly higher expression was confirmed on the left side of administration. Expression was confirmed not only in the brain surface but also in the basal ganglia. It was also confirmed on the brain surface of the brain. The expression on the brain surface of the antibrain was thought to have flowed to the contralateral side due to collateral flow.
FIG. 16E is a diagram showing the results of pCMV-NK4, a vector expressing mutant HGF that inhibits HGF function, suppressing angiogenesis induced by VEGF in a dose-dependent manner.
FIG. 16F is a diagram showing the results of gene transfer performed by injecting an HVJ envelope vector into the trachea.
FIGS. 17A and 17B show the results of observing fluorescence of cells with a fluorescence microscope on the day after introduction of oligonucleotides into cells. FIGS. The oligonucleotide introduction efficiency was about 10% after 10 minutes of incubation (FIG. 17B). On the other hand, in the incubation for 60 minutes, the oligonucleotide was introduced into 80% or more of the cells (FIG. 17A).
FIG. 18 shows the results of an introduction experiment on CCRF-CEM, NALM-6, and K-562, which are human leukemia cell lines. These cell lines are cell lines (especially CCRF-CEM, NALM-6) in which introduction efficiency is extremely low with HVJ-liposomes and existing liposome reagents (Gibc BRL Lipofectin, Lipofectamine, etc.). High luciferase activity was obtained under the conditions of adding 600 to 1000 μg / ml of protamine sulfate and centrifuging at 10000 rpm or 15000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. There was no significant cytotoxicity. Both centrifugation and protamine sulfate were necessary for introduction.
FIG. 18 shows the results of introduction experiments on human leukemia cell lines CCRF-CEM, NALM-6, and K-562. These cell lines are cell lines (especially CCRF-CEM, NALM-6) in which introduction efficiency is extremely low in HVJ-liposomes and existing liposome reagents (Gibc BRL Lipofectin, Lipofectamine, etc.). High luciferase activity was obtained under the conditions of adding 600 to 1000 μg / ml of protamine sulfate and centrifuging at 10000 rpm or 15000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. There was no significant cytotoxicity. Both centrifugation and protamine sulfate were necessary for introduction.
FIG. 18 shows the results of an introduction experiment on CCRF-CEM, NALM-6, and K-562, which are human leukemia cell lines. These cell lines are cell lines (especially CCRF-CEM, NALM-6) in which introduction efficiency is extremely low with HVJ-liposomes and existing liposome reagents (Gibc BRL Lipofectin, Lipofectamine, etc.). High luciferase activity was obtained under the conditions of adding 600 to 1000 μg / ml of protamine sulfate and centrifuging at 10000 rpm or 15000 rpm for 10 minutes at 20 ° C. There was no significant cytotoxicity. Both centrifugation and protamine sulfate were necessary for introduction.
FIG. 19 shows the results of gene transfer into cancer tissue. Gene expression was observed in a tumor mass which is a cancer tissue, and in particular, high gene transfer activity was obtained when protamine sulfate was 500 μg / ml. When a lower concentration of protamine sulfate was used, gene expression could not be detected.
FIG. 20 shows the results of gene transfer into cells using a herpesvirus envelope vector. Although the total luciferase activity was low, it was judged that a vector with the highest introduction efficiency could be prepared by treatment with Triton-X100 for 5 minutes. In addition, the preparation method without using protamine sulfate had high introduction efficiency. In each sample, no cytotoxicity was observed by morphological observation.
FIG. 21 shows the results of gene transfer into cells using a herpesvirus envelope vector after storage at −80 ° C. When a medium supplemented with 10% serum was used, the introduction efficiency was higher than that of the serum-free medium, and the
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