JP4179422B2 - Pharmaceutical composition for treating cedar pollen allergy - Google Patents

Description

あるいは、候補ペプチド中のＴ細胞エピトープの存在は、タンパク質抗原のアミノ酸配列中の候補ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに位置する重複ペプチドのアミノ酸残基に依存するが、そのようなエピトープが候補ペプチド中には存在しない場合は、以下の式を使用することにより、候補ペプチド中のＴ細胞反応性の存在を算出できると考えられる：

この式において、“N_Tフランキングペプチド”とは、このペプチドが由来するタンパク質抗原のアミノ酸配列において候補ペプチドのＮ−末端に位置するアミノ酸残基と重複するアミノ酸残基を含んで成るペプチドを言い；“C_Tフランキングペプチド”とは、このペプチドが由来するタンパク質抗原のアミノ酸配列において候補ペプチドのＣ−末端に位置するアミノ酸残基と重複するアミノ酸残基を含んで成るペプチドを言う。この計算で、候補ペプチドに関する刺激指数は、Ｎ−末端フランキングペプチドおよびＣ−末端フランキングペプチドを加え、そして重複ペプチドの全組に関する全刺激指数の和で割り算することにより、候補ペプチドに関するＴ細胞反応性のパーセントを得る。２つ以上の候補ペプチドの組み合わせが選択されるならば、その各々が重複するアミノ酸残基を含むが、この計算を各候補ペプチドについてＴ細胞反応性の割合を決定するために別々に使用できない。しかし、候補ペプチドの組み合わせに関するＴ細胞反応性の全パーセントを得ることができる。この場合、重複するすべての候補ペプチドの刺激指数が計算に含まれる。
各個人の試験で、候補ペプチドまたはペプチドの組み合わせに関するＴ細胞反応性のパーセントについて得られた値は、上記計算の結果より低い、および高い値の範囲を表すことができる。上記のいずれかの計算により、タンパク質抗原に対して感受性の少なくとも約（20）、そして好ましくは少なくとも約（30）の個体についてパーセントを得、そして平均パーセントを決定する。本発明の組成物に使用するために、候補ペプチドまたは候補ペプチドの組み合わせは以下の基準を有する：（１）候補ペプチドまたは候補ペプチドの組み合わせは、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約30％、より好ましくは少なくとも約40％、そしてさらに好ましくは少なくとも約50−60％以上の平均パーセントを有する；そして（２）試験した個体群において、少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約75％、そしてより好ましくは少なくとも約90−100％が、陽性Ｔ細胞応答（2.0以上のS.I.）を、候補ペプチドまたは候補ペプチドの組み合わせに反応して有する。上記基準に合う候補ペプチドまたは候補ペプチドの組み合わせは、CryjIに対して感受性の個体群に実質的な割合で、Ｔ細胞非−応答またはＴ細胞応答の減少を誘導するために、CryjIに対する実質的なパーセントのＴ細胞反応性を含んで成るようである。
上記記載のアルゴリズムの説明的な態様として、CryjIに由来する１組の重複ペプチドおよび候補ペプチド、CJI-24.5、CJI-23.39およびCJI-44.8を作成し、そして試験した。CryjIタンパク質抗原と反応性であると定められた二代目のＴ細胞カルチャーを、36名のCryjI-アレルギー性患者から得、そして重複ペプチド組の反応性を本明細書に記載したインビトロＴ細胞増殖アッセイで分析した。結果を図５に示す。各ペプチドに反応して2.0以上の最高の刺激指数を、試験した各個体について記録した。次にデータを上記式により分析した。１人のCryjI-アレルギー性個体について、この結果、およびＴ細胞反応性の計算を式（１）および（２）を使用して、以下に示す。
患者１３０８に関するＴ細胞反応性
ペプチド刺激指数
ＣＪＩ−１（配列番号１） １０．９
ＣＪＩ−２（配列番号２） １６．１
ＣＪＩ−３（配列番号３） ８．８
ＣＪＩ−４（配列番号４） ０
ＣＪＩ−５（配列番号５） ３．２
ＣＪＩ−６（配列番号６） ０
ＣＪＩ−７（配列番号７） ２．５
ＣＪＩ−８（配列番号８） ０
ＣＪＩ−４１（配列番号４１） ８．９
ＣＪＩ−１１（配列番号１１） ０
ＣＪＩ−１２（配列番号１２） ０
ＣＪＩ−１３（配列番号１３） ０
ＣＪＩ−１４（配列番号１４） ０
ＣＪＩ−１５（配列番号１５） ９
ＣＪＩ−４２．５（配列番号４２） １７．６
ＣＪＩ−１８（配列番号１８） ０
ＣＪＩ−１９（配列番号１９） ０
ＣＪＩ−２０（配列番号２０） ０
ＣＪＩ−２１（配列番号２１） ０
ＣＪＩ−４３．３９（配列番号３６） ２５．６
ＣＪＩ−２３（配列番号２３） ５．３
ＣＪＩ−２４．５（配列番号３７） ６．９
ＣＪＩ−２５（配列番号２５） ９．４
ＣＪＩ−２６（配列番号２６） １１．９
ＣＪＩ−２７（配列番号２７） ５．５
ＣＪＩ−２８（配列番号２８） ０
ＣＪＩ−２９（配列番号３９） ２．９
ＣＪＩ−３０（配列番号３０） ０
ＣＪＩ−４４．８（配列番号３８） ２１．５
ＣＪＩ−３３（配列番号３３） ２０．９
ＣＪＩ−３４（配列番号３４） １７．８
ＣＪＩ−３５（配列番号３５） ０
刺激指数の和 ： １９５．７（分母）
患者1308に関するペプチド44.8の％反応性

したがって、この患者に関するペプチド44.8（配列番号３８）のＴ細胞反応性の予想範囲は、CryjIタンパク質の全反応性の11−21.7％である。上記計算を任意の可能性のある候補ペプチドで繰り返す。試験した36名のCryjI-アレルギー性患者において、以下の結果を得た：

このように、本発明の３つのペプチドの組み合わせは、組み合わせて十分なCryjIのＴ細胞反応性を有する範囲内であり、したがって本発明の“独特“なペプチドという第一の基準に合っている。
本発明の方法によるアレルギー治療には、組み合わせて使用するペプチドが免疫グロブリンＥ（IgE）に結合しないか、またはペプチドが由来するCryjIタンパク質アレルゲンよりも実質的に少ない程度（すなわち少なくとも100倍少ない結合、より好ましくは少なくとも1,000倍少ない結合）でIgEに結合することが好ましい。標準的な免疫療法での主な複雑さは、アナィフラキシーのようなIgE-媒介反応である。免疫グロブリンＥは、アレルギー性（“アトピー性”）患者において、抗原がマスト細胞または好塩性細胞上のIgEに結合あるいは架橋結合し、そしてメディエーター（例えばヒスタミン、セロトニン、好酸球遊走因子）を放出する結果生じるアナィフラキシー反応のメディエーターである。このように、治療されるべきアレルゲンに感受性の個体群で実質的割合のアナフィラキシーは、CryjIに感受性の個体群において、IgEに結合しない１つのペプチドまたは複数のペプチドを免疫療法に使用することにより実質的な割合で（例えば少なくとも約75％）回避できるか、あるいはもしペプチドがIgEと結合しても、そのような結合はマスト細胞または好塩性細胞からメディエーターを放出しない。アナフィラキシーの危険性は、IgE結合性が減少した１つのペプチドまたは複数のペプチドを免疫療法に使用することにより減少させることができた。IgE結合は、例えば直接的なELISAまたは捕捉ELISAにより試験できる。さらに、最小のIgE刺激活性を有するペプチドが治療効力のためには望ましい。最小のIgE刺激活性とは、天然のCryjIタンパク質アレルゲンにより刺激されるIgE生産量および／またはIL-4生産量よりも少ないIgE生産を言う。もしペプチドがIgEに結合するならば、そのような結合がマスト細胞または好塩性細胞からメディエーター（例えばヒスタミン）の放出を生じないことが好ましい。IgEに結合するペプチドがメディエーターを放出するかどうかを測定するために、ヒスタミン放出アッセイを、例えばアマック社（Amac,Inc.、ウエストブロック、メリーランド州）から得た標準試薬および手法を使用して行うことができる。簡単に説明すると、試験するペプチドの緩衝液をアレルギー患者からの等容量の全ヘパリン処理血液と混合する。混合そしてインキューベーションした後、細胞をペレットとし、そして上清を処理して放射性免疫アッセイを使用して放出したヒスタミン量を測定する。実施例３に記載するように、本発明の候補ペプチド、24.5（配列番号３７）、43.39（配列番号３６）および44.8（配列番号３８）は、IgEとは結合しないようである。
第二の独特なペプチドの特徴は、既に定義したようなpH6−pH8のpH範囲のpHで5mg/mlよりも大きい溶解性の“超溶解性”である。生理学的に許容できるpH範囲（例えば、pH6−pH8）内のpHでの溶解性は、注射用のマルチペプチド治療剤を配合するときに特に重要である。生理学的に許容できるpH範囲での可溶性製剤の静脈または皮下注射による投与は、薬剤が導入される生理学的系に薬剤成分の100％の生物利用性を提供する。したがって、注射を意図する製剤はシリンジで容易に注射できる程度に流体である必要があり、そして最大の治療効果を達成するためには、活性成分も十分に可溶性である必要がある。また溶解性は、経口投与（錠剤、エアゾール、舌下）のような他の投与様式を介して投与される組成物を配合する時、または徐放性組成物および配合物にも有用である。
ペプチドは任意の所望するpH範囲では可溶性ではなく、あるいはわずかに狭いpH範囲でのみ可溶性であるため、１つのタンパク質またはペプチドを可溶性組成物に配合することは難しいかもしれない。特に、多数のペプチドを一緒に１つのマルチペプチド組成物中に配合する時、各ペプチドの可溶性pH範囲が組成物中の他のペプチドの可溶性範囲とは重複しないので、特に難しい。その結果、目的とする候補ペプチドをかなり修飾して、ほとんどの配合物との柔軟性を要求する“超溶解性”という必要条件が、マルチペプチド製剤を成功裏に配合するためには必須であるかもしれない。
本発明の独特のペプチドは、元の目的とする候補ペプチド配列（“親”）の多くのアミノ酸を変更した生成物であり、この（“親”）から本発明の修飾された独特なペプチドが“超溶解性”という特性に適するペプチドを見出す目的で初めに引き出された。例えば、CJI-44.8（配列番号３８）のアミノ酸配列は、CryjI（配列番号４０）のタンパク質配列から、最初に親タンパク質（図１）のこれらの領域を、実施例１に記載するような20-merの重複ペプチドの組を使用して高いＴ細胞反応性で同定することにより取り出し、これを図２に示すが、これは全配列を網羅する。これらの２つのペプチド、CJI-31（配列番号３１）およびCJI-32（配列番号３２）は、個々に高いＴ-細胞反応性を表した。これらのペプチドは天然のタンパク質配列中（図１）で互いに隣接し、かつ10残基が重複し、ペプチドCJI-44は両ペプチドの総Ｔ細胞反応性を捕捉するように合成された。CJI-44はアミノ酸配列DEEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAEFNVE（配列番号４３）を有する30merのペプチドであり、これは2つの20merのCJI-31（配列番号３１）およびCJI-32（配列番号３２）のペプチドに存在するすべての配列を含む。しかし、CJI-44（配列番号４３）は2つの20mer、CJI-31（配列番号３１）およびCJI-32（配列番号３２）のＴ細胞反応性を有するが、CJI-44（配列番号４３）の溶解性を試験した時、本発明の“独特”なペプチドに必要な5mg/mlの溶解性よりもはるかに低い溶解性を有した。
ここでさらに、CJI-44のＮ−末端部分を短縮化することにより溶解性を増大することを試み、これによりCJI-44.1を生成した（NGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE）（配列番号４４）。さらに２つのＣ−末端残基を短縮して44.2を生成した（NGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFN）（配列番号４５）。しかし、これらの配列で溶解性は増したが、“超溶解性”の標準には達しなかった。そこで44.2（配列番号４５）を、Ｎ−末端に電荷を付加（親水性残基）することにより、そして疎水性残基Valをより低い疎水性残基Alaに置換することにより、さらに修飾した。２つの生成した類似体、CJI-44.5（DENGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNAE）（配列番号４６）およびCJI-44.6（DEENGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE）（配列番号４７）は、“１ｐＨ点プロトコール法”（例えばマンニトールを含まない100mMのリン酸ナトリウム緩衝液中、一定の撹拌下で、1pH点で溶解性を決定するプロトコール）の使用に対して、溶解性の増大を示した。さらなる類似体は、残基Asnを欠失させて構築した。これら２つの類似体、CJI-44.7（DEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNAE）（配列番号４８）およびCJI-44.8（DEEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE）（配列番号３８）は、“１ｐＨ点プロトコール”で大変溶解性が高く、そして“pH範囲プロトコール法”（すなわち最初に撹拌した後は撹拌せずに、5％のマンニトールを含む50mMのリン酸ナトリウム中でpHの関数として溶解性を測定する）で“超溶解性”を活性化した。CJI-44.8（配列番号３８）は安定であり、そして溶解性は水性緩衝液中でpH6−8にわたるpHで5mg/mlより高かった（実施例４および図６ｃを参照にされたい）。
ペプチドCJI-44.8（配列番号３８）が、その親ペプチド、CJI-31（配列番号３１）、CJI-32（配列番号３２）およびCJI-44（配列番号４３）と同様のＴ−細胞反応性を保持していることを確認した後（実施例２を参照にされたい）、そして以下に考察するようなその安定性を確認した後に、“独特”のペプチドであると決定した。他の“独特”なペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）およびCJI-43.39（配列番号３６）の開発は、上記のCJI-44.8（配列番号３８）に記載したものに従った。
本発明の独特なペプチドが満たさなければならない第三の基準は、pH6−pH8の範囲で生理的に許容できるpHでの安定性である。ペプチドは製造または保存の条件下で、そしてもし必要ならば再構成の条件下で安定でなければならない。安定性試験は、最終的な投与形態で製剤の完全性、品質および純度が妨害される時間を決定する。安定性試験は、実施例４に考察したように溶解性の実験と同時に行うことができる。本発明の各々の候補ペプチドは、pH6−8のpH範囲の生理学的pHで、室温で少なくとも24時間、安定であった（例えば有意な分解が無い）。
したがって、候補ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）は上記に概説した必要とされる３つの“独特”な特性のそれぞれを有し、このペプチドの組み合わせが、スギ花粉アレルゲンに対するアレルギーを治療するために、ヒトに投与するための至適化された治療用製剤として配合するのに適することを示す。
本発明の高度に精製されたペプチドは、標準的方法を使用して化学合成により合成的に生成できる。市販されているペプチド合成機で、全または半自動化された固相合成のような、様々なペプチドの化学合成法が当該技術分野で知られている。次に合成的に生成したペプチドは均一に精製され（すなわち、少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、そしてさらに一層好ましくは少なくとも97％純度）、すべての他のポリペプチドおよび混入物は、タンパク質精製に関して文献で知られている任意の多くの方法を使用して除去される。
本発明の高度に精製された均一なペプチドを生成するための１つの方法に従い、合成の化学手段により生成したペプチド（ポリマー支持体に連結された“固相合成”、または従来の均一化学反応の“溶液合成”のいずれか）は、調製用逆相クロマトグラフィーにより精製できる。この方法では、合成で生成した“粗”状態のペプチドを、適当な溶媒（典型的には水性緩衝液）に溶解し、そして分離カラム（典型的には逆相シリカを基本とした媒体、さらにポリマーまたは炭素を基本とした媒体も使用できる）に添加する。ペプチドをカラムから、水性緩衝液（典型的にはＴＦＡ、リン酸トリエチルアミン、酢酸塩または同様の緩衝液）中の有機成分（典型的にはアセトニトリルまたはメタノール）の濃度を増加させることにより溶出する。溶出液の画分を集め、そして適当な分析法（典型的には逆相ＨＰＬＣまたはＣＺＥクロマトグラフィー）により分析する。必要な均一性を有する画分をプールする。存在する対イオンは、次に選択した塩の中でのさらなる逆相クロマトグラフィーまたはイオン交換樹脂により変えることができる。このペプチドを次にその酢酸塩または他の適当な塩として単離できる。ペプチドを次に濾過し、そして水を除去（典型的には凍結乾燥による）して、少なくとも90％、より好ましくは95％、そしてさらに一層好ましくは少なくとも97％の必要とするペプチド成分を含む均一なペプチド組成物を得る。場合によっては、上記の逆相ＨＰＬＣと組み合わせて、精製はアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、サイズ排除、向流または通常の相分離システムにより、あるいはこれらの方法を組み合わせることにより、行うことができる。ペプチドは限外濾過、ロータリーエバポレーション、沈殿、透析または他の同様な方法により、さらに濃縮できる。
高度に精製された均一なペプチド組成物は、次に以下の任意の方法により、またはその組み合わせにより特性を決定することができる：ａ）ペプチドの同一性を確認するために分子量を測定するためのマススペクトロメトリー；ｂ）アミノ酸組成を介して、ペプチドの同一性を確認するためのアミノ酸分析：ｃ）アミノ酸残基の定めた配列を確認するためのアミノ酸シークエンシング（自動化タンパク質シークエンサーまたは手動を使用する）；ｄ）ペプチドの同一性および純度を検査するために使用するＨＰＬＣ（所望により多くのシステム）（すなわち、ペプチドの不純物を同定する）；ｅ）ペプチド組成物の水濃度を測定するための水含量；ｆ）ペプチド組成物中の塩の存在を測定するためのイオン含量；およびｇ）残存有機試薬、出発物質、およひ／または有機混入物を検査するための残存有機物質。
本発明のペプチドは、そのようなペプチドをコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞中で、組換えＤＮＡ法により生産することもできる。組換え法により生産した時、所望のペプチドをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、細胞に適する培地中で培養し、そして単離したペプチドを細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動または所望のペプチドに特異的な抗体を用いた免疫精製法を含むペプチドおよびタンパク質の精製について当該技術分野で周知の方法を使用して精製できる。組換え的に生産したペプチドを使用するためには、合成的に生成したペプチド用に上記に記載した方法に従い単離そして均一に精製し、細胞性物質、他のポリペプチドまたは培地を含まない。
特定の限られた状況において、本発明のペプチドは、化学的消化または酵素的開裂の部位がすでに決定され、そして生じる消化に再現性がある、高度に精製された完全長の、または天然のタンパク質の化学的または酵素的開裂により生成することもできる。定めたアミノ酸配列を有するペプチドは、合成的または組換え的に生成したペプチドを高度に精製し、そして単離するために上記に記載した任意の方法により、酵素的または化学的消化で存在するポリペプチドまたは混入物が無い状態に高度に精製でき、そして単離できる。
また本発明は、本発明の独特なペプチドを含んで成る治療用組成物およびマルチペプチド治療用組成物を意図する。本発明の治療用組成物は、ヒトおよび他の哺乳類のスギ花粉アレルゲンに対するアレルギーを治療するために、１回分の処方として同時に、または連続的に投与できる１つ以上の本発明の独特なペプチドを含んで成ることができる。そのような治療的処方は、本発明の１つ以上のペプチドの物理的混合物である必要は無いが、最大治療効果を達成するために、そのようなペプチドの組み合わせを同時に、または連続して1回分の治療として含んで成り、独特のペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）の組み合わせを提供する（例えば生理的に許容できるｐＨ範囲（好ましくはpH7.0−pH7.5）で、溶解性および安定性を提供し、ならびに試験した患者の97％に36-53％のＴ細胞反応性をカバーする）。
本発明の治療用組成物は、１つ以上のペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）を含んで成り、そしてまた１つの組成物中に存在する１つのペプチドまたは複数のペプチドと適合性がある賦形剤のような１つ以上の医薬的に許容できるキャリアーも含んで成る。組成物がマルチペプチド組成物の時、医薬的に許容できるキャリアーはマルチペプチド組成物中のすべてのペプチドと適合性がなければならない。好適な賦形剤は、制限する訳ではないが、滅菌水、リン酸ナトリウム、マンニトール、あるいはリン酸ナトリウムおよびマンニトールの両方、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む。他の適当な賦形剤は制限する訳ではないが、ソルビトール、スクロース、デキストロース、ラクトースデキストランおよびＰＶＰがある。さらに、医薬的に許容できる対イオンを、マルチペプチド組成物の調製中に加えてもよい。医薬的に許容できる対イオンは酢酸塩、ＨＣｌおよびクエン酸塩がある。
本発明の治療用組成物は、製造、保存、輸送および使用条件下で滅菌、安定な状態であるべきであり、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されるべきである。組成物の完全性を維持するために（すなわち、混入、長期保存を防ぐ）、本発明の治療用組成物を製造するための好適な手段は、ペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアー（１つまたは複数）を、組成物が使用直前に滅菌水のような医薬的に許容できるキャリアー中で再構成される凍結乾燥粉末状態となることができる配合物に調製することである。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好適な方法は真空乾燥、凍結−乾燥またはスピン乾燥であり、これらは活性成分にさらなる所望の成分を加えて、すでに滅菌濾過したその溶液状態から粉末にする。
好適なマルチペプチド組成物は、独特なCryjIペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）ならびにリン酸ナトリウムおよびマンニトールを含んで成る。この態様のために、酢酸塩のような適当な対イオンが組成物の調製中に加えられ、そして組成物は好ましくは生理的に許容できるキャリアー（滅菌水のような）中で、使用前に再構成される凍結乾燥粉末状態に調製される。制限するわけではないが、本発明の１つの好適なマルチペプチド組成物の例を以下に記載する。CryjIペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）は、好ましくは製造中に適当な対イオンと混合されて、以下の組成を有する滅菌状態の、パイロジェンを含まない凍結粉末を含むバイアルを作成する：
活性：CryjIペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）
ペプチドあたり0.75mg
不活性：0.05Mリン酸ナトリウム、pH6.0−8.0
５％重量／容量 マンニトール、U.S.P.
希釈剤：注射用滅菌水、U.S.P.（最初の再構成）
注射用の0.9％塩化ナトリウム
（最初の再構成後の希釈）
最終ｐＨ：pH7.0−pH7.5
本発明のマルチペプチド組成物は、使用説明書を含むキットの状態で提供されることもできる。
上記の治療用組成物およびマルチペプチド組成物を個体に、好ましくは非-免疫原性の状態で投与することは、個体のスギ花粉またはスギ花粉アレルゲンと免疫的に交叉反応性のアレルゲンに対する免疫反応の下方調節を引き起こすために有効な投与量および投与期間（すなわち、スギ花粉またはスギ花粉誘発喘息を含む関連アレルゲンにより引き起こされるアレルギー症状を減少する）で、周知の方法を使用して行うことができる。ヒトのスギ花粉に対するアレルギー性免疫反応の下方調節は、可能であればいつでも（例えば、Varneyら、British Medical Journal, 302:265-269（1990）を参照にされたい）、あるいは患者毎に（すなわち、患者がスギ花粉により起こるアレルギー症状のいくつか、またはすべてが軽減したと感じる時）に、臨床的に測定できる。
本発明の各ペプチドの独特の特徴は、各ペプチドが“超溶解性”を有することである。したがって、本発明の組成物およびマルチペプチド組成物は、注射（例えば静脈または皮下）による投与に特に適する。しかし、至適化された本発明組成物およびマルチペプチド組成物は、活性薬剤成分の溶解性が所望であるか、または許容できる任意の便利な様式で、例えば注射（皮下、静脈等）、経口投与、舌下、吸入、経皮投与、直腸投与、または可溶性治療剤用に当該技術分野で周知の任意の他の投与経路により投与できる。本発明の１つ以上の治療用組成物の治療的に有効な量を同時に、または連続して、個体に１回分の処方として投与することが好ましいかもしれない。１回分の処方として同時または連続的に投与するためのそのような各組成物は、本発明の独特なペプチド単独で成るか、あるいは本発明に従い、至適化されたマルチペプチド組成物を含んで成るものでもよい。
本発明の１つ以上の治療用組成物およびマルチペプチド組成物の皮下注射については、投薬単位あたり好ましくは約１μg−3mg、そしてより好ましくは約20μg−1.5mg、そしてさらに一層好ましくは約50μg−750μgの各活性成分（ペプチド）を投与できる。投与の容易さ、および投与量の均一性のためには、単位投薬形態で非経口組成物を配合することが特に有利である。本明細書で使用する単位投薬形態とは、治療するヒト患者に均一に投与するのに適する物理的に分割された単位を言い；各単位は所望のキャリアーと共に所望の治療効果を生成するために計算された、予め定めた量の活性成分を含む。本発明の新規な単位投薬形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）ヒト患者の治療用にそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限に支配され、そして直接的に依存する。
本発明の組成物を非経口投与以外の様式で投与するために（すなわち、経口投与による）、組成物の不活性化を防ぎ、または吸収および生物利用性を増大させるための物質で組成物を被覆するか、あるいはその物質とともに投与する必要があるかもしれない。例えば、ペプチド組成物は酵素阻害剤と共に、またはリポソーム状態で投与できる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート（DEP）およびトラシロールがある。リポソームには水中油中水CGF乳剤および従来のリポソーム（Strejanら、（1984）J.Neuroimmunol.,7:27）を含む。ペプチドが適当に保護される時、ペプチドは例えば不活性希釈剤または同化できる可食性キャリアーと一緒に経口的に投与できる。このペプチドおよび他の成分は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、あるいは個体の食物に直接的に含ませることもできる。経口治療投与には、活性化合物は賦形剤と一緒に包含され、そして消化性錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリクシル、溶剤、ゲル、懸濁剤、シロップ、カシュ剤等の形態で使用できる。そのような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物の割合は、もちろん可変であってよいが、そして都合よくは単位重量の約5-80％の間であることができる。そのような治療に有用な活性化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。さらに、活性化合物は徐放性または制御放出（一定の、または搏動性の放出）調製物または組成物中に包含することができる。
本発明の至適化された薬剤組成物の有効量は、抗原に対する個体の感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびにペプチドの個体中での抗原特異的免疫反応の下方調節能力、のような因子に従い変化するだろう。投与量の処方は、最適な治療応答を提供するために調整できる。例えば、幾つかに分けた投与量を日、週、月または年にわたって投与してもよく、あるいは投与量は治療状況の緊急性に示されるように、各々の後の注射を比例的に増加または減少することができる。１つの好適な治療的処方では、治療用組成物の皮下注射は、1週間に1回、3-6週間与えられる。この投与量で各注射を一定にするか、あるいは後の各注射を増加または減少することもできる。追加注射は最初の処置後、約３ケ月から約１年の間隔で投与でき、そして１回の注射だけでよいか、あるいは初期の処置と同様に別に数回の注射が必要かもしれない。
本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これらは制限を意図するものではない。
実施例１
重複CryjIペプチドを用いたスギ花粉アレルギー患者のＴ細胞実験
重複ペプチドの合成
スギ花粉CryjIを、20アミノ酸長で10個のアミノ酸が重複する35種のペプチド組に分割した。重複ペプチドは標準的なFmoc/tBoc合成化学を使用して合成し、そして逆相HPLCにより精製した。図２はこれらの実験に使用した重複CryjIペプチドを示している。ペプチド名は実験を通して一貫している。
スギ花粉抗原性ペプチドに対するＴ細胞応答
末梢血単核細胞（PBMC）は、季節的な鼻炎の臨床的症状を示し、そしてスギ花粉にMASTおよび／または皮膚試験が陽性を表すスギ花粉−アレルギー患者から、60mlのヘパリン処理血液をリンパ球分離媒質（LSM）遠心することにより精製した。長期間のＴ細胞系は、完全培地（PRMI-1640、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、5×10^-5 2-メルカプトエタノールおよび10mM HEPES、5％の熱不活性化ヒトAB血清を補充）のバルクカルチャー中で2Ｘ10⁶PBL/mlを、20μg/mlの部分精製された天然のCryjI（図２と同じ３本のバンドを含む75％純度）を用いて、37℃で７日間、５％のCO₂インキューベーターで刺激して樹立し、Ｔ細胞に反応性のCryjIを選択した。このプライミング抗原の量は、ほとんどの花粉アレルギー患者からのＴ細胞活性化のために最適であると決定した。生細胞を、LSM遠心により精製し、そして5単位の組換えヒトIL-2/mlおよび5単位の組換えヒトIL-4/mlを補充した完全培地中で、最高３週間まで、細胞がこれ以上リンホカインに反応せず、そして“休止“したと考えられるまで培養した。Ｔ細胞が、選択したペプチド、組換えCryjI（CryjI）、精製した天然のCryjまたは組換えAmbaI.1（AmbaI.1）または陽性対照、フィトヘモアグルチニン（PHA）に対して増殖する能力を次に測定した。アッセイのために2×10⁴の休止細胞を、2×10⁴の自己エプスタイン-バールウイルス（EBV）-形質転換Ｂ細胞（以下に記載したように調製）（25,000RADSでガンマ−照射）の存在下で、2-50μg/mlの選択ペプチド、CryjI、精製した天然CryjIまたはrAmbaI.1またはPHA（200μlの完全培地中）を用いて、96-ウェルの丸底プレート中で2連または3連で、2−4日間再刺激した。最適なインキューベーションは、３日間であることが分かった。各ウェルは次に１μCiのトリチル化チミジンを16-20時間受容した。取り込まれたカウントをガラスフィルターマット上に集め、そして液体シンチレーションカウンターで処理した。集めたデータ（示さず）では、組換えCryjI、精製した天然のCryjIおよび組換えAmbaI.1および上記のように合成した幾つかの抗原性ペプチドを用いたアッセイで、様々な抗原投与量の効果が示された。幾つかのペプチドはこれらのアッセイでは高濃度で阻害物質であることが判明した。この力価はＴ細胞アッセイでペプチドの投与量を至適化するために使用した。各ペプチドの力価で最大の反応を、刺激指数（S.I.）として表す。このS.I.は、ペプチドに反応して細胞に取り込まれた１分あたりのカウント（CPM）であり、培地中の細胞のみにより取り込まれたCPMにより割り算した。バックグラウンドレベルの２倍以上のS.I.値は“陽性”であり、そしてペプチドがＴ細胞エピトープを含むと考える。陽性の結果は、試験した患者群について、各ペプチドに関する平均刺激指数を算出するために使用した。結果（データは示さず）は、患者#999が組換えCryjIおよび精製した天然CryjIならびにペプチドCJ1-2、3、20および22によく反応するが、組換えAmb aI.1には反応しないことを示した。これはCryjI Ｔ細胞エピトープがこの特定のアレルギー患者からのＴ細胞により認識され、そしてrCryjIおよびペプチド３（配列番号４９）、20（配列番号５０）、および22（配列番号５１）がＴ細胞エピトープを含むことを示している。さらにこのエピトープはしばしば隣接する重複ペプチドでは検出されず、したがっておそらく反応性ペプチドの非重複中心残基に広がっているのだろう。対照抗原を用いてプライムしたＴ細胞、または他の抗原に対するCryjＩプライムＴ細胞を使用するＴ細胞アッセイでは、有意な交叉反応は見られなかった。
上記の方法は、多数の他の患者でも行った。もし患者がCryjIタンパク質に対して2.0以上のS.I.で反応し、そして患者がCryjIに由来する少なくとも１つのペプチドと2.0以上のS.I.で反応するならば、個々の患者の結果を、各ペプチドの平均S.I.を算出するために使用した。25名の患者からの陽性実験の要旨を、図４に示す。棒は陽性指数を表す。各棒の上は、試験した患者群を対象として、少なくとも２つのペプチドまたはタンパク質のS.I.との陽性応答のパーセントである。各棒の上のカッコは、試験した患者群に関する、各ペプチドまたはタンパク質の平均刺激指数である。25のＴ細胞系が精製した天然CryjIに反応し、そしてＴ細胞系の68.0％がrCryjＩに反応した。これらの25のＴ細胞系は、かなり低いレベルでrAmba I.1にも反応し、Amba IアレルゲンがCryjＩとホモロジーを共有し、そしてこの“共有”されたＴ細胞エピトープがCryjIとAmba Iとの間に存在するかもしれないことを示している。スギアレルギー患者のこのパネルは、ペプチド ＣＪＩ−１（配列番号１）、ＣＪＩ−２（配列番号２）、ＣＪＩ−３（配列番号３）、ＣＪＩ−４（配列番号４）、ＣＪＩ−７（配列番号７）、ＣＪＩ−８（配列番号８）、ＣＪＩ−９（配列番号９）、ＣＪＩ−１０（配列番号１０）、ＣＪＩ−１１（配列番号１１）、ＣＪＩ−１２（配列番号１２）、ＣＪＩ−１４（配列番号１４）、ＣＪＩ−１５（配列番号１５）、ＣＪＩ−１６（配列番号１６）、ＣＪＩ−１７（配列番号１７）、ＣＪＩ−１８（配列番号１８）、ＣＪＩ−１９（配列番号１９）、ＣＪＩ−２０（配列番号２０）、ＣＪＩ−２１（配列番号２１）、ＣＪＩ−２２（配列番号２２）、ＣＪＩ−２３（配列番号２３）、ＣＪＩ−２４（配列番号２４）、ＣＪＩ−２５（配列番号２５）、ＣＪＩ−２６（配列番号２６）、ＣＪＩ−２７（配列番号２７）、ＣＪＩ−２８（配列番号２８）、ＣＪＩ−３０（配列番号３０）、ＣＪＩ−３１（配列番号３１）、ＣＪＩ−３２（配列番号３２）、ＣＪＩ−３３（配列番号３３）、ＣＪＩ−３４（配列番号３４）およびＣＪＩ−３５（配列番号３５）に反応し、これらのペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示している。
抗原提示細胞として使用するための（EBV）-形質転換Ｂ細胞の調製
自己EBV-形質転換細胞系を、25,000Radでγ-照射し、そして第二増殖アッセイおよび第二のバルク刺激に抗原提示細胞として使用した。これらのEBV-形質転換細胞系は、5×10⁶PBLを1mlのＢ-59/8 Marmoset細胞系（ATCC CRL 1612、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）と共に、1μl/mlのフォルボール12-ミリステート-13-アセテート（PMA）が存在するコンディション培地中で、37℃で60分間、12×75mmのポリプロピレン丸底ファルコン スナップ カップ試験管（Falcon snap cap tubes）（ベクトンデッキンソン ラボウェア：Becton Dickinson Labware、リンカンパーク、ニュージャージー州）中でインキュベーションすることにより作成した。これらの細胞を次に1.25×10⁶細胞/mlにRPMI-1640中（10％の熱不活性化ウシ胎児血清を除き、上記のような）で希釈し、そして200μlのアリコートを平底培養プレート中で目で見えるコロニーが検出されるまで培養した。これらを次に大きなウェルに移して、細胞系を樹立した。
実施例２
全Ｔ細胞反応性のパーセントおよび本発明の独特なペプチドの組み合わせの患者適用範囲の決定
本発明の独特なペプチドの合成
ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）およびCJI-44.8（配列番号３８）は、標準的なＦmoc合成化学を使用して合成した。ペプチドCJI-43.39（配列番号３６）は、t-Boc合成化学により合成した。すべてのペプチドを、すでに記載したように高度に精製されたペプチドを生成するための方法を使用して93％以上の純度に精製した。図３はこの実験に使用した独特なCryjＩペプチドを示す。ペプチドの名前は実験を通して一貫している。
本発明の独特なペプチドのＴ細胞反応性
ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）を、実施例１に記載したようにＴ細胞反応性について試験し（データは示さず）、そしてこれらのペプチドが由来するそれぞれの“親”ペプチドのようにＴ細胞活性の発現を測定し、このように、これらは組み合わせたときに、CryjＩに対して感受性の群に十分な割合でCryjＩに対する全Ｔ細胞反応性の割合を有するかを決定するためのさらなる実験に、候補ペプチドとして適してした。
重複ペプチドおよびペプチド候補を用いたＴ細胞実験
CryjＩタンパク質アレルゲンに反応性であると決定された第二のＴ細胞カルチャーは、36名のCryjＩ-アレルギー性患者から得、そして実施例１に記載したようなインビトロＴ細胞増殖アッセイで、重複ペプチド組（図２）および本発明の候補ペプチド（図３）の反応性を分析した。結果を図５に示す。各ペプチドに対して2.0以上の最高の刺激指数を、試験した各患者に関して記録した。このデータを次に明細書にすでに記載した式により分析した。
候補ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）は、36名の患者の分析に基づき約36−53％のＴ細胞反応性の範囲を有し（図５）、97％の応答頻度は少なくとも１つの候補ペプチドに対する反応性を表し、このペプチドの組み合わせが本発明の“独特”なペプチドの第一基準に合い、ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）の組み合わせが、試験した群に実質的な割合で、CryjIの全Ｔ細胞反応性の実質的な割合を含んで成ることを示している。
実施例３
IgE結合実験
候補ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-43.39（配列番号３６）およびCJI-44.8（配列番号３８）そして図３に示す、に対するIgE反応性を分析するために、直接的なELISAフォーマットを使用した。ELISAウェルを候補ペプチドで被覆し、そしてIgE結合をアッセイした。結合の結果は、２つの異なるCryjIアレルギー性患者血漿のプールを使用して作成した。患者血漿プールＡ（PHP-Aと記載）は、天然の精製されたCryjIへのIgEの直接的結合がELISAにより陽性であると示されたすべての22名の患者に由来する等容量の血漿を混合することにより配合した。第二プール（PHP-D）は、天然および変性した精製CryjIへのIgEの結合を有すると直接的ELISAにより示された8名の患者に由来する等容量の血漿を混合することにより配合した。このプールではペプチドに対する反応性の検出の機会を増加するように作成した。このアッセイ組では両方のプールが、天然の精製CryjＩへの直接的結合を示した（データは示さず）。使用した任意の血漿濃度で、試験した任意のペプチドに対して検出しうるIgE結合反応性は無かった。ウェルを被覆するペプチドの存在を制御するために、マウスポリクローナル抗血清をペプチドに対して作成した。これらの抗血清を次に直接的ELISA結合に使用して、ペプチドがウェルを被覆していることを示した。これらのアッセイの結果（データは示さず）は、ペプチドがウェルを被覆していることを示した。
実施例４
本発明の候補ペプチドのpH-溶解性およびpH安定性プロフィールの同時測定
１．緩衝液の調製
50mMのリン酸ナトリウム保存溶液：
保存溶液Ａ：0.66g（0.05mol）のリン酸１塩基ナトリウム1水和物を、100mlのWFIに溶解した。溶液を0.2ミクロンフィルターを通して濾過した。
保存溶液Ｂ：0.71g（0.05mol）のリン酸２塩基ナトリウムを100mlのWFIに溶解した。溶液を0.2ミクロンフィルターを通して濾過した。
２．最初のペプチド分散
分散液Ａ：3.0mgの各ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-44.8（配列番号３８）およびCJI-43.39（配列番号３６）を別個に計り取り、そして別々の1.5mlのエッペンドルフバイアルに600μLの保存溶液Ａと共に入れた。この組成物を５秒間撹拌してよく混合した。
分散液Ｂ：3.0mgの各ペプチドCJI-24.5（配列番号３７）、CJI-44.8（配列番号３８）およびCJI-43.39（配列番号３６）を別個に計り取り、そして別々の1.5mlのエッペンドルフバイアルに600μLの保存溶液Ｂと共に入れた。この組成物を５秒間撹拌してよく混合した。
分散液ＡおよびＢを、よく均一にするために２分間超音波処理した。各々の分散液から、以下の容量比に従い小容量を表示したエッペンドルフバイアルにピペットで移した：

生成した溶液／懸濁液を、暗室で22℃にて24時間、撹拌せずに保存した。11個のミクロ遠心フィルターをレテンテート（retentate）カップ上に表示した。フィルターリザーバーを除いたキャプ付の各カップの重量を測定した。平衡化した溶液／懸濁液を各エッペンドルフバイアルからピペットでフィルターリザーバーに移し、そしてミクロ遠心機に設置し、そして10分間回転した。遠心後、フィルターリザーバーを捨て、そして各カップ／キャップの重量を集めた濾液と共に記録した。各カップ中の正味の濾液重量は、濾液を含む各カップ／キャップの重量から空のカップ／キャップの重量を引き算することにより算出した。各カップ中の濾液のpHは、ミクロ コンビネーションpH電極を使用して測定した。各pHを読んだ後、電極チップを1.0mLの選択された希釈緩衝液で各カップ中にすすいだ。各カップ／キャップ中の総希釈溶液を記録した。希釈因子は希釈溶液の重量を濾液重量で割り算することにより算出した。
希釈溶液中のペプチドの濃度は、HPLC分析により決定した。各pHでのペプチドの溶解性は、測定した濃度に希釈因子を掛け算することにより得た。ペプチドの分解の程度は、総ピーク面積にわたる総分解ピーク面積の割合から算出した。
溶解性の値に関してpH値をプロットし、そして図６ａ−ｃに各ペプチドについて示す。図６ａ−ｃに表すように、各ペプチドに関する溶解曲線を示す時、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-44.8（配列番号３８）およびCJI-43.39（配列番号３６）は、それぞれpH6−pH8のpH範囲のpHで、5mg/mlより高い溶解性を有する。
各ペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-44.8（配列番号３８）およびCJI-43.39（配列番号３６）に関するpH安定性プロフィールを算出し、そして総分解面積の関数として表を作成した（データは示さず）。24時間後に有意な分解を示すペプチドは無かった。
したがって、各ペプチド、CJI-24.5（配列番号３７）、CJI-44.8（配列番号３８）およびCJI-43.39（配列番号３６）は、本発明の独特なペプチドに要求される適切な溶解性および安定性を有すると決定した。
本発明はその好適態様に関して記載してきたが、他の態様も同じ結果を達成できる。本発明の変更および修飾は当業者には明らかであり、そしてそれらは本発明の真の精神および範囲に従うものである。
配列表
（１）−般情報：
（ｉ）出願人：イムロジック ファーマシューティカル コーポレーション
（ii）発明の名称：スギ花粉アレルギーを治療するための医薬組成物
（iii）配列の数：５１
（iv）住所：
（Ａ）宛て先：イムロジック ファーマシューティカル コーポレーション
（Ｂ）通り：リンカーン通り ６１０
（Ｃ）市：ウォールサム
（Ｄ）州：マサチューセッツ州
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：０２１５４
（ｖ）コンピューター読み取り先：
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換型
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0、
バージョン#1.25
（vi）本出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先願データ：
（Ａ）出願番号：米国特許第08/226,248号
（Ｂ）出願日：１９９４年４月８日
（Ａ）出願番号：米国特許第08/350,225号
（Ｂ）出願日：１９９４年１２月６日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ダルレーン エイ．バンストーン
（Ｂ）登録番号：３５，７２９
（Ｃ）参照／処理番号：025.7PCT（IMI-028CPC）
（ix）通信情報：
（Ａ）電話番号：（６１７）４６６−６０００
（Ｂ）ファックス：（６１７）４６６−６０４０
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１：

（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２：

（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３：

（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４：

（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号５：

（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号６：

（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号７：

（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号８：

（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号９：

（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１０：

（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１１：

（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１２：

（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１３：

（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１４：

（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１５：

（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１６：

（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１７：

（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１８：

（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号１９：

（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２０：

（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２１：

（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２２：

（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２３：

（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２４：

（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２５：

（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２６：

（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２７：

（２）配列番号２８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２８：

（２）配列番号２９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号２９：

（２）配列番号３０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３０：

（２）配列番号３１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３１：

（２）配列番号３２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３２：

（２）配列番号３３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３３：

（２）配列番号３４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３４：

（２）配列番号３５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：13アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３５：

（２）配列番号３６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：22アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３６：

（２）配列番号３７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３７：

（２）配列番号３８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号３８：

（２）配列番号３９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1337塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ
（ｖ）起源：
（Ａ）微生物：クリトポメリア ジャポニカ（Ｃｒｙｔｐｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：６６．．１１８７
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ｍａｔ＿Ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）位置：１２９．．１１８７
（xi）配列の記載：配列番号３９：

（２）配列番号４０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：374アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号４０：

（２）配列番号４１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４１：

（２）配列番号４２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４２：

（２）配列番号４３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４３：

（２）配列番号４４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４４：

（２）配列番号４５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：24アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４５：

（２）配列番号４６の青報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４６：

（２）配列番号４７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：29アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４７：

（２）配列番号４８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：27アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４８：

（２）配列番号４９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号４９：

（２）配列番号５０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号５０：

（２）配列番号５０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号５１：

Background of the Invention
Japanese cedar (Japanese cedar: Cryptomeria japonica:Cryptomeria japonica) Hay fever is one of the most important allergic diseases in Japan. The number of patients with the disease continues to increase, and in some areas more than 10% of the population is affected.
The main allergen from cedar pollen is purified and the amino acid sequence is partially identified, and the Sugi basic protein (SBP) orCryjI (Yasueda et al. (1983),J.Allergy Clin.Immunol.71: 77-86; and Taniai et al. (1988)FEBS Letters 239: 329-332).CryjI was cloned andCryjThe full-length nucleotide sequence and the full-length amino acid sequence of the I protein have been identified (WO 93/01213).
Cryptomeria japonica (Cryptomeria japonica)CryjI allergenCupressus sempervirensIt has also been found to be cross-reactive with allergens in pollen derived from other species of trees. Panzani et al.Annals of Allergy 57: 26-30 (1986)) in the skin test (RAST and RAST inhibition)Cupressus sempervirens) And cryptomelia japonica:Cryptomeria japonica) Reported that cross-reactivity was detected among allergens in pollen. Mountain Cedar (Janipels Sabinoides:Juniperus sabinoides, Janipels Ashey:Juniperus asheiThe 50 kDa allergen isolated from (also known as)CryjI Allergen NH₂-NH is the same sequence as the first 5 amino acids of the terminal sequence₂-It has a terminal sequence. thisCryjI allergens have also been found to be allergic and cross-reactive with the following species of trees: Cupressus Arizonica (Cupressus arizonica), Cupressus Macrocarpa (Cupressus macrocarpa), Janipels Virginiana (Juniperus virginiana), Janipels Communis (Juniperus communis), Zuya Orientalis (Thuya orientalis) And Chamaesiparis Obtusa (Chamaecyparis obtusa).
In order to desensitize allergen, an attempt was made to treat cedar pollinosis by administration of cedar pollen extract. However, desensitization using cedar pollen extracts has the disadvantage of developing anaphylaxis when high doses are used, while immunological tolerance to the extract is reduced when low doses are used to avoid anaphylaxis. Treatment must continue for several years to establish.
WO 94/01560 discloses improved compositions and methods for treating susceptibility to cedar pollen or immunologically cross-reactive pollen allergens, which use cedar pollen extracts Significantly reduces the potential adverse effects associated with desensitization therapy. WO 94/01560 is a cedar pollen-sensitive individual, or an individual against cedar pollen or such a cross-reactive allergen when administered to an individual allergic to a cedar pollen allergen and a cross-reactive allergen. Can down-regulate the allergic response,CryjDisclosed is an isolated antigenic fragment or peptide from I. Such down-regulation of an individual's allergic response leads to a reduction or alleviation of classic allergic symptoms, including asthma symptoms induced by cedar pollen. Such antigenic fragments can produce a T cell response such as stimulation (ie, T cell proliferation or lymphokine secretion) and / or T cell non-non-challenge when challenged with cedar pollen allergens. It is disclosed that a response can be induced or a decrease in T cell response can be induced. Furthermore, WO 94/01560 is most suitable for therapeutic use.CryjI peptide isCryjDoes not bind to IgE specific for I or naturalCryjDisclose to bind IgE to a substantially lower extent than the I allergen, thereby reducing or eliminating the possibility of anaphylaxis in therapeutic formulations involving such peptides. Finally, WO 94/01560 discloses a peptide having the above characteristics.
As a result of various pre-blending efforts, the present invention is a novel modifiedCryjModified optimally for the preparation of I peptides and formulations suitable for use to treat cedar pollen allergy in humans and other mammalsCryjNew combinations and formulations of I peptides are provided. Such as for use as an optimized human formulationCryjThe I peptide and its compositions have never been disclosed or intended.
Summary of invention
The present invention provides a preliminary formulation for the development of optimized formulations for therapeutic treatment of humans suffering from allergies to cedar pollen allergens or pollen allergens immunologically cross-reactive with cedar pollen allergens. Modified as part of the formulation schemeCryjA novel peptide of I is provided. Such modified peptides have certain unique characteristics that make them particularly suitable for pharmaceutical compositions. Furthermore, the present invention is modifiedCryjOptimized to adapt and maintain the unique properties of I-peptide and at the same time provide maximum therapeutic effect when used in therapeutic formulations for the treatment of human cedar pollen allergy Therapeutic compositions and multipeptide compositions are provided.
Description of drawings
FIG. 1 consists of 66 nucleotides of 5 'untranslated sequence, 1122 nucleotide reading frame starting from the methionine codon, and 1312 nucleotides including the 3' untranslated region.CryjThis represents the complete cDNA sequence of I (SEQ ID NO: 39). FIG. 1 also showsCryjThe shortened amino acid sequence of I (SEQ ID NO: 40) is also represented.
FIG.CryjRepresents 35 types of overlapping 20mer peptides overlapping with 10 peptides derived from I.
FIG. 3 represents the amino acid sequence of the novel “unique” peptide of the present invention.
Figure 4 shows purified naturalCryjThe T cell responses from 25 patients picked up in vitro with I are graphed, and the 35 overlapping 20mer shown in FIG.CryjResponses to I peptides were expressed as percent response (positive) at SI of at least 2 (shown above each bar), stimulation index of positive response for peptides (shown in parentheses above each bar), and positive index ( Y axis);
FIG. 5 shows the overlap shown in FIG.Cryj3 graphically depicts the T cell response to the I peptide and the novel “unique” peptide of the invention shown in FIG. The average S.I. as well as the percent response is shown above each bar (in parentheses) and the positive index (average S.I. multiplied by percent response) is the Y axis.
FIG. 6a shows CJI-24.5 (SEQ ID NO: 36) (desalted) in 50 mM phosphate buffer (containing 5% mannitol and containing an estimated peptide content of 95.2% and 2.7% acetate at 22 ° C.). pH solubility profile.
FIG. 6b shows CJI-43.39 (SEQ ID NO: 37) (desalted) in 50 mM phosphate buffer (containing 5% mannitol and containing an estimated peptide content of 83.5% and 1.9% acetate at 22 ° C.). pH solubility profile.
FIG. 6c shows CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) (desalted) in 50 mM phosphate buffer (containing 5% mannitol and containing an estimated peptide content of 86.% and 1.5% acetate at 22 ° C.). PH solubility profile.
Detailed Description of the Invention
The present invention relates to a pollen allergen that is immunologically cross-reactive with a cedar pollen allergen or a cedar pollen allergen (Cuppressus semipervence (Cupressus sempervirens), Janipels Sabinoides:Juniperus sabinoides(Janipels Ashey:Juniperus asheiAlso known as), Cupressus Arizonica (Cupressus arizonica), Cupressus Macrocarpa (Cupressus macrocarpa), Janipels Virginiana (Juniperus virginiana), Janipels Communis(Juniperus communis), Zuya Orientalis (Thuya orientalis) And Chamaesiparis Obtusa (Chamaecyparis obtusaModified as part of a pre-combination scheme to develop optimized formulations for therapeutic treatment of humans suffering from allergies toCryjA novel peptide of I is provided. Such modified peptides have certain unique properties that make them particularly suitable for pharmaceutical compositions and are referred to herein as “unique” peptides.
According to medicinal chemistry, pre-formulation is through the determination and / or definition of the physical and chemical properties of drugs that are believed to be important for stable, effective and safe dosage form compositions. This is a process for optimizing the process. Consider possible interactions with various ingredients that are intended for use in the final formulation. Pre-formulation is a thorough study that includes studies of parameters such as solubility, pH profile of stability and drug-excipient interactions, and this study relates to the physiological availability and physical and chemical stability of the drug. There may also be a sufficient effect. Data from such studies are integrated with preliminary pharmaceutical and biochemical studies on active drug ingredients to select the best drug form and the most desirable excipients to use in this development. Provide information that can be enabled.
Developing optimal formulations of active pharmaceutical ingredients and excipients is complex and many factors affect the properties of the composition. The high degree of homogeneity, physiological availability and therapeutic properties expected of pharmaceuticals can only be achieved with considerable effort and technology. Flexibility is also an important factor for pre-formulation. A number of excipients, stabilizing counterions, etc. may have to be tested to find compatibility with the active drug component of the composition. Various modifications of the active ingredient may be required to successfully formulate the formulation. Such changes do not affect the overall therapeutic effect of the drug, but must at the same time make the drug more suitable for the composition.
CryjAs part of a pre-formulation scheme to provide an optimized formulation suitable for use in humans and other mammals for the treatment of susceptibility to I, the active ingredients in such compositions ( Peptide or candidate peptide)CryjAmong all possible peptides derived from the I sequence, they should have the following characteristics that make them unique. First of all, unique peptides alone or in combination with other unique peptides,CryjA sufficient proportion to induce a T cell non-response or decreased T cell response in a substantial proportion of individuals susceptible to I protein allergenCryjIt should comprise T cell reactivity of the I protein allergen. Second, the candidate peptide should have “super-solubility” properties as defined herein, such as solubility in aqueous buffer at pH 6 to pH 8 and higher than 5 mg / ml. Third, the peptide is stable in aqueous buffers at pH in the pH range of pH 6 to pH 8. The candidate peptides determined as “unique” peptides in the present invention are CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38), all shown in FIG. .
The first property is to exhibit a T cell response, such as T cell proliferation or lymphokine secretion (ie comprising at least one T cell epitope), or to reduce T cell non-responsiveness or a decrease in T cell response. Those peptides found to induce are believed to have T cell reactivity. T cell epitopes appear to be involved in the initiation and persistence of immune responses to protein allergens that are responsible for the clinical symptoms of allergies. These T cell epitopes are thought to trigger early events at the level of T helper cells by binding to appropriate HLA molecules on antigen presenting cells and stimulating the relevant T cell subpopulation. These events lead to activation of the B cell cascade leading to T cell proliferation, lymphokine secretion, local inflammatory response, reassembly of additional immune cells, and antibody production. One isotype of these antibodies, IgE, is fundamentally important for the development of allergic symptoms, and its production is influenced by the early events of the cascade, at the level of T helper cells, due to the nature of the secreted lymphokines. A T cell epitope is a basic element or minimal unit of recognition by a T cell receptor, where the epitope comprises amino acids essential for receptor recognition. A cedar pollen patient isolated comprising at least one T cell epitopeCryjExposure to I-peptide, for example, anergy, immunological tolerance or apoptosis, the ability to alter the lymphokine secretion profile compared to exposure to naturally occurring self-antigens; and / or the ability to cause induction of T suppressor cells Through the T cell non-responsiveness of the appropriate T cell subpopulation so that it becomes non-responsive to or reduced in responsiveness to protein allergens and does not participate in stimulating immune responses upon such exposure. It is thought that can be pulled out.
In order to determine a peptide that has T cell reactivity and comprises at least one T cell epitope, the isolated peptide is tested, for example, by T cell biological methods, and the peptide is a T cell. Determine whether to develop a response or induce T cell non-responsiveness. As discussed in the Examples, human T cell stimulating activity is achieved by T cells obtained from individuals sensitive to cedar pollen allergens (ie, individuals having an IgE-mediated immune response to cedar pollen allergens).CryjIncubate with peptides derived from I or modified peptides and determine if T cell proliferation occurs in response to the peptide, as measured, for example, by cellular uptake of tritylated thymidine. The stimulation index of the T cell response to the peptide can be calculated by dividing the CPM responding to the peptide (maximum counts per minute) by the control CPM. A stimulation index (S.I.) greater than or equal to twice the background level is considered “positive”. Positive results are used to calculate the average stimulation index for each peptide for the group of patients tested. Peptides suitable as candidates for formulation in the final formulation have an average T cell stimulation index of 2.0 or greater and are preferably higher (eg, at least 2.5, more preferably at least 3.5, more preferably at least 4.0, More preferably at least 5, even more preferably at least 7, and most preferably at least about 9).
For therapeutic purposes, candidate peptides are recognized by a population susceptible to at least 10%, more preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, and more preferably at least 40% or more cedar pollen. Furthermore, suitable candidate peptides have a positive index (P.I.) of at least about 100, more preferably at least about 250, and most preferably at least about 350. This positive index for peptides is the mean T cell stimulation index, the percentage of individuals in a population susceptible to cedar pollen having a T cell stimulation index of at least 2.0 for such peptides (eg, at least 15 individuals, More preferably, it is determined by multiplying at least 30 individuals. Thus, the positive index represents both the strength of the T cell response to the peptide (S.I.) and the frequency of the T cell response to the peptide, targeting a population sensitive to cedar pollen.
One peptide (candidate peptide) or a combination of candidate peptidesCryjTo induce a T cell non-response in a substantial proportion of I-sensitive populationsCryjAn algorithm can be used to determine if it comprises a sufficient proportion of I T cell reactivity. According to one such algorithm,CryjBy deliberately dividing I into at least two overlapping peptide regions of the desired length (eg, about 12-30 amino acid residues long, preferably no longer than about 25 amino acid residues long, Create a set of overlapping peptides (with 15 overlapping amino acid residues). See, for example, FIG. This division into peptide regions can be done arbitrarily, can be made according to an algorithm, or is known to comprise at least one T cell epitopeCryjIt can also be based on all or part of the region of I. Preferably allCryjAt least 50% of the I protein sequence, and more preferablyCryjThe entire protein sequence of I is split into two or more peptides. The human T cell stimulation index is determined for each peptide in the in vitro T cell amplification assay described herein for each individual tested in a population that is sensitive to protein allergens. See, for example, FIG. A candidate peptide or combination of candidate peptides is selected based at least in part on the average human T cell stimulation index of the candidate peptides of the tested peptide set and the positive index of the candidate peptides of the tested peptide set. For example, see FIG. Summarize the human T cell stimulation index for candidate peptide (s). For each individual, the human T cell stimulation index for the candidate peptide (s) is divided by the sum of the human T cell stimulation indices of the remaining peptides in the peptide set tested, and the T cell response as shown below: Determine gender percentage:

Alternatively, the presence of a T cell epitope in a candidate peptide depends on the amino acid residue of the overlapping peptide located at either the N-terminus or C-terminus of the candidate peptide in the amino acid sequence of the protein antigen, but such If the epitope is not present in the candidate peptide, it may be possible to calculate the presence of T cell reactivity in the candidate peptide by using the following formula:

In this formula, “N_T“Flanking peptide” refers to a peptide comprising an amino acid residue that overlaps with the amino acid residue located at the N-terminus of a candidate peptide in the amino acid sequence of the protein antigen from which the peptide is derived;_T"Flanking peptide" refers to a peptide comprising an amino acid residue that overlaps with the amino acid residue located at the C-terminus of the candidate peptide in the amino acid sequence of the protein antigen from which the peptide is derived. The stimulation index for is obtained by adding the N-terminal flanking peptide and the C-terminal flanking peptide and dividing by the sum of the total stimulation indices for the entire set of overlapping peptides to obtain the percent T cell reactivity for the candidate peptide. If a combination of two or more candidate peptides is selected, each contains overlapping amino acid residues, but this calculation cannot be used separately to determine the percentage of T cell reactivity for each candidate peptide. However, the total percentage of T cell reactivity for the candidate peptide combination is obtained. Can. In this case, stimulation index of all candidate peptides which overlap is included in the calculation.
In each individual test, the value obtained for the percent T cell reactivity for the candidate peptide or peptide combination can represent a range of lower and higher values than the results of the above calculations. By any of the above calculations, a percentage is obtained for at least about (20), and preferably at least about (30) individuals sensitive to protein antigens, and an average percentage is determined. For use in the compositions of the present invention, the candidate peptide or combination of candidate peptides has the following criteria: (1) The candidate peptide or combination of candidate peptides is at least about 10%, preferably at least about 20%, more Preferably having an average percent of at least about 30%, more preferably at least about 40%, and more preferably at least about 50-60% or more; and (2) in the tested population, at least about 60%, preferably at least About 75%, and more preferably at least about 90-100%, have a positive T cell response (2.0 or higher SI) in response to a candidate peptide or combination of candidate peptides. Candidate peptides or combinations of candidate peptides that meet the above criteria are:CryjIn order to induce a T cell non-response or a decrease in T cell response in a substantial proportion to a population sensitive to I,CryjIt appears to comprise a substantial percentage of T cell reactivity to I.
As an illustrative aspect of the algorithm described above,CryjA set of overlapping and candidate peptides derived from I, CJI-24.5, CJI-23.39 and CJI-44.8 were generated and tested.CryjA second generation T cell culture that was determined to be reactive with I protein antigensCryjThe reactivity of overlapping peptide sets was obtained from I-allergic patients and analyzed with the in vitro T cell proliferation assay described herein. The results are shown in FIG. The highest stimulation index of 2.0 or higher in response to each peptide was recorded for each individual tested. The data was then analyzed by the above formula. One personCryjFor I-allergic individuals, the results and T cell reactivity calculations are shown below using equations (1) and (2).
T cell reactivity for patient 1308
Peptide stimulation index
CJI-1 (SEQ ID NO: 1) 10.9
CJI-2 (SEQ ID NO: 2) 16.1
CJI-3 (SEQ ID NO: 3) 8.8
CJI-4 (SEQ ID NO: 4) 0
CJI-5 (SEQ ID NO: 5) 3.2
CJI-6 (SEQ ID NO: 6) 0
CJI-7 (SEQ ID NO: 7) 2.5
CJI-8 (SEQ ID NO: 8) 0
CJI-41 (SEQ ID NO: 41) 8.9
CJI-11 (SEQ ID NO: 11) 0
CJI-12 (SEQ ID NO: 12) 0
CJI-13 (SEQ ID NO: 13) 0
CJI-14 (SEQ ID NO: 14) 0
CJI-15 (SEQ ID NO: 15) 9
CJI-42.5 (SEQ ID NO: 42) 17.6
CJI-18 (SEQ ID NO: 18) 0
CJI-19 (SEQ ID NO: 19) 0
CJI-20 (SEQ ID NO: 20) 0
CJI-21 (SEQ ID NO: 21) 0
CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) 25.6
CJI-23 (SEQ ID NO: 23) 5.3
CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37) 6.9
CJI-25 (SEQ ID NO: 25) 9.4
CJI-26 (SEQ ID NO: 26) 11.9
CJI-27 (SEQ ID NO: 27) 5.5
CJI-28 (SEQ ID NO: 28) 0
CJI-29 (SEQ ID NO: 39) 2.9
CJI-30 (SEQ ID NO: 30) 0
CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) 21.5
CJI-33 (SEQ ID NO: 33) 20.9
CJI-34 (SEQ ID NO: 34) 17.8
CJI-35 (SEQ ID NO: 35) 0
Sum of stimulation indices: 195.7 (denominator)
% Reactivity of peptide 44.8 for patient 1308

Thus, the expected range of T cell reactivity of peptide 44.8 (SEQ ID NO: 38) for this patient isCryj11-21.7% of the total reactivity of the I protein. The above calculation is repeated with any possible candidate peptides. 36 people testedCryjIn I-allergic patients, the following results were obtained:

Thus, the combination of the three peptides of the present invention is sufficient in combination.CryjIt is within the scope of having a T cell reactivity of I and therefore meets the first criteria of the “unique” peptide of the present invention.
For the allergy treatment according to the method of the present invention, the peptide used in combination does not bind to immunoglobulin E (IgE) or the peptide is derived.CryjIt is preferred to bind to IgE to a substantially lesser extent than the I protein allergen (ie at least 100 times less binding, more preferably at least 1,000 times less binding). The main complication with standard immunotherapy is an IgE-mediated reaction such as anaphylaxis. Immunoglobulin E binds or cross-links IgE on mast cells or halophilic cells and mediators (eg histamine, serotonin, eosinophil migration factor) in allergic (“atopic”) patients. It is a mediator of the anaphylactic reaction resulting from the release. Thus, a substantial proportion of anaphylaxis in the population that is sensitive to the allergen to be treated isCryjIn an I-sensitive population, a substantial percentage (eg, at least about 75%) can be avoided by using one or more peptides that do not bind IgE for immunotherapy, or if the peptide binds to IgE Nevertheless, such binding does not release mediators from mast cells or halophilic cells. The risk of anaphylaxis could be reduced by using one or more peptides with reduced IgE binding for immunotherapy. IgE binding can be tested, for example, by direct ELISA or capture ELISA. In addition, peptides with minimal IgE stimulating activity are desirable for therapeutic efficacy. Minimal IgE stimulating activity is naturalCryjIgE production stimulated by I protein allergen and / or IgE production less than IL-4 production. If the peptide binds to IgE, it is preferred that such binding does not result in the release of mediators (eg histamine) from mast cells or halophilic cells. To determine whether a peptide that binds to IgE releases a mediator, a histamine release assay was performed using standard reagents and techniques obtained, for example, from Amac (Amac, Inc., Westbrook, Md.). It can be carried out. Briefly, a peptide buffer to be tested is mixed with an equal volume of whole heparinized blood from an allergic patient. After mixing and incubation, the cells are pelleted and the supernatant is processed to measure the amount of histamine released using a radioimmunoassay. As described in Example 3, the candidate peptides of the present invention, 24.5 (SEQ ID NO: 37), 43.39 (SEQ ID NO: 36) and 44.8 (SEQ ID NO: 38) do not appear to bind to IgE.
A second unique peptide characteristic is a “supersolubility” of solubility greater than 5 mg / ml at a pH in the pH range of pH 6 to pH 8 as previously defined. Solubility at a pH within the physiologically acceptable pH range (eg, pH 6-pH 8) is particularly important when formulating multipeptide therapeutics for injection. Administration by intravenous or subcutaneous injection of a soluble formulation in the physiologically acceptable pH range provides 100% bioavailability of the drug component to the physiological system into which the drug is introduced. Thus, a formulation intended for injection must be fluid enough to be easily injected with a syringe, and the active ingredient must also be sufficiently soluble to achieve the maximum therapeutic effect. Solubility is also useful when formulating compositions to be administered via other modes of administration such as oral administration (tablets, aerosols, sublingual) or for sustained release compositions and formulations.
It may be difficult to formulate one protein or peptide into a soluble composition because the peptide is not soluble in any desired pH range, or is only soluble in a slightly narrow pH range. In particular, when multiple peptides are formulated together in one multipeptide composition, it is particularly difficult because the soluble pH range of each peptide does not overlap with the soluble range of other peptides in the composition. As a result, the requirement of “ultra-solubility”, which significantly modifies the candidate peptide of interest and requires flexibility with most formulations, is essential for the successful formulation of multipeptide formulations. It may be.
The unique peptide of the present invention is a product in which many amino acids of the original intended candidate peptide sequence (“parent”) are altered, from which (“parent”) the modified unique peptide of the present invention It was initially derived with the aim of finding peptides suitable for the property of “super solubility”. For example, the amino acid sequence of CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) isCryjFrom the protein sequence of I (SEQ ID NO: 40), these regions of the parent protein (FIG. 1) were first treated with high T cell reactivity using a 20-mer overlapping peptide set as described in Example 1. This is shown in FIG. 2, which covers the entire sequence. These two peptides, CJI-31 (SEQ ID NO: 31) and CJI-32 (SEQ ID NO: 32), individually exhibited high T-cell reactivity. These peptides were adjacent to each other in the native protein sequence (FIG. 1) and 10 residues overlapped, and peptide CJI-44 was synthesized to capture the total T cell reactivity of both peptides. CJI-44 is a 30mer peptide having the amino acid sequence DEEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAEFNVE (SEQ ID NO: 43), which is present in all 20mer CJI-31 (SEQ ID NO: 31) and CJI-32 (SEQ ID NO: 32) peptides. Contains an array. However, CJI-44 (SEQ ID NO: 43) has two 20-mer, CJI-31 (SEQ ID NO: 31) and CJI-32 (SEQ ID NO: 32) T cell reactivity, but CJI-44 (SEQ ID NO: 43) When tested for solubility, it had a much lower solubility than the 5 mg / ml solubility required for the “unique” peptides of the present invention.
Here, further, it was attempted to increase the solubility by shortening the N-terminal part of CJI-44, thereby generating CJI-44.1 (NGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE) (SEQ ID NO: 44). Two further C-terminal residues were shortened to generate 44.2 (NGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFN) (SEQ ID NO: 45). However, these sequences increased solubility, but did not reach the “super solubility” standard. Thus 44.2 (SEQ ID NO: 45) was further modified by adding a charge at the N-terminus (hydrophilic residue) and by replacing the hydrophobic residue Val with the lower hydrophobic residue Ala. The two generated analogs, CJI-44.5 (DENGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNAE) (SEQ ID NO: 46) and CJI-44.6 (DEENGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE) (SEQ ID NO: 47) are “1 pH point protocol methods” (eg 100 mM sodium phosphate buffer without mannitol). The use of a protocol for determining solubility at 1 pH point under constant agitation in solution showed an increase in solubility. Additional analogs were constructed by deleting residue Asn. These two analogs, CJI-44.7 (DEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNAE) (SEQ ID NO: 48) and CJI-44.8 (DEEGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVE) (SEQ ID NO: 38) are very soluble in the “1 pH point protocol” and are “pH range protocol method” “Solubility” was activated by (ie, measuring the solubility as a function of pH in 50 mM sodium phosphate containing 5% mannitol without stirring after the first stirring). CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) was stable and solubility was higher than 5 mg / ml at pH ranging from pH 6-8 in aqueous buffer (see Example 4 and FIG. 6c).
Peptide CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) exhibits T-cell reactivity similar to its parent peptide, CJI-31 (SEQ ID NO: 31), CJI-32 (SEQ ID NO: 32) and CJI-44 (SEQ ID NO: 43). After confirming retention (see Example 2) and after confirming its stability as discussed below, it was determined to be a “unique” peptide. The development of other “unique” peptides, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) followed those described in CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) above.
A third criterion that must be met by the unique peptides of the present invention is stability at a physiologically acceptable pH in the range of pH 6 to pH 8. The peptide must be stable under the conditions of manufacture or storage and, if necessary, reconstitution. The stability test determines the time during which the final dosage form interferes with the integrity, quality and purity of the formulation. The stability test can be performed simultaneously with the solubility experiment as discussed in Example 4. Each candidate peptide of the invention was stable (eg, without significant degradation) at room temperature for at least 24 hours at physiological pH in the pH range of pH 6-8.
Thus, candidate peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) have each of the three “unique” properties required outlined above. However, this combination of peptides is shown to be suitable for formulation as an optimized therapeutic formulation for administration to humans to treat allergies to cedar pollen allergens.
The highly purified peptides of the invention can be produced synthetically by chemical synthesis using standard methods. Various peptide chemical synthesis methods are known in the art, such as fully or semi-automated solid phase synthesis on commercially available peptide synthesizers. The synthetically produced peptide is then purified to homogeneity (ie, at least 90%, more preferably at least 95%, and even more preferably at least 97% purity), all other polypeptides and contaminants are protein It is removed using any of a number of methods known in the literature for purification.
According to one method for producing highly purified homogenous peptides of the present invention, peptides produced by synthetic chemical means ("solid phase synthesis" linked to polymer supports, or conventional homogenous chemical reactions) Any of the “solution synthesis”) can be purified by preparative reverse phase chromatography. In this method, the synthetically produced “crude” peptide is dissolved in a suitable solvent (typically an aqueous buffer) and separated by a separation column (typically a reverse phase silica-based medium, Polymer or carbon based media can also be used). Peptides are eluted from the column by increasing the concentration of organic components (typically acetonitrile or methanol) in an aqueous buffer (typically TFA, triethylamine phosphate, acetate or similar buffer). The eluate fractions are collected and analyzed by a suitable analytical method (typically reverse phase HPLC or CZE chromatography). Pool the fractions with the required uniformity. The counter ions present can then be changed by further reverse phase chromatography or ion exchange resins in selected salts. The peptide can then be isolated as its acetate salt or other suitable salt. The peptide is then filtered and the water removed (typically by lyophilization) to contain at least 90%, more preferably 95%, and even more preferably at least 97% of the required peptide component. Peptide composition is obtained. In some cases, in combination with the reverse phase HPLC described above, purification can be performed by affinity chromatography, ion exchange, size exclusion, countercurrent or conventional phase separation systems, or by a combination of these methods. The peptide can be further concentrated by ultrafiltration, rotary evaporation, precipitation, dialysis or other similar methods.
The highly purified homogenous peptide composition can then be characterized by any of the following methods or combinations thereof: a) for measuring molecular weight to confirm peptide identity Mass spectrometry; b) amino acid analysis to confirm peptide identity via amino acid composition: c) amino acid sequencing (automated protein sequencer or manual to confirm defined sequence of amino acid residues) D) HPLC used to check the identity and purity of the peptide (more systems if desired) (ie identify peptide impurities); e) Water to measure the water concentration of the peptide composition Content; f) ionic content to determine the presence of salt in the peptide composition; and g) residual organic reagent, Residual organic substances for testing materials, the Oyohi / or organic contaminants.
The peptides of the present invention can also be produced by recombinant DNA methods in host cells transformed with nucleic acid sequences encoding such peptides. When produced recombinantly, host cells transformed with a nucleic acid encoding the desired peptide are cultured in a medium suitable for the cells, and the isolated peptide is ionized from the cell culture medium, the host cell, or both. Peptides and proteins can be purified using methods well known in the art, including exchange chromatography, ultrafiltration, electrophoresis or immunopurification using antibodies specific for the desired peptide. To use recombinantly produced peptides, they are isolated and purified to homogeneity according to the methods described above for synthetically produced peptides and are free of cellular material, other polypeptides or media.
In certain limited situations, the peptides of the present invention are highly purified full-length or native proteins whose sites of chemical digestion or enzymatic cleavage have already been determined and are reproducible in the resulting digestion. It can also be produced by chemical or enzymatic cleavage of A peptide having a defined amino acid sequence is a polypeptide present in enzymatic or chemical digestion by any of the methods described above for highly purifying and isolating synthetically or recombinantly produced peptides. It can be highly purified and isolated in the absence of peptides or contaminants.
The present invention also contemplates therapeutic compositions and multi-peptide therapeutic compositions comprising the unique peptides of the present invention. The therapeutic compositions of the present invention comprise one or more unique peptides of the present invention that can be administered simultaneously or sequentially as a single dose to treat allergies to cedar pollen allergens in humans and other mammals. Can comprise. Such therapeutic formulations need not be a physical mixture of one or more peptides of the present invention, but in order to achieve maximal therapeutic effects, such peptide combinations can be combined simultaneously or sequentially 1 Comprising a combination of unique peptides, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38), comprising as a batch treatment (eg physiologically acceptable) In the pH range (preferably pH 7.0-pH 7.5) provides solubility and stability, and covers 36-53% T cell reactivity in 97% of patients tested).
The therapeutic composition of the present invention comprises one or more peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38), and also one composition It also comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers such as excipients that are compatible with the peptide or peptides present in the product. When the composition is a multipeptide composition, the pharmaceutically acceptable carrier must be compatible with all the peptides in the multipeptide composition. Suitable excipients include, but are not limited to, sterile water, sodium phosphate, mannitol, or both sodium phosphate and mannitol, or any combination thereof. Other suitable excipients include, but are not limited to sorbitol, sucrose, dextrose, lactose dextran and PVP. In addition, a pharmaceutically acceptable counterion may be added during the preparation of the multipeptide composition. Pharmaceutically acceptable counterions include acetate, HCl and citrate.
The therapeutic composition of the present invention should be sterile, stable under the conditions of manufacture, storage, transportation and use and protected against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi . In order to maintain the integrity of the composition (ie, prevent contamination, long-term storage), suitable means for preparing the therapeutic compositions of the present invention include peptides and pharmaceutically acceptable carriers (one or To prepare a formulation that can be reconstituted in a lyophilized powder in a pharmaceutically acceptable carrier such as sterile water just prior to use. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying, freeze-drying or spin drying, which are already sterile filtered by adding further desired ingredients to the active ingredient From the solution state to powder.
Suitable multipeptide compositions are uniqueCryjIt comprises the I peptide, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and sodium phosphate and mannitol. For this embodiment, a suitable counterion such as acetate is added during preparation of the composition, and the composition is preferably in a physiologically acceptable carrier (such as sterile water) before use. Prepared in reconstituted lyophilized powder state. Without limitation, an example of one suitable multipeptide composition of the present invention is described below.CryjThe I peptides, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38), preferably mixed with a suitable counterion during manufacture, have the following composition Make a sterile vial containing pyrogen-free frozen powder:
Activity:CryjI peptide, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38)
0.75mg per peptide
Inactivity: 0.05M sodium phosphate, pH 6.0-8.0
5% weight / volume Mannitol, U.S.P.
Diluent: Sterile water for injection, U.S.P. (first reconstitution)
0.9% sodium chloride for injection
(Dilution after first reconstitution)
Final pH: pH7.0-pH7.5
The multipeptide composition of the present invention can also be provided in the form of a kit containing instructions for use.
Administration of the therapeutic and multipeptide compositions described above to an individual, preferably in a non-immunogenic state, results in an immune response to the cedar pollen or cedar pollen allergen immunoreactive with the individual. Effective dosages and durations to cause downregulation of (e.g., reducing allergic symptoms caused by cedar pollen or related allergens including cedar pollen-induced asthma) and can be performed using well-known methods . Down-regulation of allergic immune responses to human cedar pollen is possible whenever possible (eg Varney et al.,British Medical Journal,302: 265-269 (1990)) or on a patient-by-patient basis (ie, when the patient feels that some or all of the allergic symptoms caused by cedar pollen have alleviated).
A unique feature of each peptide of the invention is that each peptide has “supersolubility”. Accordingly, the compositions and multipeptide compositions of the invention are particularly suitable for administration by injection (eg, intravenous or subcutaneous). However, optimized compositions and multi-peptide compositions of the present invention can be used in any convenient manner in which solubility of the active drug ingredient is desired or acceptable, eg, injection (subcutaneous, intravenous, etc.), oral Administration can be by administration, sublingual, inhalation, transdermal administration, rectal administration, or any other route of administration known in the art for soluble therapeutic agents. It may be preferable to administer a therapeutically effective amount of one or more therapeutic compositions of the present invention to an individual simultaneously or sequentially as a single formulation. Each such composition for simultaneous or sequential administration as a single formulation consists of a unique peptide of the invention alone or comprises a multipeptide composition optimized according to the invention. It may consist of.
For subcutaneous injection of one or more therapeutic and multipeptide compositions of the invention, preferably about 1 μg-3 mg, and more preferably about 20 μg-1.5 mg, and even more preferably about 50 μg-per dosage unit. 750 μg of each active ingredient (peptide) can be administered. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, a unit dosage form refers to a physically divided unit suitable for uniform administration to a treated human patient; each unit together with a desired carrier to produce the desired therapeutic effect. Contains a calculated, predetermined amount of the active ingredient. The specifications for the novel unit dosage forms of the present invention include (a) the unique properties of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved, and (b) the technology for formulating such active compounds for the treatment of human patients. It is subject to inherent limitations and depends directly.
In order to administer the composition of the invention in a manner other than parenteral administration (ie, by oral administration), the composition is made up of substances to prevent inactivation of the composition or to increase absorption and bioavailability. It may be necessary to coat or administer with the substance. For example, the peptide composition can be administered with an enzyme inhibitor or in a liposomal state. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropyl fluorophosphate (DEP) and trasilol. Liposomes include water-in-oil-in-water CGF emulsions and conventional liposomes (Strejan et al. (1984).J. Neuroimmunol.7:27). When the peptide is suitably protected, it can be administered orally, for example with an inert diluent or an assimilable edible carrier. The peptide and other ingredients can be enclosed in hard or soft shell gelatin capsules, compressed into tablets, or included directly in the individual's food. For oral therapeutic administration, the active compound is included with excipients and can be used in the form of digestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, solvents, gels, suspensions, syrups, cachets, etc. . Such compositions and preparations should contain at least 1% by weight of active compound. The proportions of the compositions and preparations can of course vary, but can conveniently be between about 5-80% of the unit weight. The amount of active compound useful for such treatment is such that a suitable dosage will be obtained. In addition, the active compounds can be included in sustained or controlled release (constant or peristaltic release) preparations or compositions.
An effective amount of an optimized pharmaceutical composition of the present invention includes the degree of individual sensitivity to the antigen, age, sex and individual weight, and the ability to down-regulate the antigen-specific immune response in the individual of the peptide. It will change according to such factors. Dosage regimes can be adjusted to provide the optimum therapeutic response. For example, several divided doses may be administered over a day, week, month or year, or the dose may be increased proportionally with each subsequent injection, as indicated by the urgency of the treatment situation. Can be reduced. In one suitable therapeutic formulation, subcutaneous injections of the therapeutic composition are given once a week for 3-6 weeks. Each dose can be made constant at this dose, or each subsequent injection can be increased or decreased. Additional injections can be administered at intervals of about 3 months to about 1 year after the initial treatment, and only one injection may be required, or several separate injections may be required, as with the initial treatment.
The invention is further illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting.
Example 1
T cell experiment of cedar pollen allergic patients using duplicate CryjI peptide
Synthesis of overlapping peptides
Cedar pollenCryjI was divided into 35 peptide sets, 20 amino acids long and 10 amino acids overlapping. Overlapping peptides were synthesized using standard Fmoc / tBoc synthetic chemistry and purified by reverse phase HPLC. Figure 2 shows the overlap used for these experiments.CryjI peptide is shown. Peptide names are consistent throughout the experiment.
T cell response to cedar pollen antigenic peptide
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) show clinical symptoms of seasonal rhinitis and lymphocytes from 60 ml of heparinized blood from a cedar pollen-allergic patient with a positive MAST and / or skin test in cedar pollen Purified by centrifugation of separation medium (LSM). The long-term T cell line is composed of complete medium (PRMI-1640, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 5 × 10 5^-Five 2 × 10 in bulk culture supplemented with 2-mercaptoethanol and 10 mM HEPES, supplemented with 5% heat-inactivated human AB serum⁶PBL / ml, 20 μg / ml partially purified naturalCryjI (75% purity, including the same three bands as in Figure 2), 7 days at 37 ° C, 5% CO₂Established by stimulation with an incubator, reactive to T cellsCryjI selected. The amount of this priming antigen was determined to be optimal for T cell activation from most pollen allergic patients. Live cells are purified by LSM centrifugation and the cells are allowed to up to 3 weeks in complete medium supplemented with 5 units of recombinant human IL-2 / ml and 5 units of recombinant human IL-4 / ml. The cells were cultured until they did not respond to lymphokine and were considered "rested". T cell is selected peptide, recombinantCryjI (CryjI), refined naturalCryj or recombinationAmbaI.1 (AmbaThe ability to grow against I.1) or the positive control, phytohemaglutinin (PHA) was then measured. 2 x 10 for assay^FourOf resting cells, 2 × 10^Four2-50 μg / ml selected peptide in the presence of autologous Epstein-Barr virus (EBV) -transformed B cells (prepared as described below) (gamma-irradiated at 25,000 RADS),CryjI, purified naturalCryjI orrAmbaI.1 or PHA (in 200 μl complete medium) was restimulated in duplicate or triplicate in 96-well round bottom plates for 2-4 days. The optimal incubation was found to be 3 days. Each well then received 1 μCi of tritylated thymidine for 16-20 hours. The incorporated counts were collected on a glass filter mat and processed with a liquid scintillation counter. Collected data (not shown)CryjI, refined naturalCryjI and recombinationAmbaAssays with I.1 and several antigenic peptides synthesized as described above showed the effect of various antigen doses. Some peptides were found to be inhibitors at high concentrations in these assays. This titer was used to optimize peptide dosage in the T cell assay. The maximum response at the titer of each peptide is expressed as the stimulation index (S.I.). This S.I. is the count per minute (CPM) taken up by the cells in response to the peptide, and was divided by the CPM taken up only by the cells in the medium. A SI value of more than twice background level is “positive” and the peptide is considered to contain a T cell epitope. Positive results were used to calculate the average stimulation index for each peptide for the group of patients tested. Results (data not shown) show that patient # 999 recombinedCryjI and purified naturalCryjReacts well with I and peptides CJ1-2, 3, 20, and 22, but recombinationAmb aI.1 showed no response. this isCryjI T cell epitopes are recognized by T cells from this particular allergic patient and rCryjI and Peptide 3 (SEQ ID NO: 49), 20 (SEQ ID NO: 50), and 22 (SEQ ID NO: 51) are shown to contain T cell epitopes. Furthermore, this epitope is often not detected in adjacent overlapping peptides and therefore probably extends to non-overlapping central residues of reactive peptides. To T cells primed with control antigen, or other antigensCryjIn T cell assays using I primed T cells, no significant cross-reaction was found.
The above method was also performed on a number of other patients. If the patientCryjReacts with a S.I. of 2.0 or higher against I protein, and the patientCryIndividual patient results were used to calculate the mean S.I. for each peptide if it reacted with at least one peptide derived from jI with a S.I. of 2.0 or greater. A summary of the positive experiments from 25 patients is shown in FIG. The bar represents the positive index. Above each bar is the percentage of positive responses with S.I. of at least two peptides or proteins for the group of patients tested. The parenthesis above each bar is the average stimulation index for each peptide or protein for the group of patients tested. 25 T cell lines purified by natureCryResponds to jI and 68.0% of T cell lines are rCryReacted to jI. These 25 T cell lines are rAmba Reacts to I.1,Amba I allergenCryshares homology with jI, and this “shared” T cell epitopeCryjIAmba It may be present between I and I. This panel of cedar allergic patients consists of peptides CJI-1 (SEQ ID NO: 1), CJI-2 (SEQ ID NO: 2), CJI-3 (SEQ ID NO: 3), CJI-4 (SEQ ID NO: 4), CJI-7 (SEQ ID NO: 4). No. 7), CJI-8 (SEQ ID NO: 8), CJI-9 (SEQ ID NO: 9), CJI-10 (SEQ ID NO: 10), CJI-11 (SEQ ID NO: 11), CJI-12 (SEQ ID NO: 12), CJI -14 (SEQ ID NO: 14), CJI-15 (SEQ ID NO: 15), CJI-16 (SEQ ID NO: 16), CJI-17 (SEQ ID NO: 17), CJI-18 (SEQ ID NO: 18), CJI-19 (SEQ ID NO: 19), CJI-20 (SEQ ID NO: 20), CJI-21 (SEQ ID NO: 21), CJI-22 (SEQ ID NO: 22), CJI-23 (SEQ ID NO: 23), CJI-24 (SEQ ID NO: 24), CJI- 25 (sequence number 25), CJI-26 (SEQ ID NO: 26), CJI-27 (SEQ ID NO: 27), CJI-28 (SEQ ID NO: 28), CJI-30 (SEQ ID NO: 30), CJI-31 (SEQ ID NO: 31), CJI- 32 (SEQ ID NO: 32), CJI-33 (SEQ ID NO: 33), CJI-34 (SEQ ID NO: 34) and CJI-35 (SEQ ID NO: 35), indicating that these peptides contain T cell epitopes Yes.
Preparation of (EBV) -transformed B cells for use as antigen presenting cells
Autologous EBV-transformed cell lines were γ-irradiated at 25,000 Rad and used as antigen presenting cells for the second proliferation assay and second bulk stimulation. These EBV-transformed cell lines are 5 × 10⁶PBL with 1 ml B-59 / 8 Marmoset cell line (ATCC CRL 1612, American Type Culture Collection, Rockville, Md.) And 1 μl / ml phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) Incubate in 12 x 75mm polypropylene round bottom Falcon snap cap tubes (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) in conditioned medium for 60 minutes at 37 ° C Created by. These cells are then 1.25 x 10⁶Dilute cells / ml in RPMI-1640 (except for 10% heat-inactivated fetal bovine serum, as above) and 200 μl aliquots until a visible colony is detected in a flat bottom culture plate Cultured. These were then transferred to larger wells to establish cell lines.
Example 2
Determination of percent of total T cell reactivity and patient coverage of unique peptide combinations of the invention
Synthesis of unique peptides of the present invention
Peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) were synthesized using standard Fmoc synthetic chemistry. Peptide CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) was synthesized by t-Boc synthetic chemistry. All peptides were purified to> 93% purity using the method for producing highly purified peptides as previously described. Figure 3 shows the uniqueness used in this experiment.CryjI peptide is shown. Peptide names are consistent throughout the experiment.
T cell reactivity of the unique peptides of the present invention
Peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) were tested for T cell reactivity as described in Example 1 (data not shown). , And measure the expression of T cell activity as the respective “parent” peptides from which these peptides are derived, and thus when combined,CryjA sufficient proportion for the group sensitive to ICryjSuitable as a candidate peptide for further experiments to determine if it has a proportion of total T cell reactivity to I.
T cell experiments using overlapping peptides and peptide candidates
CryjThe second T cell culture that was determined to be responsive to the I protein allergen was 36 people.CryjReactivity of overlapping peptide sets (FIG. 2) and candidate peptides of the invention (FIG. 3) was analyzed in an in vitro T cell proliferation assay obtained from I-allergic patients and as described in Example 1. The results are shown in FIG. The highest stimulation index of 2.0 or higher for each peptide was recorded for each patient tested. This data was then analyzed by the formula already described in the specification.
Candidate peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) range from about 36-53% T cell reactivity based on analysis of 36 patients. (FIG. 5), a response frequency of 97% represents reactivity to at least one candidate peptide, and this peptide combination meets the first criteria for a “unique” peptide of the present invention, and the peptide CJI-24.5 ( SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) are a substantial proportion of the tested groups,CryIt shows that it comprises a substantial proportion of total T cell reactivity of jI.
Example 3
IgE binding experiments
To analyze the IgE reactivity against candidate peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and shown in FIG. 3, a direct ELISA format was used. used. ELISA wells were coated with candidate peptides and assayed for IgE binding. The result of the join is two differentCryjI made using a pool of allergic patient plasma. Patient plasma pool A (denoted PHP-A) is naturally purifiedCryjFormulated by mixing equal volumes of plasma from all 22 patients that were shown to be positive for IgE binding to I by ELISA. The second pool (PHP-D) is purified natural and denaturedCryjFormulated by mixing equal volumes of plasma from 8 patients shown by direct ELISA to have IgE binding to I. This pool was created to increase the chance of detecting reactivity to peptides. In this assay set, both pools are naturally purified.CryjDirect binding to I was shown (data not shown). There was no detectable IgE binding reactivity against any peptide tested at any plasma concentration used. In order to control the presence of the peptide covering the well, a mouse polyclonal antiserum was generated against the peptide. These antisera were then used for direct ELISA binding to show that the peptides covered the wells. The results of these assays (data not shown) indicated that the peptides covered the wells.
Example 4
Simultaneous measurement of pH-solubility and pH stability profiles of candidate peptides of the present invention
1.Buffer preparation
50 mM sodium phosphate stock solution:
Stock solution A: 0.66 g (0.05 mol) of monobasic sodium phosphate monohydrate was dissolved in 100 ml of WFI. The solution was filtered through a 0.2 micron filter.
Stock solution B: 0.71 g (0.05 mol) of dibasic sodium phosphate was dissolved in 100 ml of WFI. The solution was filtered through a 0.2 micron filter.
2.First peptide dispersion
Dispersion A: 3.0 mg of each peptide CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) were weighed separately and placed in separate 1.5 ml Eppendorf vials. Placed with 600 μL of Stock Solution A. The composition was stirred for 5 seconds and mixed well.
Dispersion B: 3.0 mg of each peptide CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) were weighed separately and placed in separate 1.5 ml Eppendorf vials. Placed with 600 μL of stock solution B. The composition was stirred for 5 seconds and mixed well.
Dispersions A and B were sonicated for 2 minutes for good homogeneity. Each dispersion was pipetted into an Eppendorf vial displaying a small volume according to the following volume ratio:

The resulting solution / suspension was stored in the dark at 22 ° C. for 24 hours without stirring. Eleven microcentrifuge filters were displayed on the retentate cup. The weight of each cup with a cap excluding the filter reservoir was measured. The equilibrated solution / suspension was pipetted from each Eppendorf vial into a filter reservoir and placed in a microcentrifuge and spun for 10 minutes. After centrifugation, the filter reservoir was discarded and the weight of each cup / cap was recorded with the collected filtrate. The net filtrate weight in each cup was calculated by subtracting the empty cup / cap weight from the weight of each cup / cap containing the filtrate. The pH of the filtrate in each cup was measured using a micro combination pH electrode. After reading each pH, the electrode tips were rinsed into each cup with 1.0 mL of the selected dilution buffer. The total diluted solution in each cup / cap was recorded. The dilution factor was calculated by dividing the weight of the diluted solution by the filtrate weight.
The concentration of the peptide in the diluted solution was determined by HPLC analysis. The solubility of the peptide at each pH was obtained by multiplying the measured concentration by a dilution factor. The degree of peptide degradation was calculated from the ratio of the total degradation peak area over the total peak area.
The pH value was plotted against the solubility value and is shown for each peptide in FIGS. 6a-c. As shown in FIGS. 6a-c, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) are pH 6-pH8 when showing dissolution curves for each peptide, respectively. Has a solubility greater than 5 mg / ml at a pH in the pH range.
A pH stability profile was calculated for each peptide, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), and a table was generated as a function of total degradation area ( Data not shown). None of the peptides showed significant degradation after 24 hours.
Thus, each peptide, CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) and CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), has the appropriate solubility and stability required for the unique peptides of the present invention. Determined to have
Although the present invention has been described in terms of its preferred embodiments, other embodiments can achieve the same results. Variations and modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art and are intended to follow the true spirit and scope of the invention.
Sequence listing
(1)-General information:
(I) Applicant: Imlogic Pharmaceutical Corporation
(Ii) Title of invention: Pharmaceutical composition for treating cedar pollen allergy
(Iii) Number of sequences: 51
(Iv) Address:
(A) Destination: Imlogic Pharmaceutical Corporation
(B) Street: Lincoln Street 610
(C) City: Walsum
(D) State: Massachusetts
(E) Country: United States
(F) Zip code: 02154
(V) Computer reading destination:
(A) Medium: floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible type
(C) Operation system: PC-DOS / MS-DOS
(D) Software: Patent in release # 1.0,
Version # 1.25
(Vi) Application data:
(A) Application number:
(B) Application date:
(C) Classification:
(Vii) Prior application data:
(A) Application number: US Patent No. 08 / 226,248
(B) Application date: April 8, 1994
(A) Application number: US Patent No. 08 / 350,225
(B) Application date: December 6, 1994
(Viii) Patent Attorney / Agent Information:
(A) Name: Dallane A. Banstone
(B) Registration number: 35,729
(C) Reference / Process number: 025.7PCT (IMI-028CPC)
(Ix) Communication information:
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(B) Fax: (617) 466-6040
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Claims (7)

An isolated CryjI peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38). Japanese cedar comprising at least one isolated CryjI peptide selected from the group consisting of CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) as an active ingredient Osamu 療製 agents for treating sensitivity to pollen allergens. A cedar containing two or more isolated CryjI peptides selected from the group consisting of CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) as an active ingredient A pharmaceutical formulation for treating sensitivity to pollen allergens. CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), each peptide has T cell activity, each peptide is soluble and stable at a pH of 6.0-8.0, CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38) multi-peptide composition for at least two CryjI peptide selected from the group of treating sensitivity to cedar pollen allergen comprising Nde contains consisting. 5. The multi-peptide composition of claim 4 , comprising the peptides CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36), CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38). CryjI peptides CJI-24.5 (SEQ ID NO: 37), CJI-43.39 (SEQ ID NO: 36) and CJI-44.8 (SEQ ID NO: 38), each peptide containing 0.75 mg per vial, and sterile for injection To treat susceptibility to cedar pollen allergens , comprising sodium phosphate and mannitol, providing 0.05M sodium phosphate (pH 6.0-8.0) and a 5% weight / volume mannitol solution when reconstituted with water An optimized multipeptide composition. A freeze-dried powder state, a multi-peptide compositions optimized according to claim 6, wherein.

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