JP4171791B2

JP4171791B2 - Glucose transfer agent

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Publication number: JP4171791B2
Application number: JP2002204924A
Authority: JP
Inventors: 久成松; 雅式後藤; 裕子岩崎; 俊量矢田; 秀雄望月
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: JP2004024208A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、D-グルクロン酸残基と二残基のD-ガラクトース残基とD-キシロース残基とがグリコシド結合してなる四糖を含むN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質に対してN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する糖転移作用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべてD体を示すものとする。
【０００３】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸は、N-アセチルガラクトサミン（以下「GalNAc」とも記載する）にグルクロン酸（以下「GlcUA」とも記載する）がβ1,3結合によりグリコシド結合した二糖がβ1,4グリコシド結合で結合して連なる基本骨格を有したグリコサミノグリカンの一種である。生体内においてコンドロイチン／コンドロイチン硫酸は、タンパク質に結合したコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして合成される。その合成には様々な酵素が関与していることが知られている（糖鎖工学：産業調査会バイオテクノロジー情報センター発行（発行日：1992年8月1日））。
【０００４】
コンドロイチンプロテオグリカンは、ペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸残基のうち、セリン残基の側鎖にコンドロイチン／コンドロイチン硫酸が結合した構造を有している。すなわちコンドロイチン／コンドロイチン硫酸とセリン残基との結合部分には下記式(4)で表される構造が存在する。
【０００５】
GalNAc−GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (4)
式(4)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「Ser」は前記Xylで示されるD-キシロース残基が側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「−」はグリコシド結合を示し、この構造中、下記式(1)で表される構造を便宜的に「リンケージ四糖」とも記載する。
【０００６】
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
式(1)中、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【０００７】
上記式(4)で表される構造を合成するための酵素のうち、非還元末端のGlcUAに対してGlaNAcを転移する十分な作用を有する糖転移作用剤はこれまでは知られていなかった。すなわち、J. Biol. Chem. 277 (2002), 8841-8846にはGenBank（商標名）受け入れ番号AB071403のcDNAがコードするアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号４２乃至５３２からなるアミノ酸配列のタンパク質が有するコンドロイチン合成作用に関する記載が存在する。すなわち、当該タンパク質には上記式(4)の構造を合成しうる「合成開始作用（イニシエーション作用）」及びコンドロイチン骨格を連続的に合成しうる「基本骨格伸長作用（エロンゲーション作用）」の双方を有する旨記載されている。しかし当該文献の記述によるとGalNAc−リンケージ四糖を生ずる活性は検出不能（0.01pmol/ml 培地/h未満）であり、リンケージ四糖に対してGalNAcをGalNAc供与体基質から転移する作用を実質的に有する糖転移作用剤は存在していなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一方、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸は生体由来の材料であり、これらの安定した供給を確保するためのコンドロイチン／コンドロイチン硫酸を人工的にプロテオグリカンとして合成する方法の探索が強く望まれている。しかし、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成の開始点となるリンケージ四糖に対してN-アセチルガラクトサミンを転移する十分な作用を有する糖転移作用剤は存在せず、そのような糖転移作用剤の探索が大いに期待されていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、公知のDNAデータベースに掲載されたcDNAの部分配列を発現させた際に、リンケージ四糖に対してGalNAcを転移する強い作用を有するタンパク質が得られることを発見した。そしてそれを糖転移作用剤とすることで本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
（１）下記式(1)で示される糖鎖を含むN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質の下記式(1)における非還元末端に存在するD-グルクロン酸残基に対し、N-アセチル-D-ガラクトサミン供与体基質からN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
式(1)中、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（２）下記式(2)で示される構造を有するN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質の下記式(2)における非還元末端に存在するD-グルクロン酸残基に対し、N-アセチル-D-ガラクトサミン供与体基質からN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (2)
式(2)中、「Ser」は上記Xylで示されるD-キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「GlcUA」、「Gal」及び「−」は式(1)と同様である。
（３） N-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質に対し、N-アセチル-D-ガラクトサミン供与体基質からN-アセチル-D-ガラクトサミン残基をβ1,4結合で転移することを特徴とする（１）又は（２）記載の糖転移作用剤。
（４）糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする（１）乃至（３）何れか記載の糖転移作用剤。
（５）糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする（１）乃至（３）何れか記載の糖転移作用剤。
（６）（１）乃至（５）何れか記載の糖転移作用剤を作用させて下記式(1)で示される構造を有するN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質に対してN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式(3)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc−GlcUA−Gal−Gal−Xyl (3)
式(1)及び(3)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（７）下記式(1)で示される構造を有するN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するD-グルクロン酸残基に対して、N-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移して下記式(3)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、（１）乃至（５）何れか記載の糖転移作用剤の使用。
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc−GlcUA−Gal−Gal−Xyl (3)
式(1)及び(3)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（８）組織における配列番号１記載の塩基配列を有するDNAの発現量と、当該組織の癌化とを関連づけることを特徴とする癌化の検出方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を発明の実施の形態により詳説する。
1.本発明糖転移作用剤
本発明糖転移作用剤は下記式(1)で示される糖鎖を含むGalNAc受容体基質の下記式(1)における非還元末端に存在するGlcUAに対し、GalNAc供与体基質からGalNAcを転移する作用（イニシエーション作用）を有することを特徴とする。
【００１２】
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
式(1)中、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【００１３】
本発明糖転移作用剤におけるGalNAc受容体基質とは、GalNAcが転移される対象となる上記式(1)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされない。しかし、本発明糖転移作用剤はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を開始することができることから、好ましくは上記式(1)に示される糖鎖の還元末端に存在するD-キシロース残基はセリン残基（ペプチド鎖中の場合も含む）の側鎖に結合した構造（下記式(2)で示される構造）を有することが好ましい。
【００１４】
GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (2)
式(2)中、「Ser」は上記Xylで示されるD-キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「GlcUA」、「Gal」及び「−」は式(1)と同様である。
【００１５】
上記式(2)のGalNAc受容体基質に対して本発明糖転移作用剤を作用させてGalNAcを転移すると、下記式(4)で示す構造が得られる。
【００１６】
GalNAc-GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (4)
式(4)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「Ser」は上記Xylで示されるD-キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「GlcUA」、「Gal」及び「−」は式(1)と同様である。
【００１７】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの構造中、リンケージ四糖（プロテオグリカンにおけるペプチド（タンパク質）とコンドロイチン／コンドロイチン硫酸とが結合した領域）のグリコシド結合は各々特定の結合様式を有している。本発明糖転移作用剤は、このような特定の結合様式を有するリンケージ四糖に対してGalNAcを転移することが好ましい。生体内でコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成に使用できるからである。すなわち上記式(2)の構造を有するGalNAc受容体基質は下記式(2')の構造を有することがより好ましい。
【００１８】
GlcUAβ1−3Galβ1−3Galβ1−4Xyl−Ser (2')
式(2')中の「GlcUA」、「Gal」、「Xyl」、「Ser」及び「−」は上記式(2)と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
【００１９】
本発明糖転移作用剤におけるGalNAc供与体基質としてはGalNAcを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−N-アセチルガラクトサミン（ADP-GalNAc）、ウリジン二リン酸−N-アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）、グアノシン二リン酸−N-アセチルガラクトサミン（GDP-GalNAc）、シチジン二リン酸−N-アセチルガラクトサミン（CDP-GalNAc）などが例示され、UDP-GalNAcが最も好ましいが特に限定はされない。
【００２０】
本発明糖転移作用剤は、前記GalNAc受容体基質に対し前記GalNAc供与体基質からGalNAcをβ1,4グリコシド結合で転移する。コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンにおけるリンケージ四糖へのGalNAcの結合はβ1,4グリコシド結合でなされているからである。
【００２１】
また更に、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸に共通の構造であるコンドロイチン骨格（(4GlcUAβ1-3GalNAcβ1-)_n ｎ≧1）中の非還元末端に存在するGlcUAに対しても、GalNAc供与体基質からGalNAcを転移する作用を本発明糖転移作用剤は有することが好ましい。更に上記と同様にGalNAcをβ1,4グリコシド結合によって転移する作用を有していることが天然のコンドロイチン／コンドロイチン硫酸を構成する基本骨格であるため好ましい。
【００２２】
このような本発明糖転移作用剤の作用は、例えば実施例に記載した高速液体クロマトグラフィー（以下「HPLC」とも記載する）を用いた方法によって容易に確認することが可能である。本発明糖転移作用剤のGalNAc転移作用によって生じた生成物の検出は、例えば吸光度を測定して行うことが可能である。また予めGalNAc供与体基質のGalNAcを蛍光色素や放射性同位元素（H³（トリチウム）、C¹⁴など）で標識して、予想される生成物の分子量画分における標識物質の検出を組み合わせることによっても正確に検出することが可能である。本発明糖転移作用剤は本明細書中実施例２（３）記載の方法で転移作用を測定した結果、リンケージ四糖−メトキシフェニル（以下「リンケージ四糖-MP」と記載する）に対するGalNAc転移作用が10 pmol/ml培地/hであることが好ましく、15 pmol/ml培地/h以上であることがより好ましく、20pmol/ml培地/h以上であることが最も好ましい。また同様にコンドロイチンに対するGalNAc転移作用が10pmol/ml培地/h以上であることが好ましく、15pmol/ml培地/h以上であることがより好ましい。更に、リンケージ四糖-MPに対するGalNAc転移作用はコンドロイチンに対するGalNAc転移作用よりも高いことが、効率よくコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成開始剤として働くため極めて好ましい。
【００２３】
本発明糖転移作用剤の活性は本明細書中実施例２（３）記載の方法で測定した場合には、生化学工業株式会社製のコンドロイチンに対するGalNAc転移作用(C)とリンケージ四糖-MPに対するGalNAc転移作用（L）との相対活性比（(C)/(L)）が0.9未満、好ましくは0.85未満、0.75未満であること最も好ましい。このような本発明糖転移作用剤は、イニシエーション作用が強くコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成への使用に極めて適している。
【００２４】
本発明糖転移作用剤の構造は、配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であることが、上述したGalNAc転移作用を強く有する観点から好ましい。特に配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であることがリンケージ四糖に対するGalNAc転移作用が強いことから極めて好ましい。
【００２５】
２．本発明糖転移作用剤の調製
本発明糖転移作用剤の調製は例えば以下の方法に従って行うことができる。
上記したように特に配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質が最も好ましい本発明糖転移作用剤であるので、それをコードするDNA（本発明糖転移作用剤のタンパク質をコードするDNA）の調製方法及びその発現方法を説明する
【００２６】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが存在するヒト組織のcDNAなどを用いることで効率的に該DNAを増幅することが可能である。このような組織としては例えば軟骨組織、骨髄組織、胎盤、甲状腺等が例示され、特に骨髄組織が好ましい。このような組織の細胞を使用して調製したcDNAライブラリーを鋳型として使用するポリメラーゼチェインリアクション法（以下「PCR法」とも記載する）等の既知の方法により本発明糖転移作用剤のタンパク質をコードするDNAを比較的容易に調製することが可能である。PCR法には例えば配列番号１４の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号１５からなる3'プライマーとを使用することができ、常法に従って行うことができる。上記で例示したプライマーを用いる場合には約1.6kbpのDNA断片が増幅産物として生ずるので、この断片を単離する。単離の方法は常法によって行うことができ、例えばアガロースゲル電気泳動後に1.2kbp近辺をのゲルを切り出し、MagExtractor（商標名：東洋紡株式会社製）などを用いて容易に単離することが可能である。増幅産物は常法に従って適当な宿主細胞で発現するための基本ベクターに組み込むことが可能である。宿主細胞と基本ベクターの組み合わせは当業者であれば培養に使用する宿主細胞に合わせて適宜選択することができ、その選択された基本ベクターに適切な方法で増幅産物を基本ベクターに組み込むことが可能である。宿主細胞しては原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌など）であっても真核細胞（例えば酵母、昆虫細胞、ほ乳類細胞など）であっても使用することは可能である。特に原核細胞を宿主細胞として用いた場合には、DNA断片を発現させた際に得られる産物には糖鎖が付加されないため、「タンパク質」のみを得ることが可能である。しかし、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成は通常は真核生物で行われているため、本発明糖転移作用剤のタンパク質も真核細胞を宿主細胞として調製することが好ましい。その中でも特に昆虫細胞（大量合成の面で極めて優れる）又はほ乳類細胞（増幅産物が通常発現しているのはほ乳類細胞である）が例示される。
【００２７】
また上記基本ベクターに挿入したDNA断片の発現を行う際に、生じたタンパク質の同定・分析及び単離・精製を容易とするために、DNA断片がコードするタンパク質と適当な識別ペプチドとの融合タンパク質としてDNA断片が発現しうるように構築することが好ましい。前記識別ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、タンパク質の選別のために細胞内では機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を6〜10個並べて配したペプチド配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の13アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸配列からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸配列）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸配列）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸配列）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（βガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインGからなる群から選択されるいずれかのペプチドが例示され、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法によるタンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、抗体を用いることで極めて容易にタンパク質の精製が可能となることから、特にFLAGペプチドが好ましい。
【００２８】
例えばFLAGペプチドとの融合タンパク質としてDNA断片を発現させた場合には、抗FLAG抗体（例えばM1など）が結合した樹脂などを使用することで、宿主細胞の培養物（培養上清や宿主細胞の抽出物など）からタンパク質を容易に単離・精製することが可能であり、またその樹脂をそのまま本発明糖転移作用剤として使用することも可能である。
【００２９】
３．本発明合成方法
本発明合成方法は、本発明糖転移作用剤を作用させて、下記式(1)で示される構造を有するGalNAc受容体基質に対してGalNAcを転移することを特徴とする、下記式(3)で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。
【００３０】
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc−GlcUA−Gal−Gal−Xyl (3)
式(1)及び(3)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」はD-グルクロン酸残基を示し、「Gal」はD-ガラクトース残基を示し、「Xyl」はD-キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【００３１】
本発明合成方法におけるGalNAc受容体基質とは、GalNAcが転移される対象となる上記式(1)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされない。しかし、本発明糖転移作用剤はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を開始することができることから、好ましくは上記式(1)に示される糖鎖の還元末端に存在するD-キシロース残基はセリン残基（ペプチド鎖中の場合も含む）の側鎖に結合した構造（下記式(2)で示される構造）を有することが好ましい。
【００３２】
GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (2)
式(2)中、「Ser」は上記Xylで示されるD-キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「GlcUA」、「Gal」及び「−」は式(1)と同様である。
【００３３】
上記式(2)のGalNAc受容体基質に対して本発明糖転移作用剤を作用させてGalNAcを転移すると、下記式(4)で示す構造が得られる。
【００３４】
GalNAc-GlcUA−Gal−Gal−Xyl−Ser (4)
式(4)中、「GalNAc」はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を示し、「Ser」は上記Xylで示されるD-キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記Serで示されるセリン残基の側鎖に結合したD-キシロース残基を示し、「GlcUA」、「Gal」及び「−」は式(1)と同様である。
【００３５】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの構造中、リンケージ四糖のグリコシド結合は各々特定の結合様式を有している。本発明合成方法におけるGalNAc受容体基質も、このような特定の結合様式を有するリンケージ四糖であることが好ましい。生体内でコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成に使用できるからである。すなわち上記式(2)の構造を有するGalNAc受容体基質は下記式(2')の構造を有することがより好ましい。
【００３６】
GlcUAβ1−3Galβ1−3Galβ1−4Xyl−Ser (2')
式(2')中の「GlcUA」、「Gal」、「Xyl」、「Ser」及び「−」は上記式(2)と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
【００３７】
本発明合成方法におけるGalNAcはGalNAc供与体基質からGalNAc受容体基質に対して転移される。ここでGalNAc供与体基質としてはGalNAcを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばADP-GalNAc、UDP-GalNAc、GDP-GalNAc、CDP-GalNAcなどが例示され、UDP-GalNAcが最も好ましいが特に限定はされない。生体内では主にUDP-GalNAcがGalNAc供与体基質として働いているからである。
【００３８】
本発明合成方法に使用する本発明糖転移作用剤は、前記GalNAc受容体基質に対し前記GalNAc供与体基質からGalNAcをβ1,4グリコシド結合で転移する。コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンにおけるリンケージ四糖へのGalNAcの結合はβ1,4グリコシド結合でなされているからである。
【００３９】
本発明合成方法におけるGalNAc供与体基質からGalNAc受容体基質へのGalNAcの転移作用は、安定した一定のpH、温度条件下で行われることが好ましい。例えばpHは5.0乃至9.0が好ましく、5.5〜8.0がより好ましく、6.0〜7.5であることが最も好ましい。このような条件を保つために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましい。緩衝液としては酢酸緩衝液、2-モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（以下単に「MES」とも記載する）、ヒドロキシメチルアミノエタン-塩酸緩衝液（以下単に「Tris-HCl緩衝液」とも記載する）、及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましいpH範囲（pH6.0〜7.5）全体において安定したpHを保つ作用が強いことからMESが最も好ましい。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが10〜200mM、好ましい範囲としては20〜100mMが例示される。
作用時の温度条件は20〜45℃が例示され、好ましくは24〜40℃、最も好ましくは36〜37℃が例示される。
【００４０】
なお、好ましい本発明糖転移作用剤はコンドロイチン及びコンドロイチン硫酸の基本骨格（(4GlcUAβ1-3GalNAcβ1-)_n ｎ≧1）中の非還元末端に存在するGlcUA残基に対しても、GalNAc供与体基質からGalNAcを転移する作用（「エロンゲーション作用」とも記載する）を有することが好ましい。
【００４１】
上記と同条件を用いて本発明糖転移作用剤により、(GlcUA−GalNAc)_nで示される受容体基質にGalNAc供与体基質からGalNAcを転移して下記式(5)の構造を有する糖鎖の合成をすることも可能である。
【００４２】
GalNAc−(GlcUA−GalNAc)_n (5)
上記式(5)において「GalNAc」はN-アセチルガラクトサミン残基を、「GlcUA」、及び「−」は式(1)におけるものと同義であり、ｎは1以上の整数を示す。
【００４３】
この場合において本発明糖転移作用剤は(GlcUA−GalNAc)_n（ｎは1以上の整数）の非還元末端に存在するGlcUAにGalNAcを転移してGalNAc-(GlcUA−GalNAc)_nを生成する反応を触媒する作用を示す。転移における結合様式はβ1,4結合である。
本発明糖転移作用剤は、上述の式(3)及び式(5)記載の糖鎖の合成に使用することができ、式(3)又は式(5)の構造を有する糖鎖の式(3)又は式(5)中の非還元末端に存在するGalNAcを転移するための使用は本発明使用となる。
【００４４】
４．本発明検出方法
本発明検出方法は、組織における配列番号１記載の塩基配列を有するDNAの発現量と、当該組織の癌化とを関連づけることを特徴とする癌化の検出方法である。
本発明検出方法における組織とは、いずれの組織であってもよく、例えば神経、甲状腺、血球、骨髄、大腸、胃、皮膚、肝臓、膵臓、卵巣等が例示されるがこれに限定はされない。これらの組織は、例えば生検などの方法で採取して本発明検出方法に使用することができる。本発明検出方法においては配列番号１記載の塩基配列を有するDNAの発現量が定量されるが、当該発現量の定量は例えば後述の実施例に記載された定量的リアルタイムPCR法（例えば配列番号１８記載の塩基配列からなる5'プライマー、配列番号１９記載の塩基配列から3'プライマー、及びマイナーグルーブ結合物質などが結合した配列番号２０記載の塩基配列からなるプローブを用いる）等の常法を用いることで容易に行うことができる。PCR法などを用いて発現量の定量を行う場合には、必ずしも配列番号１記載の全塩基配列を増幅して定量する必要はなく、その一部分の領域（例えば当該塩基配列記載の塩基番号25乃至1623からなる領域の任意の0.1乃至1.5kbの領域）を増幅して定量することができる。なお、当該DNAの発現量の定量は、当該DNAがコードするタンパク質の量を常法に従って定量することによっても行うことができる。
【００４５】
本発明検出方法においては、例えば生検によって得た患部域組織に含まれる健常組織部分と病変組織部分とで上記DNAの発現量を対比して、健常組織部分における上記DNAの発現量より病変組織部分における上記DNAの発現量が変化している場合、好ましくは低下している場合に、病変組織部分が癌化しているとすることで、癌化の検出を容易に行うことができる。例えば、後述の定量的リアルタイムPCR法を用いて上記DNAの発現量の定量を行なった場合、健常組織部分と比して病変組織部分における上記DNAの発現量が1/2以下、好ましくは1/3以下、最も好ましくは1/5以下に低下している場合に、病変組織部分が癌化しているとして癌化の検出することが好ましいが、これに限定はされない。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明をより具体的に詳説する。
試験例１
HPLCを用いた酵素活性の測定
基質を含む50mM MES緩衝液（pH6.5、0.1% TritonX-100(商標名)、1mMの糖残基供与体基質、10mM MnCl₂及び500μMの糖残基受容体基質を含む）20μlと酵素懸濁液10μlとを混合し、37℃で16時間反応させた。反応終了後、反応混液をウルトラフリー-MCカラム（ミリポア社製）で濾過した。10μlの濾液を逆相カラム（ODS-80Ts QAカラム：4.6×250mm 東ソー株式会社製）を用いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した。移動相としては0.1% TFA（トリフルオロ酢酸）/水を使用した。溶出は条件は流速1ml/分、50℃で行なった。
【００４７】
溶出ピークの検出には210nmにおける吸光度測定を用い、SPD-10A_vp（島津製作所株式会社製）を使用した。また、糖残基によって修飾されたペプチドの検出には蛍光標識を用いた。すなわちCy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を用いて修飾されたペプチドの蛍光標識を行い、RF-10A_XL（島津製作所株式会社製）で検出した。
【００４８】
試験例２
質量分析法による反応生成物の分析
エレクトロスプレーイオン化質量分析（以下「ESI-MS」と記載する）はEsquire3000plus（ブルッカーダルトニクス社製）で行なった。また、マトリックス支援レーザーイオン化-飛行時間質量分析（以下「MALDI-TOF-MS」と記載する）はReflex IV（ブルッカーダルトニクス社製）で行なった。
【００４９】
ESI-MS用の試料の調製は以下の通り行った。すなわち試料25pmolを蒸留水5μlに溶解し、更に45μlの0.1%蟻酸及び50μlのメタノールを添加して試料溶液を調製した。試料溶液はキャピラリー電圧3kVで3μl/分で注入した。ESI-MSでの192.00 m/zのピークは再度エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS/MS）を行った。これらの分析は陽イオン及び陰イオンの双方のモードで行った。
MALDI-TOF-MS用の試料は10pmolの試料を乾燥させ、1μlの蒸留水に溶解して調製した。
【００５０】
試験例３
GalNAc転移作用の定量
試験例１と同様の反応液に、40,000から55,000 dpmのUDP-[¹⁴C]GalNAc（パーキンエルマーライフサイエンス社製）、及び1μg又は100μgのGalNAc受容体基質を添加し、37℃で1時間ないし16時間反応させた。反応液はSuperdex Peptide HR10/30（アマシャムバイオサイエンス社製）でゲルろ過分画し、各画分の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。また、産物の定量は、１つのピークに相当する全画分の放射能を加算して行った。
【００５１】
調製例１
β4ガラクトース転移酵素7（β4Gal-T7）、β3ガラクトース転移酵素6（β3Gal-T6）及びグルクロン酸転移酵素I（GlcAT-I）と、FLAGペプチドとの融合タンパク質の調製
β4Gal-T7、β3Gal-T6又はGlcAT-IはFLAGペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞又はほ乳類細胞で発現するように構築した。
【００５２】
ヒト骨髄由来のMarathon-Ready（商標名） cDNAを鋳型としてPCR法を行った。β4Gal-T7の増幅には配列番号３の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号４からなる3'プライマーとを使用してPCR法によりDNA断片を増幅した。同様にGlcAT-Iの増幅には配列番号５の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号６からなる3'プライマーとを使用してPCR法によりDNA断片を増幅した。増幅産物をIwai, Tらの方法（J. Biol. Chem.発行準備中）によりプラスミドベクター pFBIFに挿入してpFBIF-β4Gal-T7及びpFBIF-GlcAT-Iを得た。
【００５３】
β3Gal-T6の増幅には配列番号７の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号８からなる3'プライマーとを使用してPCR法によりDNA断片を増幅し、断片をシグマ社製のpFLAG-CMV-1のBamHI-XbaIサイトに常法により挿入してpFLAG-β3Gal-T6を得た。
【００５４】
pFBIF-β4Gal-T7及びpFBIF-GlcAT-Iは常法に従ってSf21（昆虫由来の培養細胞株）に導入し、pFLAG-β3Gal-T6は常法に従ってCOS-1（サル脾臓由来の培養細胞株）に導入した。ベクターにより組換えられた宿主細胞（組換体）を0.5% CO₂/Air条件下、37℃で2日間培養して各目的タンパク質を発現させた。その後培養上清を回収し、1000×gで15分間遠心処理して上清のみを50ml回収し、抗FLAG M1抗体が結合した樹脂（シグマ社製）と混合した。タンパク質と樹脂の混合物は１mMのCaCl₂を含む50mM TBS（50mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl）で二回洗浄し、活性測定用緩衝液100μlに懸濁した（各々β4Gal-T7懸濁液、GlcAT-I懸濁液、及びβ3Gal-T6懸濁液とした）。
【００５５】
実施例１
本発明糖転移作用剤の調製
（１）DNA断片の単離
クローニングされたβ1,4-ガラクトース転移酵素（以下「β4Gal-T1」と記載する）のアミノ酸配列を基にして、インターネット上の配列検索ソフト「BLAST」を用いて近似した配列を検索した。β4Gal-T1の特徴的アミノ酸配列（配列番号９）を有するEST（Expression-Sequence-Tag：GenBank（商標名）受け入れ番号 AK055154）を発見した。オープンリーディングフレーム（ORF）の塩基配列を得るためにMarathon-Ready（商標名） cDNA増幅キット（クロンテック社製）を用いてcDNA末端高速増幅法（5'RACE法）を行なった。5'末端の配列は二段階の5'RACE法で増幅した。第一段の5'RACE法には、PCR法のために配列番号１０の塩基配列からなるプライマーを使用し、ネステッドPCR法のために配列番号１１記載の塩基配列からなるプライマーを使用した。第二段の5'RACE法には配列番号１２記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１３記載の塩基配列からなるプライマーとを用いて行なった。得られた約1.6kbのDNA断片を常法に従って塩基配列の解析をしたところ、配列番号１記載の塩基配列からなることが確認された。このcDNAをCSGalNAc-T cDNAとし、それがコードするタンパク質をCSGalNAc-Tとした。この塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２記載の通りだった。また、上記BLASTでの検索に用いたβGal-T1とのアミノ酸配列の対比を図１に示した。この対比により得られたDNAがβGal-T1と相同性が見られたことから、CSGalNAc-Tは糖転移酵素の可能性が示唆された。
【００５６】
（２）FLAG-CSGalNAc-T（活性部位）融合タンパク質の構築と精製
上記で得られたDNA断片がコードするアミノ酸配列（配列番号２）から、CSGalNAc-Tの活性部位はアミノ酸番号３７乃至５３２の領域と予測された。この領域のアミノ酸配列からなるタンパク質とFLAGペプチドとが融合した分泌型のタンパク質を昆虫細胞に分泌させて得るために、付属マニュアルに従ってGATEWAY（商標名）システム（インビトロゲン社製）を行なった。
【００５７】
まず、ヒト骨髄由来のMarathon-Ready（商標名） cDNAを鋳型として用い、配列番号１４の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号１５からなる3'プライマーとを使用してPCR法によりDNA断片を増幅した。増幅産物をIwai, Tらの方法（J. Biol. Chem.発行準備中）によりプラスミドベクター pFBIFに挿入してpFBIF-CSGalNAc-T（活性部位）を得た（「CSGalNAc-Tの活性部位」を以下「CSGalNAc-TC」と記載する）。このpFBIF-CSGalNAc-TCを昆虫由来の培養細胞株 Sf21に常法に従って導入し、その後細胞を27℃で4日間培養した培養上清を1次ウィルスとした。さらに、同様の操作を4回繰り返し、4度目の培養上清を回収した。その後培養上清を1000×gで15分間遠心処理して上清のみを50ml回収し、抗FLAG M1抗体が結合した樹脂（シグマ社製）と混合した。タンパク質と樹脂の混合物は１mMのCaCl₂を含む50mM TBS（50mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl）で二回洗浄し、活性測定用緩衝液100μlに懸濁した（作用剤懸濁液）。
【００５８】
実施例２
CSGalNAc-TCの基質特異性の検討
GalNAc供与体基質としてウリジン二リン酸-GalNAc（UDP-GalNAc：シグマ社製）、GalNAc受容体基質としてGlcUA-β-パラニトロフェニル（GlcUA-β-pNp）を使用して試験例１に従ってHPLCによる酵素活性の分析を行った。アセトニトリルによる濃度勾配溶出法による溶出は0〜15%の濃度勾配を使用した。その結果、対照には見られなかった新たな溶出ピークが55.4分に検出された（図２Ｂ：Ａは対照）。
【００５９】
55.4分のピークを回収し試験例２に従ってESI-MSを行なった。陽イオンモードでは519.05m/zのピークが観察された（図３Ａ）。このピークはGalNAc-GlcUA-pNpの分子量に相当していた。このピークを回収し、試験例２に従ってESI-MS/MSで更に分析したところ、203.91m/z及び298.97m/zに新たなピークが観察された（図３Ｂ）。203.91m/zのピークはGalNAcの分子量に相当し、298.97m/zのピークはGlcUA-pNpのピークに相当した。
【００６０】
更に55.4分のピークを回収して試験例２に従ってESI-MSを陰イオンモードで行なったところ生成物はGalNAc-GlcUA-pNpに相当する517.19m/zと水を失ったGlcUA-pNpに相当する296.00m/zが観察された。
【００６１】
これらの結果から、CSGalNAc-TCはGlcUAにGalNAcを転移する活性を有することが明らかになった。従来知られているGalNAcとGlcUAとの結合は、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸にしか存在が知られていない。従ってCSGalNAc-TCはコンドロイチン／コンドロイチン硫酸のGlcUAにGalNAcを転移する作用を有しているものと考えられた。
【００６２】
（１）エロンゲーション作用の検討
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸鎖中でのGalNAc-GlcUA結合は、二糖の繰り返し構造（3GalNAcβ1-4GlcUAβ1-）_n中での結合、及びコンドロイチン硫酸とリンケージ四糖（GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl）との結合の二種類が知られている。CSGalNAc-TCがエロンゲーション作用を有するか否かを調べるために、コンドロイチン（生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製））がGlcNAc受容体基質として働くか否かを調べた。糖残基受容体としてコンドロイチン及びコンドロイチン硫酸Ｃを用いて試験例１に従ってHPLCを用いて酵素活性の分析を行ったところ、逆相クロマトグラフィーで双方ともに新たなピークが観察された（コンドロイチン硫酸Ｃを糖残基受容体として使用した場合には溶出ピークは極めて低かった）（図４矢印）。この溶出ピークを回収し、コンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）で消化して、Superdex Peptide HR10/30（ファルマシア社製）でゲルろ過分析した。その結果、GalNAcがGlcUAにβ1-4結合で付加されていることが確認された。
【００６３】
（２）イニシエーション作用の検討
イニシエーション作用は合成基質のリンケージ四糖-メトキシフェニル（GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-MP：生化学工業株式会社提供）をGalNAc受容体基質として用いて試験例１記載の方法により観察した。その結果、GalNAc受容体基質の29.7分の溶出ピーク(S)の他に、28.9分の新たな溶出ピーク(P)が生じた（図５Ｂ：Ａは対照）。
【００６４】
これらのピークを回収して試験例２に従ってMALDI-TOF MSで解析した。ピークSは質量779.20m/zを示し、この質量はリンケージ四糖の質量と同じであった（図６Ａ）。一方、ピークPの分析においては982.23m/z及び1004.21m/zの二つのピークが観察された（図６Ｂ）。982.23m/zはGalNAcが結合したリンケージ四糖-MPの質量に相当し、1004.21m/zはGalNAcが結合したリンケージ四糖-MPとナトリウムイオンとが結合した質量に相当していた。更に、ピークPの物質は、「（１）コンドロイチン伸長作用の検討」で記載した方法と同様の方法でコンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）で消化して調べた結果、GalNAcは非還元末端に結合していることが明かとなった。
これらの結果からCSGalNAc-TCはリンケージ四糖の非還元末端のGlcUAに対してGalNAcを転移してコンドロイチン／コンドロイチン硫酸合成の開始を行うことが明かとなった。
【００６５】
（３）各種基質に対するGalNAc転移作用の定量
CSGalNAc-TCの各種GalNAc受容体基質に対するGalNAc転移活性を比較した。使用したGalNAc受容体基質としては、コンドロイチン（クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａから酸性メタノール溶液で脱硫酸して調製したもの：生化学工業株式会社製）、コンドロイチンのオリゴマー（14糖、12糖、10糖、8糖、6糖：生化学工業株式会社より恵与）、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社））、コンドロイチン硫酸のオリゴマー（14糖、12糖、10糖、8糖、6糖：Biochem. J., 226(1985), 705-714に従って調製した）およびリンケージ四糖-MP（生化学工業株式会社より恵与）である。また、方法は実施例２に示した方法を用いた（表１）。
【００６６】
【表１】

【００６７】
CSGalNAc-TCは、他の基質と比較してリンケージ四糖-MPにGalNAcを転移する作用が最も強いことがこの結果から明かとなった。また、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸伸長作用に関しては、何れも低い活性であるが、長いオリゴ糖へのGalNAc転移作用の方が短いオリゴ糖へのGalNAc転移作用よりも強いことが明かとなった。
【００６８】
実施例３
組織におけるCSGalNAc-Tの発現の解析
（１）組織におけるCSGalNAc-T遺伝子の転写産物及びその量の解析
組織におけるCSGalNAc-T遺伝子の転写産物の分子量はノザンブロットハイブリダイゼーション法によって解析した。ノザンブロットハイブリダイゼーション法は実施例１（１）で調製したDNA断片の3'末端部に存在する695bpの翻訳されない領域をプローブとして行なった。プローブの調製は、上記DNA断片を鋳型として用い、配列番号１６の塩基配列からなる5'プライマーと配列番号１７の塩基配列からなる3'プライマーとを用いて常法に従ってPCR法により増幅して6.9kbpの断片として回収した。
【００６９】
ノザンブロットハイブリダイゼーションはクロンテック社製のMultiple Tissue Northern Blot IIIをハイブリダイズ用RNAとして用いて行なった。またプローブのラベルと検出はAlkPhos Direct Labeling（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）及び、CDP-StarとHyperfilmとを含んだ検出システム（アマシャム
バイオサイエンス株式会社製）。
【００７０】
ハイブリダイズは50%ホルムアミド、5×SSPE（20×SSPE：2.97M NaCl、0.2M NaH₂PO₄・H₂O、0.025M EDTAを含むpH7.4の水溶液）、5×デンハルト溶液（100×デンハルト液：1gのフィコール400（ファルマシア社製）、1gのポリビニルピロリドン（PVP-360：シグマ社製）、1gのBSAフラクションV（牛血清アルブミン：シグマ社製）を50mlの水に溶解した水溶液）、0.5%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、サケ精子DNAの存在下、42℃で16時間のインキュベートして行い、更にその後の0.1%SDSを含む1×SSPE、0.1%SDSを含む0.1×SSPEによる55℃での順次洗浄を行なった。
【００７１】
その結果、CSGalNAc-Tの転写産物は約4.4kbpであることが明かとなった（図７）。組織毎にその量には差異があったものの、CSGalNAc-Tの転写産物は解析した全ての組織で検出された。
【００７２】
（２）組織及び培養細胞株におけるCSGalNAc-T転写量の定量的リアルタイムPCR法による解析
定量的リアルタイムPCR法はIwai, T.ら（J. Biol. Chem., 277(2002), 12802-12809）、Genome Res. 6(1996), 995-1001、Genome Res., 6(1996), 986-994等に記載された方法によって行なった。様々なヒト組織から増幅されたMarathon Ready cDNA（クロンテック社製）及び培養細胞株（GOTO、SCCH-26：神経芽腫由来細胞、T98G、U251：膠芽腫由来細胞、SW1736：甲状腺癌由来細胞、HL-60：前骨髄球白血病由来細胞、Namalwa：B細胞白血病由来細胞、Daudi：B細胞バーキットリンパ腫由来細胞、U937：単球由来白血病由来細胞、K562：赤芽球様白血病由来細胞、U266：骨髄腫由来細胞、Colo205、HCT15、LSB、SW480：大腸癌由来細胞、MKN45、KATO III：胃癌由来細胞、G-361：黒色腫由来細胞、HepG2：肝臓癌由来細胞、Capan-2：膵臓癌由来細胞、PA-1：卵巣奇形腫由来細胞）から常法により増幅して得たcDNAライブラリーを用いた。定量の基準としては段階希釈したpCR2.1（インビトロゲン社製：グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のDNAを含んでいる）を用いた。
【００７３】
プライマー、プローブの組み合わせは配列番号１８記載の塩基配列からなる5'プライマー、配列番号１９記載の塩基配列からなる3'プライマー、及びマイナーグルーブ結合物質がついた配列番号２０記載の塩基配列からなるプローブの組み合わせを用いた。PCR産物はABI PRISM 7700シークエンス検出システム（アプライドバイオシステムス社製）で継続的に検出した。GAPDH転写物の量によりCSGalNAc-T転写産物量を標準化した。
その結果、何れの組織に於いてもCSGalNAc-Tの転写は観察されたが、特に甲状腺と胎盤における転写量が高いことが明かとなった（図８）。また、いずれの癌由来の細胞においてもCSGalNAc-Tの転写量は極めて低いことが判明した（図９）。このことから、CSGalNAc-Tの転写量の低下は癌化の示標となりうることが示され、CSGalNAc-Tは癌化の検出に使用できる可能性が示唆された。
【００７４】
（３）in situハイブリダイゼーション解析
in situハイブリダイゼーション解析に使用するためのリボプローブは、実施例１（１）で調製したDNA断片の翻訳されない3'末端の695bpの領域をpGEM-T Easy（プロメガ社製）に挿入して調製した。デオキシゲニンで標識したセンス及びアンチセンスのプローブはこのプラスミドのT7プロモータ及びSP6プロモータによって生ずるように構築した（センスプローブは陰性対照として働く）。胎盤組織の固定及びハイブリダイズはJ. Biol. Chem. 273(1998), 26729-26738記載の方法に従って行なった（図１０）。その結果、胎盤の脱落膜、合胞体層、栄養膜細胞層、線維細胞などの全ての種類の細胞でCSGalNAc-Tの発現が観察された。センスプローブで検出した試料に於いては何も検出されなかった。
【００７５】
実施例４
コンドロイチン五糖の酵素的合成
四種類の糖転移酵素（調製例１で調製したβ4Gal-T7・β3Gal-T6及びGlcAT-I、及びCSGalNAc-TC）及び四糖合成系の受容体基質（キシロース結合ペプチド（配列番号２１：第9番目のアミノ酸残基であるセリンに側鎖としてキシロースが結合しているビクニンのN-末端配列：ペプチド研究所製））を使用し、合成された五糖合成系の受容体基質であるリンケージ四糖と、リンケージ四糖にGalNAcが結合した五糖の酵素学的合成を各々行なった。そして各々の反応後の産物を試験例１記載のHPLCによって分析した（四糖合成：図１１Ｂ，五糖合成：図１１Ｃ）。
【００７６】
反応液の組成は下表の通りで、反応は37℃で16時間行った。既知酵素によるそれぞれの産物は、各酵素を一つずつ添加していき、新たに一種類のみのピークが生じることを確認した。また、CSGalNAc-Tによる産物は、実施例２で示したコンドロイチナーゼAC-II消化により確認した。これらの結果から、四糖合成系ではセリン残基の側鎖にリンケージ四糖が結合したビクニンのN-末端配列（プロテオグリカン）が合成され、また五糖合成系では同様にリンケージ四糖とGalNAcとが結合した五糖を糖鎖として有するコンドロイチンプロテオグリカンが合成されたことが明かとなった。
【００７７】
【表２】

【００７８】
【発明の効果】
リンケージ四糖に対してGalNAcをGalNAc供与体基質から転移する十分な作用を有する糖転移作用剤が本発明により提供され、それによりコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの効率よい合成が可能となる。
【００７９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 CSGalNAc-Tのアミノ酸配列とβ4Gal-T1のアミノ酸配列とのホモロジーを示す図である。
【図２】 UDP-GalNAcからGlcUA-β-pNpへのGalNAc転移活性をHPLCによって分析したチャートを示す図。Ａは対照を示す。
【図３】 UDP-GalNAcからGlcUA-β-pNpへのGalNAc転移活性をESI-MS及びESI-MS/MSで観察したチャートを示す図。ＡはESI-MSのチャートを示し、ＢはESI-MS/MSのチャートを示す。
【図４】コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸Ｃに対するGalNAc転移活性をHPLCによって分析したチャートを示す図。
【図５】 UDP-GalNAcからリンケージ四糖-MPへのGalNAc転移活性をHPLCによって分析したチャートを示す図。Ａは対照を示す。
【図６】 UDP-GalNAcからリンケージ四糖-MPへのGalNAc転移活性をMALDI-TOF MSによって分析したチャートを示す図。Ａは図５ＢのSピークを分析した図であり、Ｂは図５ＢのPピークを分析した図である。
【図７】組織におけるCSGalNAc-Tの発現のノザンブロットハイブリダイゼーションによる像を示す写真である。
【図８】各組織におけるCSGalNAc-Tの発現量のリアルタイムPCRでの相対比較を示す図である。
【図９】各培養細胞におけるCSGalNAc-Tの発現量のリアルタイムPCRでの相対比較を示す図である。
【図１０】 in situハイブリダイゼーションで胎盤組織におけるCSGalNAc-Tの発現を観察した写真である。
【図１１】本発明糖転移作用剤によるコンドロイチンプロテオグリカン合成を示す図である。Ａはキシロース結合ペプチドをHPLCで分析したチャートを示す。Ｂは四糖合成系での反応生成物をHPLCで分析したチャートを示す図であり、Ｃは五糖合成系での反応生成物をHPLCで分析したチャートを示す図である。Ｄは各ピークに存在する物質を模式的に示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an N-acetyl-D-galactosamine receptor substrate containing a tetrasaccharide formed by glycosidic bonding of a D-glucuronic acid residue, two D-galactose residues, and a D-xylose residue. The present invention relates to a glycosyl transfer agent that transfers N-acetyl-D-galactosamine residues.
[0002]
[Prior art]
In the following description of the sugars and sugar residues in the present specification, all optical isomers indicate D forms unless otherwise specified.
[0003]
Chondroitin / chondroitin sulfate is a disaccharide in which glucuronic acid (hereinafter also referred to as “GlcUA”) is glycosidically linked to N-acetylgalactosamine (hereinafter also referred to as “GalNAc”) by β1,3 linkage, and is linked by β1,4 glycoside linkage. It is a kind of glycosaminoglycan having a continuous basic skeleton. In vivo, chondroitin / chondroitin sulfate is synthesized as chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan bound to protein. It is known that various enzymes are involved in the synthesis (Glycoengineering: Published by Industrial Research Institute Biotechnology Information Center (issue date: August 1, 1992)).
[0004]
Chondroitin proteoglycan has a structure in which chondroitin / chondroitin sulfate is bound to the side chain of a serine residue among amino acid residues constituting a peptide or protein. In other words, a chondroitin / chondroitin sulfate and serine residue bond has a structure represented by the following formula (4).
[0005]
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (4)
In formula (4), `` GalNAc '' represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, `` GlcUA '' represents a D-glucuronic acid residue, `` Gal '' represents a D-galactose residue, and `` Xyl '' Indicates the D-xylose residue bound to the side chain of the serine residue indicated by Ser, and “Ser” indicates the serine residue (in the peptide chain) where the D-xylose residue indicated by Xyl is bound to the side chain. In this structure, the structure represented by the following formula (1) is also referred to as “linkage tetrasaccharide” for convenience.
[0006]
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
In formula (1), “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, “Gal” represents a D-galactose residue, “Xyl” represents a D-xylose residue, and “−” represents a glycosidic bond. Show.
[0007]
Among the enzymes for synthesizing the structure represented by the above formula (4), a glycosyl transfer agent having a sufficient action of transferring GlaNAc to non-reducing terminal GlcUA has not been known so far. That is, J. Biol. Chem. 277 (2002), 8841-8846 includes chondroitin possessed by a protein having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 42 to 532 among the amino acid sequences encoded by the cDNA of GenBank (trade name) accession number AB071403. There is a description of the synthetic action. That is, the protein has both a “synthesis initiation action (initiation action)” that can synthesize the structure of the above formula (4) and a “basic skeleton elongation action (elongation action)” that can continuously synthesize a chondroitin skeleton. It is stated that it has. However, according to the description of the literature, the activity to produce GalNAc-linkage tetrasaccharide is undetectable (less than 0.01 pmol / ml medium / h), and the action of transferring GalNAc from the GalNAc donor substrate to the linkage tetrasaccharide is substantial. There were no glycosyltransferases.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
On the other hand, chondroitin / chondroitin sulfate is a material derived from a living body, and a search for a method for artificially synthesizing chondroitin / chondroitin sulfate as a proteoglycan for securing a stable supply thereof is strongly desired. However, there is no transglycosylation agent that has sufficient action to transfer N-acetylgalactosamine to the linkage tetrasaccharide, which is the starting point for the synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan. Was highly expected.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies for solving the above problems, the present inventors have a strong action of transferring GalNAc to linkage tetrasaccharide when expressing a partial sequence of cDNA published in a known DNA database. I found that protein was obtained. And this invention was completed by making it into a glycosyl transfer agent.
That is, the present invention is as follows.
[0010]
(1) N-acetyl with respect to the D-glucuronic acid residue present at the non-reducing end in the following formula (1) of the N-acetyl-D-galactosamine receptor substrate containing a sugar chain represented by the following formula (1) A sugar transfer agent characterized by having an action of transferring an N-acetyl-D-galactosamine residue from a D-galactosamine donor substrate.
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
In formula (1), “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, “Gal” represents a D-galactose residue, “Xyl” represents a D-xylose residue, and “−” represents a glycosidic bond. Show.
(2) N-acetyl-D-glucuronic acid residue present at the non-reducing end of the N-acetyl-D-galactosamine receptor substrate having the structure represented by the following formula (2) in the following formula (2) A glycosyl transfer agent characterized by having an action of transferring an N-acetyl-D-galactosamine residue from a D-galactosamine donor substrate.
GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (2)
In the formula (2), “Ser” represents a serine residue (including the case in the peptide chain) in which the D-xylose residue represented by Xyl is bound to the side chain, and “Xyl” represents the Ser. D-xylose residue bonded to the side chain of the serine residue, “GlcUA”, “Gal”, and “−” are the same as in formula (1).
(3) It is characterized by transferring N-acetyl-D-galactosamine residue from N-acetyl-D-galactosamine donor substrate by β1,4 bond to N-acetyl-D-galactosamine acceptor substrate ( The glycosyltransferase agent according to 1) or (2).
(4) The glycosyl transfer agent comprises a protein comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein (1) to (3) Any of the glycosyltransferases.
(5) The glycosyl transfer agent includes a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein (1) to (3) Any of the glycosyltransferases.
(6) The N-acetyl-D-galactosamine receptor substrate having the structure represented by the following formula (1) by the action of the glycosyl transfer agent described in any one of (1) to (5) A method for synthesizing a sugar chain having a structure represented by the following formula (3), which comprises transferring a D-galactosamine residue.
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl (3)
In formulas (1) and (3), “GalNAc” represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, and “Gal” represents a D-galactose residue. "Xyl" represents a D-xylose residue, and "-" represents a glycosidic bond.
(7) N-acetyl-D-galactosamine residue in comparison with D-glucuronic acid residue present at the non-reducing end of the N-acetyl-D-galactosamine receptor substrate having the structure represented by the following formula (1) Use of a glycosyl transfer agent according to any one of (1) to (5) for synthesizing a sugar chain having a structure represented by the following formula (3) by transferring
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl (3)
In formulas (1) and (3), “GalNAc” represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, and “Gal” represents a D-galactose residue. "Xyl" represents a D-xylose residue, and "-" represents a glycosidic bond.
(8) A method for detecting canceration, comprising associating the expression level of a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in a tissue with the canceration of the tissue.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
1. Glucose transfer agent of the present invention
The glycosyl transfer agent of the present invention acts to transfer GalNAc from a GalNAc donor substrate to GlcUA present at the non-reducing end of the following formula (1) of a GalNAc acceptor substrate containing a sugar chain represented by the following formula (1) (Initiation action).
[0012]
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
In formula (1), “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, “Gal” represents a D-galactose residue, “Xyl” represents a D-xylose residue, and “−” represents a glycosidic bond. Show.
[0013]
The GalNAc receptor substrate in the sugar transfer agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains a sugar chain of the above formula (1) to which GalNAc is transferred. However, since the glycosyl transfer agent of the present invention can initiate the synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan, the D-xylose residue present at the reducing end of the sugar chain represented by the above formula (1) is preferably a serine residue. It preferably has a structure (structure represented by the following formula (2)) bonded to a side chain of a group (including a case in a peptide chain).
[0014]
GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (2)
In the formula (2), “Ser” represents a serine residue (including the case in the peptide chain) in which the D-xylose residue represented by Xyl is bound to the side chain, and “Xyl” represents the Ser. D-xylose residue bonded to the side chain of the serine residue, “GlcUA”, “Gal”, and “−” are the same as in formula (1).
[0015]
When GalNAc is transferred by applying the glycosyltransferase agent of the present invention to the GalNAc receptor substrate of the above formula (2), a structure represented by the following formula (4) is obtained.
[0016]
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (4)
In the formula (4), “GalNAc” represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, and “Ser” represents a serine residue (in the peptide chain) where a D-xylose residue represented by Xyl is bound to its side chain. "Xyl" represents a D-xylose residue bonded to the side chain of the serine residue represented by Ser, and "GlcUA", "Gal" and "-" represent formula (1) It is the same.
[0017]
In the structure of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans, the glycosidic bonds of the linkage tetrasaccharide (the region where the peptide (protein) and chondroitin / chondroitin sulfate are combined in proteoglycan) each have a specific binding mode. The sugar transfer agent of the present invention preferably transfers GalNAc to a linkage tetrasaccharide having such a specific binding mode. This is because it can be used for synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans in vivo. That is, the GalNAc receptor substrate having the structure of the above formula (2) more preferably has the structure of the following formula (2 ′).
[0018]
GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl-Ser (2 ')
“GlcUA”, “Gal”, “Xyl”, “Ser” and “−” in the formula (2 ′) are the same as those in the above formula (2). β represents a β bond, and a number represents a bonding position (glycoside bond existing position) with an adjacent sugar residue.
[0019]
The GalNAc donor substrate in the sugar transfer agent of the present invention is preferably a sugar nucleotide having GalNAc. Examples of such substances include adenosine diphosphate-N-acetylgalactosamine (ADP-GalNAc), uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine (UDP-GalNAc), guanosine diphosphate-N-acetylgalactosamine (GDP-GalNAc). ), Cytidine diphosphate-N-acetylgalactosamine (CDP-GalNAc) and the like, and UDP-GalNAc is most preferred, but is not particularly limited.
[0020]
The sugar transfer agent of the present invention transfers GalNAc from the GalNAc donor substrate to the GalNAc acceptor substrate through β1,4 glycosidic bonds. This is because GalNAc is bound to the linkage tetrasaccharide in chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan by β1,4 glycosidic bond.
[0021]
Furthermore, the chondroitin skeleton ((4GlcUAβ1-3GalNAcβ1-), a structure common to chondroitin and chondroitin sulfate _n The glycosyl transfer agent of the present invention preferably has an action of transferring GalNAc from a GalNAc donor substrate to GlcUA present at the non-reducing end in n ≧ 1). Further, as described above, it is preferable to have an action of transferring GalNAc by β1,4 glycosidic bond because it is a basic skeleton constituting natural chondroitin / chondroitin sulfate.
[0022]
Such an action of the sugar transfer agent of the present invention can be easily confirmed by, for example, a method using high performance liquid chromatography (hereinafter also referred to as “HPLC”) described in Examples. The detection of the product produced by the GalNAc transfer action of the sugar transfer agent of the present invention can be performed, for example, by measuring the absorbance. In addition, the GalNAc donor substrate, GalNAc, is preliminarily converted into a fluorescent dye or a radioisotope (H ^Three (Tritium), C ¹⁴ Etc.) and can also be detected accurately by combining the detection of the labeled substance in the molecular weight fraction of the expected product. As a result of measuring the transfer action of the sugar transfer agent of the present invention by the method described in Example 2 (3) of this specification, GalNAc transfer to linkage tetrasaccharide-methoxyphenyl (hereinafter referred to as “linkage tetrasaccharide-MP”). The action is preferably 10 pmol / ml medium / h, more preferably 15 pmol / ml medium / h or more, and most preferably 20 pmol / ml medium / h or more. Similarly, the GalNAc transfer action on chondroitin is preferably 10 pmol / ml medium / h or more, more preferably 15 pmol / ml medium / h or more. Furthermore, it is extremely preferable that the GalNAc transfer action on linkage tetrasaccharide-MP is higher than the GalNAc transfer action on chondroitin because it works efficiently as a chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan synthesis initiator.
[0023]
When the activity of the sugar transfer agent of the present invention is measured by the method described in Example 2 (3) of this specification, GalNAc transfer action (C) and linkage tetrasaccharide-MP on chondroitin manufactured by Seikagaku Corporation. Most preferably, the relative activity ratio ((C) / (L)) to GalNAc transfer action (L) is less than 0.9, preferably less than 0.85 and less than 0.75. Such a glycosyl transfer agent of the present invention has a high initiation effect and is extremely suitable for use in the synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans.
[0024]
The structure of the glycosyltransferase of the present invention is a protein comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein, which strongly enhances the above-described GalNAc transfer activity. From the viewpoint of having. In particular, a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein in which a sugar chain is bound to the protein is extremely preferable because of its strong GalNAc transfer effect on linkage tetrasaccharide.
[0025]
2. Preparation of the glycosyl transfer agent of the present invention
The glycosyl transfer agent of the present invention can be prepared according to the following method, for example.
As described above, a protein consisting of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein is the most preferred glycosyl transfer agent of the present invention, and therefore encodes it. The preparation method of DNA (DNA encoding the protein of the glycosyltransferase agent of the present invention) and the expression method thereof will be described.
[0026]
By using cDNA of human tissue in which chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans are present, it is possible to efficiently amplify the DNA. Examples of such tissues include cartilage tissue, bone marrow tissue, placenta, thyroid and the like, and bone marrow tissue is particularly preferable. The protein of the glycosyltransferase of the present invention is encoded by a known method such as polymerase chain reaction method (hereinafter also referred to as “PCR method”) using a cDNA library prepared using cells of such tissues as a template. DNA can be prepared relatively easily. For example, a 5 ′ primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and a 3 ′ primer consisting of SEQ ID NO: 15 can be used in the PCR method, and can be performed according to a conventional method. When the primers exemplified above are used, a DNA fragment of about 1.6 kbp is generated as an amplification product, and this fragment is isolated. The isolation method can be performed by a conventional method. For example, a gel around 1.2 kbp can be cut out after agarose gel electrophoresis and easily isolated using MagExtractor (trade name: manufactured by Toyobo Co., Ltd.). It is. The amplification product can be incorporated into a basic vector for expression in an appropriate host cell according to a conventional method. The combination of the host cell and the basic vector can be appropriately selected by those skilled in the art according to the host cell used for the culture, and the amplification product can be incorporated into the basic vector by a method suitable for the selected basic vector. It is. The host cell can be a prokaryotic cell (eg, E. coli, Bacillus subtilis, etc.) or a eukaryotic cell (eg, yeast, insect cell, mammalian cell, etc.). In particular, when a prokaryotic cell is used as a host cell, only a “protein” can be obtained because a sugar chain is not added to a product obtained when a DNA fragment is expressed. However, since the synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan is usually performed in eukaryotes, it is preferable to prepare the protein of the glycosyltransferase agent of the present invention using eukaryotic cells as host cells. Among these, insect cells (very excellent in terms of mass synthesis) or mammalian cells (amplified products are usually expressed in mammalian cells) are exemplified.
[0027]
In order to facilitate the identification, analysis, isolation and purification of the resulting protein when expressing the DNA fragment inserted into the basic vector, a fusion protein of the protein encoded by the DNA fragment and an appropriate identification peptide It is preferable to construct so that a DNA fragment can be expressed. Examples of the identification peptide include a signal peptide (a peptide consisting of 15 to 30 amino acid residues present at the N-terminal of many proteins and functioning in cells for protein selection: for example, OmpA, OmpT, Dsb, etc. ), Protein kinase A, protein A (a protein constituting the S. aureus cell wall and having a molecular weight of about 42,000), glutathione S-transferase, His tag (a peptide sequence in which 6 to 10 histidine residues are arranged side by side), myc tag ( 13 amino acid sequence derived from cMyc protein), FLAG peptide (analytical marker consisting of 8 amino acid sequence), T7 tag (first 11 amino acid sequence of gene10 protein), S tag (15 amino acid sequence derived from pancreatic RNaseA), HSV tag, pelB (22 amino acid sequence of E. coli outer membrane protein pelB), HA tag (10 amino acid sequence derived from hemagglutinin), Trx tag (thioredoxin sequence) , CBP tag (calmodulin-binding peptide), CBD tag (cellulose-binding domain), CBR tag (collagen-binding domain), β-lac / blu (β-lactamase), β-gal (β-galactosidase), luc (luciferase), HP- Thio (His-patch thioredoxin), HSP (heat shock peptide), Lnγ (laminin γ peptide), Fn (fibronectin partial peptide), GFP (green fluorescent peptide), YFP (yellow fluorescent peptide), CFP (cyan fluorescent peptide), Any one selected from the group consisting of BFP (blue fluorescent peptide), DsRed, DsRed2 (red fluorescent peptide), MBP (maltose binding peptide), LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avidin, and protein G Peptides are exemplified, and any identification peptide can be used. Among these, signal peptides, protein kinase A, protein A, glutathione S transferase, His tag, myc tag, FLAG peptide, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB or HA tag are expressed by genetic engineering techniques. The FLAG peptide is particularly preferable because the purification is easier and the protein can be purified very easily by using an antibody.
[0028]
For example, when a DNA fragment is expressed as a fusion protein with a FLAG peptide, a host cell culture (such as a culture supernatant or a host cell) can be obtained by using a resin to which an anti-FLAG antibody (for example, M1) is bound. It is possible to easily isolate and purify proteins from extracts and the like, and it is also possible to use the resin as it is as a glycosyl transfer agent of the present invention.
[0029]
3. Synthesis method of the present invention
The synthesis method of the present invention is characterized in that GalNAc is transferred to a GalNAc receptor substrate having a structure represented by the following formula (1) by the action of the glycosyltransferase agent of the present invention. A method for synthesizing a sugar chain having the structure represented by
[0030]
GlcUA−Gal−Gal−Xyl (1)
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl (3)
In formulas (1) and (3), “GalNAc” represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, “GlcUA” represents a D-glucuronic acid residue, and “Gal” represents a D-galactose residue. "Xyl" represents a D-xylose residue, and "-" represents a glycosidic bond.
[0031]
The GalNAc receptor substrate in the synthesis method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a sugar chain of the above formula (1) to which GalNAc is transferred. However, since the glycosyl transfer agent of the present invention can initiate the synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan, the D-xylose residue present at the reducing end of the sugar chain represented by the above formula (1) is preferably a serine residue. It preferably has a structure (structure represented by the following formula (2)) bonded to a side chain of a group (including a case in a peptide chain).
[0032]
GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (2)
In the formula (2), “Ser” represents a serine residue (including the case in the peptide chain) in which the D-xylose residue represented by Xyl is bound to the side chain, and “Xyl” represents the Ser. D-xylose residue bonded to the side chain of the serine residue, “GlcUA”, “Gal”, and “−” are the same as in formula (1).
[0033]
When GalNAc is transferred by applying the glycosyltransferase agent of the present invention to the GalNAc receptor substrate of the above formula (2), a structure represented by the following formula (4) is obtained.
[0034]
GalNAc-GlcUA-Gal-Gal-Xyl-Ser (4)
In the formula (4), “GalNAc” represents an N-acetyl-D-galactosamine residue, and “Ser” represents a serine residue (in the peptide chain) where a D-xylose residue represented by Xyl is bound to its side chain. "Xyl" represents a D-xylose residue bonded to the side chain of the serine residue represented by Ser, and "GlcUA", "Gal" and "-" represent formula (1) It is the same.
[0035]
In the chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan structure, each glycosidic linkage of the linkage tetrasaccharide has a specific binding mode. The GalNAc receptor substrate in the synthesis method of the present invention is also preferably a linkage tetrasaccharide having such a specific binding mode. This is because it can be used for synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans in vivo. That is, the GalNAc receptor substrate having the structure of the above formula (2) more preferably has the structure of the following formula (2 ′).
[0036]
GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl-Ser (2 ')
“GlcUA”, “Gal”, “Xyl”, “Ser” and “−” in the formula (2 ′) are the same as those in the above formula (2). β represents a β bond, and a number represents a bonding position (glycoside bond existing position) with an adjacent sugar residue.
[0037]
GalNAc in the synthesis method of the present invention is transferred from a GalNAc donor substrate to a GalNAc acceptor substrate. Here, the GalNAc donor substrate is preferably a sugar nucleotide having GalNAc. Examples of such substances include ADP-GalNAc, UDP-GalNAc, GDP-GalNAc, CDP-GalNAc and the like, and UDP-GalNAc is most preferred but is not particularly limited. This is because UDP-GalNAc mainly functions as a GalNAc donor substrate in vivo.
[0038]
The sugar transfer agent of the present invention used in the synthesis method of the present invention transfers GalNAc from the GalNAc donor substrate to the GalNAc acceptor substrate by β1,4 glycosidic bond. This is because GalNAc is bound to the linkage tetrasaccharide in chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycan by β1,4 glycosidic bond.
[0039]
The transfer action of GalNAc from the GalNAc donor substrate to the GalNAc acceptor substrate in the synthesis method of the present invention is preferably performed under stable and constant pH and temperature conditions. For example, the pH is preferably 5.0 to 9.0, more preferably 5.5 to 8.0, and most preferably 6.0 to 7.5. In order to maintain such conditions, the transfer reaction is preferably performed in a buffer solution. As the buffer solution, acetate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid buffer (hereinafter also simply referred to as “MES”), hydroxymethylaminoethane-hydrochloric acid buffer (hereinafter also simply referred to as “Tris-HCl buffer”), And sodium phosphate buffer and the like, and any of them can be used. However, MES is most preferred because it has a strong effect of maintaining a stable pH throughout the most preferred pH range (pH 6.0 to 7.5) in the synthesis method of the present invention. The concentration of the buffering agent in the buffer solution is not particularly limited, but 10 to 200 mM, and a preferable range is 20 to 100 mM.
The temperature condition during the action is exemplified by 20 to 45 ° C, preferably 24 to 40 ° C, and most preferably 36 to 37 ° C.
[0040]
A preferred glycosyltransferase of the present invention is a basic skeleton of chondroitin and chondroitin sulfate ((4GlcUAβ1-3GalNAcβ1-) _n It is preferable that the GlcUA residue present at the non-reducing end in n ≧ 1) also has an action of transferring GalNAc from the GalNAc donor substrate (also referred to as “elongation action”).
[0041]
(GlcUA-GalNAc) _n It is also possible to synthesize a sugar chain having the structure of the following formula (5) by transferring GalNAc from a GalNAc donor substrate to an acceptor substrate represented by
[0042]
GalNAc- (GlcUA-GalNAc) _n (Five)
In the above formula (5), “GalNAc” is an N-acetylgalactosamine residue, “GlcUA” and “−” are synonymous with those in formula (1), and n is an integer of 1 or more.
[0043]
In this case, the glycosyltransferase of the present invention is (GlcUA-GalNAc) _n GalNAc is transferred to GlcUA existing at the non-reducing end of (n is an integer of 1 or more) GalNAc- (GlcUA-GalNAc) _n The effect | action which catalyzes reaction which produces | generates is shown. The binding mode in the transition is β1,4 bond.
The glycosyl transfer agent of the present invention can be used for the synthesis of the sugar chains described in the above formulas (3) and (5), and the sugar chain formula having the structure of formula (3) or formula (5) ( Use for transferring GalNAc present at the non-reducing end in 3) or formula (5) is a use of the present invention.
[0044]
4). Detection method of the present invention
The detection method of the present invention is a canceration detection method characterized by associating the expression level of a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in a tissue with the canceration of the tissue.
The tissue in the detection method of the present invention may be any tissue, and examples thereof include nerves, thyroid gland, blood cells, bone marrow, large intestine, stomach, skin, liver, pancreas, ovary and the like, but are not limited thereto. These tissues can be collected by a method such as biopsy and used in the detection method of the present invention. In the detection method of the present invention, the expression level of DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is quantified. The expression level is quantified by, for example, the quantitative real-time PCR method (for example, SEQ ID NO: 18) described in Examples below. A conventional method such as a 5 ′ primer consisting of the base sequence described above, a 3 ′ primer from the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 bound with a minor groove binding substance or the like is used. This can be done easily. When quantifying the expression level using PCR or the like, it is not always necessary to amplify and quantify the entire base sequence described in SEQ ID NO: 1, but a partial region thereof (for example, base numbers 25 to 25 described in the base sequence). An arbitrary 0.1 to 1.5 kb region of 1623) can be amplified and quantified. The expression level of the DNA can also be determined by quantifying the amount of protein encoded by the DNA according to a conventional method.
[0045]
In the detection method of the present invention, for example, the expression level of the DNA is compared between a healthy tissue portion and a lesion tissue portion contained in the affected area tissue obtained by biopsy, and the lesion tissue is compared with the expression level of the DNA in the healthy tissue portion. When the expression level of the DNA in the portion changes, preferably decreases, the lesioned tissue portion has become cancerous, so that canceration can be easily detected. For example, when the expression level of the DNA is quantified using the quantitative real-time PCR method described later, the expression level of the DNA in the diseased tissue part is 1/2 or less, preferably 1 / It is preferable to detect canceration as a lesion tissue portion is cancerous when it is reduced to 3 or less, most preferably 1/5 or less, but is not limited thereto.
[0046]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
Test example 1
Measurement of enzyme activity using HPLC
50 mM MES buffer containing substrate (pH 6.5, 0.1% TritonX-100 ™, 1 mM sugar residue donor substrate, 10 mM MnCl ₂ 20 μl (including 500 μM sugar residue acceptor substrate) and 10 μl of enzyme suspension were mixed and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was filtered through an Ultra Free-MC column (Millipore). 10 μl of the filtrate was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using a reverse phase column (ODS-80Ts QA column: 4.6 × 250 mm, manufactured by Tosoh Corporation). As the mobile phase, 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) / water was used. Elution was performed at a flow rate of 1 ml / min and 50 ° C.
[0047]
For detection of the elution peak, absorbance measurement at 210 nm was used, and SPD-10A _vp (Shimadzu Corporation) was used. In addition, a fluorescent label was used to detect a peptide modified with a sugar residue. That is, fluorescent labeling of modified peptides using Cy5 (Amersham Biosciences) was performed, and RF-10A _XL (Shimadzu Corporation).
[0048]
Test example 2
Analysis of reaction products by mass spectrometry
Electrospray ionization mass spectrometry (hereinafter referred to as “ESI-MS”) was performed with Esquire3000plus (manufactured by Bruker Daltonics). Matrix-assisted laser ionization-time-of-flight mass spectrometry (hereinafter referred to as “MALDI-TOF-MS”) was performed with Reflex IV (manufactured by Bruker Daltonics).
[0049]
A sample for ESI-MS was prepared as follows. That is, 25 pmol of a sample was dissolved in 5 μl of distilled water, and 45 μl of 0.1% formic acid and 50 μl of methanol were further added to prepare a sample solution. The sample solution was injected at 3 μl / min with a capillary voltage of 3 kV. The 192.00 m / z peak in ESI-MS was again subjected to electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS / MS). These analyzes were performed in both positive and negative ion modes.
A sample for MALDI-TOF-MS was prepared by drying a 10 pmol sample and dissolving it in 1 μl of distilled water.
[0050]
Test example 3
Quantification of GalNAc transfer action
In the same reaction solution as in Test Example 1, 40,000 to 55,000 dpm of UDP- [ ¹⁴ C] GalNAc (manufactured by Perkin Elmer Life Sciences) and 1 μg or 100 μg of GalNAc receptor substrate were added, and reacted at 37 ° C. for 1 to 16 hours. The reaction solution was subjected to gel filtration fractionation with Superdex Peptide HR10 / 30 (Amersham Bioscience), and the radioactivity of each fraction was measured with a liquid scintillation counter. The product was quantified by adding the radioactivity of all fractions corresponding to one peak.
[0051]
Preparation Example 1
Preparation of fusion protein of FLAG peptide with β4 galactosyltransferase 7 (β4Gal-T7), β3 galactosyltransferase 6 (β3Gal-T6) and glucuronyltransferase I (GlcAT-I)
β4Gal-T7, β3Gal-T6 or GlcAT-I was constructed to be expressed in insect cells or mammalian cells as a fusion protein with a FLAG peptide.
[0052]
PCR was performed using Marathon-Ready (trade name) cDNA derived from human bone marrow as a template. For the amplification of β4Gal-T7, a DNA fragment was amplified by PCR using a 5 ′ primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a 3 ′ primer consisting of SEQ ID NO: 4. Similarly, for amplification of GlcAT-I, a DNA fragment was amplified by the PCR method using a 5 ′ primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a 3 ′ primer consisting of SEQ ID NO: 6. The amplified product was inserted into the plasmid vector pFBIF by the method of Iwai, T et al. (J. Biol. Chem. In preparation) to obtain pFBIF-β4Gal-T7 and pFBIF-GlcAT-I.
[0053]
For amplification of β3Gal-T6, a DNA fragment was amplified by PCR using a 5 ′ primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a 3 ′ primer consisting of SEQ ID NO: 8, and the fragment was pFLAG-CMV manufactured by Sigma. PFLAG-β3Gal-T6 was obtained by insertion into the BamHI-XbaI site of -1 by a conventional method.
[0054]
pFBIF-β4Gal-T7 and pFBIF-GlcAT-I are introduced into Sf21 (insect-derived cultured cell line) according to a conventional method, and pFLAG-β3Gal-T6 is introduced into COS-1 (monkey spleen-derived cultured cell line) according to a conventional method. Introduced. Host cells (recombinant) recombined with the vector at 0.5% CO ₂ Each target protein was expressed by culturing at 37 ° C. for 2 days under / Air conditions. Thereafter, the culture supernatant was collected, centrifuged at 1000 × g for 15 minutes, 50 ml of the supernatant alone was collected, and mixed with a resin (manufactured by Sigma) bound with anti-FLAG M1 antibody. The protein and resin mixture is 1 mM CaCl ₂ Was washed twice with 50 mM TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) and suspended in 100 μl of activity measurement buffer (β4Gal-T7 suspension, GlcAT-I suspension, and β3Gal-T6 suspension).
[0055]
Example 1
Preparation of the glycosyl transfer agent of the present invention
(1) Isolation of DNA fragments
Based on the amino acid sequence of the cloned β1,4-galactosyltransferase (hereinafter referred to as “β4Gal-T1”), an approximate sequence was searched using the sequence search software “BLAST” on the Internet. An EST (Expression-Sequence-Tag: GenBank (trade name) accession number AK055154) having a characteristic amino acid sequence of β4Gal-T1 (SEQ ID NO: 9) was discovered. In order to obtain the base sequence of the open reading frame (ORF), a cDNA end high-speed amplification method (5′RACE method) was performed using a Marathon-Ready (trade name) cDNA amplification kit (manufactured by Clontech). The sequence at the 5 ′ end was amplified by a two-step 5 ′ RACE method. In the first stage 5′RACE method, a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 was used for the PCR method, and a primer consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 11 was used for the nested PCR method. The 5′RACE method in the second stage was carried out using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. The obtained DNA fragment of about 1.6 kb was analyzed for the base sequence according to a conventional method, and it was confirmed that it consisted of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. This cDNA was designated as CSGalNAc-T cDNA, and the protein encoded by it was designated as CSGalNAc-T. The amino acid sequence encoded by this base sequence was as shown in SEQ ID NO: 2. In addition, FIG. 1 shows a comparison of the amino acid sequence with βGal-T1 used for the above BLAST search. The DNA obtained by this comparison was found to be homologous with βGal-T1, suggesting that CSGalNAc-T may be a glycosyltransferase.
[0056]
(2) Construction and purification of FLAG-CSGalNAc-T (active site) fusion protein
From the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA fragment obtained above, the active site of CSGalNAc-T was predicted to be the region of amino acid numbers 37 to 532. In order to obtain a secretory protein in which a protein comprising an amino acid sequence of this region and a FLAG peptide are fused to insect cells, a GATEWAY (trade name) system (manufactured by Invitrogen) was performed according to the attached manual.
[0057]
First, Marathon-Ready (trade name) cDNA derived from human bone marrow was used as a template, and a DNA fragment was obtained by PCR using a 5 ′ primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 14 and a 3 ′ primer consisting of SEQ ID NO: 15. Amplified. The amplified product was inserted into the plasmid vector pFBIF by the method of Iwai, T et al. (Preparing for publication in J. Biol. Chem.) To obtain pFBIF-CSGalNAc-T (active site) ("CSGalNAc-T active site" Hereinafter referred to as “CSGalNAc-TC”). This pFBIF-CSGalNAc-TC was introduced into an insect-derived cultured cell line Sf21 according to a conventional method, and then the culture supernatant was cultured at 27 ° C. for 4 days as a primary virus. Further, the same operation was repeated four times, and the fourth culture supernatant was collected. Thereafter, the culture supernatant was centrifuged at 1000 × g for 15 minutes to recover 50 ml of the supernatant alone and mixed with a resin (manufactured by Sigma) bound with anti-FLAG M1 antibody. The protein and resin mixture is 1 mM CaCl ₂ Was washed twice with 50 mM TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) and suspended in 100 μl of an activity measurement buffer (agent suspension).
[0058]
Example 2
Examination of substrate specificity of CSGalNAc-TC
By HPLC according to Test Example 1 using uridine diphosphate-GalNAc (UDP-GalNAc: Sigma) as a GalNAc donor substrate and GlcUA-β-paranitrophenyl (GlcUA-β-pNp) as a GalNAc acceptor substrate The enzyme activity was analyzed. A concentration gradient of 0 to 15% was used for elution by the concentration gradient elution method using acetonitrile. As a result, a new elution peak that was not seen in the control was detected at 55.4 minutes (FIG. 2B: A is the control).
[0059]
A peak at 55.4 minutes was collected and ESI-MS was performed according to Test Example 2. In the positive ion mode, a peak of 519.05 m / z was observed (FIG. 3A). This peak corresponded to the molecular weight of GalNAc-GlcUA-pNp. When this peak was recovered and further analyzed by ESI-MS / MS according to Test Example 2, new peaks were observed at 203.91 m / z and 298.97 m / z (FIG. 3B). The 203.91 m / z peak corresponds to the molecular weight of GalNAc, and the 298.97 m / z peak corresponds to the GlcUA-pNp peak.
[0060]
Furthermore, when the peak of 55.4 minutes was collected and ESI-MS was conducted in the negative ion mode according to Test Example 2, the product was equivalent to 517.19 m / z corresponding to GalNAc-GlcUA-pNp and GlcUA-pNp having lost water. 296.00 m / z was observed.
[0061]
From these results, it became clear that CSGalNAc-TC has an activity to transfer GalNAc to GlcUA. The conventionally known binding between GalNAc and GlcUA is known only to chondroitin / chondroitin sulfate. Therefore, CSGalNAc-TC was considered to have an action of transferring GalNAc to GlcUA of chondroitin / chondroitin sulfate.
[0062]
(1) Examination of elongation effect
GalNAc-GlcUA binding in chondroitin / chondroitin sulfate chains is a disaccharide repeat structure (3GalNAcβ1-4GlcUAβ1-) _n There are two types of binding, and the binding between chondroitin sulfate and linkage tetrasaccharide (GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl). In order to examine whether CSGalNAc-TC has an elongation effect, chondroitin (manufactured by Seikagaku Corporation) and chondroitin sulfate (chondroitin sulfate A (derived from whale cartilage: manufactured by Seikagaku Corporation)), chondroitin sulfate B ( Pig skin derived: Seikagaku Corporation), chondroitin sulfate C (shark cartilage origin: Seikagaku Corporation), chondroitin sulfate D (shark cartilage origin: Seikagaku Corporation)) as GlcNAc receptor substrates I checked whether it worked. When enzyme activity was analyzed using HPLC according to Test Example 1 using chondroitin and chondroitin sulfate C as sugar residue receptors, new peaks were observed in both cases by reverse phase chromatography (chondroitin sulfate C). When used as a sugar residue receptor, the elution peak was very low) (arrow in FIG. 4). This elution peak was collected, digested with chondroitinase ACII (Seikagaku Corporation), and subjected to gel filtration analysis with Superdex Peptide HR10 / 30 (Pharmacia). As a result, it was confirmed that GalNAc was added to GlcUA with a β1-4 bond.
[0063]
(2) Examination of initiation action
The initiation action was observed by the method described in Test Example 1 using the synthetic substrate linkage tetrasaccharide-methoxyphenyl (GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-MP: provided by Seikagaku Corporation) as the GalNAc receptor substrate. As a result, in addition to the 29.7 minute elution peak (S) of the GalNAc receptor substrate, a new elution peak (P) of 28.9 minutes occurred (FIG. 5B: A is a control).
[0064]
These peaks were collected and analyzed by MALDI-TOF MS according to Test Example 2. Peak S showed a mass of 779.20 m / z, which was the same as that of the linkage tetrasaccharide (FIG. 6A). On the other hand, in the analysis of the peak P, two peaks of 982.23 m / z and 1004.21 m / z were observed (FIG. 6B). 982.23 m / z corresponded to the mass of linkage tetrasaccharide-MP bound to GalNAc, and 1004.21 m / z corresponded to the mass of linkage tetrasaccharide-MP bound to GalNAc and sodium ion. Furthermore, the substance of peak P was examined by digesting with chondroitinase ACII (Seikagaku Corporation) in the same manner as described in “(1) Examination of chondroitin elongation action”. It was revealed that it was bound to the reducing end.
These results indicate that CSGalNAc-TC initiates chondroitin / chondroitin sulfate synthesis by transferring GalNAc to GlcUA at the non-reducing end of the linkage tetrasaccharide.
[0065]
(3) Quantification of GalNAc transfer action on various substrates
The GalNAc transfer activity of CSGalNAc-TC against various GalNAc receptor substrates was compared. As the GalNAc receptor substrate used, chondroitin (prepared by desulfation with whale cartilage-derived chondroitin sulfate A with an acidic methanol solution: manufactured by Seikagaku Corporation), chondroitin oligomer (14 sugar, 12 sugar, 10 sugar) Sugar, octasaccharide, hexasaccharide: provided by Seikagaku Corporation, chondroitin sulfate (chondroitin sulfate A (from whale cartilage: manufactured by Seikagaku Corporation)), chondroitin sulfate B (from pig skin: Seikagaku Corporation) ), Chondroitin sulfate C (derived from shark cartilage: produced by Seikagaku Corporation), chondroitin sulfate D (derived from shark cartilage: produced by Seikagaku Corporation)), oligomers of chondroitin sulfate (14 sugars, 12 sugars, 10 sugars, 8 Sugar, hexasaccharide: prepared according to Biochem. J., 226 (1985), 705-714) and linkage tetrasaccharide-MP (given from Seikagaku Corporation). Further, the method shown in Example 2 was used (Table 1).
[0066]
[Table 1]

[0067]
This result revealed that CSGalNAc-TC had the strongest effect of transferring GalNAc to linkage tetrasaccharide-MP compared to other substrates. In addition, chondroitin and chondroitin sulfate elongating action were both low in activity, but it was revealed that the GalNAc transfer action to a long oligosaccharide is stronger than the GalNAc transfer action to a short oligosaccharide.
[0068]
Example 3
Analysis of CSGalNAc-T expression in tissues
(1) Analysis of CSGalNAc-T gene transcripts and their amounts in tissues
The molecular weight of CSGalNAc-T gene transcript in tissues was analyzed by Northern blot hybridization. Northern blot hybridization was performed using a 695 bp untranslated region present at the 3 ′ end of the DNA fragment prepared in Example 1 (1) as a probe. The probe was prepared using the above DNA fragment as a template, amplified by the PCR method according to a conventional method using a 5 ′ primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 16 and a 3 ′ primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 17 to obtain 6.9. It was recovered as a kbp fragment.
[0069]
Northern blot hybridization was carried out using Multiple Tissue Northern Blot III manufactured by Clontech as hybridization RNA. Probe labeling and detection are performed using AlkPhos Direct Labeling (Amersham Biosciences) and a detection system (Amersham) including CDP-Star and Hyperfilm.
Bioscience Corporation).
[0070]
Hybridization is 50% formamide, 5 x SSPE (20 x SSPE: 2.97M NaCl, 0.2M NaH ₂ PO _Four ・ H ₂ O, aqueous solution of pH 7.4 containing 0.025M EDTA), 5 × Denhardt's solution (100 × Denhardt's solution: 1 g Ficoll 400 (Pharmacia), 1 g polyvinylpyrrolidone (PVP-360: Sigma), 1 g BSA Fraction V (Aqueous solution of bovine serum albumin: Sigma) dissolved in 50 ml of water), 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate), salmon sperm DNA, incubated at 42 ° C. for 16 hours, and further Thereafter, sequential washing was performed at 55 ° C. with 1 × SSPE containing 0.1% SDS and 0.1 × SSPE containing 0.1% SDS.
[0071]
As a result, it was revealed that the transcription product of CSGalNAc-T was about 4.4 kbp (FIG. 7). CSGalNAc-T transcripts were detected in all tissues analyzed, although the amounts differed from tissue to tissue.
[0072]
(2) Quantitative real-time PCR analysis of CSGalNAc-T transcription in tissues and cultured cell lines
The quantitative real-time PCR method is described in Iwai, T. et al. (J. Biol. Chem., 277 (2002), 12802-12809), Genome Res. 6 (1996), 995-1001, Genome Res., 6 (1996), This was performed by the method described in 986-994. Marathon Ready cDNA (Clontech) amplified from various human tissues and cultured cell lines (GOTO, SCCH-26: neuroblastoma-derived cells, T98G, U251: glioblastoma-derived cells, SW1736: thyroid cancer-derived cells, HL-60: promyelocytic leukemia-derived cells, Namalwa: B-cell leukemia-derived cells, Daudi: B-cell Burkitt lymphoma-derived cells, U937: monocyte-derived leukemia-derived cells, K562: erythroblast-like leukemia-derived cells, U266: Myeloma-derived cells, Colo205, HCT15, LSB, SW480: Colon cancer-derived cells, MKN45, KATO III: Gastric cancer-derived cells, G-361: Melanoma-derived cells, HepG2: Liver cancer-derived cells, Capan-2: Pancreatic cancer-derived Cells, PA-1: ovarian teratoma-derived cells), and a cDNA library obtained by amplification by a conventional method was used. As a standard for quantification, serially diluted pCR2.1 (manufactured by Invitrogen: glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (GAPDH) DNA) was used.
[0073]
A combination of a primer and a probe is a probe comprising a 5 ′ primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, a 3 ′ primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 with a minor groove binding substance. The combination of was used. PCR products were continuously detected with ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). The amount of CSGalNAc-T transcript was normalized by the amount of GAPDH transcript.
As a result, although transcription of CSGalNAc-T was observed in any tissue, it was revealed that the transcription amount was particularly high in the thyroid gland and placenta (FIG. 8). Further, it was found that the transcription amount of CSGalNAc-T was extremely low in any cancer-derived cells (FIG. 9). This indicates that a decrease in the transcription amount of CSGalNAc-T can be an indicator of canceration, suggesting that CSGalNAc-T can be used to detect canceration.
[0074]
(3) In situ hybridization analysis
A riboprobe for use in in situ hybridization analysis was prepared by inserting the 695 bp region at the 3 ′ end of the DNA fragment prepared in Example 1 (1) into the pGEM-T Easy (Promega). did. Sense and antisense probes labeled with deoxygenin were constructed to be generated by the T7 and SP6 promoters of this plasmid (the sense probe serves as a negative control). Placental tissue was fixed and hybridized according to the method described in J. Biol. Chem. 273 (1998), 26729-26738 (FIG. 10). As a result, expression of CSGalNAc-T was observed in all types of cells such as placental decidua, syncytial layer, trophoblast cell layer, and fibrocytes. Nothing was detected in the sample detected with the sense probe.
[0075]
Example 4
Enzymatic synthesis of chondroitin pentasaccharide
Four types of glycosyltransferases (β4Gal-T7 / β3Gal-T6 and GlcAT-I and CSGalNAc-TC prepared in Preparation Example 1) and a receptor substrate for tetrasaccharide synthesis system (xylose-binding peptide (SEQ ID NO: 21: No. 9 Linkage 4 is a pentasaccharide synthesis receptor substrate synthesized using the N-terminal sequence of bikunin in which xylose is bound as the side chain to serine, the second amino acid residue: manufactured by Peptide Institute). Enzymatic synthesis of sugar and pentasaccharide in which GalNAc was linked to linkage tetrasaccharide was performed. The product after each reaction was analyzed by HPLC described in Test Example 1 (tetrasaccharide synthesis: FIG. 11B, pentasaccharide synthesis: FIG. 11C).
[0076]
The composition of the reaction solution is as shown in the table below, and the reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. Each product of known enzymes was added one by one, and it was confirmed that only one new peak was generated. Further, the product of CSGalNAc-T was confirmed by digestion with chondroitinase AC-II shown in Example 2. From these results, the N-terminal sequence (proteoglycan) of bikunin with linkage tetrasaccharide linked to the side chain of the serine residue was synthesized in the tetrasaccharide synthesis system, and the linkage tetrasaccharide and GalNAc were similarly synthesized in the pentasaccharide synthesis system. It was revealed that chondroitin proteoglycan having a pentasaccharide with a sugar chain as a sugar chain was synthesized.
[0077]
[Table 2]

[0078]
【The invention's effect】
A glycosyl transfer agent having a sufficient action to transfer GalNAc from a GalNAc donor substrate to the linkage tetrasaccharide is provided by the present invention, thereby enabling efficient synthesis of chondroitin / chondroitin sulfate proteoglycans.
[0079]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the homology between the amino acid sequence of CSGalNAc-T and the amino acid sequence of β4Gal-T1.
FIG. 2 shows a chart obtained by analyzing the GalNAc transfer activity from UDP-GalNAc to GlcUA-β-pNp by HPLC. A indicates a control.
FIG. 3 is a diagram showing a chart in which GalNAc transfer activity from UDP-GalNAc to GlcUA-β-pNp is observed by ESI-MS and ESI-MS / MS. A shows an ESI-MS chart, and B shows an ESI-MS / MS chart.
FIG. 4 shows a chart obtained by analyzing the GalNAc transfer activity against chondroitin and chondroitin sulfate C by HPLC.
FIG. 5 shows a chart obtained by analyzing the GalNAc transfer activity from UDP-GalNAc to linkage tetrasaccharide-MP by HPLC. A indicates a control.
FIG. 6 shows a chart obtained by analyzing the GalNAc transfer activity from UDP-GalNAc to linkage tetrasaccharide-MP by MALDI-TOF MS. FIG. 5A is a diagram obtained by analyzing the S peak in FIG. 5B, and B is a diagram obtained by analyzing the P peak in FIG. 5B.
FIG. 7 is a photograph showing an image of CSGalNAc-T expression in tissues by Northern blot hybridization.
FIG. 8 is a diagram showing a relative comparison in real-time PCR of the expression level of CSGalNAc-T in each tissue.
FIG. 9 is a diagram showing a relative comparison in real-time PCR of the expression level of CSGalNAc-T in each cultured cell.
FIG. 10 is a photograph showing the expression of CSGalNAc-T in placental tissues by in situ hybridization.
FIG. 11 is a diagram showing chondroitin proteoglycan synthesis by the glycosyl transfer agent of the present invention. A shows the chart which analyzed the xylose binding peptide by HPLC. B is a diagram showing a chart obtained by analyzing a reaction product in a tetrasaccharide synthesis system by HPLC, and C is a diagram showing a chart obtained by analyzing a reaction product in a pentasaccharide synthesis system by HPLC. D is a diagram schematically showing substances present in each peak.

Claims

A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein is allowed to act, (1) Indicated by N- Acetyl -D- Against galactosamine receptor substrate N- Acetyl -D- Characterized by transferring galactosamine residues, N- Acetyl -D- Galactosamine is the following formula (1) Non-reducing end of D- A method for synthesizing a sugar chain having a structure bonded to a glucuronic acid residue.
GlcUA β 1 − 3Gal β 1 − 3Gal β 1 − 4Xyl β 1 − O-MP (1)
formula (1) During" GlcUA Is D- Glucuronic acid residue Gal Is D- Galactose residues Xyl Is D- Xylose residue -O-MP "Represents a methoxyphenyl residue, and"-"represents a glycosidic bond.

A protein having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 37 to 532 in SEQ ID NO: 2 or a glycoprotein having a sugar chain bound to the protein is allowed to act, (1) Indicated by N- Acetyl -D- Against galactosamine receptor substrate N- Acetyl -D- Characterized by transferring galactosamine residues, N- Acetyl -D- Galactosamine is the following formula (1) Non-reducing end of D- A method for synthesizing a sugar chain having a structure bonded to a glucuronic acid residue.
GlcUA β 1 − 3Gal β 1 − 3Gal β 1 − 4Xyl β 1 − O-MP (1)
formula (1) During" GlcUA Is D- Glucuronic acid residue Gal Is D- Galactose residues Xyl Is D- Xylose residue -O-MP "Represents a methoxyphenyl residue, and"-"represents a glycosidic bond.