JP3939401B2

JP3939401B2 - Peptides and their uses

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Publication number: JP3939401B2
Application number: JP25175897A
Authority: JP
Inventors: 三郎斉藤; 淳子川口; 一樹平原; 明郎白石; 伸記芹澤; 雅司栗本; 克彦日野
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Sankyo Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Sankyo Co Ltd
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: JPH1192497A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、スギ花粉アレルゲンに特異的に反応するＴ細胞を不活性化するペプチド、及び、そのペプチドを有効成分として含んでなる免疫療法剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ここ数十年来、我国においては、春先になるとスギ花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が増加し続けている。スギ花粉症はアルレギー症の一種であり、その主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花粉症アレルゲンであるといわれている。大気中に飛散したスギ花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲンに対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状態で次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のアレルゲンとこのイムノグロブリンＥ抗体が免疫反応を起し、アレルギー症状を呈することとなる。
【０００３】
スギ花粉中に抗原性の相違する少なくとも二種類のアレルゲンの存在することが現在までに知られている。
その一つは、ヤスエダ等が『ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ１」と呼称されている。なお、Ｃｒｙｊ１はその全長アミノ酸配列が決定され、国際出願されている（ＷＯ９３／０１２１３）。
【０００４】
もう一つは、タニアイ等『エフ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチ等『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ２」と呼称されている。なお、Ｃｒｙｊ２はその全長アミノ酸配列が決定され、国際出願されている（ＷＯ９４／１１５１２）。また、 Komiyama らも別個にＣｒｙｊ２の全長アミノ酸配列を決定しているが（ Biochem. Biophys. Res, Comm., vol.201, No.2, 1021-1028, (1994))、ＷＯ９４／１１５１２記載のアミノ酸配列とはアミノ酸残基が４か所異なっている。
【０００５】
スギ花粉中には、通常、Ｃｒｙｊ１とＣｒｙｊ２が約５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採取した血清の殆どがＣｒｙｊ１にもＣｒｙｊ２にも反応すると云われている。澤谷らは、『アレルギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９９３年）において、Ｃｒｙｊ２は、皮内反応試験やＲＡＳＴ試験において、Ｃｒｙｊ１と同程度の抗原性を発揮すると報告している。
【０００６】
このように、スギ花粉アレルゲンが既に幾つか単離され、その性質、性状もある程度解明されたことから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減感作することにより、スギ花粉症を治療・予防できる見通しがついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか考案されており、例えば、特開平１−１５６９２６号公報や特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端からのアミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ又はＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎで表わされるスギ花粉アレルゲンに糖質を共有結合せしめ、生成した複合体を減感作剤としてヒトに投与する提案が為されている。
【０００７】
しかしながら、アレルギー症の診断や減感作療法には、通常、高純度のアレルゲンが大量に必要とされ、スギ花粉中のアレルゲンは僅少であるうえに安定性が低く、スギ花粉症の診断剤や減感作剤をスギ花粉だけで賄おうとすると、多大の困難が伴なう。
このようなことから、最近のアレルギー疾患の治療・予防においては、これまでのように、患者にアレルゲン全体を投与するのではなく、アレルゲン中のＴ細胞が特異的に認識する最小領域、すなわち、本質的にＴ細胞エピトープのみからなる低分子のペプチドを投与する免疫療法が注目されている。
【０００８】
一般に、アレルゲンは、マクロファージなどの抗原提示細胞に取込まれると、そこで消化され、消化断片が免疫提示細胞表層のＨＬＡ（Human Leucocyte Antigen ）蛋白質に結合し、抗原提示されることとなる。抗原提示される断片は、ＨＬＡ蛋白質に対する親和性などにより、アレルゲンにおける一部の特定領域に限られ、斯かる領域のうち、Ｔ細胞が特異的に認識する領域は、通常、「Ｔ細胞エピトープ」と呼称される。実質的にＴ細胞エプトープのみからなるペプチドを投与する免疫療法には、
(i) ペプチドがＢ細胞エピトープを欠いている、すなわち、アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体が反応しないので、従来の粗製又は精製アレルゲンで頻発していたアナフィラキシーなどの副作用が起こり得ない。
(ii) 少量からスタートし、有効投与量に達するまでの期間が、従来の減感作剤に比較して、大幅に短縮できる。
(iii) 経口免疫寛容を誘導し、アレルゲンに対するアレルギー反応を減弱することができる。
などの利点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記Ｔ細胞エピトープを構成する最小単位のアミノ酸配列を見出し、本発明を完成した。
この発明の第一の課題は、本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープのみからなるペプチドを提供することにある。
この発明の第二の課題は、有効成分として上記ペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（３）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド、
（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（５）配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチド、
（６）配列番号３のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（７）配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチド、
（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（９）配列番号５のアミノ酸配列から成るペプチド、
（１０）配列番号５のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（１１）配列番号６のアミノ酸配列から成るペプチド、
（１２）配列番号６のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（１３）配列番号７のアミノ酸配列から成るペプチド、
（１４）配列番号７のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（１５）配列番号８のアミノ酸配列から成るペプチド、
（１６）配列番号８のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（１７）配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチド、
（１８）配列番号９のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（１９）配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチド、
（２０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（２１）配列番号１１のアミノ酸配列から成るペプチド、
（２２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド、
（２３）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２４）配列番号１のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２５）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２６）配列番号２のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２７）配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２８）配列番号３のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（２９）配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３０）配列番号４のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３１）配列番号５のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３２）配列番号５のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３３）配列番号６のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３４）配列番号６のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３５）配列番号７のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３６）配列番号７のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３７）配列番号８のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３８）配列番号８のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（３９）配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（４０）配列番号９のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（４１）配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（４２）配列番号１０のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（４３）配列番号１１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
（４４）配列番号１１のアミノ酸配列を含むことから成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤、
に関する。
【００１１】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明における好ましいペプチドの例は表１の通りである。
【００１２】
【表１】

【００１３】
なお、上記のペプチド１は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド３は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド４は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド５は、配列表の配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド６は、配列表の配列番号６のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド７は、配列表の配列番号７のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド８は、配列表の配列番号８のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド９は、配列表の配列番号９のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１０は、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１１は、配列表の配列番号１１のアミノ酸配列で示されるペプチド、
をそれぞれ示す。
【００１４】
上記（１）乃至（１１）に記載のペプチドは、「固相法」又は「液相法」として知られる斯界において慣用のペプチド合成法により、容易に調製することができる。例えば、社団法人日本生化学会編『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されている。また、該ペプチドは、マルチペプチドシンセサイザー SYMPHONY （プロティンテクノロジー社製）を用い、Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) 固相合成法にて同装置のプロトコールに従って合成することができる。すなわち、合成する各ペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸が導入されている Fmoc-L-アミノ酸 Wang 樹脂を上記ペプチド合成装置の反応容器にセットし、デプロテクション溶液を用いて Fmoc を除く。さらにＣ末端から２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸溶液とアクチベーター溶液を反応せしめ、反応後再び Fmoc 基のデプロテクションを行い、同様の操作を繰り返すことにより、目的とするペプチドを合成することができる。
【００１５】
本発明のペプチドは化学合成により調製されたものに限定されず、例えば、スギの花粉又は雄花から採取するか、組換えＤＮＡ技術により調製したスギ花粉アレルゲンを適宜分解し、分解物から採取したものであってもよく、また、例えば、上記（１）乃至（１１）に記載されたペプチドをコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物からこの発明のペプチドを採取してもよい。
【００１６】
さらに、この発明のペプチドは、斯くして得られるペプチドに糖質やポリエチレングリコールを付加して得られる複合体としての形態、さらには、ペプチドをアセチル化、アミド化及び／又は多官能試験により架橋重合させて得られる誘導体又は重合体としての形態であってもよい。
【００１７】
この発明のペプチドは、比較的粗な形態で投与しても所期の治療・予防効果を発揮するが、通常は使用に先立って精製される。精製には、例えば、濾過、濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などのペプチド乃至蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮、凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。
本発明のペプチドがＴ細胞エピトープとしての活性を有することは、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞のトリチウム化チミジンの取込を計測することにより確認することができる。
【００１８】
すなわち、フィコール・ハイパック比重遠心法等により花粉症患者の末梢血単核細胞群を分離し、この細胞群をＲＰＭＩ１６４０等の培地に浮遊させ、９６穴マイクロプレート上に分注する。次に、被検物質であるペプチドを加え培養する。この培養の温度、時間等の条件は各実験毎に適宜調整することができるが、３７℃、３日間が好適である。その後トリチウム化チミジンを培地に加え、さらに一定時間培養を続け、単核細胞群におけるトリチウム化チミジンの取込み量を測定することにより、本発明のペプチドのＴ細胞エピトープとしての活性を算定することができる。なお、本発明では、同時にペプチドを含まない系を設けてこれを陰性対照とし、トリチウム化チミジンの取込み量が陰性対照の２倍以上に達した系を「陽性」、達しなかった系を「陰性」とした。
【００１９】
【作用】
本発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を不活性化することができる。
【００２０】
有効成分としてかかるペプチドを含んでなる本発明の抗スギ花粉症剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなくスギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。
有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症に罹患したヒトを含む哺乳類一般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することができる。一方、この発明の抗スギ花粉症例を、スギ花粉が飛散し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に著効を発揮する。
【００２１】
この発明の抗スギ花粉症剤につきさらに詳しく説明すると、この発明の抗スギ花粉症剤は、通常、この発明によるペプチドの１種又は２種以上を0.０１乃至１００％(w/w) 、望ましくは、0.０５乃至５０％(w/v) 、さらに望ましくは、0.５乃至5.０％(w/w) 含んでなる。この発明の抗スギ花粉症剤は、当該ペプチド単独の形態はもとより、その以外の生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、ぶどう糖、果糖、しょ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、りん酸緩衝液剤もしくはクエン酸緩衝液剤を主体とする担体、賦形剤、免疫助成剤および安定剤、さらには、必要に応じて、スギ花粉に特異的な公知のＴ細胞エピトープ、ステロイドホルモンやクリモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤及び免疫抑制剤を含む１種又は２種以上の他の薬剤との組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の抗スギ花粉症剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明のポリペプチドを、例えば、１日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）又はその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟こう剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【００２２】
この発明の抗スギ花粉症剤の使用方法について説明すると、この発明の抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症の治療・予防を目的に、ヒトを含む哺乳類一般に経皮、経口、点鼻、点眼又は注射投与される。ヒトにおける投与量は、投与の目的や症状に依っても変わるが、通常、対象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１日当たり本発明のポリペプチドの量にして0.０１乃至1.０g 、望ましくは、0.０１乃至0.１g を目安に、毎週１回乃至毎月１回の頻度で、約１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら反復投与される。
【００２３】
本発明のポリペプチドの急性毒性
常法により、生後２０日のマウスに後述の製剤例１乃至４の方法により得た免疫治療剤を経口又は腹腔内投与した。その結果、これら抗スギ花粉症剤は、いずれの投与経路によっても２００mg/kg 以上のLD₅₀であることが判明した。このことは、この発明のペプチドが、ヒトを含むほ乳類に対する抗スギ花粉症剤に安全に配合使用し得ることを示している。
【００２４】
試験例１
スギ花粉症患者由来のＴ細胞を用い、本発明のペプチド１ないし１１がスギ花粉症抗原Ｔ細胞エピトープ活性を有することを以下に記載する方法により確認した。
抗スギ花粉アレルゲンIgE反応に陽性を示す患者から４０ｍｌの末梢血を採取した。遠心分離後、バフィーコートを得て、さらにフィコール・ハイパック比重遠心法により、末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells; ＰＢＭＣ）を採取した。このＰＢＭＣを培地（５％のヒトＡＢ型血清を含むＲＰＭＩ）に懸濁した。
【００２５】
９６穴の平底プレートに１ウェルあたり５×１０⁵個の細胞を分注し、各ウェル２００ｎｇのペプチド１ないし１１を含む２００μｌの培地中で３７℃、５％炭酸ガス下で７２時間培養した。また別に、ペプチドを含まない培養群を設けてこれを陰性対照とした。その後、０．５μＣｉのトリチウム化チミジンを加え、さらに１６時間培養した。セルハーベスターを用いて各ウェルの細胞をガラス繊維フィルター上に集め、それぞれ液体シンチレーションカウンターで細胞に取込まれたトリチウム化チミジン量を測定した。取込みチミジン量が陰性対照群の取込み量の２倍以上であった群をＴ細胞エピトープ活性「陽性」とし、達しなかった系を「陰性」とした。
この結果を以下の表２に示す。
【００２６】
【表２】

【００２７】
以上の結果より、これらのペプチドは、Ｃｒｙｊ１アレルゲンのＴ細胞エピトープを含有していることが示された。配列表における配列番号１乃至１１に示すアミノ酸配列を有するＴ細胞エピトープは未だ知られておらず、新規Ｔ細胞エピトープと判断される。
以上のように、本発明のペプチドは、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を不活性化することができる。
【００２８】
有効成分として斯かるペプチドを含んでなる本発明の抗スギ花粉症剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなくスギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。
有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症に罹患したヒトを含む哺乳類一般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することができる。一方、この発明の抗スギ花粉症剤を、スギ花粉が飛散し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に著効を発揮する。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例、製剤例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによりその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕ペプチド１の合成
樹脂に固定したアミノ酸誘導体に、１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）でペプチドを化学合成した。各サイクルで使用するアミノ酸はアミノ基および残基部分の反応基が保護基でブロックされた特殊なアミノ酸誘導体を用いた。ここで、それぞれのアミノ基がFmoc (9-フルオレニル・メチロキシカルボニル）によりブロックされているアミノ酸を用いた（Fmoc法)。またペプチド合成は樹脂に結合したアミノ酸のアミノ基のFmocを脱保護し、次にカルボキシル基が活性化したアミノ酸誘導体を結合させるという反応を順次繰り返して行なった。
【００３０】
ペプチド１のぺプチドは、マルチペプチドシンセサイザー（シンフォニー；プロテインテクノロジー社製）を用い、上記のFmoc固相合成法にて同装置のプロトコールに従って合成した。
すなわち、合成するペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Gly)が導入されているFmoc-Gly-Wang樹脂（０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）の２５μｍｏｌ相当を上記ペプチド合成装置の反応容器にセットし、デプロテクション溶液（２０％ピぺリジン／ジメチルホルムアミド）１．２５ｍｌを５分間２回反応させ、樹脂に結合しているアミノ酸のFmoc基を除いた。樹脂をジメチルホルムアミド液１．２５ｍｌで３０秒間６回洗浄し、Ｃ末端側から２番目のアミノ酸に相当する１００ｍＭのFmoc-Pheジメチルホルムアミド溶液１．２５ｍｌに、１００ｍＭのアクチベーター溶液（１００ｍＭ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−）−１、１、３、３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート／４００ｍＭＮ−メチルモルフォリン／ジメチルホルムアミド）１．２５ｍｌを加え（結合アミノ酸に対して５倍等量）、２０分間室温で反応させた。ここで生成した Fmoc- Phe-Gly-Wang 樹脂をジメチルホルムアミド１．２５ｍｌで３０秒間６回洗浄後、再びFmoc基のデプロテクションを行い、ジメチルホルムアミド１．２５ｍｌで３０秒間６回洗浄後、Fmoc-Gln(Trt) 溶液とアクチベーター溶液を加え反応させた。
【００３１】
同様の操作を繰り返すことにより保護ペプチド樹脂(Fmoc- Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly -Wang樹脂 )を合成した。
本実施例以下のペプチド合成に使用したアミノ酸は以下の通りである：
Fmoc-Asp(OtBu) Fmoc-Asn(Trt) Fmoc-Ala Fmoc-Glu(OtBu)
Fmoc-Gln(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-His(Trt) Fmoc-Ile Fmoc-Leu
Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Met Fmoc-Phe Fmoc-Pro Fmoc-Ser(tBu)
Fmoc-Thr(tBu) Fmoc-Trp(Boc) Fmoc-Tyr(tBu) Fmoc-Val
（（）内は残基部分の反応基を保護する保護基を表わす。；（株）パーキンエルマージャパンアプライドバイオシステムズ事業部製）
【００３２】
まず、上記のように合成し得られた保護ぺプチド樹脂 (Fmoc- Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly -Wang樹脂 )にデプロテクション溶液 1.25ｍｌを5分間2回反応させてＮ末端 Fmoc基を脱保護した。
次に1.25mlのＤＭＦにて６回洗浄後、ジクロロメタンにて９回洗浄し、さらに窒素ガスを吹き付けることにより２０分間乾燥させた。
【００３３】
樹脂を取り出し、クリベージ溶液（トリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」という）：フェノール：水：チオアニソール：エタンジチオール＝82.5：5：5：5：2.5）を４ｍｌ加え、室温で２時間反応させることにより樹脂からのペプチドの切断およびアミノ酸側鎖保護基の除去を行い、ペプチド溶液を得た。［King,D.S.(1990)Int.J.peptide Protein Reg. 36,255]。このぺプチド溶液をフィルターを用いて濾過し、濾液を遠心管に回収した。これに、１０ｍｌの冷エーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。しばらく冷却後、これを遠心して（３０００ｒｐｍ，１０分間）沈殿物を集め、再び冷エーテルを加えて分散させては回収する操作を４回繰り返してペプチドを洗浄した。得られたペプチドを乾燥させ、粗ペプチドを得た。以下、上記の操作を「クリベージ反応」という。
【００３４】
得られた粗ペプチドのうち１１．７ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む３０％アセトニトリル水溶液に溶解後、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という）に供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２５−２８％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，１５分
流速：５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１２〜１４分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド４．９ｍｇを得た。
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００３５】
［実施例２］ペプチド２の合成
C末端がProであるペプチドの合成にはFmoc-Pro-2-Chlorotrityl樹脂を用い実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc- Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-2-Chlorotrityl樹脂 )を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドのうち１０ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００３６】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔ，７．８ｍｍｘ３００ｍｍ；東ソー（株）社製）
移動相：３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，３０分
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２３０ｎｍ
２１〜２２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド１．３ｍｇを得た。
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００３７】
［実施例３］ペプチド３の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Trp(Boc)-Thr(tBu)-Ile Wang 樹脂 )を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドのうち８．９ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００３８】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２０−３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１７〜２０分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド５．０ｍｇを得た。
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００３９】
［実施例４］ペプチド４の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Trp(Boc)- Wang 樹脂 )を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドのうち９ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００４０】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２０−３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１３〜１６分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド６．４ｍｇを得た。
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００４１】
［実施例５］ペプチド５の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Trp(Boc)-Thr(tBu) Wang 樹脂 )を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
【００４２】
得られた粗ペプチドのうち８ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００４３】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２０−３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
８〜１１分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド４．１ｍｇを得た。
【００４４】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００４５】
［実施例６］ペプチド６の合成
C末端がProであるペプチドの合成にはFmoc-Pro-2-Chlorotrityl樹脂を用い、実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-2-Chlorotrityl樹脂 )を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
【００４６】
得られた粗ペプチドのうち５．５ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００４７】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２１−２６％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，１５分
流速：５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
９〜１０．５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド２．８ｍｇを得た。
【００４８】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００４９】
［実施例７］ペプチド７の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc- Ser(tBu)- Ser(tBu)
-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val−Wang樹脂）を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドのうち１１ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む１５％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００５０】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：１５−２５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１０〜１２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド５．９ｍｇを得た。
【００５１】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００５２】
［実施例８］ペプチド８の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc- Ser(tBu) -Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)−Wang樹脂）を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
【００５３】
得られた粗ペプチドのうち１１ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む１５％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００５４】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：１５−２２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１０〜１２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド６．４ｍｇを得た。
【００５５】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００５６】
［実施例９］ペプチド９の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc- Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val −Wang樹脂）を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
【００５７】
得られた粗ペプチドのうち１１ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む１５％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００５８】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：１５−２０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，２０分
流速：８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
１６〜１８分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド４．８ｍｇを得た。
【００５９】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６０】
［実施例１０］ペプチド１０の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)−Wang樹脂）を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。
【００６１】
得られた粗ペプチドのうち５．４ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００６２】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２０−３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，１５分
流速：５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２３０ｎｍ
９〜１０分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド３．６ｍｇを得た。
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６３】
［実施例１１］ペプチド１１の合成
実施例１と同様の操作により、保護ペプチド樹脂 (Fmoc- Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val−Wang樹脂）を合成しクリベージ反応を行なって、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドのうち５ｍｇを０．１％のＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００６４】
カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫガードカラムＯＤＳ，２１．５ｍｍｘ７５ｍｍ；東ソー（株）社製）移動相：２０−３５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ，１５分
流速：５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２３０ｎｍ
９．５〜１０．５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチド３．５ｍｇを得た。
【００６５】
この合成したペプチド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列装置（ＰＰＳＱ−１０型；島津製作所（株）社製）を用いてアミノ酸配列分析を行なったところ、配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６６】
製剤例１．
液剤
実施例１乃至１１記載の方法により得た１１種類のペプチドのいずれかを最終濃度0.１g/mlになるように安定剤として１％(w/v) 精製ゼラチンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して１１種類の液剤を得た。
本発明のペプチドに対する感受性は個体毎に変わるのが通例であるから、本品は個々の個体に最も適した組成になるよう、１１種類の液剤を適宜配合して使用する。本品は安定性に優れているので、スギ花粉症を治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用である。
【００６７】
製剤例２．
注射剤
安定剤として１％(w/v) ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例１乃至１１記載の方法により得た２４種類のペプチドをそれぞれ最終濃度0.01、0.１又は１mg/ml になるように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２mlずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。
本品は投与に先立ち、まず、バイアル瓶内に注射用蒸留水等を１ml加え、次いで、内容物を均一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として本発明による１１種類のポリペプチドを含んでなる本品は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００６８】
製剤例３．
錠剤
平均分子量約20,000ダルトンの精製プルラン２g を蒸留水１００mlに均一に溶解し、溶液に塩化シアヌルの1.７％(w/v) アセトン溶液を２ml加え、５％(w/v) 炭酸ナトリウム水溶液でpHを７付近に保ちつつ、攪拌下、５℃で２時間反応させた。その後、同様にして反応物のpHを７付近に保ちながら、４℃の冷水に対して一晩透析し、活性化プルランを含む水溶液２０mlを得た。
実施例１乃至１１記載の方法により得たペプチドをそれぞれ0.２mg加え、溶液のpHを７付近に保ちつつ、穏やかに攪拌しながら、３７℃で１２時間反応させた。反応後、反応物にグリシンを４g を加え、穏やかに攪拌しながら、３７℃で５時間インキュベートし、未反応の活性基をブロックした。
【００６９】
反応物を濃縮し、あらかじめ0.１M リン酸緩衝液（pH 7.0) で平衡化させておいたセファデックス G-50 カラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液して、この発明のペプチドとプルランの複合体を含む画分を採取した。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。
常法に従って、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕後、マンニトールを均一に混合し、混合物を打錠して製品１錠（200mg）当たり複合体を２、１０又は５０mg含む錠剤を得た。
摂取性、安定性に優れた本品は、スギ花粉症を治療・予防するための舌下剤として有用である。
【００７０】
製剤例４．
シロップ剤
大腸菌由来の精製リポ多糖１g を１０mMリン酸カルシウム溶液１００mlに溶解し、溶液に１００mM過ヨウ素酸ナトリウムを６ml加え、室温下で２０分間反応させてリポ多糖を活性化した。反応物を４℃の１M グリシン−塩酸緩衝液（pH 4.4) に対して一晩透析して未反応の過ヨウ素酸を除去した後、0.１M 炭酸水素ナトリウム緩衝液によりpH 9.5付近に調整する一方、別途、実施例１乃至１１記載の方法により得た１１種類のペプチドを0.１M リン酸緩衝液（pH 7.0) １００mlにそれぞれ１０mgずつ溶解し、活性化リポ多糖を含む上記反応物に加え、室温下で１２時間静置して反応させた。
その後、新たに得られた反応物を製剤例３の方法により精製し、得られた本発明のペプチドとリポ多糖の複合体を含む画分を濃縮し、凍結乾燥し、粉砕して固状物とした。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。
【００７１】
この固形物を蔗糖をそれぞれ最終濃度が0.１若しくは１mg/ml 又は５０％(w/w) になるように安定剤として精製ゼラチンを１％(w/w) 含む蒸留水に溶解し、溶液を常法により滅菌濾過してシロップ状物を得た。このシロップ状物を２mlずつ滅菌バイアル瓶に分注し、密栓して製品とした。
安定性に優れ、有効成分としてこの発明のペプチドとリポ多糖の複合体を含む本品は、スギ花粉症を治療・予防するためのシロップ剤として有用である。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、本質的にスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞エピトープのみからなる新規ペプチド群、さらにはそれらのポリペプチドを有効成分として含んでなる抗スギ花粉症剤を提供することができた。そして、本発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を不活性化することができる。
【００７３】
【配列表】

【００７４】

【００７５】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide that inactivates a T cell that specifically reacts with a cedar pollen allergen, and an immunotherapeutic agent comprising the peptide as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
In recent decades, in Japan, the number of people complaining of rhinitis and conjunctivitis due to cedar pollinosis continues to increase in early spring. Cedar pollinosis is a type of arlegiosis, and the main cause is said to be an antigenic substance in cedar pollen, that is, cedar pollinosis allergen. When cedar pollen scattered in the atmosphere enters the human body, immunoglobulin E antibodies against cedar pollen allergen are produced. Next, when cedar pollen invades in this state, the allergen in the pollen and the immunoglobulin E antibody cause an immune reaction, and allergic symptoms are exhibited.
[0003]
It has been known to date that at least two types of allergens having different antigenicity are present in cedar pollen.
One of them is the allergen reported by Yasuda et al. In “Journal of Allergy and Clinical Immunology”, Vol. 71, No. 1, pp. 77-86 (1983). This is called “Cryj1”. The full-length amino acid sequence of Cryj1 has been determined and has been internationally filed (WO 93/01213).
[0004]
The other is Taniyai et al. “EF SB Letters”, Vol. 239, No. 2, pp. 329-332 (1988) and Sakaguchi et al., “Allergy”, No. 45, No. 309- It is an allergen reported on page 312 (1990) and today it is called “Cry j 2”. The full-length amino acid sequence of Cry j 2 has been determined and has been internationally filed (WO 94/11512). Komiyama et al. Also separately determined the full-length amino acid sequence of Cryj2 (Biochem. Biophys. Res, Comm., Vol. 201, No. 2, 1021-1028, (1994)), described in WO 94/11512. The amino acid sequence differs from that in 4 amino acid residues.
[0005]
In cedar pollen, Cryj1 and Cryj2 are usually present in a ratio of about 50: 1 to 5: 1, and it is said that most of the serum collected from hay fever responds to both Cryj1 and Cryj2. Sawatani et al., Allergy, Vol. 42, No. 6, pp. 738-747 (1993), reported that Cryj2 exhibits the same level of antigenicity as Cryj1 in intradermal reaction tests and RAST tests. is doing.
[0006]
In this way, several cedar pollen allergens have already been isolated, and their properties and properties have been elucidated to some extent, so that purified cedar pollen allergen is administered to humans to desensitize it, thereby treating cedar pollinosis. The prospects that can be prevented have come. Recently, several desensitizers have been devised for this purpose. For example, JP-A-1-156926 and JP-A-3-93730 disclose that the amino acid sequence from the N-terminus is Asp-Asn-Pro-Ile. -A sugar-covalent allergen represented by Asp-Ser or Ala-Ile-Asn-Ile-Phe-Asn is covalently bound, and the resulting complex is administered to humans as a desensitizer. .
[0007]
However, diagnosis and desensitization of allergies usually require large amounts of high-purity allergens, and allergens in cedar pollen are scarce and have low stability. It is very difficult to cover the desensitizer with cedar pollen alone.
For this reason, in the recent treatment and prevention of allergic diseases, instead of administering the whole allergen to the patient as in the past, the minimum region that T cells in the allergen specifically recognize, that is, Attention has been focused on immunotherapy in which a small peptide consisting essentially of a T cell epitope is administered.
[0008]
In general, when allergens are taken into antigen-presenting cells such as macrophages, they are digested there, and the digested fragments bind to HLA (Human Leucocyte Antigen) protein on the surface of immune-presenting cells and presented as antigens. The antigen-presented fragment is limited to a specific region of the allergen due to its affinity for the HLA protein. Among these regions, the region specifically recognized by T cells is usually a “T cell epitope”. It is called. For immunotherapy in which a peptide consisting essentially of only a T cell eptop is administered,
(i) Since the peptide lacks the B cell epitope, that is, the immunoglobulin E antibody specific to the allergen does not react, side effects such as anaphylaxis that frequently occur with conventional crude or purified allergens cannot occur.
(ii) The period from starting with a small amount to reaching an effective dose can be significantly shortened compared to conventional desensitizers.
(iii) It can induce oral tolerance and attenuate allergic reactions to allergens.
There are advantages such as.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have found the amino acid sequence of the minimum unit constituting the T cell epitope and completed the present invention.
The first object of the present invention is to provide a peptide consisting essentially of a T cell epitope of a cedar pollen allergen.
The second object of the present invention is to provide an anti-cedar pollinosis agent comprising the above peptide as an active ingredient.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(2) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(3) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(4) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(5) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(6) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(7) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(8) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(9) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
(10) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
(11) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
(12) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
(13) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
(14) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
(15) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
(16) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
(17) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
(18) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
(19) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10,
(20) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10,
(21) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11,
(22) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11,
(23) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient,
(24) An anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient,
(25) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient,
(26) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient,
(27) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as an active ingredient,
(28) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as an active ingredient,
(29) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as an active ingredient,
(30) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as an active ingredient,
(31) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 as an active ingredient,
(32) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 as an active ingredient,
(33) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 as an active ingredient,
(34) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 as an active ingredient,
(35) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 as an active ingredient,
(36) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 as an active ingredient,
(37) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 as an active ingredient,
(38) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 as an active ingredient,
(39) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 as an active ingredient,
(40) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 as an active ingredient,
(41) An anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 as an active ingredient,
(42) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 as an active ingredient,
(43) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 as an active ingredient,
(44) an anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 as an active ingredient,
About.
[0011]
The present invention will be described in detail below.
Examples of preferred peptides in the present invention are shown in Table 1.
[0012]
[Table 1]

[0013]
The above peptide 1 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
Peptide 2 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
Peptide 3 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
Peptide 4 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
The peptide 5 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
The peptide 6 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
The peptide 7 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
Peptide 8 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
The peptide 9 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
The peptide 10 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
The peptide 11 is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing,
Respectively.
[0014]
The peptides described in the above (1) to (11) can be easily prepared by a peptide synthesis method commonly used in this field known as “solid phase method” or “liquid phase method”. For example, the details of peptide synthesis are described in the Japan Biochemical Society, “New Chemistry Laboratory”, Volume 1, “Protein VI”, pp. 3-44, 1992, published by Tokyo Kagaku Dojin. Further, the peptide can be synthesized according to the protocol of the same apparatus by Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) solid phase synthesis method using a multi-peptide synthesizer SYMPHONY (manufactured by Protein Technology). That is, Fmoc-L-amino acid Wang resin into which an amino acid corresponding to the C-terminus of each peptide to be synthesized has been introduced is set in the reaction vessel of the peptide synthesizer, and Fmoc is removed using a deprotection solution. Furthermore, the target peptide can be synthesized by reacting an amino acid solution corresponding to the second amino acid from the C-terminus with an activator solution, deprotecting the Fmoc group again after the reaction, and repeating the same operation. .
[0015]
The peptides of the present invention are not limited to those prepared by chemical synthesis, for example, those collected from cedar pollen or male flowers, or from cedar pollen allergens prepared by recombinant DNA technology, and collected from degradation products Alternatively, for example, a DNA encoding the peptide described in (1) to (11) above is prepared and inserted into a vector capable of autonomous replication to obtain a recombinant DNA. , Bacillus subtilis, actinomycetes, yeast or the like may be introduced into a suitable host to obtain a transformant, and the peptide of the present invention may be collected from the culture.
[0016]
Furthermore, the peptide of the present invention is in the form of a complex obtained by adding a carbohydrate or polyethylene glycol to the peptide thus obtained, and further, the peptide is crosslinked by acetylation, amidation and / or multifunctional test. It may be in the form of a derivative or polymer obtained by polymerization.
[0017]
The peptide of the present invention exerts the intended therapeutic / preventive effect even when administered in a relatively crude form, but is usually purified prior to use. For purification, for example, to purify peptides or proteins such as filtration, concentration, centrifugation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography, gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. Conventional methods in this field are used, and these methods may be appropriately combined as necessary. Then, the purified peptide may be concentrated and lyophilized to make it liquid or solid depending on the final use form.
The activity of the peptide of the present invention as a T cell epitope can be confirmed by measuring the uptake of tritiated thymidine in T cells specific for the cedar pollen allergen.
[0018]
That is, a peripheral blood mononuclear cell group of a hay fever patient is separated by Ficoll-Hipac specific gravity centrifugation or the like, and the cell group is suspended in a medium such as RPMI 1640 and dispensed onto a 96-well microplate. Next, a peptide as a test substance is added and cultured. Conditions such as the temperature and time of the culture can be appropriately adjusted for each experiment, but 37 ° C. and 3 days are preferable. Thereafter, tritiated thymidine is added to the medium, and the culture is further continued for a certain period of time. By measuring the amount of tritiated thymidine incorporated in the mononuclear cell group, the activity of the peptide of the present invention as a T cell epitope can be calculated. . In the present invention, a system not containing a peptide is provided at the same time as a negative control. A system in which the amount of tritiated thymidine taken up more than twice that of the negative control is “positive”, and a system that has not reached “negative” "
[0019]
[Action]
Since the peptide of the present invention does not substantially react with an immunoglobulin E antibody specific for a cedar pollen allergen, it is specific to a cedar pollen allergen without substantially causing anaphylaxis when administered to mammals including humans. T cells can be inactivated.
[0020]
The anti-cedar pollinosis agent of the present invention comprising such a peptide as an active ingredient exerts a remarkable therapeutic / preventive effect on cedar pollinosis without substantially causing anaphylaxis when administered to mammals including humans in general. To do.
An anti-cedar pollinosis agent comprising the peptide of the present invention as an active ingredient treats cedar pollinosis without substantially causing side effects such as anaphylaxis when administered to mammals including humans suffering from cedar pollinosis can do. On the other hand, when the anti-cedar pollen case of this invention is administered to a healthy individual or an individual with potential cedar pollinosis before the cedar pollen begins to scatter, it exhibits a remarkable preventive effect against cedar pollinosis Effective in relieving allergic symptoms at the time of onset.
[0021]
The anti-cedar pollinosis agent of the present invention will be described in more detail. The anti-cedar pollinosis agent of the present invention usually contains 0.01 to 100% (w / w) of one or more of the peptides according to the present invention. Preferably, it comprises 0.05 to 50% (w / v), and more preferably 0.5 to 5.0% (w / w). The anti-cedar pollinosis agent of the present invention is not only in the form of the peptide alone but also physiologically acceptable, for example, serum albumin, gelatin, glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, sorbitol, mannitol , Carriers based on maltitol, lactitol, phosphate buffer or citrate buffer, excipients, immune aids and stabilizers, and, if necessary, known T cells specific for cedar pollen It includes forms as compositions with one or more other drugs including epitopes, anti-inflammatory drugs such as steroid hormones and sodium crimoglycate, antihistamines and immunosuppressants. Further, the anti-cedar pollinosis agent of the present invention includes a drug in a dosage unit form, and the drug in the dosage unit form includes, for example, a dose per day or an integral multiple thereof (4 Means an agent in a physically separate, unitary dosage form that contains an amount equivalent to (up to twice) or a fraction thereof (up to 1/40) and is suitable for administration. Such dosage unit forms include powders, fine granules, granules, pills, tablets, capsules, troches, syrups, emulsions, ointments, plasters, poultices, suppositories, eye drops. Nasal drops, sprays, injections and the like.
[0022]
The method of using the anti-cedar pollinosis agent of the present invention will be described. The anti-cedar pollinosis agent of the present invention is generally transdermally, orally, nasally, and instilled for mammals including humans for the purpose of treating and preventing cedar pollinosis. Or it is administered by injection. The dose in humans varies depending on the purpose and symptom of administration, but is usually 0.01 to the amount of the polypeptide of the present invention per day for an adult while observing the subject's symptoms and the course after administration. The dose is usually repeatedly administered in increasing doses for about 1 to 6 months at a frequency of once a week to once a month with a standard of 1.0 g, preferably 0.01 to 0.1 g.
[0023]
Acute toxicity of the polypeptide of the present invention
By an ordinary method, 20 days old mice were orally or intraperitoneally administered with an immunotherapeutic agent obtained by the methods of Preparation Examples 1 to 4 described later. As a result, these anti-cedar pollinosis agents have an LD of 200 mg / kg or higher by any route of administration.₅₀It turned out to be. This indicates that the peptide of the present invention can be safely used in an anti-cedar pollinosis agent for mammals including humans.
[0024]
Test example 1
Using T cells derived from a cedar pollinosis patient, it was confirmed by the method described below that peptides 1 to 11 of the present invention have a cedar pollinosis antigen T cell epitope activity.
40 ml of peripheral blood was collected from a patient positive for anti-cedar pollen allergen IgE reaction. After centrifugation, a buffy coat was obtained, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected by Ficoll-Hypac specific gravity centrifugation. This PBMC was suspended in a medium (RPMI containing 5% human type AB serum).
[0025]
5 x 10 per well in a 96-well flat bottom plate^FiveIndividual cells were dispensed and cultured for 72 hours at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas in 200 μl medium containing 200 ng of peptide 1 to 11 in each well. Separately, a culture group containing no peptide was provided as a negative control. Thereafter, 0.5 μCi of tritiated thymidine was added and further cultured for 16 hours. Cells in each well were collected on a glass fiber filter using a cell harvester, and the amount of tritiated thymidine incorporated into the cells was measured with a liquid scintillation counter. The group in which the amount of thymidine incorporated was more than twice that of the negative control group was defined as T cell epitope activity “positive”, and the system that did not reach it was defined as “negative”.
The results are shown in Table 2 below.
[0026]
[Table 2]

[0027]
From the above results, these peptides were shown to contain the T cell epitope of Cryj1 allergen. T cell epitopes having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 11 in the sequence listing are not yet known, and are judged to be novel T cell epitopes.
As described above, the peptide of the present invention can inactivate T cells specific for the cedar pollen allergen without substantially causing anaphylaxis when administered to mammals including humans in general.
[0028]
The anti-cedar pollinosis agent of the present invention comprising such a peptide as an active ingredient has a remarkable therapeutic / preventive effect on cedar pollinosis substantially without causing anaphylaxis when administered to mammals including humans. Demonstrate.
An anti-cedar pollinosis agent comprising the peptide of the present invention as an active ingredient treats cedar pollinosis without substantially causing side effects such as anaphylaxis when administered to mammals including humans suffering from cedar pollinosis can do. On the other hand, when the anti-cedar pollinosis agent of this invention is administered to healthy individuals or individuals with potential cedar pollinosis before the cedar pollen begins to scatter, it exerts a remarkable preventive effect against cedar pollinosis. At the same time, it is effective in relieving allergic symptoms at the onset.
[0029]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a formulation example demonstrate this invention further in detail, this invention does not limit the technical scope by these.
[Example 1] Synthesis of peptide 1
Peptides were chemically synthesized by a method (solid phase synthesis method) in which amino acids were bonded to the amino acid derivative fixed on the resin one by one from the carboxyl terminal side. The amino acid used in each cycle was a special amino acid derivative in which the reactive group of the amino group and the residue part was blocked with a protecting group. Here, an amino acid in which each amino group was blocked with Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) was used (Fmoc method). Peptide synthesis was performed by sequentially repeating the reaction of deprotecting the Fmoc of the amino group of the amino acid bonded to the resin, and then binding the amino acid derivative activated with the carboxyl group.
[0030]
The peptide 1 peptide was synthesized using a multi-peptide synthesizer (Symphony; manufactured by Protein Technology) according to the protocol of the same apparatus by the Fmoc solid phase synthesis method described above.
That is, 25 μmol equivalent of Fmoc-Gly-Wang resin (0.65 mmol / g) into which an amino acid (Gly) corresponding to the C-terminal residue of the peptide to be synthesized was introduced was set in the reaction vessel of the peptide synthesizer, 1.25 ml of a deprotection solution (20% piperidine / dimethylformamide) was reacted twice for 5 minutes to remove the Fmoc group of the amino acid bound to the resin. The resin was washed 6 times with 1.25 ml of dimethylformamide solution for 30 seconds, and 1.25 ml of 100 mM Fmoc-Phe dimethylformamide solution corresponding to the second amino acid from the C-terminal side was added with 100 mM activator solution (100 mM 2- (1H-benzotriazol-1-yl-)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphate / 400 mM N-methylmorpholine / dimethylformamide) Add 1.25 ml (for bound amino acids) 5 times equivalent), and allowed to react at room temperature for 20 minutes. The Fmoc-Phe-Gly-Wang resin produced here was washed with 1.25 ml of dimethylformamide 6 times for 30 seconds, deprotected with Fmoc group again, washed with 1.25 ml of dimethylformamide 6 times for 30 seconds, and then Fmoc- Gln (Trt) solution and activator solution were added and reacted.
[0031]
Protected peptide resin (Fmoc-Met-Lys (Boc) -Val-Thr (tBu) -Val-Ala-Phe-Asn (Trt) -Gln (Trt) -Phe-Gly-Wang resin) by repeating the same operation Was synthesized.
The amino acids used in the peptide synthesis below this example are as follows:
Fmoc-Asp (OtBu) Fmoc-Asn (Trt) Fmoc-Ala Fmoc-Glu (OtBu)
Fmoc-Gln (Trt) Fmoc-Gly Fmoc-His (Trt) Fmoc-Ile Fmoc-Leu
Fmoc-Lys (Boc) Fmoc-Met Fmoc-Phe Fmoc-Pro Fmoc-Ser (tBu)
Fmoc-Thr (tBu) Fmoc-Trp (Boc) Fmoc-Tyr (tBu) Fmoc-Val
(() Represents a protecting group for protecting the reactive group of the residue part; manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems Division)
[0032]
First, the protected peptide resin synthesized as described above (Fmoc-Met-Lys (Boc) -Val-Thr (tBu) -Val-Ala-Phe-Asn (Trt) -Gln (Trt) -Phe- Gly-Wang resin) was reacted with 1.25 ml of a deprotection solution twice for 5 minutes to deprotect the N-terminal Fmoc group.
Next, it was washed 6 times with 1.25 ml of DMF, then 9 times with dichloromethane, and further dried by blowing nitrogen gas for 20 minutes.
[0033]
By removing the resin, adding 4 ml of cleaved solution (trifluoroacetic acid (hereinafter referred to as “TFA”): phenol: water: thioanisole: ethanedithiol = 82.5: 5: 5: 5: 2.5) and reacting at room temperature for 2 hours The peptide was cleaved from the resin and the amino acid side chain protecting group was removed to obtain a peptide solution. [King, D.S. (1990) Int. J. peptide Protein Reg. 36, 255]. The peptide solution was filtered using a filter, and the filtrate was collected in a centrifuge tube. To this, 10 ml of cold ether was added to precipitate the peptide. After cooling for a while, this was centrifuged (3000 rpm, 10 minutes), the precipitate was collected, and cold ether was added again to disperse and recover, and the peptide was washed 4 times. The obtained peptide was dried to obtain a crude peptide. Hereinafter, the above operation is referred to as “cribage reaction”.
[0034]
11.7 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 30% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as “HPLC”). The HPLC conditions were as follows.
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm x 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 25-28% acetonitrile / 0.1% TFA, 15 minutes
Flow rate: 5 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 12 to 14 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 4.9 mg of the desired peptide.
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was confirmed. .
[0035]
[Example 2] Synthesis of peptide 2
For the synthesis of a peptide having C-terminal Pro, Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl resin was used and the same procedure as in Example 1 was followed to obtain a protected peptide resin (Fmoc-Ser (tBu) -Met-Lys (Boc) -Val- Thr (tBu) -Val-Ala-Phe-Asn (Trt) -Gln (Trt) -Phe-Gly-Pro-2-Chlorotrityl resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide.
Of the obtained crude peptide, 10 mg was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0036]
Column: ODS column (TSKgel ODS-80T, 7.8 mm x 300 mm; manufactured by Tosoh Corporation)
Mobile phase: 30% acetonitrile / 0.1% TFA, 30 minutes
Flow rate: 0.7 ml / min.
Detection wavelength: 230 nm
The fraction eluted at 21-22 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 1.3 mg of the desired peptide.
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was confirmed. .
[0037]
[Example 3] Synthesis of peptide 3
In the same manner as in Example 1, the protected peptide resin (Fmoc-Tyr (tBu) -Gly-Leu-Val-His (Trt) -Val-Ala-Asn (Trt) -Asn (Trt) -Asn (Trt)- Tyr (tBu) -Asp (OtBu) -Pro-Trp (Boc) -Thr (tBu) -Ile Wang resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide.
8.9 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0038]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 20-30% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 17 to 20 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 5.0 mg of the desired peptide.
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was confirmed. .
[0039]
[Example 4] Synthesis of peptide 4
In the same manner as in Example 1, the protected peptide resin (Fmoc-Tyr (tBu) -Gly-Leu-Val-His (Trt) -Val-Ala-Asn (Trt) -Asn (Trt) -Asn (Trt)- Tyr (tBu) -Asp (OtBu) -Pro-Trp (Boc) -Wang resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide. Of the obtained crude peptide, 9 mg was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA and subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0040]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 20-30% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
Fractions eluted at 13 to 16 minutes were collected, concentrated, and lyophilized to obtain 6.4 mg of the desired peptide.
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing was confirmed. .
[0041]
[Example 5] Synthesis of peptide 5
In the same manner as in Example 1, the protected peptide resin (Fmoc-Gly-Leu-Val-His (Trt) -Val-Ala-Asn (Trt) -Asn (Trt) -Asn (Trt) -Tyr (tBu)- Asp (OtBu) -Pro-Trp (Boc) -Thr (tBu) Wang resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide.
[0042]
Of the obtained crude peptide, 8 mg was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0043]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 20-30% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 8 to 11 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 4.1 mg of the desired peptide.
[0044]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing was confirmed. .
[0045]
[Example 6] Synthesis of peptide 6
Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl resin was used for the synthesis of a peptide having C-terminal Pro, and a protected peptide resin (Fmoc-Tyr (tBu) -Gly-Leu-Val-His ( Trt) -Val-Ala-Asn (Trt) -Asn (Trt) -Asn (Trt) -Tyr (tBu) -Asp (OtBu) -Pro-2-Chlorotrityl resin) Got.
[0046]
5.5 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0047]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm x 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 21-26% acetonitrile / 0.1% TFA, 15 minutes
Flow rate: 5 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 9 to 10.5 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 2.8 mg of the desired peptide.
[0048]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing was confirmed. .
[0049]
[Example 7] Synthesis of peptide 7
In the same manner as in Example 1, a protected peptide resin (Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu)
-Gly-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -Glu (OtBu) -Gly-Gly-Asn (Trt) -Ile-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Ala-Phe-Asn (Trt) -Val-Wang resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide. 11 mg of the obtained crude peptide was dissolved in a 15% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0050]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 15-25% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 10 to 12 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 5.9 mg of the desired peptide.
[0051]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing was confirmed. .
[0052]
[Example 8] Synthesis of peptide 8
In the same manner as in Example 1, protected peptide resin (Fmoc-Ser (tBu) -Gly-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -Glu (OtBu) -Gly-Gly-Asn (Trt) -Ile-Tyr ( (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Ala-Phe-Asn (Trt) -Val-Glu (OtBu) -Wang resin) The crude peptide was obtained.
[0053]
11 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 15% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0054]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 15-22% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 10 to 12 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 6.4 mg of the desired peptide.
[0055]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was confirmed. .
[0056]
[Example 9] Synthesis of peptide 9
In the same manner as in Example 1, protected peptide resin (Fmoc-Ser (tBu) -Gly-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -Glu (OtBu) -Gly-Gly-Asn (Trt) -Ile-Tyr ( (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Ala-Phe-Asn (Trt) -Val-Wang resin) It was.
[0057]
11 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 15% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0058]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 15-20% acetonitrile / 0.1% TFA, 20 minutes
Flow rate: 8 ml / min.
Detection wavelength: 220 nm
The fraction eluted at 16 to 18 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 4.8 mg of the desired peptide.
[0059]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing was confirmed. .
[0060]
[Example 10] Synthesis of peptide 10
In the same manner as in Example 1, the protected peptide resin (Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -Glu (OtBu) -Gly-Gly-Asn (Trt) -Ile-Tyr (tBu) -Thr ( (tBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Ala-Phe-Asn (Trt) -Val-Glu (OtBu) -Wang resin) to obtain a crude peptide It was.
[0061]
5.4 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0062]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm × 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 20-30% acetonitrile / 0.1% TFA, 15 minutes
Flow rate: 5 ml / min.
Detection wavelength: 230 nm
The fraction eluted at 9 to 10 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 3.6 mg of the desired peptide.
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing was confirmed. .
[0063]
[Example 11] Synthesis of peptide 11
In the same manner as in Example 1, a protected peptide resin (Fmoc-Glu (OtBu) -Gly-Gly-Asn (Trt) -Ile-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Ala-Phe-Asn (Trt) -Val-Wang resin) was synthesized and subjected to a cleavage reaction to obtain a crude peptide. Of the obtained crude peptide, 5 mg was dissolved in 20% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, and then subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows.
[0064]
Column: ODS column (TSK guard column ODS, 21.5 mm x 75 mm; manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: 20-35% acetonitrile / 0.1% TFA, 15 minutes
Flow rate: 5 ml / min.
Detection wavelength: 230 nm
A fraction eluted at 9.5 to 10.5 minutes was collected, concentrated, and lyophilized to obtain 3.5 mg of the desired peptide.
[0065]
When 100 pmol of the synthesized peptide was subjected to amino acid sequence analysis using an amino acid sequencer (PPSQ-10 type; manufactured by Shimadzu Corporation), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing was confirmed. .
[0066]
Formulation Example 1
Liquid
Any of the 11 peptides obtained by the methods described in Examples 1 to 11 was dissolved in distilled water containing 1% (w / v) purified gelatin as a stabilizer to a final concentration of 0.1 g / ml, By sterilizing filtration by a conventional method, 11 types of liquids were obtained.
Since susceptibility to the peptide of the present invention usually varies from individual to individual, this product is used by appropriately blending 11 kinds of liquids so that the composition is most suitable for each individual. Since this product is excellent in stability, it is useful as a solution for eye drops, nasal drops, and oral sprays for treating and preventing cedar pollinosis.
[0067]
Formulation Example 2
Injection
24 kinds of peptides obtained by the method described in Examples 1 to 11 in physiological saline containing 1% (w / v) human serum albumin as a stabilizer to a final concentration of 0.01, 0.1 or 1 mg / ml, respectively. After dissolution in sterilization and sterile filtration, 2 ml each was dispensed into sterile vials, lyophilized and sealed.
Prior to administration, first add 1 ml of distilled water for injection into a vial, and then dissolve the contents uniformly before use. The product having excellent stability and comprising 11 kinds of polypeptides according to the present invention as an active ingredient is useful as a dry injection for treating and preventing cedar pollinosis.
[0068]
Formulation Example 3
tablet
2 g of purified pullulan with an average molecular weight of about 20,000 daltons is uniformly dissolved in 100 ml of distilled water, and 2 ml of a 1.7% (w / v) acetone solution of cyanuric chloride is added to the solution, and 5% (w / v) aqueous sodium carbonate solution is added. The reaction was carried out at 5 ° C. for 2 hours with stirring while maintaining the pH at around 7. Subsequently, the reaction product was dialyzed overnight against 4 ° C. cold water while maintaining the pH of the reaction at around 7 to obtain 20 ml of an aqueous solution containing activated pullulan.
0.2 mg of each of the peptides obtained by the methods described in Examples 1 to 11 was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 12 hours with gentle stirring while keeping the pH of the solution at around 7. After the reaction, 4 g of glycine was added to the reaction product, and incubated at 37 ° C. for 5 hours with gentle stirring to block unreacted active groups.
[0069]
The reaction was concentrated and loaded onto a Sephadex G-50 column that had been equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and the same buffer was passed through the column. Fractions containing a complex of the peptide and pullulan were collected. The yield was about 30% per raw peptide solid content.
This fraction is sterile filtered, concentrated, lyophilized, pulverized and mixed uniformly with mannitol, and the mixture is compressed to give 2, 10, or 50 mg of complex per tablet (200 mg) according to conventional methods. A tablet containing was obtained.
This product with excellent ingestion and stability is useful as a sublingual agent for treating and preventing cedar pollinosis.
[0070]
Formulation Example 4
Syrup
1 g of purified lipopolysaccharide derived from E. coli was dissolved in 100 ml of 10 mM calcium phosphate solution, 6 ml of 100 mM sodium periodate was added to the solution, and the mixture was reacted at room temperature for 20 minutes to activate the lipopolysaccharide. The reaction product is dialyzed overnight against 4 ° C. 1 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH 4.4) to remove unreacted periodic acid, and then adjusted to about pH 9.5 with 0.1 M sodium bicarbonate buffer. On the other hand, eleven kinds of peptides obtained by the methods described in Examples 1 to 11 were dissolved 10 mg each in 100 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 7.0), and added to the above reactant containing activated lipopolysaccharide. The reaction was allowed to stand at room temperature for 12 hours.
Thereafter, the newly obtained reaction product is purified by the method of Formulation Example 3, and the resulting fraction containing the complex of the peptide of the present invention and lipopolysaccharide is concentrated, lyophilized, pulverized and solidified. It was. The yield was about 30% per raw peptide solid content.
[0071]
This solid is dissolved in distilled water containing 1% (w / w) purified gelatin as a stabilizer so that the final concentration of sucrose is 0.1 or 1 mg / ml or 50% (w / w). Was sterilized and filtered by a conventional method to obtain a syrup. Each 2 ml of this syrup was dispensed into sterile vials and sealed to give a product.
The product having excellent stability and containing the complex of the peptide of the present invention and lipopolysaccharide as an active ingredient is useful as a syrup for treating and preventing cedar pollinosis.
[0072]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel peptide group consisting essentially of only a T cell epitope specific to a cedar pollen allergen, and further an anti-cedar pollinosis agent comprising such a polypeptide as an active ingredient can be provided. The peptide of the present invention does not substantially react with the immunoglobulin E antibody specific for the cedar pollen allergen. Therefore, when administered to mammals including humans, it does not cause anaphylaxis substantially and is specific for the cedar pollen allergen. Normal T cells can be inactivated.
[0073]
[Sequence Listing]

[0074]

[0075]

[0076]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

Claims

A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

An anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.

An anti-cedar pollinosis agent comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.

The anti-cedar pollinosis agent according to claim 3 or 4 , further comprising glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, sorbitol, mannitol, maltitol and / or lactitol.