JP4173010B2 - Δ4−デサチュラーゼ遺伝子及びその使用 - Google Patents
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はエロンガーゼによりω3−ドコサペンタエン酸に変換され得る。ω3−ドコサペンタエン酸のドコサヘキサエン酸(22:6n−3)への変換に関わる酵素またはそのコード化遺伝子の単離は未だ報告されていない。この変換に関して2つの経路が提案されている(図1及びH.Sprecher,Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care,2:135−138(1999)参照)。その1つの経路では本発明のデサチュラーゼのような単一酵素のΔ4−デサチュラーゼが関与する。n−6経路では、食事性リノール酸が哺乳動物において一連の不飽和化及び延長ステップを介してアドレン酸に変換され得る(図1参照)。アドレン酸からのω6−ドコサペンタエン酸の生成では上記したΔ6−デサチュラーセが媒介していると推定される。
本発明は真菌Thraustochytrium aureum(BICC 7091)、真菌Schizochytrium aggregatum及び藻類Isochrysis galbana由来のΔ4−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド及び翻訳アミノ酸配列に関する。更に、本発明は前記遺伝子及びこの遺伝子によりコードされる酵素の使用を包含する。例えば、遺伝子及び対応酵素は医薬組成物、栄養組成物及び他の有用な製品に添加され得るポリ不飽和脂肪酸(例えば、ω6−ドコサペンタエン酸及び/またはドコサヘキサエン酸)の生成に使用され得る。
上記したように、本発明のΔ4−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は22炭素以上の長さを有する高級不飽和ポリ不飽和脂肪酸の生成において必須である。作成したプラスミド(実施例III参照)に基づいて異なっている単離Thraustochytrium aureumΔ4−デサチュラーゼのヌクレオチド配列を図3〜6に示し、対応の精製タンパク質のアミノ酸配列を図7〜10に示す。別の単離T.aureumヌクレオチド配列を図18に示し(実施例VII参照)、コード化アミノ酸配列を図19に示す。単離Schizochytrium aggregatumΔ4−デサチュラーゼ配列のヌクレオチド配列を図13及び16に示し、コード化アミノ酸配列を図14及び17に示す。また、単離Isochrysis galbanaΔ4−デサチュラーゼ配列のヌクレオチド配列を図20に示し、前記ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を図21に示す。
Δ4−デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子が単離されたら、該遺伝子はベクターまたは構築物を用いて原核または真核宿主細胞に導入され得る。ベクター(例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド)はΔ4−デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、及び宿主細胞において機能し、前記ヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を引き出し得る調節配列(例えば、プロモーター)を含み得る。調節配列(例えば、プロモーター)は前記ヌクレオチド配列に作動可能に組み合わされているかまたは作動的に結合している。プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならばプロモーターはコード配列に作動的に結合していると言われる。好適なプロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、酸ホスファターゼ、T7、TPI、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウイルス最初期、ホエー酸性タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、及びガラクトース(例えば、GAL1及びGAL10)の存在下で活性化されるプロモーターが含まれる。他のタンパク質、オリゴサッカライド、脂質等をコードするヌクレオチド配列もベクター及び他の調節配列、例えばSV−40T−抗原、卵白アルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリ−A−シグナルのようなポリアデニル化シグナルの中に含まれ得る。構築物中に存在させる配列は所望する発現産物及び宿主細胞の種類に応じて選択される。
上記したように、単離したデサチュラーゼ遺伝子及び該遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途を有する。例えば、前記遺伝子及び対応の酵素はポリ不飽和脂肪酸の生成において直接的及び間接的に使用され得る。例えば、Δ4−デサチュラーゼはω6−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸を生成する際に使用され得る。「直接的」は酵素がある酸を組成物中に使用される別の酸に直接変換する(例えば、アドレン酸のω−ドコサペンタエン酸への変換)状況を包含することを意味する。「間接的」はデサチュラーゼによりある酸を別の酸(すなわち、経路の中間体)に変換し(例えば、アドレン酸のω6−ドコサペンタエン酸への変換)、その後後者の酸をデサチュラーゼまたは非デサチュラーゼ酵素を用いて別の酸へ変換する(例えば、Δ19−デサチュラーゼによるω6−ドコサペンタエン酸のドコサヘキサエン酸への変換)状況を包含することを意味する。また、本発明は、PUFAを非−Δ4−デサチュラーゼ酵素(例えば、エロンガーゼまたは別のデサチュラーゼ)により別のポリ不飽和脂肪酸に変換し、その後Δ4−デサチュラーゼを用いて最終生成物に変換する「間接的」状況をも含む。例えば、エイコサペンタエン酸をエロンガーゼによりω3−ドコサペンタエン酸に変換し、その後Δ4−デサチュラーゼによりドコサヘキサエン酸に変換してもよい。これらのポリ不飽和脂肪酸(すなわち、デサチュラーゼ酵素の活性により直接または間接的に生成されるもの)は、例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加され得、これらはすべて本発明に包含される。これらの使用を以下に詳記する。
本発明は栄養組成物を包含する。本発明において、前記組成物には経腸または非経口消費を含めてヒトが消費するための食品または製剤が含まれ、これらは体内に取り込まれたとき(a)栄養を与えたり、組織を構築したり、エネルギーを補給するように機能する及び/または(b)適正な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持する。
本発明はまた、本明細書に記載されている方法に従ってデサチュラーゼを用いて得られる酸及び/または油の1つ以上を含む医薬組成物を包含する。より具体的には、前記医薬組成物は1つ以上の酸及び/または油に加えて一般的な公知の非毒性医薬的に許容され得る担体、助剤またはビヒクル、例えばリン酸緩衝食塩液、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤またはエマルジョン(例えば、水/油エマルジョン)を含み得る。前記組成物は液体でも固体のいずれの形態もとり得る。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体または粉末、注射剤、または局所投与用軟膏またはクリームの形態をとり得る。適正な流動性は、例えば分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、界面活性剤を使用することにより維持され得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を配合することが望ましいことがある。不活性希釈剤に加えて、組成物は助剤、例えば湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味剤、フレバー及びパフュームを配合することもできる。
上記した医薬組成物及び栄養組成物は、動物はヒトと同じ要求及び状態を多く経験するので動物(すなわち、家畜及び家畜以外の動物)及びヒトに関連して使用され得ることに注目すべきである。例えば、本発明の油または酸は動物飼料サプリメント、動物飼料代用品、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に使用され得る。
Thraustochytrium aureum由来のデサチュラーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの設計及びcDNAライブラリーの構築
海生真菌Thraustochytrium aureum(T.aureum)(ATCC 34304)の脂肪酸組成を分析して、ポリ不飽和脂肪酸(PUFA)の種類及び量を調べた。この真菌は大量の長鎖PUFA、例えばアラキドン酸(ARA,20:4n−6)及びエイコサペンタエン酸(EPA,20:5n−3)を含んでいた。しかしながら、T.aureumはアドレン酸(ADA,22:4n−6)、ω6−ドコサペンタエン酸(ω6−DPA,22:5n−6)、ω3−ドコサペンタエン酸(ω3−DPA,22:5n−3)のようなPUFAをも産生し、最高量の脂肪酸はドコサヘキサエン酸(DHA,22:6n−3)であった(図1参照)。よって、Δ6−、Δ5−及びΔ17−デサチュラーゼに加えて、T.aureumは多分、ADAをω3−DPAまたはω6−DPAをDHAに変換するΔ19−デサチュラーゼ及び/またはADAをω6−DPAまたはω3−DPAをDHAに不飽和化するΔ4−デサチュラーゼを含んでいる。従って、目的はT.aureumから予測デサチュラーゼ遺伝子を単離し、別の宿主における発現により酵素の機能性を証明することであった。
真菌由来のデサチュラーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの使用
推定デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、全RNAを塩化リチウム法(Hogeら,Exp.Mycol.,6:225−232(1982))を用いて単離した。約5μgをSuperScript Preamplificationシステム(メリーランド州ロックビルに所在のLifeTechnoligies)を用いて逆転写して、第1鎖cDNAを作成した。以下のプライマーの組合せを使用した:RO834/836、RO834/838、RO835/836、RO835/838及びRO753/754を60℃以下のアニーリング温度での異なる熱サイクルパラメーター及びTaqポリメラーゼを用いる幾つかのPCR反応で使用したが、バンドは生じなかった。
T.aureum(ATCC 34304)由来の完全長遺伝子配列の単離
完全長遺伝子を見つけるために、2の別々のPCR反応を実施して、cDNAライブラリー由来の推定デサチュラーゼの2つの末端を決定した。遺伝子の3’末端については、(pBluescript SK(+)ベクター(カリフォルニア州ラホヤに所在のStragene)の配列に基づいて設計した)RO898(配列番号7)(5’−CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG−3’)を遺伝子特異的プライマーRO930(配列番号8)(5’−GACGATTAACAAGGTGATTTCCCAGGATGTC)と一緒にPCR増幅反応に使用した。この場合、GCリッチ配列(1313bp断片に対して61%)で生ずるPCR増幅の問題を解消するためにAdvantage−GC cDNA PCRキット(カリフォルニア州パロアルトに所在のClonetech)を用いた。PCR熱サイクル条件は以下の通りであった:鋳型をまず94℃で3分間変性した後、94℃×30秒間、52℃×30秒間及び72℃×1分間を1サイクルとして30サイクル、最後に72℃×7分間の伸長サイクルを実施した。各プライマーは20pmol用いた。こうして得たPCR産物を1%アガロースゲルを用いて分離し、除去し、ゲルをQiagenゲル抽出キット(カリフォルニア州バレンシアに所在のQiagen)を用いて精製した。断片上の付着末端を、実施例IIに記載されているようにT4 DNAポリメラーゼ(メリーランド州ロックビルに所在のLifeTechnologies)を用いて製造業者の仕様書に従って充填し、PCR−ブラントベクター(カリフォルニア州カールズバッドに所在のInvitrogen)にクローン化した。クローン93−3配列はオリジナル1313bp断片と重複しており、オープンリーディングフレーム、停止コドン及びポリA尾部を含むことが判明し、これが遺伝子の3’末端であった。2つのプライマーをクローン93−3配列に基づいて停止コドンの近くに次のように作成XhoI部位(下線)を有して設計した:RO973(配列番号9)(5’−GACTAACTCGAGTCACGTGGACCAGGCCGTGAGGTCCT−3’)及びRO974(配列番号10)(5’−GACTAACTCGAGTTGACGAGGTTTGTATGTTCGGCGGTTTGCTTG−3’)。停止コドンを含むRO973は高量(60%)のGCを有し、十分に増幅し得ないので、2つのプライマーを意図的に選択した。一方、停止コドンの下流のRO974は非常に少ない(48%)量のGCを有していた。
酵母における推定デサチュラーゼを含むプラスミドの発現
4つすべてのプラスミドをコンピテントなSaccharomyces cerevisiae菌株334に形質転換した。酵母形質転換はアルカリ−カチオン酵母形質転換キット(カリフォルニア州ビスタに所在のBIO 101)を用い、製造業者が特定する条件に従って実施した。形質転換体をロイシン欠乏媒体(DOB[−Leu])でロイシン栄養要求性について選択した。前記クローンの特定デサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換体を50μMの以下に示す特定脂肪酸基質の存在下で増殖させた:
a.リノール酸(18:2n−6)(α−リノレン酸への変換はΔ15デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ6−デサチュラーゼ活性を示す)、
b.α−リノレン酸(18:3n−3)(ステアリドン酸への変換はΔ6デサチュラーゼ活性を示す)、
c.アラキドン酸(20:4n−6)(エイコサペンタエン酸への変換はΔ17−デサチュラーゼ活性を示す)、
d.アドレン酸(22:4n−6)(ω3−ドコサペンタエン酸への変換はΔ19−デサチュラーゼ活性を示し、ω6−ドコサペンタエン酸への変換はΔ4−デサチュラーゼ活性を示す)、
e.ω3−ドコサペンタエン酸(22:5n−3)(ドコサヘキサエン酸への変換はΔ4−デサチュラーゼ活性を示す)。
酵母におけるΔ4−デサチュラーゼとマウスエロンガーゼの発現
(最高の変換率を有していた)プラスミドpRTA7及びpRTA8はそれぞれpRAE−84(援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第09/624,670号明細書)由来のマウスエロンガーゼを含むクローンであるpRMELO4と同時形質転換され得る。879塩基対のマウスエロンガーゼ(図11(配列番号22)及び図12(配列番号23)参照)はEcoRI/XhoI部位で酵母発現ベクターpYES2(カリフォルニア州カールズバッドに所在のInvitrogen)においてEcoRI/XhoI断片としてクローン化され得る。この292アミノ酸のエロンガーゼはPUPA経路の幾つかの延長ステップ、特にAAのADAへのステップ及びEPAのω3−DPAへのステップを触媒する。ADA及びω3−DPAはΔ4−デサチュラーゼの基質である。酵母形質転換体は、Δ4−デサチュラーゼ(pRTA7またはpRTA8)及びpRMELO4(マウスエロンガーゼ)の選択のためにロイシン及びウラシル欠乏最小培地(DOB[−Leu−Ura])を用いて選択され得る。ロイシン及びウラシル欠乏2%ガラクトースを含む最小培地においてpRMELO4及びpRTA7またはpRTA8を含む酵母培養物を増殖、発現させると、外から付加したAAのADAへの延長及びω6−DPAへのΔ4不飽和化が生じ得る。更に、酵母最小培地にEPAを付加すると、図1に示すように、エロンガーゼによるω3−DPAへの延長が生じ得、ω3−DPAはその後Δ4−デサチュラーゼにより不飽和化されてDHAが生成され得る。このことは、AA及びEPAを生成するためにエロンガーゼ及び他のデサチュラーゼを用いて既に立証されており(国際特許出願公開第00/12720号パンフレット)、基質の延長及びその後の不飽和化が酵母や潜在的に他の生物のような生物においてインビボで起こり得ることを示す実験データも提示されている。更に、本発明のデータは、それぞれ前駆体AA及びEPAからω6−DPAまたはDHAのいずれかを生成するためのPUFA生合成経路において別の酵素と共に働くΔ4−デサチュラーゼの能力を立証している。
Schizochytrium aggregatum(ATCC 28209)由来のΔ4−デサチュラーゼの同族体
実施例IIと平行して、RNAをSchizochytrium aggregatum(S.aggregatum)ATCC 28209から酸フェノール方法により単離した。簡単に説明すると、S.aggregatumのペレットを冷脱イオン水で洗浄し、300rpmで5分間再ペレット化した。ペレットを再懸濁するために約10mlのTBS(10mM トリス−HCl(pH7.5),10mM EDTA及び0.5% SDS)を使用した。次いで、酸フェノール(10ml)を添加し、65℃で1時間インキュベートした。ペレットを氷上で5分間置き、4℃において1000×gで5分間遠心し、水性相を新しい管に移した。水性相に酸フェノール(10ml)を更に添加し、前と同様に混合物を撹拌し、分離した。核酸を含む水性相を新しい管に移した。−70℃において一晩沈降させるために酢酸ナトリウムpH5.3(約1ml)及び氷冷エタノール(25ml)を添加した。翌日、管を4℃において14,000rpmで15分間遠心し、上清をデカントした。ペレットを70%エタノール(10ml)で洗浄し、上記ステップと同様に遠心した。ペレットを乾燥し、RNase非含有脱イオン水(500ul)に再懸濁した。RNAをQiagen RNeasy Maxiキット(カリフォルニア州バレンシアに所在のQiagen)を用いて製造業者のプロトコルに従って更に精製した。
Schizochytrium aggregatum(ATCC 28209)及びThraustochytrium aureum(BICC 7091)由来のΔ4−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
5’末端及び3’末端を単離するために、実施例VIに示した単離S.aggregatum断片の内部配列に基づいて新しいプライマーを設計した。遺伝子の5プライム末端に対して、RO1240(配列番号26)(5’−CCC TCG ATG ATG TGG TTG ACG ATG AAC−3’)、その後5プライム入れ子プライマーRO1239(配列番号27)(5’−CGG AGC ATG GGG TAG GTG CTG AAG AC−3’)を使用した。3プライム末端に対して、遺伝子の他の末端を単離するための第2反応のためにRO1236(配列番号28)(5’−CCA ACT GCC GTT ACG CCA GCA AGT−3’)、その後3プライム入れ子プライマーRO1237(配列番号29)(5’−CAA GCT CTT CTT CAT CGC CCA CTT TTC G−3’)を使用した。RACE(cDNA末端の迅速増幅)レーディcDNAを反応の標的として使用した。この材料を作成するには、全RNA(約5μg)をDNA標的を作成するための逆転写のためにSuperscript II(商標)酵素(カリフォルニア州カールズバッドに所在のInvitrogen)及びGeneRacer(商標)キット(カリフォルニア州カールズバッドに所在のInvitrogen)と共に製造業者の指示に従って使用した。末端を最初に増幅するために、以下の熱サイクルプロトコルをPerkin Elmer 9600において使用した。94℃×2分間でまず溶融した後、94℃×30秒間及び72℃×3分間を1サイクルとして5サイクル、94℃×30秒間、70℃×30秒間及び72℃×3分間を1サイクルとして10サイクル、94℃×30秒間、68℃×30秒間及び72℃×3分間を1サイクルとして10サイクル、最後に72℃×10分間の伸長サイクルを実施した。第1のPCR反応を10pMolのRO1240及び30pMolのGeneRacer(商標)5プライムプライマー(配列番号30)(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’)またはRO1236及びGeneRacer(商標)3プライムプライマー(配列番号31)(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’)を用いて実施した。反応物は製造業者の指示に従ってMgSO4を含むPlatinum Taq(商標)PCRx(カリフォルニア州パロアルトに所在のClonetch)を用い、最終容量50ul中に1ulのcDNAを含んでいた。1ulの入れ子反応を初期反応物、10pmolの入れ子プライマーRO1239、及び30pmolGeneRacer(商標)入れ子5プライムプライマー(配列番号32)(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’)またはGeneRacer(商標)入れ子3プライムプライマー(配列番号33)(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’)及び入れ子プライマーRO1237を用いて第1反応と同一条件を用いて実施した。PCR産物のアガロースゲル分析は、5プライム反応で約800塩基対及び3プライム反応で約600塩基対のバンドを示した。その後、pCR−ブラント(カリフォルニア州カールズハッドに所在のInvitrogen)にクローン化し、Top10コンピテント細胞(カリフォルニア州カールズハッドに所在のInvitrogen)に形質転換し、配列決定すると、開始コドン及び停止コドンを含むオープンリーディングフレームが明らかとなった。クローニングのために付加した制限部位(それぞれ下線をつけたEcoRI及びHindIII)を有するプライマーRO1241(配列番号34)(5’−GAT ATC GAA TTC ATG ACG GTG GGC GGC GAT GAG G−3’)及びRO1242(配列番号34)(5’−GTA CTT AAG CTT TCA CTT GGA CTT GGG GTG GTC C−3’)を完全長遺伝子を単離するために使用した。上記したように、10pmolのプライマーRO1241及びRO1242を標的としてのcDNA(2ul)、製造業者のプロトコルに従ってMgSO4を含むPlatinum Taq(商標)PCRx(カリフォルニア州パロアルトに所在のClonetach)と共に使用した。熱サイクルパラメーターは次の通りであった:まず94℃×2分間の溶融後、94℃×30秒間及び72℃×2分間を1サイクルとして5サイクル、94℃×30秒間及び70℃×2分間を1サイクルとして5サイクル、94℃×30秒間、65℃×30秒間及び68℃×2分間を1サイクルとして20サイクル、その後68℃×10分間の伸長サイクル。反応の大きな産物をQiaQuickゲル精製キット(カリフォルニア州バレンシアに所在のQiagen)を用いて精製し、EcoRI及びHindIIIで切断し、迅速結合キット(インディアナ州インディアナポリスに所在のRoche)を用いてpYX242 EcoRI/HindIII直線化DNAに連結し、pRSA−1と称した。クローンpRSA−1は1530bp(配列番号36,図16)の完全長遺伝子及び509アミノ酸(配列番号37,図17)のオープンリーディングフレームを含んでいた。プラスミドpRSA−1はバージニア州マナサスに所在のBoulevard大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに2002年3月27日に寄託され、PTA−4186の受託番号を受けた。
酵母における推定Δ4−デサチュラーゼpRSA1及びpRTA11の発現
両プラスミドをコンピテントなSaccharomyces cerevisiae菌株334に形質転換し、50μMのADAまたはω3−DPAと一緒に実施例IVに記載されているように増殖させた。表4に示すように、334(pRSA1)または(pRTA11)をADAまたはω3−DPAと一緒に増殖させたときにはΔ4−不飽和化の生成物であるω6−DPA及びDHAが生成された。
酵母におけるΔ4−デサチュラーゼ及びマウスエロンガーゼの同時発現
実施例Vに記載されているように、T.aureum(ATCC 34304)Δ4−デサチュラーゼを(プラスミドpRAE84からpYES2に再クローン化した)マウスエロンガーゼpRMELO4と共に同時形質転換した。
藻類Isochrysis galbana(CCMP 1323)からの新規デサチュラーゼ遺伝子の単離
藻類Isochrysis galbana(I.galbana)(CCMP 1323)の脂肪酸組成を調査して、この生物から産生されるポリ不飽和脂肪酸を調べた。この藻類は大量のω3−ドコサペンタエン酸(ω3−DPA,22:5n−3)及びドコサヘキサエン酸(DHAm22:6n−3)を含めた長鎖PUFAを示した。実際、DHAは総脂質の19%を占める高量で存在していた。よって、I.galbanaはω3−DPAをDHAに変換し得るΔ4−デサチュラーゼを有していると予想された。従って、目的はI.galbanaから予測Δ4−デサチュラーゼを単離し、別の宿主での発現により酵素の機能性を証明することであった。
酵母におけるIsochrysis galbana(CCMP 1323)由来の新規デサチュラーゼであるpRIG6の発現
基質特異性及びI.galbama由来の新規デサチュラーゼにより触媒される反応の種類を調べるために、pRIG6構築物を下記するようにSaccharomyces cerevisiae(SC334)において異種発現させた。S.cerevisiaeはオレイン酸(OA,18:1n−9)以外の脂肪酸を合成できないので、OA以外の基質に対する酵素活性を測定するために使用するのに理想的である。なぜならば、バックグラウンド酵素活性は検出されないからである。よって、基質は宿主に対して外から供給され、細胞に吸収され、形質転換遺伝子の発現タンパク質により作用され得る。
a.リノール酸(LA,18:2n−6);α−リノレン酸(ALA,18:3n−3)への変換はΔ15−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ6−デサチュラーゼ活性を示す。
b.ジホモ−リノレン酸(20:3n−6);エイコサテトラエン酸(ETA,20:4n−3)への変換はΔ17デサチュラーゼ活性を示し、アラキドン酸(ARA,20:4n−6)への変換はΔ5デサチュラーゼ活性を示す。
c.ω6−エイコサジエン酸(20:2n−6);ジホモ−γ−リノレン酸(20:3n−6)への変換はΔ8−デサチュラーゼを示す。
d.アドレン酸(22:4n−6);ω6−ドコサペンタエン酸(22:5n−6)への変換はΔ4−デサチュラーゼ活性を示す。
e.ω3−ドコサペンタエン酸(22:5n−3);ドコサヘキサエン酸(22:6n−3)への変換はΔ4−デサチュラーゼ活性を示す。
LA=リノール酸(18:2n−6)、
GLA=γ−リノレン酸(18:3n−6)、
DGLA=ジホモ−γ−リノレン酸(20:3n−6)、
AA=アラキドン酸(20:4n−6)、
ω6−EDA=ω−6エイコサジエン酸(20:2n−6)、
ADA=アドレン酸(22:4n−6)、
ω3−DPA=ω−3ドコサペンタエン酸(22:5n−6)、
ω6−DPA=ω−6ドコサペンタエン酸(22:5n−3)、
DHA=ドコサヘキサエン酸(22:6n−3)。
詳細説明に記載されているPUFAは各種栄養サプリメント、乳児用製剤、栄養代用品及び他の栄養溶液中に使用され得る。
A.Isomil(登録商標)鉄入り調製豆乳:
使用:牛乳に対してアレルギーまたは感受性を有する乳幼児及び成人に対する飲料として。ラクトースが禁忌な疾患、すなわちラクターゼ欠乏、ラクトース不耐性及びガラクトース血症を有する患者に対する栄養補給。
使用:小児及び幼児における下痢の食事管理のための短期間栄養補給として。
使用:牛乳タンパク質に対してアレルギーまたは感受性またはスクロースに対して不耐性を有する乳幼児及び成人に対する飲料として。ラクトース及びスクロースが禁忌な疾患を有する患者に対する栄養補給。
使用:大豆栄養補給が所望されるとき。
使用:乳児用調製乳が必要な時;1才前に母乳の断乳を決断するとき、母乳への補充が必要なとき、または母乳を与えていないときの日常的な栄養補給として。
使用:未熟児の退院後の特殊栄養要求量のため。Similac NeoCareは巻き返し成長を促進し、発達をサポートするために必要な追加のカロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを未熟児に与えるように開発された栄養的に完全な調製乳である。
使用:低出生時体重乳児に対して人乳と混合するかまたは人乳と一緒に供給するように設計。
A.ENSURE(登録商標):
使用:ENSUREは、代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残分液体食である。ENSUREは、ラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。主として経口サプリメントであるが、経管栄養補給することもできる。
使用:ENSURE BARSは食事の間または食事と一緒に栄養補給の目的で使用される完全にバランスの取れた栄養物である。栄養分が高く、おいしく、他のスナックの代用品である。ENSURE BARSは<1g/バーのラクトースを含み、チョコレートファッジブラウニーフレバーはグルテンを含まない(ハニーグラハムクランチフレバーはグルテンを含む)。
使用:ENSURE HIGH PROTEINは、食事にカロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを追加する必要がある患者に対して設計された濃厚な高タンパク質液体食である。代用食品として食事と一緒にまたは食事の間に適量経口栄養サプリメントとして使用され得る。ENSURE HIGH PROTEINはラクトロスもグルコースも含まず、通常の手術または股関節骨折からの回復期の患者及び圧迫潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
バニラシュプリーム:−D 水、糖(スクロース)、マルトデキストリン(コーン)、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレインサフラワー油、大豆タンパク質単離物、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−コフェリルアセテート、ゲランガム、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、ビタミンAパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3及びシアノコバラミン。
使用:ENSURE LIGHTは食事と一緒または食事の間に経口栄養サプリメントとして使用するように設計された低脂肪液体食である。ENSURE LIGHTはラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
フレンチバニラ:−D 水、マルトデキストリン(コーン)、糖(スクロース)、カゼイン酸カルシウム、高オレインサフラワー油、カノラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、塩(塩化ナトリウム)、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ビタミンAパルミテート、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3及びシアノコバラミン。
使用:ENSURE PLUSはタンパク質は正常濃度であるが過剰のカロリー及び栄養分が必要であるときに使用するための高カロリーの低残分液体食である。代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用する経口栄養サプリメントとして主に設計されている。ENSURE PLUSはラクトースもグルコースも含まない。主として経口栄養サプリメントあるが、経管栄養補給することもできる。
バニラ:−D 水、コーンシロップ、マルトデキストリン(コーン)、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖(スクロース)、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンAパルミテート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンD3。
使用:ENSURE PLUS HNは高いカロリー及びタンパク質を必要とするかまたは限定量のトレランスを有する患者に対して設計された栄養的に完全な高カロリー/高窒素液体食である。経口栄養補給または経管による完全栄養サポートのために使用され得る。ENSURE PLUS HNはラクトースもグルテンも含まない。
バニラ:−D 水、マルトデキストリン(コーン)、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖(スクロース)、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、L−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンAパルミテート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンD3。
使用:(水で再構成される)ENSURE POWDERは食事と一緒または食事の間に使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残分液体食である。ENSURE POWDERはラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
使用:ENSURE PUDDINGは食事と一緒または食事の間に使用される非液体形態でバランスのとれた栄養を与える栄養分に富むサプリメントである。コンシステンシー調整食(例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体)のため、またはえん下困難な患者のために適当である。ENSURE PUDDINGはグルテンを含まない。
使用:ENSURE WITH FIBERは食物繊維及び栄養分を多く取りたいヒトのために設計された繊維を含む栄養的に完全な液体食である。ENSURE WITH FIBERは低残分食を必要としないヒトに適している。経口または経管により栄養補給され得、規則的な食事への栄養補給としてまたは適量で代用食品として使用され得る。ENSURE WITH FIBERはラクトースもグルコースも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
OxepaはARDSの危険があるかまたはその状態にある患者の食事管理のために設計された低炭水化物でカロリー的に濃い経腸栄養品である。エイコサペンタエン酸(漁油由来のEPA)、γ−リノレン酸(ルリヂサ油由来のGLA)及び高い酸化防止剤レベルを含む油ブレンドを含めた諸成分のユニークな組合せを有する。
カロリー密度は、エネルギー必要量を満たすのに必要な容量を最小限とするために1.5Cal/ml(355Cal/8fl oz)ほど高い。Oxepa中のカロリー分布を表Aに示す。
Claims (23)
- デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する前記単離ヌクレオチド配列。
- デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号36、配列番号45及び配列番号54からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列。
- モノ不飽和またはポリ不飽和脂肪酸を基質として使用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求の範囲第1項または第2項に記載のヌクレオチド配列。
- 真菌及び藻類からなる群から選択される生物由来の請求の範囲第1項または第2項に記載のヌクレオチド配列。
- 配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17及び配列番号45からなる群から選択される前記配列が真菌Thraustochytrium aureum由来であり、配列番号36からなる前記配列が真菌Schizochytrium aggregatum由来であり、配列番号54からなる前記配列が藻類Isochrysis galbana由来である請求の範囲第4項に記載のヌクレオチド配列。
- 請求の範囲第1項または第2項に記載のヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド。
- ポリ不飽和脂肪酸を炭素4において不飽和化し、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、精製ポリペプチド。
- (a)i)配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするフクレオチド配列、または
ii)デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号36、配列番号45及び配列番号54からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ、
(b)i)前記単離ヌクレオチド配列をii)プロモーターに作動的に結合して含んでいるベクターを構築するステップ、
(c)前記ベクターを宿主細胞に導入し、デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で維持するステップ
を含むデサチュラーゼの作製方法。 - (a)i)デサチュラーゼ活性を有し配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
ii)デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号36、配列番号45及び配列番号54からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列及びこれに作動的に結合している
(b)プロモーターを含むベクター。 - 請求の範囲第9項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求の範囲第9項に記載のベクターを含む植物細胞、植物または植物組織であって、前記ベクターのヌクレオチド配列を発現させると前記植物細胞、植物または植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生成される前記植物細胞、植物または植物組織。
- ポリ不飽和脂肪酸がω6−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求の範囲第11項に記載の植物細胞、植物または植物組織。
- ベクターのヌクレオチド配列を発現させるとトランスジェニック植物の種子においてポリ不飽和脂肪酸が生成される請求の範囲第9項に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
- (a)i)デサチュラーゼ活性を有し配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
ii)デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号36、配列番号45及び配列番号54からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ、
(b)前記した単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップ、
(c)前記ベクターを宿主細胞に導入し、Δ4−デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で維持するステップ、及び
(d)発現させたΔ4−デサチュラーゼを基質のポリ不飽和脂肪酸に接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ
を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法。 - 基質のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸またはω3−ドコサペンタエン酸であり、生成物のポリ不飽和脂肪酸がω6−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸である請求の範囲第14項に記載の方法。
- 更に、生成物のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼに接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップを含む請求の範囲第14項に記載の方法。
- 生成物のポリ不飽和脂肪酸がω6−ドコサペンタエン酸であり、別のポリ不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求の範囲第16項に記載の方法。
- (a)基質のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼ及びエロンガーゼからなる群から選択される1つ以上の酵素と接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ、及び
(b)ステップ(a)の生成物のポリ不飽和脂肪酸を配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号37、配列番号46及び配列番号55からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ4−デサチュラーゼに接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を最終生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ
を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法。 - 基質のポリ不飽和脂肪酸がリノール酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸及びエイコサペンタエン酸からなる群から選択される請求の範囲第18項に記載の方法。
- 最終生成物のポリ不飽和脂肪酸がω6−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求の範囲第18項に記載の方法。
- デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号55のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する前記単離ヌクレオチド配列。
- デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし配列番号54のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなるかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列。
- ポリ不飽和脂肪酸を炭素4において不飽和化し且つ配列番号55のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する精製ポリペプチド。
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