JP4209673B2 - 糖ペプチド及びペプチド性膜関連成分のコンジュゲートを含んでなる抗菌薬 - Google Patents
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Description
本発明は、抗菌活性を有する薬物、並びにその製造のための方法及び中間体に関する。さらに本発明は、ヒトを含む動物における細菌感染の治療のためのかかる薬物の使用に関する。
【0002】
(発明の背景)
細菌感染によって起こる疾患は、ヒト及びその他の哺乳動物に有意な罹病率及び死亡率を有する。感染過程は、次の3つの段階:細菌の侵入及び宿主でのコロニー形成;有毒物質の出現を伴なう、宿主における細菌の侵襲及び増殖;並びに宿主の応答からなる。
【0003】
細菌感染は、ブドウ球菌属及び連鎖球菌属などのグラム陽性菌により引き起こされるものと、大腸菌などのグラム陰性菌によって引き起こされるものに大きく分類することができる。グラム陽性菌は、丈夫な細胞壁に取り囲まれた典型的な脂質二重層細胞膜を有する。上記細胞壁は、主として、ペプチドグリカンからなり、ペプチドグリカンは、交互D−及びL−アミノ酸を含むペプチドで架橋されたN−アセチルグルコサミンとN−アセチルムラミン酸のポリマーである。これに加えて、グラム陽性細菌の外側細胞壁は、多糖、タンパク質、テイコ酸、及びリポテイコ酸からなる複合体を含む。対照的に、グラム陰性菌は、はるかに薄いペプチドグリカン層、炭水化物とテイコ酸からなる複合体層が欠如したリポ多糖を含む外膜を有する。
【0004】
抗生物質は、他の微生物の生育を抑制し、最終的にはこれらを破壊し得る様々な種の微生物(細菌、真菌)により生産される物質である。加えて、一般的な意味では、抗生物質という用語は広く、半合成抗生物質、すなわち、化学的に修飾した細菌性抗生物質、並びに合成抗菌薬(例えば、スルホンアミド)をも包含する。また、「抗生物質」という用語には、微生物によるコロニー形成又は微生物の侵襲に応答して局部的に発生する宿主防御系にみいだされる多様なペプチドも含まれる。数百種の抗生物質が同定されており、その多くが感染症の治療に有用な段階まで開発されている。
【0005】
抗菌薬を分類及び区分するのに、複数のスキームが提案されている。最も一般的な分類は、下記のように、化学的構造、並びに提示された作用機構に基づいてなされる:(1)微生物の細胞膜に直接作用し、透過性に作用することによって、細菌内化合物の漏出を起こす薬物、例えば、デタージェント、カチオン性ペプチド、グラミシジンA及びポリミキシンなど;(2)細菌細胞壁の合成を阻害する、βラクタム、セファラスポリン及び糖ペプチドなどの薬物;(3)細菌のタンパク質合成に作用する薬物、例えば、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールなど;(4)抗代謝物として作用し、細菌の葉酸合成を妨害する薬物、例えば、スルホンアミドなど;並びに、(5)核酸の合成又は活性を阻害する薬物、例えば、キノロンなど。
【0006】
細菌膜に直接作用するペプチド抗菌薬は、細菌の細胞膜の全体的透過性化又は変質を引き起こす。これは、ペプチドと外膜表面の成分との結合によるもので、これにより膜構造の再編と、細胞内の内容物が漏出する細孔の形成が起こる。一般に、これらの特徴は、両親媒性ペプチドの特性に関連し、らせん状の二次構造と実効陽電荷が関わることが多い。この作用様式を有するペプチド抗生物質としては、マガイニン、ディフェンシン、並びに、ナイシンのようなランチビスティックスが挙げられる。このクラスの抗生物質の活性は、哺乳動物細胞よりむしろ細菌を指向する。何故なら、抗生物質の正に帯電した残基が、哺乳動物細胞膜より細菌において優勢に存在する負に帯電した脂質と相互作用するからである。
【0007】
特に、マガイニンは、アフリカツメガエル(Xenopus laeVis)の皮膚にみいだされる一クラスの両親媒性α−らせんペプチドである。このクラスのペプチド(両生類由来のボンビニン[Gibson, B.W., Tang, D., Mandrell, R. Kelly, M. & Spindel, E. R.(1991)J. Biol. Chem. 266, 223103-23111]、ハチ毒素由来のメリチン[Habermann, E.(1972)Science, 177, 314-322]、及び真菌由来のアラメチシン[Latorre, R. & AlVarez, S.(1981)Physiol. ReV., 61, 77-150]も含まれる)は、低濃度で、膜電位の破壊を、また、より高い濃度では、挿入を介した膜溶解を引き起こす。
【0008】
臨床上の効能のために、多方面からの関心を集めている一群の抗生物質として、糖ペプチド群の抗生物質がある。これらの薬物は、多様なアミノ糖及び非アミノ糖で置換されていることもある剛性で環状化したヘプタペプチドバックボーンからなる。このクラスにおけるいくつかのメンバーのアミノ糖部分は、N−アシル、N−アルキル、又はN−アリール置換を含んでいる。このクラスに含まれる2つの抗生物質は、バンコマイシンとテイコプラニンである。バンコマイシンは、インドネシア及びインドの土壌サンプルから単離される放線菌、Streptococcus orientalisにより生産される。この抗生物質は、その発見から間もなく精製され、その特性が記載された(McCormickら、1956)。バンコマイシンは、分子量が約1,500Daの複雑な三環糖ペプチドである。その構造は、X線分析により下記のように決定された(Sheldrickら、1978):
【化2】
バンコマイシンは、主として、グラム陽性菌に対して活性である。これらの菌の菌株は、4μg/mL以下の最小阻害濃度で、感受性であると考えられる。エンテロコッカスspp.の大部分の菌株がそうであるように、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、コリネバクテリウムspp.が高度に感受性である。放線菌spp.やクロストリジウムspp.の大部分の種もバンコマイシンに対して感受性であるが、上記より高い濃度の抗生物質を要する。バンコマイシンは、重症の感染を治療するためだけに用いられ、特に、肺炎、気腫、心内膜炎、骨髄炎、及び軟組織膿瘍など、メチシリン耐性ブドウ球菌による感染のマネージメントに特に有用である。この薬物は、ペニシリン及びセファロスポリンに対しアレルギーの患者におけるブドウ球菌感染の治療にも極めて有用である。
【0009】
バンコマイシンは、細菌の細胞壁の合成中に、ペプチドグリカンの糖成分とペプチド成分との架橋を阻止することにより、感受性細菌における細胞壁の合成を阻害する。十分な架橋がなければ、細胞壁は機械的に脆弱となり、細菌は、浸透圧の変化を受けると、溶解する。バンコマイシンは、架橋の前に、ペプチドグリカン前駆体のペンタペプチド部分のD−アラニル−D−アラニン(D-Ala-D-Ala)末端と、高い親和力で結合する。D-Ala-D-Alaジペプチドは、バンコマイシンのペプチドバックボーンとの相補的水素結合を形成する。バンコマイシン−ペプチドグリカン複合体は、トランスペプチダーゼ酵素の作用を物理的に遮断し、これによって、ペプチドグリカンを強化するペプチド架橋の形成を阻害すると考えられている。また、この活性により、細菌細胞質におけるペプチドグリカン前駆体の蓄積も起こる。
【0010】
抗生物質に対する耐性については詳しく記載されており、耐性株は、ヒトの健康にとって大きな脅威となり得る。細菌は、薬物がその標的に到達できない;薬物が不活性化された;あるいは、標的が改変した、いずれかの理由で、抗菌薬に対して耐性となる。例えば、細胞表面中又は内に常在して、薬物を不活性化する酵素を生産する細菌もあれば、薬物の流入を妨げる不透過性細胞膜を備える細菌もある。
【0011】
VanA〜C型などのバンコマイシンについては、数種の耐性が記載されている。VanA表現型は、バンコマイシンにより誘導可能であり、テイコプラニンとバンコマイシンの両方に対する耐性を賦与する。VanA表現型は、転移因子Tn1546、又は密接に関連する因子により媒介される(Arthurら、1993)。トランスポゾンは、ピルビン酸をD−乳酸(D−lac)に還元するデヒドロゲナーゼ(VanH)と、D−Ala及びD−Lac間のエステル結合の形成を触媒する広い基質特異性のリガーゼ(VanA)をコードする(Dukta-Malenら、1990;Buggら、1991)。結果として得られたD-Ala-D-Lacデプシペプチドにより、ペプチドグリカン合成の経路におけるジペプチドD-Ala-D-Alaが置換される。置換により、抗生物質の結合に重要な水素結合が排除される(Buggら、1991)。バンコマイシンに暴露すると、VanB表現型も誘導される;しかし、VanA表現型とは対照的に、これらの微生物は、テイコプラニンに対して耐性ではない。何故なら、テイコプラニンは、VanB細菌における耐性に必要な遺伝子の発現を誘導しないからである(Arthurら、1996;EVers及びCouValin, 1996)。VanB表現型の細菌によるバンコマイシンに対する耐性は、VanA耐性に類似した機構、すなわち、未成熟なペプチドグリカン上の末端D-Ala-D-Alaの、D-Ala-D-Lacデプシペプチドによる置換によって起こる。E. gallinarum、E. casseliflaVus及びE. FlaVescensの種に属する腸球菌におけるさらに別のバンコマイシン耐性表現型が記載されている(VanC)。これらの細菌は、低レベルのバンコマイシンに対して本来耐性であり、テイコプラニンに対して感受性である。耐性は、D−セリンで終結するペプチドグリカン前駆体の生産によって起こる(Billot-Kleinら、1994;Reynoldsら、1994)。
【0012】
ペプチドグリカン前駆体類似体のカルボキシ末端でのD−SerによるD−Alaの置換によって、バンコマイシンに対する前駆体の親和力が低下するが、テイコプラニンに対する親和力の変化は比較的小さい(Billot-Kleinら、1994)。過去10年にわたる腸球菌における糖ペプチドに対する高レベル耐性の出現及び蔓延により、効能が証明された抗生物質全てに対して耐性の臨床分離菌が発生した(Handwegerら、1992;Handwegerら、1993)。臨床分離菌における糖ペプチド耐性の発生数は増加し、腸球菌は、院内病原体及び耐性遺伝子の貯蔵庫として重要になってきた(Murray 1990;Woodfordら、1995)。多薬物耐性株への院内感染は、破滅的となる恐れがあるため、新規の抗菌薬、又は細菌感染を制御する方法を開発する必要がある。
【0013】
抗生物質耐性株の出現に対処するために用いられてきた手法として、既存の抗生物質を修飾して、耐性生物に対するそれらの効力を改善する方法、あるいは、細菌の原形質膜を透過性にすることによりその標的を殺す新規のペプチド抗生物質の発見がある。最初の手法の例は、近年、バンコマイシンのような糖ペプチドの誘導体の形成に焦点を絞っている。
【0014】
結合剤である2−(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を用いたバンコマイシンのカルボキシル末端の官能化により、溶液及び固相の両方で、短いペプチド配列を結合するのに成功している[Sundram, U. N.及びGriffin, J. H.(1995)J. Org. Chem. 60 1102-1103]。バンコマイシン及び関連する抗生物質のアミノ糖及び末端アミン部分も誘導体化されている。還元的アルキル化法で、バンコサミン糖(vancosamine sugar)がアルキル化された一連の化合物が作られたが、そのいくつかは、バンコマイシン耐性細菌株に対し、非常に改善された活性を示した[Cooper, R. D. G.ら(1996)J. Antibiotics 49, 575-581;Rodrigez, M. J.ら(1998)J. Antibiotics 51, 560-569]。
【0015】
WO-A-98/02454には、可溶性の治療用ポリペプチドを、一般的構造:
−(L−[W])n−X (I)
(式中、各Lは、独立に、フレキシブルリンカー基であり、各Wは、独立に、ペプチド性膜結合成分であり、nは、1以上の整数であり、Xは、ペプチド又は非ペプチド性膜結合又は挿入型成分である)
の実体で修飾したポリペプチド誘導体が記載されている。
【0016】
(I)型の構造は、膜と相互作用する成分のコンビナトリアルアレイを表し、これと可溶性ポリペプチドとの結合が、ポリペプチドと哺乳動物細胞の外側細胞膜との結合を媒介することがわかった。これによって、特に、細胞保護物質及び抗炎症薬として作用する補体活性化の調節物質の場合、治療効果が得られた(例えば、Dongら(1999)Mol. Immunol. 36 957-963)。
【0017】
(発明の概要)
本発明者らは、(I)型の構造が、真核生物より高い比率の酸性リン脂質を有し、かつより高い比率の膜関連生合成タンパク質を有する細菌膜と、より強い結合を呈示すると仮定した。そして、バンコマイシン及びその誘導体などの化合物をさらに(I)型の構造及び関連構造で誘導体化すれば、これら化合物の抗菌活性を増加できることがわかった。
【0018】
従って、本発明の第1の態様は、化合物:
V−L−W−X (II)
(式中、Vは、細菌におけるペプチドグリカン生合成を阻害する糖ペプチド部分であり;Lは、連結基であり;
Wは、ペプチド性膜関連成分であり;
Xは、水素又は膜挿入型成分である)
を提供する。
【0019】
ペプチドグリカン生合成阻害物質(V)
ペプチドグリカンの最初の2つの段階は、細菌細胞内で起こる。第1の段階は、連結ペンタペプチドとN−アセチルムラミン酸に基づく脂質との組立からなり、このペプチドは:
L−アラニン−γ−D−グルタミン酸−Xaa−D−アラニン−D−アラニン(配列番号39)(式中、Xaaは通常、m−D−アミノピメリン酸であるが、いくつかの種(例えば、黄色ブドウ球菌)では、L−リシンである)
である。
【0020】
第2の段階では、脂質が、N−アセチルグルコサミンにより延長される。次に、この脂質が、細胞膜を通して輸送される。
【0021】
第3の段階は、細菌膜の外側表面上で起こり、トランスグリコラーゼによる、脂質連結GlcNAc−MurNAC−二糖の重合と、トランスペプチダーゼによるペプチド側鎖の架橋を含んでなる。
【0022】
このクラスの生合成経路の阻害物質として最もよく知られている化合物は、バンコマイシンであり、これは、前述したように、細菌細胞壁ペプチドグリカン前駆体のペンタペプチドのD−Ala−D−Alaジペプチド末端との結合によってペプチドグリカン生合成を阻害し、それらのペプチドグリカンへのさらなるプロセシングを阻止することが知られている。
【0023】
バンコマイシンの誘導体もまた、ペプチドグリカンの生合成を阻害することによって作用する。バンコサミン糖上でアルキル化した一連の化合物には、別の糖で誘導体化した類似化合物と同様、バンコマイシン耐性菌に対して活性があることが明らかにされている[Cooper, R.D.G.ら(1996)J. Antibiotics 49, 575-581;Rodriguez, M.J.ら(1998)J. Antibiotics 51, 560-569;Ge, M.ら(1999)Science 284, 507-511]。
【0024】
一般に、部分Vは、細菌においてペプチドグリカン生合成を阻害する糖ペプチド部分である。一般に、当業者は、このクラスの糖ペプチドをよく知っており、本発明での使用に適した糖ペプチドを選択することができる。このような糖ペプチドは、通常分子量が、1,000〜3,000Daであり、Lys−D−Ala−D−Alaペプチド、Lys−D−Ala−D−乳酸デプシペプチド、脂質GlcNAC-MurNAC−ペンタペプチドの成分などの細菌ペプチドグリカン構造の個々の成分と相互作用することができ、4μg/ml以下のmic(最小阻害濃度)で、バンコマイシン感受性標準株(例えば、下記の標準株から選択されるいずれか:黄色ブドウ球菌NCTC(National Collection of Type Cultures)6571、黄色ブドウ球菌ATCC 25923(NCTC 12981)、黄色ブドウ球菌ATCC 29213(NCTC 12973)、肺炎連鎖球菌ATCC 49619(NCTC 12977)、及びEnterococcus faecalis ATCC 29212(NCTC 12697))に対して活性である。micを試験するのに一般に是認されている標準的方法は、BSACによる推奨に従う、IsoSensitest寒天上の寒天稀釈法である。これは、The Journal of Antimicrobial Chemotherapy(1991)、第27巻、付録Dに公表されている。
【0025】
部分Vとして考慮される具体的バンコマイシン誘導体として、WO96/30401及びWO98/00153に開示されている糖ペプチドに基づく化合物、それらの塩が挙げられる。尚、これらの文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【0026】
従って、部分V−L−の好ましい例として、式(III)を有するもの、又はそれらの塩が挙げられる:
【化3】
(式中、
Y及びY’は、独立に水素又はクロロであり;
Rは、水素、4−エピ−バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又は式−Ra−L−の基であり、ここで、Raは、4−エピ−バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニルで、L(式(II)のリンカー)はRaのアミノ基に結合しており;
R1は、水素、又はマンノースであり;
R2は、−NH2−、−NHCH3、−N(CH3)2、−NHL−、又はN(CH3)L−であり;
R3は、−CH2CH(CH3)2、[p−OH、m−Cl]フェニル、p−ラムノース−フェニル、[p−ラムノース−ガラクトース]フェニル、[p−ガラクトース−ガラクトース]フェニル、又は[p−CH3O−ラムノース]フェニルであり;
R4は、−CH2−(CO)NH2、ベンジル、[p−OH]フェニル、又は[p−OH,m−Cl]フェニルであり;
R5は、水素、又はマンノースであり;
R6は、水素、4−エピ−バンコサミニル、バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又はアスコサミニルであり;あるいは、R6は、式Rb−L−の基であって、ここで、Rbは4−エピ−バンコサミニル、バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又はアスコサミニルであり、LはRbのアミノ基に結合しており;又は、R6は、基Rb−R7であって、ここで、R7は、1,000以下、好ましくは、500以下、さらに好ましくは、250以下(例えば、150以下など)Daの有機側鎖部分であり;
Ter1は、ヒドロキシ又はL−である;
但し、上記部分は、少なくとも1つの(例えば、2又は3の)基−L−を含むものとする)。
【0027】
有機側鎖部分の詳細な性質は、本発明を制限する特徴ではない。このような部分として、何千もの種類が当技術分野では知られており、WO96/30401及びWO98/00153に記載されている多数の例が挙げられる。尚、これらの文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【0028】
有機側鎖部分のサブグループは、式−CH2−R8を有するものを含み、式中R8は:
水素、
C1−C15のアルキル、
C2−C15のアルケニル、
C2−C15のアルキニル、
C1−C7のハロアルキル、
アセナフテニル、
2−フルオレニル、
9,10−ジヒドロ−2−フェナントレニル、
R9、
C1−C11アルキル−R9、
C2−C7アルケニル−R9、
C2−C7アルキニル−R9、又は
C1−C7アルキル−O−R9であり、
ここで、R9は、下記式の基である:
−R10−[リンカー(0又は1)−R10](0又は1)
(式中、各R10は、独立に、フェニル、C5−C6のシクロアルキル、ナフチル、又はチエニルを示し、その各々は、非置換もしくは、1又は2の置換基で随意に置換されており、該置換基の各々は、独立に、C1−C10のアルキル、C1−C2のハロアルキル、C1−C2のハロアルコキシ、C1−C10のアルコキシ、ハロ、シアノ、又はニトロであり;
「リンカー」は:
−C1−C3のアルキレン、
−O−C1−C6アルキレン、
−C1−C6アルキレン−O−、
−O−、
−N(H又はC1−C3の低アルキル)
−S−、
−SO−、
−SO2−、
−NH−C(O)−、
−C(O)−NH−、
−CH=CH−、
−C C−、
−N=N−、
−O−C(O)−、又は
−C(O)−O−である)。
【0029】
「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味し;フルオロ及びクロロが好ましい。ハロアルキル及びハロアルコキシ基は、好ましくは、一置換又は同じハロ基で二置換されているが、C1−3ハロアルキル基はペルフルオロ基であってもよい。
【0030】
基−CH2−R8の好ましい例として、下記のものが挙げられる:
(4−フェニルベンジル)
(4−(4−クロロフェニル)ベンジル)
(4−(4−メチルフェニル)ベンジル)
(4−フェノキシベンジル)
((4−n−ブチルフェニル)ベンジル)
(4−ベンジルベンジル)
式(III)の化合物として、Rodriguez, M.J.ら(1998)J. Antibiotics 51, 560-569に記載されたLY 264826、LY 191145及びLY 333328が挙げられる。
【0031】
部分Vの特に好ましい例として、限定するものではないが、バンコマイシン、クロロエレモマイシン、テイコプラニンA2−2、リストセチンA、エレモマイシン、バルキマイシン、アクチノジンA、コムプレスタニン、クロロペプチン1、キスタマイシンA及びアボパルシンが挙げられる。
【0032】
ペプチド性膜関連成分(W)
式IIの化合物のこの部分(W)は、細菌膜に関連するペプチドである。特定の理論に拘束されるわけではないが、成分Wと細菌膜との関連によって、糖ペプチド抗生物質の局部濃度が増加することから、耐性株に対して低下した効力が、作用部位で増加した濃度により改善されると考えられる。
【0033】
「膜関連」という用語は、2つの基本的な作用様式、すなわち、膜との結合及び/又は膜への挿入を意味する。前者の場合には、ペプチドは、負に帯電したリン脂質のような細菌膜の表面上の成分と会合(結合)できるという特性を有する。後者の場合には、この成分は、この特性を有する抗菌ペプチドであるか、又はそのようなペプチドに基づくものでよい(例えば天然のものから得られる)。
【0034】
ペプチドは、組換え又は合成により、例えば、段階的合成によって調製することができる。あるいは、これらのペプチドは、例えば、細菌により生産される膜関連ペプチドの場合、自然にペプチドを生産する細胞の培養物から回収することができる。
【0035】
合成手段により生産されるペプチドは、一般に、天然のL−アミノ酸(すなわち、遺伝コードによりコードされるもの、すなわち、いわゆるタンパク新生アミノ酸)から構成されるが、D−アミノ酸を用いてもよい。いずれの場合でも、例えば、in ViVo半減期を増強する、又は安定性を改善するために、側鎖修飾を実施することができる。側鎖修飾として、例えば、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化後にNaBH4を用いた還元、メチルアセトイミデートを用いたアミジン化、又は無水酢酸を用いたアシル化などによるアミノ基の修飾がある。
【0036】
アルギニン残基のグアニジノ基は、2,3−ブタンジオン又はグリオキサールのような試薬を用いた複素環縮合産物の形成により修飾することができる。スルフヒドリル基は、カルボキシメチル化のような方法により、トリプトファン残基は、インドール環の酸化又はアルキル化により、また、ヒスチジン残基のイミダゾール環は、アルキル化により、それぞれ修飾することができる。
【0037】
カルボキシ末端及びその他のカルボキシ側鎖は、エステル基、例えば、C1−6アルキルエステルの形態、又はアミドの形態でブロックすることができる。
【0038】
また、N−末端をブロックしてもよい。
【0039】
アミノ酸に対する修飾について以上記載した例が全てを網羅しているわけではない。当業者は、当技術分野でそれ自体公知の化学を用いて、所望であれば、アミノ酸側鎖を修飾することができる。
【0040】
天然に存在する供給源から回収したペプチドは、非タンパク新生アミノ酸を含んでいることがある。これらのアミノ酸は、タンパク新生アミノ酸の翻訳後修飾、又は生合成のいずれかにより生産される。
【0041】
ペプチド性成分は、システイン又はリシン残基で終結しているか、あるいは、C末端から1又は2アミノ酸以内にこのような残基を有することにより、リンカーLを介した基Vとの連結を促進することができる。しかし、その他のアミノ酸が排除されるわけではなく、連結基の性質が、他の部分との結合に適している場合には、用いてもよい。
【0042】
ペプチド成分Wは、一般に、長さが5〜40アミノ酸、好ましくは、7〜30アミノ酸、例えば、8〜30アミノ酸のサイズである。
【0043】
別途記載のない限り、アミノ酸配列は、標準表記を用いて、かつ、NからC末端方向に表示する。
【0044】
膜結合ペプチド
ペプチドが膜結合性である場合、成分(W)は、一般にアルギニン及びリシン、特にリシンから選択される複数の帯電アミノ酸を含むことにより、細菌膜に存在する帯電脂質との相互作用を促進することができる。このようなペプチドは、好ましくは、少なくとも1つの配列(Xaa)n(式中、nは、1〜12、好ましくは、3〜10であり、各Xaaは、独立に、リシン又はアルギニンである)を含む。
【0045】
従って、前述した優先事項全体を考慮に入れると、Wは、リシン及びアルギニンから選択される1〜12、より好ましくは2〜10、例えば3〜10個の連続した残基の少なくとも1つの配列を含む5〜40個のアミノ酸のペプチドでよい。
【0046】
さらにまた好ましくは、Wは、リシン及びアルギニンから選択される1〜12、より好ましくは2、好ましくは3〜10個の連続した残基の少なくとも1つの配列を含む7、好ましくは8〜30個のアミノ酸のペプチドでよい。
【0047】
さらに好ましくは、Wは、1〜12、より好ましくは2、好ましくは3〜10個の連続したリシン残基の少なくとも1つの配列を含む7、好ましくは8〜30個のアミノ酸のペプチドでよい。
【0048】
前記実施形態のすべてにおいて、ペプチドは、例えば、+1〜+10の合計正電荷を有するのが好ましい。このような成分の例として、下記のものが挙げられる:
DGPKKKKKKSPSKSSG(配列番号4);
GSSKSPSKKKKKKPGD(配列番号5);
SPSNETPKKKKKRFSFKKSG(配列番号6);
DGPKKKKKKSPSKSSK(配列番号7);及び
SKDGKKKKKKSKTK(配列番号8)。
【0049】
膜挿入ペプチド
ペプチドが膜挿入性ペプチドである場合、このようなペプチドは、膜を破壊するペプチドの作用により、多くの場合、そこに細孔を形成することによって、それ自体が抗菌活性を有するものである。「抗菌活性」とは、バンコマイシンのカルボキシ末端でバンコマイシンと連結したペプチドのコンジュゲートが、前述した条件下で、前述したE. faecalis株に対して、0.064mg/ml以下、好ましくは、0.032mg/ml以下のmicを有することを意味する。
【0050】
このようなペプチドの具体的例として、動物など、天然の供給源からのものが挙げられる。両生類の皮膚など、様々な供給源に由来する特定のペプチドは、往々にして抗菌性を伴なう膜挿入特性を有することが知られている。
【0051】
多数のペプチド群が、このような活性を有することが知られており、Jack及びJung, Chimia 52(1988);48-55、並びに、McCaffertyら、Current Opinion, Chemical Biology(1999)3;672-680に記載されているペプチドなどがある。尚、これらの文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【0052】
ペプチドの一群は、非常に多様な動物により生産されるα−及び−ディフェンシンである。αディフェンシン類は、一般に、実質的度合いの相同性を共有し、多数のArg残基(但し、Lysではない)を含んでおり、ジスルフィド結合構成は一様に保存されている;ジスルフィド結合の破壊により、抗菌活性の喪失が起こる。ディフェンシンは、プレプロ−ペプチドとして生産され、恐らく、リーダー及びプロ−セグメントが、貯蔵小胞へのそれらの輸送の指令に関与しており、該ペプチドは、使用されるまでそこで待機する。−ディフェンシンTAPはウシ粘膜から単離された;−ディフェンシンは、α−ディフェンシンより大きく、異なるジスルフィド構成を有する。Arg/Lys含有率、ジスルフィド結合の数及び構成並びに全体長さが異なる多数の様々なディフェンシンペプチド、及び、ペプチドファミリーが単離されており、例えば、HNP−1や、カブトガニから単離した18−アミノ酸抗菌ペプチドであるタキプレシンがある。ペプチドTAPは、タキプレシンのファミリーに属し、その一次配列は若干異なるが、そのジスルフィド結合構成及び二次構造は保存されたままである。
【0053】
非常に多数のディフェンシン様ペプチドが現在記載されており、哺乳動物の免疫細胞、粘膜、昆虫の血液リンパ、甲殻類、並びに、植物及びそれらの種子など、多様な供給源から単離されている。
【0054】
また、抗菌ペプチドの別の群が、細菌からも単離されている。バクテリオシン、又は細菌由来の抗菌ペプチドは多数の様々な細菌種により生産される。構造はかなり異なっており、ジスルフィド結合を有するもの、遊離システインを含むもの、システインもシスチンも含まないものなどがある。第4の群は、抗菌活性のために相補的存在を必要とする2つのペプチドから構成される。しかし、それらの構造的特徴とは関係なく、それらはすべて、感受性細菌の細胞膜に親水性細孔を形成することにより、作用する。これらの細孔又はチャネルは、細胞膜を脱分極させ、エネルギー変換及びATP生産を破壊する。
【0055】
よく特性が知られているバクテリオシンは、Pediococcus acidilactici PAC1.0により生産されるペジオシンPA-1である。このバクテリオシンは、翻訳後の修飾を含まないが、2つの必須ジスルフィド結合、並びに、多数の他のバクテリオシンと相同的なN末端配列を含んでいる。
【0056】
ランチビオティックスもバクテリオシンであり、従って、リボソームで前駆体ペプチドとして合成される。しかし、前述のバクテリオシンとは違い、ランチビオティックスは、多数の翻訳後修飾を含む;ランチオティックの名称は、チオエーテルアミノ酸ランチオニン及び3−メチルランチオニン中にそれらが含まれていることに由来する。
【0057】
25種以上のランチビオティックスが同定されている。大部分のランチビオティックスは、高度に修飾され、多くは、50%(以上)の非タンパク新生αアミノ酸を含んでいる。
【0058】
チオエーテルアミノ酸以外にも、ランチビオティックスは、その他の様々な修飾アミノ酸を含んでおり、例えば、2,3−ジデヒドロアラニン及び−ブチリン、リシノ−アラニン、2−アミノビニル−D−システイン、ヒドロキシ−アスパラギン酸、多数のN−末端修飾及びD−Alaが挙げられる。全てのランチビオティックスがこれら修飾アミノ酸の各々を含むわけではない。これらが広く散在しているものもあれば、1種のランチビオティックだけに特異的であるものもある。
【0059】
特に有用なランチビオティックスとして、エネルギーを受けた膜二重層に細孔を形成することにより、非特異的で、一時的なチャネルを細胞膜に形成するA型ランチビオティックスが挙げられる。A型ランチビオティックスとして、ナイシン及びガリゲルミンが挙げられ、これらの配列は、Jack及びJung, 1998(前掲)に記載されている。
【0060】
下記のペプチドは、本発明で特に使用できるものの例である:配列が、
GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMK(配列番号9)及び
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS(配列番号10)であるマガイニン1及び2(アフリカツメガエル)、並びに、以下の表1に挙げるペプチド。
【0061】
【表1】
表中、“B”は、ジアミノベンゾエート、”O”はオルニチン、”d”はD鏡像体アミノ酸をそれぞれ示す。
【0062】
これらの、及び本明細書に記載したその他の膜挿入ペプチド、又は、それらの変異体、例えば、1〜5アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を有し、かつ、すでに定義した活性を保持するものなどが、用いることができる成分Wのさらに別の群を形成する。
【0063】
このような変異体として下記のものが挙げられる:
GIGKFLHSAKKFGKAFVAEIMNS(配列番号32);
GIAKFLHSAKKFGKAFVAEIMNS(配列番号33);
AAGKFLHSAKKFGKAFVGDIMNS(配列番号34);
G-GKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS(配列番号35);
G-GKFIHSAKKFGKAFVGEIMNS(配列番号36);
GIGKFIHSAKKFGKAFVGEIMNSK(配列番号37);及び
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQC(配列番号38)、
ここで、太字は、前記の野生型マガイニン又はメリチン配列の置換、又はこれら配列への付加を示し、−は欠失を示す。
【0064】
ペプチドは、例えば、+1〜+10までの合計正電荷を有するのが好ましい。
【0065】
連結基L
この連結基は、部分Vと部分Wとの間にあるすべての原子であり、従って、連結基は、一末端に、ペプチドグリカン生合成阻害物質(V)と連結可能な部分を、また他方の末端に、ペプチド性膜結合成分(W)と連結可能な部分を備えていなければならない。
【0066】
本発明の化合物は、一般に、Wの反応性誘導体を、Vの反応性誘導体と反応させる(この段階の前又は後のいずれかに、基XをWに結合させる)ことにより、合成されることは当業者には理解されよう。従って、本発明の化合物における構造−L−は、V及びW両方の反応性誘導体の一部であった原子を含むことになる。
【0067】
糖ペプチド及びポリペプチドの反応性誘導体を調製する方法は、それ自体、当技術分野では知られており、当業者は、多様な方法から選択し、VをWと連結して、基Lを形成することができるだろう。従って、基Lの詳細な性質は、本発明の本質的な特徴ではなく、一形態では、この基は、便宜的に下記のように表示する:
−A−R−B− (III)
(式中、Aは、ペプチドグリカン生合成阻害物質(V)と連結することができる基であり、Bは、ペプチド性膜結合成分(W)と連結することができる基であり、Rは、AとBを連結する結合又は基である)。
【0068】
このタイプの連結基の例として、例えば、EP-A-109653、EP-A-152736、EP-A-155388及びEP-A-284413に記載されているような化学的架橋基がある。尚、これらの文献は、参照として本明細書に組み込む。
【0069】
Wとの連結
WをそのN末端、又は側鎖残基上のアミン部分(例えば、リシンのε−アミノ基)を介して結合しようとする場合、Bは、アミン基と反応が可能な部分の基でよい。例えば、Bの前駆体は、カルボン酸(又はその誘導体)でよく、これは、Wの前駆体のN末端と反応すると、アミド結合でWと連結した−C(=O)−であるBとなる。これらの実施形態では、B=−R=をW=(式中、W=は、Wの前駆体であり、B=は、Bの前駆体で、R=は、式IIの化合物の残り部分の前駆体である)と反応させることにより、連結が形成されると考えられる。
【0070】
あるいは、Bは、N−アセチル基、−C(=O)−CH2−T−(式中、カルボキシル炭素がWのアミン基に結合しており、Tは、O、S、NHから選択される)でよい。このような連結は、WのN−ハロアセチル誘導体を合成した後、適した前駆体B’−R=(式中、B’は、OH、SH又はNH2のいずれかである)と反応させることにより、形成することができる。
【0071】
WをそのC末端を介して結合しようとする場合、Bは、カルボン酸基と反応が可能な部分の基でよく、通常、求核基である。例えば、Bの前駆体はアミン(又はその誘導体)でよく、これは、Wの前駆体のC末端と反応すると、アミド結合でWと連結した−NH−であるBとなる。これらの実施形態では、B=−R=をW=(ここで、W=は、Wの前駆体であり、B=は、Bの前駆体で、R=は、式IIの化合物の残り部分の前駆体である)と反応させることにより、連結が形成されると考えられる。
【0072】
Wが、システインアミノ酸で終結する場合、連結基は、好ましくは、イオウで終結し、これによって、ジスルフィド又はチオエーテル結合により、LがWと結合するようにする。従って、式(III)で、Bは−S−である。この結合は、Wの前駆体、又はBの前駆体上のいずれかで、Sを活性化させる、例えば、チオ基と反応して所望のジスルフィド結合を形成することができる2−ピリジルジスルフィド誘導体を形成することにより、達成することができる。
【0073】
Vとの連結
Vがバンコマイシンである場合には、アミノ末端(2)、バンコサミン糖(3)のアミン、又は、より好ましくは、カルボキシル末端(1)のいずれかから、連結基(L)の結合点が誘導される。
【0074】
【化4】
誘導体化及び連結の手段は、前述した通りである。
【0075】
Vが、前記位置の一つがすでに誘導体化されているバンコマイシン誘導体である場合、結合点は、残っている利用可能な位置の1つ、又は誘導体化に適したいずれかの位置にあってよい。
【0076】
基Rが結合ではなく、AとBを連結する基である場合には、3〜12個の炭素原子を含むアルキレン鎖であるのが好ましく、この鎖は、1以上の複素原子及び/又は芳香族環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって分断されていてもよく、また、1以上の炭素−炭素二重又は三重結合を含んでいてもよく、さらには、1以上の官能基で置換されていてもよい。
【0077】
従って、Rは、水と相互作用して、連結基の水溶性を維持する部分を含んでいることがあり、好適な部分として、−CO−NH−、−CO−NMe−、−S−S−、−CH(OH)−、−SO2−、−CO2−、−(CH2CH2O)m−及びCH(COOH)−(式中、mは、2以上の整数である)が挙げられる。
【0078】
従って、Rの例として、−(CH2)r−、−(CH2)p−S−S−(CH2)q−及び(CH2)p=−CH(OH)−CH(OH)−(CH2)q=−が挙げられ、式中、rは、3〜12の整数であり、p及びqは、独立に整数であり、その合計が3〜12であり、p=及びq=は、合計が1〜10の整数である。
【0079】
膜挿入型成分X
この成分は、本発明の成分上に随意に存在する。Wが膜結合ペプチドである場合には、膜挿入型成分の存在が好ましい。Wがこれらの特性を有する場合でも、さらなる挿入型成分の存在が排除されるわけではない。
【0080】
膜挿入型特性を有する成分の範囲は、当技術分野では公知である。本発明で考えられる好ましいクラスは、炭素原子に基づく親油性鎖である。多くのこのような鎖が当技術分野では知られており、水性環境で細菌膜と接触させたとき細菌膜中に分配されるのに十分な親油性を有することができるのであれば、一次化学構造の正確な性質は本発明の本質ではない。
【0081】
一般に、親油性鎖は、次のように定義される:
― もし存在すれば、いかなる芳香族環のものを含めて、6〜30、好ましくは、6〜24個の炭素原子を有する;
− 直線状又は分枝しており、後者の場合には、1以上、例えば、2又は3個の分枝点を含む;
− 飽和又は不飽和であり、後者の場合には、1以上、例えば、2、3又は4個の二重又は三重結合を含む;
− S、O又はNから独立に選択される1、2又は3個の複素原子を含む(もし存在すれば、芳香族環中に存在するものに加えて、);
− 1以上、例えば、2又は3個の芳香族環を随意に含み、これらは融合されていてもよく、その各々が、1、2又は3個の複素原子(もし存在すれば、これらは、S、O又はNから独立に選択される)を含んでいてもよい;並びに、
− ヒドロキシ、−SH、アミノ及びハロ(ここで、ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード)から選択された1以上(例えば、1、2又は3個)の置換基を随意に有する。
【0082】
好ましくは、芳香族環は、6員環であり、ベンゼン及びピリジンから選択することができる。環が融合されている場合には、ナフタレン、アントラセン、キノレン及びイソキノレンから選択することができる。芳香族環のその他の例として、チオフェン及びピロールが挙げられる。
【0083】
一実施形態では、上記成分は、少なくとも6原子、好ましくは、12、16又は20個以下の炭素原子を含む非分断脂肪族炭素鎖からなる。このような化合物の一群は、構造−Ph−O−(CH2)t−H(式中、Phは、ベンゼン環であり、tは6〜12、16又は20である)を有する。
【0084】
別の実施形態では、上記成分は脂肪酸であり、好ましくは、5〜28炭素原子を有し、4個以下、より好ましくは、1又は2個の炭素−炭素二重結合を随意に含む。不飽和基は、構造−C(O)−(CH2)t=−H(式中、t=は5〜27、より好ましくは、9、11、13、15、17又は19である)を有する。
【0085】
別の実施形態は、基−C(O)−Ph−Ph(式中、Phはフェニル基である)を含む成分であり、これを置換して、例えば、成分−C(O)−Ph−Ph−p−Clを生成することもできる。
【0086】
別の実施形態は、合計10〜16個の炭素原子を含む脂肪酸内のエーテル基であり、これは、1又は2個の二重結合を随意に含む。
【0087】
別の実施形態は、式Ph−CH(OH)−CH2−NH−C(Me2)の基であり、式中、Phは、パラ位置で基RO−CH2−により、また、メタ位置で基RO−により置換されたフェニレン環であり、ここで、各Rは、独立にC4−C10アルキル鎖である。
【0088】
薬物の投与
本発明の第2の形態は、式(II)の化合物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物である。
【0089】
上記製剤は、その他の治療成分又は希釈剤を随意に含んでいる。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、その受容者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【0090】
非経口又は筋肉内投与に適した製剤としては、抗酸化剤、バッファー、及製剤を意図する受容者の血液と等張にするび溶質を含んでいてもよい水性及び非水性滅菌注射液:並びに、水性及び非水性滅菌懸濁液(懸濁剤及び増粘剤を含有していてもよい)がある。製剤は、単位用量又は多数回用量容器、例えば、密封したアンプル及びバイアルに入っていてもよいし、フリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存してもよく、後者の場合には、使用の直前に、注射用の滅菌液体担体、例えば、水を添加するだけでよい。注射液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤からすぐに調製することができる。
【0091】
以上、特に記載した成分に加えて、上記製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野で公知のその他の薬剤を含んでいてもよい。考えられる製剤については、滅菌した発熱物質非含有水性及び非水性溶液が好ましい。
【0092】
あるいは、上記組成物は、局部適用の用途で、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼薬、点耳薬、うがい薬、含浸包帯及び縫合糸、及びエーロゾルの形態に製剤化することができ、例えば、防腐剤、薬物浸透を助ける溶剤、並びに、軟膏及びクリームの皮膚軟化薬など、好適な公知の添加剤を含有していてもよい。このような局所製剤はまた、適合性の公知の担体、例えば、クリーム又は軟膏基材、並びに、ローション用のエタノール又はオレイルアルコールを含有してもよい。このような担体は、製剤の約1重量%〜約98重量%を占め;より一般的には、製剤の約80重量%以下を占める。
【0093】
本発明の組成物は、注射により投与して、留置装置の挿入直前に、関連細菌に対する全身効果を達成することができる。治療は、手術後、装置が体内にある間、継続する。さらに、組成物を用いて、細菌による創傷感染を防止する外科手術技法のための手術用カバーを拡大することもできる。
【0094】
多くの整形外科医は、人工関節を有する患者に関して、菌血を引き起こし得る歯科治療の前に、抗生物質予防法を考慮すべきであると考えている。後期の深い感染は、重度の合併症であり、人工関節を失うことにもなりかねず、有意な罹病率及び死亡率を伴なう。従って、この場合、予防的抗生物質に代わるものとして、ペプチド又はペプチド/薬物コンジュゲートの使用を拡大することができる。
【0095】
細菌感染は、移植片及び留置装置の臨床上の使用に関連する主要な合併症の一つである。特に、ブドウ球菌は、医療装置関連の感染に関与していることが多い(Dankertら、1986, CRC Rev Biocompatibility 2, 219-301)。いったん樹立すると、感染は治療するのが実質的に不可能であり、その結果、インプラント不全が起こる。インプラントへのブドウ球菌付着を克服する試みとして、人工器具材料の表面の改変;例えば、PTFEのような「非付着」材料でのコーティング、又は表面への抗生物質の結合により、タンパク質の付着を抑えるものがあった(Kamalら、1991, J. Amer. Med. Assoc. 265, 2364-2368)。加えて、非ステロイド性抗炎症薬を用いることにより、医療ポリマーへのブドウ球菌の付着を防止する提案もあった(Farber及びWolff 1992, J. Infect. Dis. 166: 861-865)。
【0096】
ヒト患者への投与のために、活性薬物の毎日用量レベルは、0.01〜50mg/kg、典型的には、約1mg/kgとなると考えられる。どんな場合でも、医師は、個々の患者に最も適した実際用量を決定するが、これは、各患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動する。上記用量は、平均的患者の例である。もちろん、これより高い又は低い用量範囲が適している場合も考えられ、それらも本発明の範囲に含まれる。
【0097】
以上説明してきた治療に加えて、本発明の組成物を創傷治療薬として一般に用いることにより、創傷した組織中に露出したマトリックスタンパク質、特にフィブロネクチンへの細菌の付着を防ぐと共に、抗生物質予防法に代わり、又はそれと一緒に、歯科治療で使用することができる。
【0098】
あるいは、本発明の組成物を用いて、挿入の直前に留置装置を浸漬することもできる。活性薬物は、創傷部位又は留置装置の浸漬の場合、0.1g/ml〜10mg/mlの濃度で存在するのが好ましい。
【0099】
本発明の組成物は、下記の生物によって起こる細菌感染の治療に用いることができるが、これらに限定されるわけではない:マイコバクテリウム属種;エンテロコッカス属種;大腸菌属種;ブドウ球菌属種;連鎖球菌属種;ビブリオ属種;ナイセリア属種;ボレリア属種;クレブシエラ属種;ヘモフィルス属種;クロストリジウム属種;シュードモナス属種;放線菌属種;肺炎球菌属種;サルモネラ属種。
【0100】
本発明のさらに別の形態では、式(II)の化合物を医薬品として、又は動物もしくはヒト身体の治療方法において、特に上に挙げた生物により引き起こされる細菌感染の治療のために用いることができる。式(II)の化合物はまた、細菌感染、特に上に挙げた生物により引き起こされる感染の治療のための医薬の製造に用いることもできる。
【0101】
実施例
例として、本発明の実施形態を以下に詳しく説明することにする。
【0102】
方法
溶血アッセイ
以下のように、V型底のマイクロタイタープレートフォーマットを用いた標準的溶血アッセイにより、感作したヒツジ赤血球の溶解を測定した。
【0103】
Hepesバッファーで稀釈した様々な濃度の化合物50マイクロリットルを100マイクロリットルの感作したヒツジ赤血球と混合した後、37℃で1時間インキュベートした。サンプルを室温にて3時間1,600rpmで回転させてから、150マイクロリットルの上清を平底のマイクロタイタープレートに移した後、405又は410nmで吸収を測定した。0.1M Hepes/0.15M NaCl/0.1%ゼラチンpH7.4中に1:400稀釈(アッセイ混合物の最終濃度)したヒト血清の存在下で、赤血球と一緒に血清をインキュベートすることにより、最大溶解(Amax)を測定した。対照としてPBSを用いて、血清又は化合物の不在下で、赤血球をインキュベートすることにより、バックグラウンド溶解(Ao)を測定した。溶解は、100%全細胞溶解に対する割合として表し、LC50は、50%溶解を得るのに必要な化合物濃度を表すようにした。抗菌活性と比較して、赤血球の低溶解活性の抗生物質が有利である。
【0104】
抗菌活性アッセイ
1以上の下記の微生物を含む様々な細菌株に対する抗菌活性について、化合物を試験した:大腸菌TG1、枯草菌株168S、黄色ブドウ球菌H、Enterococcus faecium STR207(Van A耐性表現型)、Enterococcus faecium STR211(バンコマイシン感受性表現型)、及びEnterococcus faecalis V583(Van B耐性表現型)。大腸菌及び枯草菌に対する抗菌活性についての化合物試験の場合、各細菌株の培養物を、2.5mLの新鮮なLBブロスで、約5×106細胞/mLに稀釈して、アッセイを行なった。試験しようとする化合物を水で稀釈してから、細菌培養物に添加し、最終濃度を200μg/mL〜0.5ng/mLとした。大腸菌培養物は37℃、枯草菌培養物は30℃で、振盪しながら、培養物を16時間まで増殖させた。様々な培養物の混濁度の検査、並びに、波長600nmでの培養物の光学濃度の測定から、抗菌活性を測定した。E. faecium STR 207、E. faecium 211、E. faecalis V 583、及び黄色ブドウ球菌Hに対する抗菌活性についての化合物の試験には、異なる方法を用いた。これらの微生物を脳心臓/0.5%酵母抽出物(BHY)ブロス中に培養し、37℃で一晩インキュベートした。次に、各培養物のサンプルを新鮮なBHYブロスで40倍稀釈してから、37℃で1時間インキュベートした。こうして得られた中央対数期(mid-log phase)培養物を106cfu/mLまで稀釈した後、96ウェルポリプロピレンプレートのウェルに添加した。培養物含有ウェルで、バンコマイシンを連続的に2倍稀釈して128〜0.0156μg/mLとした。次に、同様に培養物含有ウェルで、試験化合物を連続的に稀釈して512μg/mL〜0.03μg/mLとした。96ウェルプレートを覆い、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、混濁度の検査により、最小阻害濃度を測定した。
【0105】
実施例1. APT542 の合成及び特性決定
(MSWP−1、WO/9802454の実施例2)。Sheppard及びAthertonにより開発された一般的Fmoc/tBu法(E. Atherton及びR. C. Sheppard, Solid Phase Synthesis, IRL Press, オックスフォード、1989)に従う固相合成を用いて、ペプチド:Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-Cys-NH2(配列番号1)を調製した。キーゼルグールで支持したポリジメチルアクリルアミド樹脂(Macrosorb 100)を固体支持体として用い、エチレンジアミンで誘導体化した。
【0106】
N,N‘−ジイソプロピルカルボジイミド/N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(4倍モル過剰量)で前活性化したN−α−Fmoc保護試薬を用いて、ブロモフェノールブルーでモニターしながら結合反応を実施した。Fmoc切断には、DMF中の20%ピペリジンを用いた。最終切断の際にC末端アミドが得られるよう設計された修飾Rink連結試薬(p−[(R,S)−α−[1−(9H−フルオレニ−9−イル−メトキシフォルムアミド)−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸]の結合を含む結合及び脱保護の反復サイクルにより、ペプチド鎖を組み立てる反応を実施した。個々のアミノ酸の側鎖官能基は次のように保護した:Ser(tブチル)、Lys(Boc)、Asp(O−tブチル)、Cys(トリチル)。
【0107】
ペプチド組立の完了時に、ペプチドがまだ樹脂に結合している状態で、同じ活性化方法を用いたミリスチン酸の直接結合により、ミリストイル基をN末端グリシンのアミノ基に結合させた。次に、2.5%水及び2.5%トリイソプロピルシランを含むトリフルオロ酢酸での処理により、この修飾ペプチドを樹脂から切断すると同時に側鎖保護基を除去した。
【0108】
pH8〜9の0.01M酢酸アンモニウム溶液中の2,2’−ジチオピリジンで粗生成物を約2時間処理した後、酢酸で酸性化し、勾配成分として0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/水と0.1%TFA/アセトニトリルを用いた分離用高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。凍結乾燥の後、ペプチドは白色の非晶質粉末であり、ジメチルスルホキシド中に少なくとも10mg/mlまで可溶性であった。高速原子ボンバードメント質量分光法により、m/e 2107.8、2129.7及び2145.8で主要ピークが観察されたが、これらは、上記ペプチドの一プロトン化、一ナトリウム化及び一カリウム化分子イオンに対応する。このペプチドを0.1Mホウ酸ナトリウム(pH.8.0)中に約0.03mM〜0.2mM前後まで溶解させ、ジチオトレイトールを5mMまで添加して還元することにより、上記ペプチドの2−チオピリジル含有量を測定した。343nmでの光学濃度の変化から、8080cm−1M−1のこの波長での吸光係数を用いて、放出されたピリジン2−チオンの量を算出した。これにより、ペプチド含有率は、乾燥重量の約60%であることがわかった。
【0109】
従って、最終生成物は、下記の構造を有する:N-(ミリストイル)-Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-(S-2-チオピリジル)-Cys-NH2。前記方法の項に記載したように、大腸菌株TG1及び枯草菌168Sに対する抗菌活性について、APT542を試験した。大腸菌株TG1の増殖を阻止するAPT542の最小阻害濃度は、6時間後0.022mg/mLで、16時間後は0.067mg/mLであった。枯草菌株168Sの増殖を阻止するAPT542の最小阻害濃度は、6時間後0.003mg/mLで、24時間増殖後は0.022mg/mLであった。また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT542の抗菌活性も測定した。APT542の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.064mg/mL、0.256mg/mL、0.032mg/mL、及び0.064mg/mLであった。
【0110】
実施例2. APT540 の合成及び特性決定
APT540は、C末端cys残基を通じたシステイン架橋により連結されたAPT542の二量体である。
【0111】
APT542(実施例1;WO98/02454の実施例2;54mg)を0.1M Tris pH8.5(2.68mL)中に溶解させた後、水に溶解した0.35モル当量のトリス−2−カルボキシエチルホスフィン(TCEP)で処理した。反応を室温で30分進行させた後、0.1%トリフルオロ酢酸中の35%〜90%アセトニトリルの勾配を用いたC18逆相カラムを用いて、HPLCにより分析した。反応生成物を210nm及び310nmの波長でモニタリングした。注入から約10.5分後に、カラムからのピーク溶離物としてAPT540を確認した。APT540化合物に対応する物質を収集し、凍結乾燥した。PerSeptive Biosystems装置を用いたサンプルの質量分光法により、APT540の理論上の分子量と一致する3998ダルトンの主要ピークを確認した。前記方法の項に記載したように、大腸菌株TG1及び枯草菌168Sに対する抗菌活性について、APT540を試験した。大腸菌株TG1の増殖を阻止するAPT540の最小阻害濃度は、6時間後0.067mg/mLで、16時間後は0.2mg/mLであった。枯草菌株168Sの増殖を阻止するAPT540の最小阻害濃度は、6時間及び24時間増殖後0.007mg/mLであった。
【0112】
実施例3. APT541 の合成及び特性決定
APT541は、配列番号1のN−ミリストイル誘導体であり、これは、C末端システインの側鎖上のシステイン残基の付加により、そのC末端でさらに誘導体化している。
【0113】
APT542(実施例1;100mM Tris(pH8.5)中10mM;1.3mL)を100mMシステイン(0.1mL)と混合し、2時間にわたり攪拌した。0.1%トリフルオロ酢酸中0〜100%アセトニトリルの勾配を用いた分離用HPLCにより、反応混合物を10分精製した。約10.0分で生成物が溶離し、これを収集した。揮発物質を蒸発させた後、凍結乾燥により、白色の固体としてAPT541を得た。MALDI TOF質量分析で、C92H168N26O26S2は、2117.2Daを必要とする。2117.3Daが観察された。精製したAPT541を過剰の1mM DTTで処理しても、343nmでの吸光度に変化は観察されなかったことから、すべてのチオピリジル基が置換されていることがわかった。
【0114】
前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT541の抗菌活性も測定した。APT541の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.128mg/mL、0.256mg/mL、0.064mg/mL、及び0.064mg/mLであった。
【0115】
実施例4. APT537 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法を用いて、配列番号2のペプチドを合成した。最も大きな違いは、リシン残基の3つをアスパラギン酸残基で置換したことである。このペプチドをそのN末端でミリストイル基と連結させ、S連結2−チオピリジル基を実施例1と同様に導入した。
【0116】
実施例5. APT539 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT539を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をラウリン酸で置換したことである。
【0117】
実施例6. APT538 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT538を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をデカン酸で置換したことである。
【0118】
実施例7. APT171 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT171を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をオクタン酸で置換したことである。
【0119】
実施例8. APT170 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT170を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をブタン酸で置換したことである。
【0120】
実施例9. APT2197 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT2197を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をパルミチン酸で置換したことである。
【0121】
実施例10. APT2198 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT2198を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をオクタデカン酸で置換したことである。
【0122】
実施例11. APT2199 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT2199を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸をエイコサン酸で置換したことである。
【0123】
実施例12. APT2200 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号1のペプチドを用いて、APT2200を合成した。最も大きな違いは、ミリスチン酸を4−ビフェニルカルボン酸で置換したことである。
【0124】
実施例13. APT2235 の合成及び特性決定
実施例1で用いたのと同じ方法に従い、配列番号3のペプチドを用いて、N末端での基の結合は省くが、C末端での2−チオピリジル誘導体化は保持して、APT2235を合成した。LC50を測定したところ、1.2μMであった。
【0125】
実施例14. APT2036 N- (ミリストイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-(S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド )-Cys-NH2 (構造3)の合成
APT2036をバンコマイシンから3段階で化学的に合成した。塩酸バンコマイシン(100mg、0.0673mmol)を乾燥ジメチルホルムアミド(1mL)及び乾燥メチルスルフォキシド(1mL)中に溶解させた。2−アミノエチル−2’−ピリジルジスルフィド二塩酸塩(34.8mg、0.1346mmol)を添加し、混合物を乾燥窒素の雰囲気下で0℃まで冷却した。2−(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(乾燥ジメチルホルアミド中の0.45M溶液0.234mL、0.1mmol)とヒドロキシベンゾトリアゾール(1mg、cat.)を添加し、混合物を室温まであたため、6時間攪拌した。HPLCにより、バンコマイシンの消失及び生成物の出現により、反応を特性決定した(APT2033−構造1、以下の表に示す通り)。バッファーA中の10〜90%バッファーBの勾配(バッファーA:0.1%トリフルオロ酢酸;バッファーB:90%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸)と、ジュピター(Jupiter)C18、250×10mm、300Åカラム(流量:5mL/分)を用いた分離用HPLCにより、生成物を20分精製した。揮発成分を真空中で除去し、水溶液を凍結乾燥することにより、白色の塩酸塩であるAPT2033を得た。保持時間8.4分;MALDI TOF質量分析でC73H86Cl3N11O22S2は1640.0Daを必要とする。1638.5Daが観察された。前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2033の抗菌活性を測定した。APT2033の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.256mg/mL、0.032mg/mL、0.002mg/mL、及び0.004mg/mLであった。166μMの最高濃度で、LC50溶解は観察されなかった。
【0126】
APT2033(9.9mg、0.00617mmol)を水(1mL)に溶解させ、トリス−2−カルボキシエチルホスフィン(50mM HEPES、pH4.5中の10mM溶液1.9mL)を攪拌しながら添加した。混合物を30分攪拌し、生成物(APT2035−構造2)を精製し、APT2033と同様に単離した。保持時間7.0分;MALDI TOF質量分析でC68H83Cl3N10O22Sは1530.9Daを必要とする。1529.1Daが観察された。また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2035の抗菌活性を測定した。APT2035の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.128mg/mL、0.016mg/mL、0.002mg/mL、及び0.008mg/mLであった。166μMの最高濃度で、LC50溶解は観察されなかった。
【0127】
APT2035(1.62mg、0.00108mmol)を水(0.2mL)に溶解させ、MSWP1(乾燥メチルスルフォキシド中の21.6mM溶液0.04mL、0.87μmol)を添加した。混合物を2時間攪拌してから、APT2033と同様に、生成物(APT2036−構造3、以下の表に示す通り)を分離用HPLC(20分にわたり10〜90%バッファーB)で精製し、その塩酸塩として単離した。保持時間13.5分;MALDI TOF質量分析でC157H244Cl3N35O46O2は3528.4Daを必要とする。3528.1Daが観察された。また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2036の抗菌活性を測定した。APT2036の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.008mg/mL、0.008mg/mL、0.008mg/mL、及び0.004mg/mLであった。LC50 71uM。
【0128】
実施例15. APT2037 N- (ラウロイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-(S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド )-Cys-NH2 (構造4)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2037を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT539で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間11.9分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2037の抗菌活性も測定した。APT2037の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.016mg/mL、0.016mg/mL、0.004mg/mL、及び0.008mg/mLであった。LC30 71uM。
【0129】
実施例16. APT2038 N- (デカノイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-(S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド )-Cys-NH2 (構造5)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2038を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT538で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間10.7分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2038の抗菌活性を測定した。APT2038の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.064mg/ml、0.064mg/ml、0.002mg/ml、及び0.008mg/mlであった。LC10 71uM。
【0130】
実施例17. APT2039 N- (オクタノイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造6)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2039を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT171で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間9.0分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2039の抗菌活性を測定した。APT2039の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.128mg/mL、0.128mg/mL、0.002mg/mL、及び0.0016mg/mLであった。 71uMでLC30溶解なし。
【0131】
実施例18. APT2040 N- ( n- ブチル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造7)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2040を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT170で置換したことであり、標題の構造が得られた。
【0132】
実施例19. APT2041 N- (ミリストイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造8)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2041を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT537で置換したことであり、示した構造が得られた。保持時間14.1分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2041の抗菌活性を測定した。APT2041の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.016mg/ml、0.016mg/ml、0.004mg/ml、及び0.008mg/mlであった。LC50 4.5uM。
【0133】
実施例20. APT2208 N- (パルミトイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造9)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2208を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT2197で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間15.2分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2208の抗菌活性も測定した。APT2208の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.008mg/ml、0.016mg/ml、0.002mg/ml、及び0.004mg/mlであった。
【0134】
実施例21. APT2209 N- (オクタデカノイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造10)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2209を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT2198で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間16.7分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2209の抗菌活性も測定した。APT2209の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.032mg/ml、0.064mg/ml、0.016mg/ml、及び0.032mg/mlであった。
【0135】
実施例22. APT2210 N- (エイコサノイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造11)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2210を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT2199で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間18.45分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2210の抗菌活性を測定した。APT2210の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.128mg/ml、0.128mg/ml、0.032mg/ml、及び>0.128mg/mlであった。
【0136】
実施例23. APT2211 N- ( 4- ビフェニルカルボキシル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-P ro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S- チオエチル -2- バンコマイシンカルボキサミド) -Cys-NH2 (構造12)の合成
実施例9で用いたのと同じ方法を用いて、APT2211を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT2200で置換したことであり、標題の構造が得られた。保持時間9.3分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2211の抗菌活性を測定した。APT2211の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.008mg/ml、0.032mg/ml、<0.03mg/ml、及び0.00025mg/mlであった。166MでLC50溶解なし。
【0137】
実施例24. APT2122 N- (ミリストイル) -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp- ( S-2- チオエチル - スクシニル - バンコマイシンバンコサミニド) -Cys-NH2 (構造15)の合成
バンコマイシンから、3段階で、APT2122を化学的に合成した。塩酸バンコマイシン(100mg、0.0673mmol)を乾燥ジメチルホルムアミド(4mL)に溶解させ、DIEA(12.9μL、0.0742mmol)を添加した。2−アミノエチル−2’−ピリジルジスルフィド二塩酸塩(0.500g、1.93mmol)を水(20mL)に溶解させ、ジクロロメタン(20mL)を添加した。1M NaOHを滴下して添加することにより、pHを12にし、有機層を抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過した。無水コハク酸(193mg、1.93mmol)とDIEA(0.5mL)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。1.04mLのこの混合物を蒸発させ、DMF(300μL)中に溶解させた。PyBOP(57.8mg、111.1μmol)及びDIEA(19.3μL、111.1μmol)を添加し、混合物を15分攪拌した後、バンコマイシンの溶液に添加した。6時間後、HPLCによるバンコマイシンの消失及び生成物(APT2116−構造13)の出現により反応を特性決定する。生成物をAPT2036と同様に精製することにより、白色の塩酸塩としてAPT2116(構造9)を得た。保持時間8.2分;MALDI TOF質量分析でC77H90Cl3N11O25S2は1740.1Daを必要とする。1739.4Daが観察された。前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2116の抗菌活性を測定した。APT2116の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.512mg/mL、0.256mg/mL、0.032mg/mL、及び>0.512mg/mLであった。
【0138】
APT2116(8.3mg、0.00477mmol)を水(0.5mL)に溶解させ、トリス−2−カルボキシエチルホスフィン(50mM HEPES(pH4.5)中の10mM溶液1.3mL)を攪拌しながら添加した。混合物を30分攪拌し、得られた生成物(APT2117−構造14)をAPT2116として精製及び単離した。保持時間7.1分;MALDI TOF質量分析でC72H87Cl3N10O25Sは1630.9Daを必要とする。1632.0Daが観察された。前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2117の抗菌活性を測定した。APT2117の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ>512mg/mL、512mg/mL、0.008mg/mL、及び0.008mg/mLであった。
【0139】
APT2117(1.41mg、0.864mmol)を水(0.20mL)に溶解させ、MSWP1(乾燥メチルスルフォキシド中の21.6mM溶液0.022mL、0.475μmol)を添加した。混合物を2時間攪拌した後、得られた生成物(APT2122−構造15)を、APT2116と同様に単離した。保持時間13.8分;MALDI TOF質量分析でC157H243Cl2N35O46S2は3628.4Daを必要とする。3638.4Daが観察された。また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2122の抗菌活性を測定した。APT2122の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.008mg/mL、0.016mg/mL、0.008mg/mL、及び0.016mg/mLであった。
【0140】
実施例25. APT2237 Gly-Ile-Gly-Ala- V al-Leu-Lys- V al-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-[ ( S- チオエチル - スクシニル - バンコマイシンバンコサミニド) -Cys]-NH2 (構造16)の合成
実施例24で用いたのと同じ方法を用いて、APT2237を合成した。最も大きな違いは、APT542をAPT2235で置換したことであり、これによって標題の構造が得られた。保持時間14.1分;また、前記方法の項に記載したように、E. faecium STR 207、E. faecalis V 583、E. faecium STR 211、及び黄色ブドウ球菌Hに対するAPT2237の抗菌活性を測定した。APT2237の最小阻害濃度は、各微生物について、それぞれ0.016mg/ml、0.064mg/ml、0.016mg/ml、及び0.008mg/mlであった。
【0141】
生物学的結果のまとめ
前記のように測定した抗菌活性を以下の表にまとめる。この表では、記載項目はすべて、最大阻害組成物を示し、mg/mlで表す。
【0142】
【表2】
化学構造式の表
構造式1〜12
【化5】
構造式1:APT 2033 R = 2-チオピリジル
構造式2:APT 2035 R = H
構造式3:APT 2036 R = ミリストイル−配列番号1−NH2
構造式4:APT 2037 R = ラウロイル−配列番号1−NH2
構造式5:APT 2038 R = デカノイル−配列番号1−NH2
構造式6:APT 2039 R = オクタノイル−配列番号1−NH2
構造式7:APT 2040 R = n-ブチル−配列番号1−NH2
構造式8:APT 2041 R = ミリストイル−配列番号2−NH2
構造式9:APT 2208 R = パルミトイル−配列番号1−NH2
構造式10:APT 2209 R = オクタデカノイル−配列番号1−NH2
構造式11:APT 2210 R = エイコサノイル−配列番号1−NH2
構造式12:APT 2211 R = N-(4-ビフェニルカルボキシル)−配列番号1−NH2
構造式13〜16
【化6】
構造式13:APT 2116 R = 2-チオピリジル
構造式14:APT 2117 R = H
構造式15:APT 2122 R = ミリストイル−配列番号1−NH2
構造式16:APT 2237 R = 配列番号3−NH2
【0143】
【配列表】
【表3】
Claims (12)
- 式V−L−W−X
[式中、
Vは、細菌におけるペプチドグリカン生合成を阻害する糖ペプチド部分であり;
Lは、連結基であり;
V−L−が、下記式:
Y及びY’は、独立に水素又はクロロであり;
Rは、水素、4−エピ−バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又は式−R a −L−の基であり、ここで、R a は、4−エピ−バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニルであり、LはR a のアミノ基に結合しており;
R 1 は、水素、又はマンノースであり;
R 2 は、−NH 2 、−NHCH 3 、−N(CH 3 ) 2 、−NHL−、又は−N(CH 3 )L−であり;
R 3 は、−CH 2 CH(CH 3 ) 2 、[p−OH、m−Cl]フェニル、p−ラムノース−フェニル、[p−ラムノース−ガラクトース]フェニル、[p−ガラクトース−ガラクトース]フェニル、又は[p−CH 3 O−ラムノース]フェニルであり;
R 4 は、−CH 2 −(CO)NH 2 、ベンジル、[p−OH]フェニル、又は[p−OH,m−Cl]フェニルであり;
R 5 は、水素、又はマンノースであり;
R 6 は、水素、4−エピ−バンコサミニル、バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又はアコサミニルであるか、あるいは、R 6 は、式R b −L−の基であって、ここで、R b は4−エピ−バンコサミニル、バンコサミニル、アクチノサミニル、リストサミニル、又はアコサミニルであり、LはR b のアミノ基に結合しているか、あるいは、R 6 は、基R b −R 7 であって、ここで、R 7 は、1,000Da以下の有機側鎖部分であり;
Ter1は、ヒドロキシ又は−L−である;
但し、当該化合物は、少なくとも1つの基−L−を含むものとする。)
で表されるもの又はその塩であり;
Wは、ペプチド性膜関連成分であり、少なくとも1つの配列(Xaa) n ( ここでnは1〜12であり、各Xaaは独立にリジン又はアルギニンである ) を含み、且つ全体として正電荷を有する膜結合ペプチドであるか、あるいは、膜挿入ペプチドであり;および
Xは、膜挿入型成分であり、且つ以下のパラメータ:
― 6〜30個の炭素原子を有する(芳香族環が存在する場合にはそのいずれの芳香族 環の炭素原子をも含む);
− 直線状又は分枝鎖状であり、後者の場合には1〜3個の分枝点を含む;
− 飽和又は不飽和であり、後者の場合には1〜4個の二重又は三重結合を含む;
− 任意により、S、O又はNから独立に選択される1、2又は3個の複素原子を有していてもよい(芳香族環がある場合、その芳香族環に複素原子が存在する場合にはそれに加えて有する);
− 任意により、1個以上、例えば2又は3個の芳香族環を含んでもよく、これらは融合されていてもよく、その各々が1、2又は3個の複素原子(存在する場合にはS、O又はNから独立に選択される)を含んでいてもよい;並びに、
− 任意により、ヒドロキシ、−SH、アミノ及びハロから選択される1〜3個の置換基を有していてもよい、
を有する親油性鎖である]
で表される抗菌化合物。 - R 7 としての有機側鎖部分が、式−CH2−R8を有するものを含み、ここでR8は水素、C1−C15アルキル、C2−C15アルケニル、C2−C15アルキニル、C1−C7ハロアルキル、アセナフテニル、2−フルオレニル、9,10−ジヒドロ−2−フェナントレニル、R9、C1−C11アルキル−R9、C2−C7アルケニル−R9、C2−C7アルキニル−R9、又はC1−C7アルキル−O−R9であり、ここで、R9は、下記式の基である:
−R10−[リンカー(0又は1)−R10](0又は1)
(式中、各R10は、独立に、フェニル、C5−C6シクロアルキル、ナフチル、又はチエニルを表し、その各々は、非置換、又は1若しくは2個の置換基で任意により置換されていてもよく、該置換基の各々は、独立に、C1−C10アルキル、C1−C2ハロアルキル、C1−C2ハロアルコキシ、C1−C10アルコキシ、ハロ、シアノ、又はニトロであり;
「リンカー」は、−C1−C3アルキレン、−O−C1−C6アルキレン、−C1−C6アルキレン−O−、−O−、−N(H又はC1−C3低級アルキル)−、−S−、−SO−、−SO2−、−NH−C(O)−、−C(O)−NH−、−CH=CH−、−C≡C−、−N=N−、−O−C(O)−、又は−C(O)−O−である。)、
請求項1記載の化合物。 - Vが、バンコマイシン、クロロエレモマイシン、テイコプラニンA2−2、リストセチンA、エレモマイシン、バルキマイシン、アクチノジンA、コムプレスタニン、クロロペプチン1、キスタマイシンA及びアボパルシンからなる群より選択される、請求項1又は2記載の化合物。
- Wが、リジン及びアルギニンから選択される2〜10個の連続する残基を含む膜結合ペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- 膜結合ペプチドが7〜30個のアミノ酸を含む、請求項4記載の化合物。
- 膜結合ペプチドが、以下のペプチド:
DGPKKKKKKSPSKSSG(配列番号4);
GSSKSPSKKKKKKPGD(配列番号5);
SPSNETPKKKKKRFSFKKSG(配列番号6);
DGPKKKKKKSPSKSSK(配列番号7);及び
SKDGKKKKKKSKTK(配列番号8)
からなる群より選択される、請求項4又は5記載の化合物。 - Wがαディフェンシン、βディフェンシン及びバクテリオシンからなる群より選択される膜挿入ペプチドである、請求項1記載の化合物。
- βディフェンシンがタキプレシンである、請求項7記載の化合物。
- Wが膜挿入ペプチドのマガイニンである、請求項1記載の化合物。
- Wが膜挿入ペプチドのマキュラチン(maculatin)1.1又はカエリン(caerin)1.1である、請求項1記載の化合物。
- 細菌感染症の治療又は予防のための医薬を製造するための請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
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