JP4377987B2

JP4377987B2 - Galactose transferase and DNA encoding the same

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Publication number: JP4377987B2
Application number: JP12255599A
Authority: JP
Inventors: 鋼一古川; 徹也岡島; 圭子古川; 健浦野; 敏福本
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2019-04-28
Also published as: JP2000312587A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラクトース転移酵素及びそれをコードするＤＮＡに関し、詳しくは、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン−タンパク質結合部位の合成に関与する、ヒト由来のガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
複合糖質は、主に細胞表面に糖タンパク質、糖脂質及びプロテオグリカンの糖成分として存在し、細胞外からの成長／分化因子によって引き起こされる細胞シグナルに対しての、認識分子、共−受容体、及び調節因子として働いている。
【０００３】
プロテオグリカンには、異なるコアタンパク質、異なる種類、数、及び長さを有するグリコサミノグリカン（GAGs）を含んでなる陰性電荷に富んだ様々な種類が存在し、細胞表面のみではなく、様々な組織の細胞外マトリックスにも存在する（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York (1980)）。特徴的に硫酸化されたGAG鎖を含むプロテオグリカンの多様性は、細胞種それぞれの特定の態様によって生じ、分化の段階におけるプロテオグリカンの厳密に調節された発現パターンは、細胞増殖／分化（Mol.Cell.Biochem.,1(2),211-28 (1973)）、組織の発達及び分化（Science 260(5104),103-6 (1993)）、ウイルスやバクテリアの感染（J.Virol.,63(1),52-8 (1989), Infect.Immun.,65(1),1-8 (1997)）の調節におけるプロテオグリカンの役割を示唆している。
【０００４】
プロテオグリカンの硫酸化GAGsの生合成は、コアタンパク質中のセリン残基へのキシロースの付加から始まり、その後２個のガラクトース残基、そしてグルクロン酸残基の付加が連続的に起こる（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York(1980)）。
【０００５】
上述の共通の結合構造にN-アセチルグルコサミンが結合するか、あるいはN-アセチルガラクトサミンが結合するかによって、ヘパリン／ヘパラン硫酸が形成されるか、あるいはコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸が形成されるかのいずれかが決定される。そして、連続した個々の糖の転移は、特定の糖転移酵素によって触媒されるが、グルクロン酸転移酵素ＩのcDNA（J.Biol.Chem.,273(12),6615-6618 (l998), J.Biol.Chem.,274(12),7857-7864 (1999)）以外の遺伝子は未だに単離されていない。
【０００６】
また、キシロースにガラクトース残基を転移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）については、同酵素を欠失したCHOの変異体の研究（J.Biol.Chem.,262(25),12189-95 (1987)）、又はデルマタン硫酸プロテオグリカンの生合成の遺伝的疾患の観察の臨床事例の研究（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-1346 (1990)）により、その性質がある程度調べられている。また、同酵素は、抽出、部分精製がなされているが（J.Biol.Chem.,250(13), 5200-5207(1975)、J.Biol.Chem.,244(10), 2790-2798 (1969)）、未だ実質的に均一なまでには精製されておらず、詳細な性質や一次構造は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、キシロースにガラクトース残基を転移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡを単離し、精製された同酵素を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）sqv-3遺伝子を使用した発現配列タグ（EST(s): expressed sequence tag(s)）のBLAST解析（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-979 (1999)）に基づき、複合糖質の共通の結合構造（GlcAβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Xylβ1-O-Ser（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York (1980)）の生合成に関与するヒトのガラクトース転移酵素ＩをコードするcDNAクローンを単離した。そして、cDNAクローン産物の基質特異性をインビトロで確認し、また、このcDNAを含む発現ベクターをガラクトース転移酵素Ｉを欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）の変異株に導入してGAGの発現回復を確認した。かくして、前記ｃＤＮＡがガラクトース転移酵素Ｉをコードすることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記性質を有する、ガラクトース転移酵素（以下「本発明酵素」ともいう）である。
（１）作用
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。
（２）基質特異性
ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトース残基を転移しない。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残基。
【００１０】
本発明のガラクトース転移酵素の好ましい態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵素である。
（３）ミカエリス定数
約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを受容体とした場合）
【００１１】
本発明のガラクトース転移酵素の具体的態様は、ヒト由来であるガラクトース転移酵素である。
【００１２】
本発明のガラクトース転移酵素としてより具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであるガラクトース転移酵素が挙げられる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１３】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう）を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１４】
上記ＤＮＡとして具体的には、配列番号１において、塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
さらに本発明は、前記ＤＮＡを保持する組換えベクターを提供する。
本発明はまた、前記ＤＮＡ又は前記組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を提供する。宿主細胞としては、線維芽細胞株が挙げられる。
本発明はさらに、前記形質転換細胞を培養し、該培養物中に前記ポリペプチドを生成蓄積させ、同培養物から前記ポリペプチドを採取することを特徴とするガラクトース転移酵素の製造法を提供する。
また本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供する。
【００１５】
以下、上記性質を有するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）を、単に「ガラクトース転移酵素」又はXGalT-1ということがある。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、以下特にことわりがない限り、Galはガラクトースを、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを、GAGはグリコサミノグリカンを、CHOはチャイニーズハムスター卵巣細胞を、D-MEMはダルベッコ改変イーグル最少必須培地を、FCSはウシ胎児血清を、PBSはリン酸緩衝生理食塩液を、GAPDHはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを、kbはキロベースペアを、bpはベースペアを、HPLCは高性能液体クロマトグラフィーを、NMRは核磁気共鳴を、p-Nph-β-D-Xylはp-ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを、XGalT-1はガラクトース転移酵素Ｉ（UDP-D-ガラクトース：D-キシロースβ-1,4-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）を、それぞれ示す。
【００１７】
＜１＞本発明酵素
本発明酵素は、下記性質を有するガラクトース転移酵素である。
【００１８】
（１）作用
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。
（２）基質特異性
ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトース残基を転移しない。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残基。
【００１９】
本発明のガラクトース転移酵素の好ましい態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵素である。
（３）ミカエリス定数
約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを受容体とした場合）
なお、測定条件によってミカエリス定数の値が多少変化することは当業者の常識である。従って、ここで示したミカエリス定数の値はあくまで指標であり、当業者にとって実質的に同一であろうと認識される範囲のミカエリス定数の値が包含されると理解されたい。
【００２０】
本発明のガラクトース転移酵素として具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであるガラクトース転移酵素が挙げられる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００２１】
この中でも、（ａ）のポリペプチドが好ましい。
なお本明細書中において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいことを示す。
【００２２】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするDNAの多形や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、本発明酵素に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、本発明酵素に包含されるものである。
【００２３】
なお本明細書における「数個のアミノ酸」とは本発明酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示す。
【００２４】
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性は、後記実施例に示すように、p-Nph-β-D-Xylへのガラクトースの転移反応を利用した測定方法を用いることによって測定できる。よって当業者であれば、本発明酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００２５】
本発明酵素は、もともとはヒトcDNAをマウスの線維芽細胞であるマウスＬ細胞で発現させることにより得られたものであるが、他の宿主を用いた遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたポリペプチドも当然に包含される。
【００２６】
本発明酵素は、本発明によりそのアミノ酸配列や性質が開示されたので、天然物からの単離・精製や、化学合成等によって製造することも可能であるが、後述の本発明DNAを用いて製造することが好ましい。本発明DNAを用いた本発明酵素の製造方法については後述する。なお本発明酵素は、必ずしも単独のポリペプチドでなくてもよく、必要により融合タンパク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明酵素のポリペプチドと他のポリペプチド、例えばプロテインＡ、を含む融合ポリペプチドが例示される。
【００２７】
本発明酵素は、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有する限り、ポリペプチドのみからなるものであってもよいし、糖鎖等を有していてもよい。
【００２８】
本発明酵素はβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する作用を有しているので、キシロース残基のＣ４位特異的ガラクトシル化や糖鎖等の合成に利用できる。
【００２９】
＜２＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００３０】
この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAが好ましい。
上記ＤＮＡとして具体的には、例えば配列番号１において塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
【００３１】
上記配列番号１記載の塩基配列を有するDNAは、もともとはヒト由来のものであるが、その由来は限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたDNAも当然に包含される。
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するDNAも本発明DNAに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００３２】
本発明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA又はRNAも包含される。さらに本発明DNAは、本発明酵素をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖またはRNA鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００３３】
本発明ＤＮＡは、後記実施例に示すように、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）のsqv-3遺伝子の、動物細胞におけるホモログをデータ・ベース検索し、見出されたヒト発現配列タグ（expressed sequence tag）に相当するヒトｃＤＮＡとして単離されたものであり、XGalT-I遺伝子と命名した。
【００３４】
具体的には、前記タグに基づいて作製したオリゴヌクレオチド、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、ヒト由来のmRNA又はcDNAライブラリーを鋳型とするポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）を行い、本発明ＤＮＡの一部を取得する。次に、得られたＤＮＡの塩基配列に基づいて、5'RACEにより5'-末端領域を取得する。その際に用いられるプライマーとしては、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
上記のようにして得られる増幅産物をプローブに用い、ヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすると、本発明ＤＮＡを含むクローンが得られる。
【００３６】
上記のようにして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列の一例を、配列表の配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
本発明ＤＮＡは、上記のようにして得られたものであるが、本発明ＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによってヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから、あるいは前記塩基配列にもとづいて作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりcDNAライブラリーまたは染色体ＤＮＡライブラリーから、単離することもできる。前記プライマーとしては、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３７】
尚、染色体ＤＮＡから本発明ＤＮＡを得た場合には、イントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンを含むＤＮＡであっても、本発明ＤＮＡに包含される。
【００３８】
本発明ＤＮＡは、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４１〜１０２１からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。
【００３９】
本発明ＤＮＡを導入した細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から同ポリペプチドを採取することによって、本発明酵素を製造することができる。
【００４０】
本発明ＤＮＡを導入した細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換プラスミドを構築し、この組換プラスミドを細胞に移入することによって得ることができる。ここで用いる本発明DNAは、本発明DNAである限りにおいて特に限定されないが、配列番号１における塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むDNAが好ましい。
【００４１】
細胞としては、大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付加されていない本発明酵素を得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖が付加しうるため、糖鎖を含むポリペプチドの形態で得ることも可能である。
【００４２】
本発明を導入する宿主細胞として具体的には、例えばマウスの線維芽細胞であるＬ細胞が挙げられる。また、ベクターとしては、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)、pMIKneo、pCD-SA等が挙げられる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４３】
本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００４４】
本発明ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran method)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）を用いてトランスフェクションを行う方法がある。
【００４５】
培養物からの本発明酵素の採取は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００４６】
本発明酵素の抽出方法として具体的には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４７】
本発明ＤＮＡを発現させると、本発明酵素は細胞の膜画分に局在する。また、本発明ＤＮＡを、本発明酵素の一部、例えばN-末端の53アミノ酸を欠く本発明酵素と他のポリペプチドとの融合タンパク質として、可溶性の形態で発現させると、同融合タンパク質は細胞質中に局在する。尚、N-末端の53アミノ酸を欠く本発明酵素をコードするＤＮＡは、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００４８】
抽出液からの本発明酵素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４９】
精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析し、前記＜１＞で説明した本発明酵素の物性と比較することにより、本発明酵素の製造が確認できる。
【００５０】
本発明によりクローニングされたXGalT-I遺伝子は、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）のsqv-3遺伝子を使用した発現配列タグのBLAST解析により、β4-ガラクトース転移酵素ファミリーに属するであろうと考えられた。sqv-3遺伝子は、C. elegansの糖質の一部を合成する、保存された糖質付加経路の構成要素をコードする一遺伝子として特定された遺伝子であり、陰門の陥入に必要な遺伝子である（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3),968-73 (1999)）。
【００５１】
ところで、sqv-3は、ほ乳類及びニワトリのβ4-ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列の相同性から、ガラクトースβ1,4-N-アセチルグルコサミンの結合を形成するβ1,4ガラクトース転移酵素であると考えられていた（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999))。しかし、XGalT-I遺伝子から予測されたアミノ酸配列は、他のほ乳類のβ4-ガラクトース転移酵素よりもsqv-3と高い相同性を有していることから、XGalT-I遺伝子は、糖脂質や糖タンパク質中のGal-β-1,4GlcNAc（又はGlc）構造の合成に関与する公知のβ4-ガラクトース転移酵素とは異なるβ4-ガラクトース転移酵素をコードしていると考えられた。そして予測されたとおり、XGalT-I遺伝子は、プロテオグリカンのグリコサミノグリカンとタンパク質の結合部の生合成に関与するガラクトース転移酵素Ｉをコードしていることが基質特異性の分析によって明らかとなった。本発明は、グリコサミノグリカンの生合成に関与するβ4-ガラクトース転移酵素の遺伝子をクローニングした初めての例である。
【００５２】
また、種々の組織におけるXGalT-I遺伝子の発現をノザンブロッティングにより解析したところ、遍在的な発現パターンを示した。このことは、同遺伝子産物は普遍的な重要性を有していることを示唆している。細胞増殖におけるプロテオグリカンの発現促進及び抑制効果が明らかとされているため（Cell,64(4), 841-8 (1991)、Science, 252(5013),1705-8 (1991)、Cell,83(3),357-60 (1995)）、プロテオグリカンのGAGの役割の重要性がますます認識されてきている。C. elegansにおけるsqv-3遺伝子の欠失の所見は、ほ乳類組織における形態形成及び成長におけるその対応遺伝子産物の特別な重要性を強く示唆している。従って、C. elegansの遺伝子及びほ乳類の糖鎖生物学的研究の連携により、プロテオグリカンのGAGの生物学的重要性及び機能的メカニズムのより深い理解が促進されることが期待される。
【００５３】
また、XGalT-I遺伝子は、早老症（progeroid syndrome）患者において、その遺伝子の異常が報告されており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-1346 (1990)）、本発明ＤＮＡは、このような疾患の遺伝子治療のツールとして利用できることが期待される。また、本発明ＤＮＡ、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、上記のような遺伝子疾患の検出等に利用できることが期待される。
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５４】
はじめに、以下の実施例で用いた試薬及び細胞について説明する。
UDP-Gal、p-ニトロフェニル-β-D-キシロピラノシド(p-Nph-β-D-Xyl)、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(p-Nph-β-D-Gal)、p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-ガラクトサミニド(p-Nph-β-D-GalNAc)、p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド(p-Nph-β-D-GlcNAc)およびp-ニトロフェニル-α-D-キシロピラノシド(p-Nph-α-D-Xyl)は、シグマ(Sigma；St.Louis, MO)より購入した。また、[α-³²P]dCTPはICN(Costa Mesa, CA)より購入した。ヘパラン硫酸に特異的なモノクローナル抗体(HepSS-1)は、生化学工業株式会社より購入した。
【００５５】
以下の実施例に用いたマウスの線維芽細胞であるＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1)は、7.5％ウシ胎児血清(FCS)を添加したD-MEM（Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium）中で、37℃、５％ CO₂条件下で生育させた。Ｌ細胞は、Memorial Sloan Kettering Cancer CenterのA.Albino博士より恵与された。CHO変異株pgsB-761（ガラクトース転移酵素Ｉ-欠損）（J.Biol.Chem.,262(25),12189-95 (1987)）は、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）より入手し、10％ FCSを添加したF-12K培地（Life Technologies, Inc.）中で生育させた。
【００５６】
【実施例１】
ヒト・ガラクトース転移酵素(XGalT-1)遺伝子のクローニング
（１）線虫sqv-3遺伝子に対するホモログの検索
線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）において、sqv-3は、ヒトや脊椎動物のβ1,4 ガラクトース転移酵素（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999)）群ファミリーのアミノ酸配列に類似しており、陰門の陥入や卵母細胞の分化に必要であると報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3),968-73 (1999)）。動物細胞における sqv-3遺伝子の類似体を見出すために、ケノルハブディティス・エレガンスsqv-3遺伝子のコード配列（GenBank, accession number AJ005867）から推定されるアミノ酸配列について、データ・ベース検索を行った。データ・ベース検索は、The National Center for Biotechnology Information(NCBI)の発現配列tag（expressed sequence tag）データ・ベース（dbEST）に対し、tBLASTnアルゴリズムを用いて行った。その結果、４つのヒト発現配列tag（GenBank, accession number AI040029, AA100869, AA442547およびT82170）が見つかった。
【００５７】
（２）sqv-3ヒトホモログｃＤＮＡの単離
見い出されたtagに相当するｃＤＮＡを単離するために、下記塩基配列を有するプライマーを合成し、ヒト大腸癌細胞株 Lovoから調製した全RNAを鋳型として用いた逆転写ポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行った。ＰＣＲは、以下の条件：94℃で１分間、次いで（94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間）を２５サイクル、次いで72℃で１分間、で行った。
【００５８】
（センスプライマー）
4GT5GSP1 5'-GGCATCCTGCTGCTCTCCAA-3'（配列番号３）（配列番号１において塩基番号644-663に相当)
（アンチセンスプライマー）
4GT3GSP1 5'-GCCACTCCACATCCTGTCAG-3'（配列番号４）（配列番号１において塩基番号1126-1107に相当）
【００５９】
その結果、重複するいくつかの部分長cDNAクローンが得られた。これらのうち、583塩基対のcDNAは、pCR 2.1-TOPOベクター（Invitrogen, San Diego, CA）にクローン化した。
【００６０】
次に、上記ｃＤＮＡの5'-末端領域を取得するために、5'RACEキット（Life Technologies, Inc.）を用い、同キットの説明書に従って、RACE（rapid amplification of cDNA ends）を行った。すなわち、ヒトLovo細胞株由来の0.4μgの全RNAと、配列番号５に示す塩基配列（5'-CAGGTGGCGAAATGTCTT-3'、配列番号１において塩基番号814-797に相当）からなる遺伝子特異的プライマー１（gene-specific primer 1；GSP1）を用いて、最初のcDNA鎖合成を行った。続いて、Nested PCRを、アダプタープライマーと、配列番号６に示す塩基配列（5'-CCCCAGAAGCGGTTGGACAT-3'、配列番号１において塩基番号708-689に相当）からなる遺伝子特異的プライマー２（gene-specific primer 2；GSP2）を用いて行った。その結果、Kozakの規則（Cell, 44, 283-292 (1986)）に適合する開始コドンを有する、679bpの断片が得られた。
【００６１】
（３）ハイブリダイゼーションによるヒトcDNAライブラリーのスクリーニング
上記のようにして得られた5'RACE産物（配列番号１において塩基番号29-687に相当）を、Megaprime^TM DNAラベリングシステム（Megaprime^TM DNA labeling system；Amersham）を用いて³²P-ラベルし、ヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-37（Sloan-Kettering Cancer CenterのL. J. Old博士より恵与）cDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。SK-MEL-37細胞cDNAライブラリー由来の約4×10⁵のEscherichia coli MC1061/P3を、コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーションは、GeneScreen Plus membrane（NEN）を用いて行った。その結果、５個の独立した陽性クローンが得られた。
【００６２】
上記の陽性クローンからｃＤＮＡを取り出し、ABI PRISM 310遺伝子解析装置(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて、ジデオキシ・ターミネーション法（dideoxy termination method）により塩基配列を決定したところ、３個のクローンは全オープンリーディングフレームを含んでいた。決定された塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。AUG開始コドンの位置はコザック（Kozak)のコンセンサス配列（Cell, 44, 283-292 (1986)）に従って決定された。
【００６３】
こうしてクローニングされた遺伝子を、XGalT-1遺伝子と命名した。同遺伝子は、327アミノ酸から構成されるタンパク質をコードし、その分子量は37,405ドルトンと計算された。
【００６４】
上記タンパク質には、一つの強力なN-リンク糖鎖結合部位が存在している。KyteとDoolittle 法（J.Mol.Biol.,157, 105-132 (1982)）によって決定された疎水性（hydropathy）は、アミノ末端部位の（Val³¹-Ala⁵⁸）に渡る28アミノ酸残基の顕著な疎水性領域が一カ所あることを示しており、今までクローニングされてきた多くの他の糖転移酵素と同様に、２型膜貫通構造を持つタンパク質と推定された（図１）。
【００６５】
同定されたcDNAの一次構造と、ヒトβ4-ガラクトース転移酵素Ｉ（β4GalT-1）と略記；GenBank accession number X14085）（Biochem.Biophys.Res.Commun.,157(2), 657-63 (1988)）の構造を比較すると、327アミノ酸のうち82残基（25%）が同一であることが明らかとなった。同様な結果は、この新しくクローン化された遺伝子とこれまでクローン化されてきた他のヒトβ4-ガラクトース転移酵素（β4GalT-II,III,IV,V,and VI）（J.Biol.Chem.,272(51), 31979-91 (1997) 、J.Biol.Chem.,273(45),29331-40 (1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95(2), 472-7 (1998)）、J.Biol.Chem.,273(22),13570-7 (1998)、Glycobiology 8(5),517-26 (1998)）との間にも見出された。対照的に、この遺伝子は、線虫のsqv-3遺伝子と38%のホモロジー（327アミノ酸中127残基）を有していることは、この遺伝子がヒトにおけるsqv-3のオーソログ（異なる種における対応する遺伝子。進化的に同じ起源を持ち、同様な構造と機能を持つ他の種の遺伝子）であることを示唆してる。これらの結果は、この新しくクローン化された遺伝子産物がβ4-ガラクトース転移酵素遺伝子ファミリーの新規な一員であることを示している。
【００６６】
【実施例２】
ヒト・ガラクトース転移酵素（XGalT-1）の製造及び性質
＜１＞XGalT-1遺伝子産物の酵素活性
（１）XGalT-1発現ベクターの構築
ヒトsqv-3オーソログであるガラクトース転移酵素の活性を測定するために、前記のクローン化されたcDNAをL細胞に導入し、発現産物を調製した。
【００６７】
まず、前記cDNAを発現させるための発現ベクターを、次のようにして構築した。XhoI部位を有する5'プライマー 5'-CTCGAGACGATGTTCCCCTCGCGGAGG-3'（配列番号７）(配列番号１において塩基番号38-58に相当)、及び、SpeI部位を有する3'プライマー 5'-TCTAGAAGCTCAGCTGAATGTGCACCA-3'（配列番号８）（配列番号１において塩基番号1027-1007に相当）をプライマーとし、クローニングされたcDNA断片を鋳型に用いたPCRにより、XGalT-1のオープンリーディングフレームをコードするcDNA断片を調製した。PCR産物を、pMIKneoベクター（東京医科歯科大学の丸山和夫博士より恵与）のXhoI部位およびSpeI部位に挿入し、XGalT-1発現ベクターpMIKneo-XGalT-1を得た。尚、pMIKneoは、マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含み、SRαプロモーターを含んでいる。
【００６８】
次に、N-末端の53アミノ酸を欠くXGalT-1を発現させるための発現ベクターを、以下のようにして構築した。EcoRI部位を有する5'プライマー 5'-CAGCTCGAATTCTCTGGGGACGTGGCCCGG-3'（配列番号９）（配列番号１において塩基番号200-217)、及び、XhoI部位を有する3'プライマー 5'-TGTCCACTCGAGTCAGCTGAATGTGCACCA-3'（配列番号１０）（配列番号１において塩基番号1024-1007に相当）をプライマーとし、クローニングされたcDNA断片を鋳型に用いたPCRにより、N-末端の53アミノ酸を欠くXGalT-1をコードするＤＮＡ断片を調製した。PCR産物をEcoRIとXhoIで消化し、pCD-SAベクター（理化学研究所の辻崇一博士より恵与）のこれらの制限酵素部位にサブクローニングし、pCDSA-XGalT-1を得た。pCD-SAベクターは、SRαプロモーターを含んでいる。pCD-SAのEcoRIとXhoIに挿入されたＤＮＡ断片は、同プロモーターによりプロテインＡ（protA）との融合タンパク質として発現する。
【００６９】
（２）XGalT-1遺伝子産物の調製
(i)不溶性のXGalT-1（膜画分）の調製
トランスフェクションの少なくとも48時間前に、マウスの線維芽細胞であるマウスＬ細胞3×10⁶個を10cmのディッシュにまいた。DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran method)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）により、XGalT-1遺伝子発現ベクターpMIKneo-XGalT-1(4μg)をＬ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で48時間培養した後、トリプシンで細胞をはがして回収した。得られた細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄後、1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)を含有する氷冷したPBS中で、窒素キャビテーション装置（nitrogen cavitation apparatus；Parr Instrument Co.）を用いて400psi、30分間、細胞溶解させた（Cancer Res.,49, 6258-6264 (1989)）。低速遠心により核を除去し、上清を４℃、100,000gで１時間遠心分離した。沈殿物を氷冷した100mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に再懸濁させた。
【００７０】
上記のようにして得られた細胞溶解抽出液を、 UDP-[¹⁴C]Galを供与体とし、いろいろな受容体基質を使ったガラクトース転移酵素活性の測定に供した。ガラクトース転移酵素活性は、Lugemwaらの方法（J.Biol.Chem., 271(32),19159-65 (1996)）を若干改変して行った。アッセイ混合液(25μl)は、1μlのMe₂SO、15mM MnCl₂、50mM KCl、1％ Triton X-100、100mM MES緩衝液(pH6.0)、0.6mM UDP-Gal、5,000dpm/μl UDP-[¹⁴C]Gal（Du Pont-New England Nuclear）、1μgの酵素溶液及び2mMの基質を含有する。37℃で30分間インキュベートした後、1mlの水を添加することにより反応を終了させ、Sep-Pak C₁₈カートリッジ(Waters)にアプライした。カートリッジを10mlの水で洗浄し、5mlのメタノールで溶出させた。メタノール溶出液中の[¹⁴C]Galの量は、液体シンチレーションカウンター(Beckman)で測定した。結果を表１に示す。活性は、１分間当りに1mgの酵素タンパク質が転移するGalの量(nmol)で示した。
【００７１】
【表１】

【００７２】
その結果、グリコサミノグリカン糖鎖形成のプライマーである、p-Nph-β-D-Xylに対しては確実な転移酵素活性がみられた。しかし、通常糖タンパク質や糖脂質でガラクトース転移酵素の基質となるはずのp-Nph-β-D-GlcNAcを含む、他の全ての基質は、全く受容体とならなかった。尚、XGalT-1の代わりに偽遺伝子(mock)を導入した細胞からの抽出液ではほとんど酵素活性を示さなかった。
【００７３】
p-Nph-β-D-Xyl基質でのおおよそのKm値は3.4 mMであった。これらの結果は発現タンパク質がガラクトース転移酵素Ｉ（UDP-D-ガラクトース: D-キシロースβ-1,4-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ; EC 2.4.1.133)（J.Biol.Chem.,250(13), 5200-7 (1975)）であることを示唆している。同様な結果は、下記の可溶性の融合酵素（XGalT-1-protA）によっても得られている。
【００７４】
(ii)可溶性のXGalT-1の調製
上記と同様にして、DEAE-デキストラン法により、pCDSA-XGalT-1（4μg）をＬ細胞(10cmディッシュ)にトランスフェクトし、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で16時間培養した。その後、培地を無血清ITS（インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸）培地（Becton Dickinson）に置換し、さらに32時間培養した。トランスフェクションの48時間後に培養培地を回収し、Molcut-L（ミリポア）を用いて100倍に濃縮し、100mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に対して透析し、可溶性酵素（XGalT-1-protA）溶液を得た。
【００７５】
NMR分析用のサンプルを調製するために、可溶性酵素をIgG-セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてさらに精製し、酵素が結合したビーズを酵素源として用いた。具体的には、100倍に濃縮した培養培地25μlを、IgG-セファロース 10μlと共に４℃で一晩インキュベートした。遠心により回収したビーズを100mM MES緩衝液(pH6.0)で洗浄し、この緩衝液に再懸濁させた。
【００７６】
＜２＞XGalT-1反応産物の解析
ガラクトース転移酵素反応生成物を同定するために、可溶性融合酵素 XGalT-1-protAを酵素源として用い、p-Nph-β-D-Xylを[¹⁴C]Galでアイソトープラベルした。生成した標識産物[¹⁴C]Galβ1-4Xylβ1-p-Nph １μgを、50mM Tris-HCl(pH7.3)、50mM NaClおよび20μgのβ-ガラクトシダーゼ（E. coli由来；Boehringer Mannheim）を含有する200μlの溶液に溶解し、37℃で７時間インキュベートした。その結果、前記標識産物の99%以上は分解された。
【００７７】
一方、前記標識産物[¹⁴C]Galβ1-4Xylβ1-p-Nphを、結合様式に特異的なβ-ガラクトシダーゼを用いて処理した。具体的には、100mM NaClおよび100μg/ml BSAを含有する50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）100μl中で、1μgの標識産物を20mUのdiplococcal（双球菌由来）β-ガラクトシダーゼ(Boehringer Mannheim)で、37℃、23時間消化することにより行った。消化産物を1mlの水で希釈して、上述のようにSep-Pak C₁₈カートリッジを用いて分離し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、標識産物は、末端β-1,4ガラクトース結合構造の加水分解を特異的に触媒するdiplococcalβ-ガラクトシダーゼ分解でも完全に切断された。
【００７８】
上記の結果は、XGalT-1-protA融合タンパク質が、UDP-Galからガラクトースをβ-1,4結合構造を持つ受容体への転移を触媒することを示している。
【００７９】
＜３＞XGalT-1反応産物の構造決定
反応生成物のβ-1,4-結合を確定するために、酵素源としてIgG-Sepharoseに固定化したXGalT-1-protA融合タンパク質を用い、反応産物を大量に調製した。
【００８０】
50μlの酵素結合IgG-セファロース、2.7mgのp-Nph-β-D-Xyl、10μlのMe₂SO、15mM MnCl₂、50mM KCl、1% Triton X-100、100mM MES緩衝液（pH6.0）および75mM UDP-Galを含有する250μlの混合液中で反応を行った。反応物の生成は、エタノール／ピリジン／n-ブタノール／酢酸／水(100：10：10：3：30)の溶媒系を用いた高速薄層クロマトグラフィーによりモニターし、終了するまで24時間行った。反応産物は、上述のようにSep-Pak C₁₈カートリッジを用いて精製し、さらにDevelosil ODS HG-5カラム（4.6mmφx250mm；Nomura Chemical）を用いたHPLC（Jasco 880-PUポンプおよびMD915検出器を使用）により精製した。カラムへの過剰負荷を避けるため、４回に分けてサンプルを負荷した。溶出は300nmの吸光度によりモニターした。溶離液として10％アセトニトリル水溶液(溶液Ａ)と30％アセトニトリル水溶液(溶液Ｂ)を用い、次の濃度勾配により行った。なお流速は1ml/分、温度40℃で行った。
【００８１】
0〜 2分溶液Ｂの0％〜30％の直線濃度勾配
2〜30分溶液Ｂ30％で保持
30〜40分溶液Ｂの30％〜100％の直線濃度勾配
【００８２】
主要な産物を含む画分を回収し、NMRによる解析に用いた。NMRによる解析の前に、サンプルをD₂O(99.9 atom ％ D)に溶解し、減圧乾燥し、最終的に600μlのD₂O(99.96 atom％ D)に溶解した。
【００８３】
プロトン核磁気共鳴（¹H NMR）スペクトル(600 MHz)は、JEOL JMNα-600（日本電子製）を用いて、25℃で測定した。D₂Oを測定溶媒、t-ブタノール(δ1.23)を内部標準とし、1D、1D-HOHAHA、NOE差スペクトルおよびCOSYはppmで記録した。FABMSデータは、m-ニトロベンジルアルコールをマトリックスとして用い、JEOL MSTATION（日本電子製）を用いて記録した。
【００８４】
FAB MS（高速原子衝撃質量分析）によって、434m/z(M+1)と456m/z(M+Na⁺)でのシグナルから、その生成物の分子量は433であると決定された。これは、出発物質Xylβ1-p-Nphのガラクトース結合生産物と帰属できる。
【００８５】
¹H-NMR スペクトルは、p-ニトロフェニル部分と２個のグリコシル残基（の存在を）示した。糖成分の全てのシグナルは、それぞれのアノマー位のシグナル（δ=4.49とδ=5.25）で照射した1D-HOHAHAスペクトルとCOSYによって同定された（図２）。p-Nph-β-D-Xyl部分の構造は出発分子のスペクトルとの比較から確定された。ガラクトース残基の（スピン）結合定数(J_1,2=7.7 Hz, J_2,3=9.9 Hz, J_3,4=3.7 Hz, J_4,5=0 Hz)は、このガラクトシドがβ-ピラノシドであることを示している。ガラクトシドの結合はNOE差スペクトルによって決定された。Gal H1への照射により、強いNOE（相互作用）がXyl H-4, GalH-3及びGal H-5位で観測され、また Xyl H-4への照射により、Gal H-1（スペクトル）が強く増加された。これらのことから、生成物の構造はGalβ1-4Xylβ1-p-Nph（Eur.J.Biochem.,247(3),1083-90 (1997)）であることが示された。
【００８６】
＜３＞グリコサミノグリカン欠損変異細胞におけるクローン化XGalT-1によるグリコサミノグリカン合成の回復
本発明の酵素が、in vivoにおいてグリコサミノグリカンの生合成に関わっていることを確認するために、変異CHO細胞 pgsB-761（ガラクトース転移酵素Ｉ-欠損）に、pMIKneo-XGalT-1を一過性に導入（トランスフェクト）した。そのトランスフェクト細胞を、ヘパラン硫酸に特異的なHepSS-1モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで分析した。
【００８７】
2×10⁶個のCHO pgsB-761細胞を10cmディッシュにまき、翌日、45μlのLipofectamine^TM試薬（Life Technologies, Inc.）を用い、その試薬の説明書に従って10μgのプラスミドDNAをトランスフェクトした。３日後、細胞を0.5mM EDTAおよび0.25％トリプシンを含有するPBSではがし、約1×10⁶個の細胞を、1:25に希釈したHepSS-1モノクローナル抗体（40μg/ml）と共に、氷中で30分間インキュベートした。２回洗浄した後、1:200に希釈した、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合ヤギ抗マウスIgM(μ鎖特異的)(Zymed Laboratories)で細胞を染色した。氷中で30分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、Cell Quest^TMバージョン3.1fソフトウエアを用いたFACSCalibur(Becton Dickinson)によって解析した。
【００８８】
その結果、約50%の細胞がモノクローナル抗体HepSS-1によって染色されるが、偽遺伝子(mock)を導入した細胞は陰性であった（図３）。このことは、本発明のＤＮＡは、グリコサミノグリカン鎖形成を促進するガラクトース転移酵素Ｉをコードする遺伝子であることを示している。
【００８９】
＜４＞各種組織におけるXGalT-1遺伝子の発現の解析
XGalT-1の遺伝子発現を解析するために、cDNAの全長フラグメントをプローブとして使い、ノーザンブロット解析を行った。
【００９０】
Human Multiple Tissue Northern Blot^TM（Clontech Laboratories）を用い、その説明書に従って、ゲル精製した[α-³²P]dCTP-標識XGalT-1 cDNA、またはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH)をプローブとして、各種ヒト成人組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）由来のポリA⁺RNAに対してノーザンブロッティングを行った。ブロットをイメージングプレートに露出させ、BAS2000イメージングアナライザー(富士写真フィルム)で解析した。
【００９１】
その結果、XGalT-1遺伝子は、調べた限りの全てのヒト組織に発現しており、1.8 kbの転写産物（mRNA）が検出された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明酵素は、プロテオグリカンやグリコサミノグリカンの製造ツールとして有用である。本発明ＤＮＡは、本発明ポリペプチドの大量調製ツールとして有用である。また、本発明酵素の遺伝子異常や発現が低下した疾患患者への遺伝子治療への応用も期待される。
【００９３】
本発明の組換えベクターは、本発明酵素の大量調製ツール、遺伝子治療等に有用である。また、本発明の形質転換細胞は、本発明酵素の大量調製ツールとして有用である。
【００９４】
【配列表】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトガラクトース転移酵素（XGalT-1）タンパク質のハイドロパシープロット。
【図２】本発明の酵素標品のプロトン核磁気（¹H NMR）共鳴スペクトルを示す図。
Ａ：クローン化されたcDNA産物によって調製された生成物の構造。
Ｂ：ガラクトース残基およびキシロース残基について測定した¹H ケミカルシフト(ppm)および¹H-¹Hカップリング定数(Hz)を要約して示す。
【図３】 XGalT-1発現ベクターでトランスフェクトしたCHO変異株pgsB-761細胞のフローサイトメトリー分析を示す図。薄い線はモノクローナル抗体を用いた結果を、実線は対照を示す。
Ａ：CHO-K1細胞（陽性対照）
Ｂ：pgsB-761細胞（陰性対象）
Ｃ：cDNAを含まないベクターMIKneoを導入したXGalT-1欠損CHO変異株pgsB-761細胞。
Ｄ：XGalT-1 cDNAを含むpMIKneoを導入したpgsB-761細胞。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a galactose transferase and a DNA encoding the same, and more particularly, to a human-derived galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-) involved in the synthesis of a glycosaminoglycan-protein binding site of a proteoglycan. Xylose β-1,4-D-galactosyltransferase) and DNA encoding the same are provided.
[0002]
[Prior art]
Complex carbohydrates exist mainly on the cell surface as glycoproteins of glycoproteins, glycolipids and proteoglycans, and recognize molecules, co-receptors for cell signals triggered by extracellular growth / differentiation factors, And act as a regulator.
[0003]
There are various types of proteoglycans that are rich in negative charges, including glycosaminoglycans (GAGs) with different core proteins, different types, numbers, and lengths. (The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, WJ, ed), pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980)). The diversity of proteoglycans, including characteristically sulfated GAG chains, arises from specific aspects of each cell type, and the tightly regulated expression pattern of proteoglycans at the stage of differentiation is cell growth / differentiation (Mol. Cell Biochem., 1 (2), 211-28 (1973)), tissue development and differentiation (Science 260 (5104), 103-6 (1993)), virus and bacterial infection (J. Virol., 63 ( 1), 52-8 (1989), Infect. Immun., 65 (1), 1-8 (1997)), suggesting the role of proteoglycans.
[0004]
The biosynthesis of sulfated GAGs of proteoglycans begins with the addition of xylose to serine residues in the core protein, followed by the sequential addition of two galactose and glucuronic acid residues (The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, WJ, ed), pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980)).
[0005]
Either heparin / heparan sulfate or chondroitin sulfate / dermatan sulfate is formed depending on whether N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine binds to the above-mentioned common binding structure. Is decided. The successive individual sugar transfers are catalyzed by specific glycosyltransferases, but the glucuronyltransferase I cDNA (J. Biol. Chem., 273 (12), 6615-6618 (l998), J Genes other than Biol. Chem., 274 (12), 7857-7864 (1999)) have not yet been isolated.
[0006]
For galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-xylose β-1,4-D-galactosyltransferase; EC 2.4.1.133), which transfers a galactose residue to xylose, CHO lacking the enzyme (J. Biol. Chem., 262 (25), 12189-95 (1987)), or a clinical case study of the observation of a genetic disorder of dermatan sulfate proteoglycan biosynthesis (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87 (4), 1342-1346 (1990)), the properties of which have been examined to some extent. The enzyme has been extracted and partially purified (J. Biol. Chem., 250 (13), 5200-5207 (1975), J. Biol. Chem., 244 (10), 2790-2798). (1969)), yet it has not been purified to substantial homogeneity, and detailed properties and primary structure are not known.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and DNA encoding galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-xylose β-1,4-D-galactosyltransferase) which transfers a galactose residue to xylose It is an object of the present invention to provide a purified same enzyme.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that an expression sequence tag (EST (s): expressed) using the Caenorhabditis elegans sqv-3 gene sequence tag (s)) based on BLAST analysis (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96 (3), 974-979 (1999)), a common binding structure of glycoconjugates (GlcAβ1,3Galβ1,3Galβ1, Encodes human galactosyltransferase I involved in biosynthesis of 4Xylβ1-O-Ser (The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, WJ, ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York (1980)) A cDNA clone was isolated, the substrate specificity of the cDNA clone product was confirmed in vitro, and the expression vector containing this cDNA was transformed into a mutant of Chinese hamster ovary cells (CHO) lacking galactose transferase I. And the recovery of GAG expression was confirmed. It was confirmed that it encodes tose transferase I, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention is a galactose transferase (hereinafter also referred to as “the enzyme of the present invention”) having the following properties.
(1) Action
The galactose residue is transferred from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue.
(2) Substrate specificity
No galactose residues are transferred from the galactose donor to the following acceptors.
N-acetylglucosamine residues, N-acetylgalactosamine residues, galactose residues, α-D-xylose residues, and glucosylceramide residues.
[0010]
A preferred embodiment of the galactose transferase of the present invention is a galactose transferase having the following properties.
(3) Michaelis constant
3.4 mM (when paranitrophenyl-β-D-xylopyranoside is used as a receptor)
[0011]
A specific embodiment of the galactose transferase of the present invention is a human-derived galactose transferase.
[0012]
More specifically, the galactose transferase of the present invention includes galactose transferase, which is a polypeptide of the following (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzyme activity for transferring a galactose residue to.
[0013]
The present invention also provides DNA encoding the following polypeptide (a) or (b) (hereinafter also referred to as “the DNA of the present invention”).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzyme activity for transferring a galactose residue to.
[0014]
Specific examples of the DNA include DNA containing the base sequence represented by base numbers 41 to 1021 in SEQ ID NO: 1.
Furthermore, the present invention provides a recombinant vector retaining the DNA.
The present invention also provides a transformed cell obtained by introducing the DNA or the recombinant vector into a host cell. Host cells include fibroblast cell lines.
The present invention further provides a method for producing a galactose transferase, comprising culturing the transformed cell, producing and accumulating the polypeptide in the culture, and collecting the polypeptide from the culture. .
The present invention also provides a DNA encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0015]
Hereinafter, the galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-xylose β-1,4-D-galactosyltransferase) having the above properties may be simply referred to as “galactose transferase” or XGalT-1.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Unless otherwise noted, Gal is galactose, GlcNAc is N-acetylglucosamine, GAG is glycosaminoglycan, CHO is Chinese hamster ovary cells, D-MEM is Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium, FCS is fetal bovine serum, PBS is phosphate buffered saline, GAPDH is glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, kb is kilobase pair, bp is base pair, HPLC is high performance liquid chromatography, NMR Represents nuclear magnetic resonance, p-Nph-β-D-Xyl represents p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, XGalT-1 represents galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-xylose β-1, 4-D-galactosyltransferase; EC 2.4.1.133) is shown respectively.
[0017]
<1> Enzyme of the present invention
The enzyme of the present invention is a galactose transferase having the following properties.
[0018]
(1) Action
The galactose residue is transferred from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue.
(2) Substrate specificity
No galactose residues are transferred from the galactose donor to the following acceptors.
N-acetylglucosamine residues, N-acetylgalactosamine residues, galactose residues, α-D-xylose residues, and glucosylceramide residues.
[0019]
A preferred embodiment of the galactose transferase of the present invention is a galactose transferase having the following properties.
(3) Michaelis constant
3.4 mM (when paranitrophenyl-β-D-xylopyranoside is used as a receptor)
In addition, it is common knowledge of those skilled in the art that the value of the Michaelis constant slightly changes depending on the measurement conditions. Therefore, it is understood that the value of Michaelis constant shown here is merely an index, and the value of Michaelis constant in a range recognized by those skilled in the art as being substantially the same is included.
[0020]
Specific examples of the galactose transferase of the present invention include galactose transferase, which is a polypeptide of the following (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzyme activity for transferring a galactose residue to.
[0021]
Among these, the polypeptide (a) is preferable.
In the present specification, “it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue. “A polypeptide having an enzyme activity to transfer a galactose residue” is a polypeptide that does not substantially impair the activity to transfer a galactose residue from a galactose donor to the C4 position of a β-D-xylose residue that is an acceptor. Alternatively, it may have several amino acid residue substitutions, deletions, insertions or rearrangements.
[0022]
In other words, naturally occurring polypeptides have amino acid substitutions and deletions in their amino acid sequences due to polymorphisms and mutations of the DNA encoding them, as well as modification reactions during in vivo and purification of the resulting polypeptide. It is known that there may be mutations such as loss, insertion or rearrangement, but nonetheless exhibiting substantially the same physiological and biological activity as a polypeptide having no mutation. Thus, the enzyme of the present invention also includes those in which no significant difference in function is recognized even if there are some structural differences. The same is true when the above mutations are artificially introduced into the amino acid sequence of a polypeptide. In this case, a wider variety of mutants can be prepared. For example, it is known that a polypeptide in which a certain cysteine residue is substituted with serine in the amino acid sequence of human interleukin 2 (IL-2) retains interleukin 2 activity (Science, 224, 1431 (1984). )). Also, certain polypeptides are known to have peptide regions that are not essential for activity. This includes, for example, signal peptides present in polypeptides secreted outside the cell and pro-sequences found in protease precursors. Most of these regions are post-translational or converted to active polypeptides. Removed. Such a polypeptide exists in a different form in the primary structure, but is finally a polypeptide having an equivalent function, and is included in the enzyme of the present invention.
[0023]
In the present specification, “several amino acids” refers to the number of amino acids that may be mutated to such an extent that the activity of the enzyme of the present invention is not lost. For example, in the case of a polypeptide consisting of 400 amino acid residues, about 20 The following numbers are shown.
[0024]
The enzyme activity for transferring a galactose residue from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue is galactose to p-Nph-β-D-Xyl as shown in the Examples below. It can measure by using the measuring method using the transfer reaction. Therefore, those skilled in the art can easily select substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or more amino acid residues that do not substantially impair the activity, using the presence or absence of the enzyme activity of the present invention as an index.
[0025]
The enzyme of the present invention was originally obtained by expressing human cDNA in mouse L cells, which are mouse fibroblasts, and is produced by genetic engineering techniques or chemical synthesis using other hosts. Naturally, polypeptides are also encompassed.
[0026]
Since the amino acid sequence and properties of the enzyme of the present invention have been disclosed by the present invention, it can be produced by isolation / purification from natural products, chemical synthesis, etc., but using the DNA of the present invention described later. It is preferable to manufacture. A method for producing the enzyme of the present invention using the DNA of the present invention will be described later. The enzyme of the present invention is not necessarily a single polypeptide, and may be part of a fusion protein if necessary. For example, a fusion polypeptide comprising a polypeptide of the enzyme of the present invention and another polypeptide such as protein A is exemplified.
[0027]
The enzyme of the present invention may be composed only of a polypeptide as long as it has an enzyme activity to transfer a galactose residue from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue, It may have a sugar chain or the like.
[0028]
Since the enzyme of the present invention has an action of transferring a galactose residue to the C4 position of a β-D-xylose residue, it can be used for C4-specific galactosylation of a xylose residue, synthesis of a sugar chain and the like.
[0029]
<2> DNA of the present invention
The DNA of the present invention is a DNA encoding the following polypeptide (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzyme activity for transferring a galactose residue to.
[0030]
Among these, DNA encoding the polypeptide (a) is preferable.
Specific examples of the DNA include DNA containing the base sequence represented by base numbers 41 to 1021 in SEQ ID NO: 1.
[0031]
The DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is originally derived from humans, but its origin is not limited and DNAs produced by genetic engineering techniques, chemical synthesis, etc. are naturally included.
It should be readily understood by those skilled in the art that DNAs having different base sequences due to the degeneracy of the genetic code are also included in the DNA of the present invention.
[0032]
The DNA of the present invention also includes DNA or RNA complementary to the DNA of the present invention. Furthermore, the DNA of the present invention may be a single strand consisting only of the coding strand encoding the enzyme of the present invention, and is a double strand consisting of this single strand and a DNA strand or RNA strand having a complementary base sequence. There may be.
[0033]
As shown in Examples below, the DNA of the present invention was found by performing a database search on homologues of the sqv-3 gene of C. elegans in animal cells, as shown in Examples below. It was isolated as a human cDNA corresponding to an expressed sequence tag and was named XGalT-I gene.
[0034]
Specifically, an oligonucleotide prepared based on the tag, for example, an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, is used as a primer, and a polymerase chain using a human-derived mRNA or cDNA library as a template. Reaction (PCR) is performed to obtain a part of the DNA of the present invention. Next, based on the base sequence of the obtained DNA, a 5′-terminal region is obtained by 5′RACE. Examples of the primer used in this case include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6.
[0035]
When the amplification product obtained as described above is used as a probe and a human cDNA library is screened by hybridization, a clone containing the DNA of the present invention is obtained.
[0036]
An example of the base sequence of the DNA of the present invention obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
The DNA of the present invention was obtained as described above. However, since the base sequence of the DNA of the present invention was clarified, human-derived mRNA was obtained by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence as a primer. Alternatively, it can be isolated from a cDNA library or a chromosomal DNA, or from a chromosomal DNA or from a cDNA library or a chromosomal DNA library by hybridization using an oligonucleotide probe prepared based on the nucleotide sequence. Examples of the primer include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8.
[0037]
In addition, when the DNA of the present invention is obtained from chromosomal DNA, it is expected to contain introns, but even DNA containing such introns is included in the DNA of the present invention.
[0038]
As long as the DNA of the present invention encodes a polypeptide having an enzyme activity that transfers a galactose residue from the galactose donor to the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue, it is described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. DNA that hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least base numbers 41 to 1021 may be used. The term “stringent conditions” used herein refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) etc.).
[0039]
A cell into which the DNA of the present invention has been introduced is cultured in a suitable medium, the polypeptide encoded by the DNA of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture. Can be manufactured.
[0040]
Cells into which the DNA of the present invention has been introduced can be obtained by inserting a fragment of the DNA of the present invention into a known expression vector to construct a recombinant plasmid, and transferring this recombinant plasmid into the cell. Although this invention DNA used here is not specifically limited as long as it is this invention DNA, DNA containing the base sequence represented by base number 41-1021 in sequence number 1 is preferable.
[0041]
Examples of cells include prokaryotic cells such as Escherichia coli and eukaryotic cells such as mammalian cells. When prokaryotic cells such as Escherichia coli are used, addition of a sugar chain does not occur in the polypeptide produced by the expression of the DNA of the present invention, so that it is possible to obtain the enzyme of the present invention to which no sugar chain is added, When a eukaryotic cell such as a mammalian cell is used, a sugar chain can be added to the polypeptide generated by the expression of the DNA of the present invention. Therefore, it can be obtained in the form of a polypeptide containing a sugar chain.
[0042]
Specific examples of host cells into which the present invention is introduced include L cells that are mouse fibroblasts. Examples of the vector include pcDNA3 expression vector (Invitrogen), pMIKneo, pCD-SA and the like. The medium and culture conditions are appropriately selected according to the host to be used, that is, the cells.
[0043]
The DNA of the present invention may be directly expressed, or may be expressed as a fusion polypeptide with another polypeptide. Further, the DNA of the present invention may be expressed in its full length, or a part thereof may be expressed as a partial peptide.
[0044]
As a method for introducing the DNA of the present invention into a host cell, for example, a method for transfection using the DEAE-dextran method (J. Biol. Chem., 267, 12082-12089 (1992)). There is.
[0045]
The enzyme of the present invention can be collected from the culture by a known polypeptide extraction and purification method. The culture includes a medium and cells in the medium.
[0046]
Specific examples of the method for extracting the enzyme of the present invention include a method using a nitrogen cavitation apparatus, homogenization, glass bead mill method, sonication, osmotic shock method, extraction by cell disruption such as freeze-thaw method, surfactant extraction, or these Processing operations such as a combination may be mentioned.
[0047]
When the DNA of the present invention is expressed, the enzyme of the present invention is localized in the cell membrane fraction. When the DNA of the present invention is expressed in a soluble form as a fusion protein of a part of the enzyme of the present invention, for example, the enzyme of the present invention lacking 53 amino acids at the N-terminal and another polypeptide, the fusion protein becomes cytoplasmic. Localized in. The DNA encoding the enzyme of the present invention lacking the 53 amino acids at the N-terminus is obtained by PCR using oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 as primers, or human-derived mRNA or cDNA library, or chromosomal DNA Can be isolated from
[0048]
Specific examples of the method for purifying the enzyme of the present invention from the extract include, for example, salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) or sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobicity. Examples of the processing operations include chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, and combinations thereof.
[0049]
The production of the enzyme of the present invention can be confirmed by analyzing the amino acid sequence, action, substrate specificity, etc. of the purified polypeptide and comparing it with the physical properties of the enzyme of the present invention described in <1> above.
[0050]
The XGalT-I gene cloned according to the present invention belongs to the β4-galactose transferase family by BLAST analysis of expressed sequence tags using the sqv-3 gene of C. elegans. It was thought that. The sqv-3 gene was identified as a gene that encodes a component of a conserved carbohydrate addition pathway that synthesizes part of the carbohydrates of C. elegans and is required for vulva invagination (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96 (3), 974-9 (1999), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96 (3), 968-73 (1999)).
[0051]
By the way, sqv-3 is considered to be a β1,4 galactose transferase that forms a bond with galactose β1,4-N-acetylglucosamine from the homology of amino acid sequences with mammalian and chicken β4-galactosyltransferases. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (3), 974-9 (1999)). However, the amino acid sequence predicted from the XGalT-I gene has higher homology with sqv-3 than other mammalian β4-galactosyltransferases. It was thought to encode a β4-galactose transferase different from the known β4-galactosyltransferase involved in the synthesis of Gal-β-1,4GlcNAc (or Glc) structure in the protein. And as expected, the analysis of substrate specificity revealed that the XGalT-I gene encodes galactose transferase I involved in the biosynthesis of the glycosaminoglycan of proteoglycan and protein. . The present invention is the first example in which a gene of β4-galactose transferase involved in glycosaminoglycan biosynthesis has been cloned.
[0052]
Moreover, when the expression of the XGalT-I gene in various tissues was analyzed by Northern blotting, it showed a ubiquitous expression pattern. This suggests that the gene product has universal importance. Since the promotion and suppression effect of proteoglycan on cell proliferation has been clarified (Cell, 64 (4), 841-8 (1991), Science, 252 (5013), 1705-8 (1991), Cell, 83 ( 3), 357-60 (1995)), the importance of the role of proteoglycan GAGs is increasingly recognized. The finding of deletion of the sqv-3 gene in C. elegans strongly suggests the particular importance of its corresponding gene product in morphogenesis and growth in mammalian tissues. Therefore, the collaboration of C. elegans gene and mammalian glycan biological research is expected to promote a deeper understanding of the biological importance and functional mechanism of proteoglycan GAG.
[0053]
In addition, XGalT-I gene has been reported to be abnormal in progeroid syndrome patients (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (4), 1342-1346 (1990)) It is expected that the DNA of the present invention can be used as a gene therapy tool for such diseases. In addition, the DNA of the present invention, for example, a DNA encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or rearranged in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, is used for detection of the genetic diseases as described above. It is expected to be possible.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0054]
First, reagents and cells used in the following examples will be described.
UDP-Gal, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside (p-Nph-β-D-Xyl), p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (p-Nph-β-D-Gal) P-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-galactosaminide (p-Nph-β-D-GalNAc), p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (p-Nph-β-D- GlcNAc) and p-nitrophenyl-α-D-xylopyranoside (p-Nph-α-D-Xyl) were purchased from Sigma (St. Louis, MO). In addition, [α- ³² P] dCTP was purchased from ICN (Costa Mesa, CA). A monoclonal antibody (HepSS-1) specific for heparan sulfate was purchased from Seikagaku Corporation.
[0055]
The mouse fibroblast L cells and Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) used in the following examples are D-MEM (Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium) supplemented with 7.5% fetal calf serum (FCS). ), 37 ℃, 5% CO ₂ Grown under conditions. L cells were kindly provided by Dr. A. Albino of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. CHO mutant pgsB-761 (galactose transferase I-deficient) (J. Biol. Chem., 262 (25), 12189-95 (1987)) is obtained from the American Type Culture Collection And grown in F-12K medium (Life Technologies, Inc.) supplemented with 10% FCS.
[0056]
[Example 1]
Cloning of human galactose transferase (XGalT-1) gene
(1) Search for homologues to the nematode sqv-3 gene
In the nematode Kenorhabditis elegans (C. elegans), sqv-3 is a β1,4 galactose transferase (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (3), 974- 9 (1999)) similar to the amino acid sequences of group families and reported to be necessary for vulva invagination and oocyte differentiation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (3) 968-73 (1999)). To find analogs of the sqv-3 gene in animal cells, we performed a database search for the amino acid sequence deduced from the coding sequence of the Kenorhabditis elegans sqv-3 gene (GenBank, accession number AJ005867). It was. The database search was performed on the expressed sequence tag (expressed sequence tag) database (dbEST) of The National Center for Biotechnology Information (NCBI) using the tBLASTn algorithm. As a result, four human expression sequences tag (GenBank, accession number AI040029, AA100869, AA442547 and T82170) were found.
[0057]
(2) Isolation of sqv-3 human homolog cDNA
In order to isolate the cDNA corresponding to the found tag, a primer having the following base sequence was synthesized, and reverse transcription polymerase chain reaction was performed using total RNA prepared from human colon cancer cell line Lovo as a template. It was. PCR was performed under the following conditions: 94 ° C for 1 minute, then (94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute) for 25 cycles, then 72 ° C for 1 minute.
[0058]
(Sense primer)
4GT5GSP1 5'-GGCATCCTGCTGCTCTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 3) (corresponding to base numbers 644-663 in SEQ ID NO: 1)
(Antisense primer)
4GT3GSP1 5'-GCCACTCCACATCCTGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 4) (corresponding to base numbers 1126-1107 in SEQ ID NO: 1)
[0059]
As a result, several overlapping partial length cDNA clones were obtained. Of these, a 583 base pair cDNA was cloned into the pCR 2.1-TOPO vector (Invitrogen, San Diego, CA).
[0060]
Next, in order to obtain the 5′-terminal region of the cDNA, RACE (rapid amplification of cDNA ends) was performed using a 5′RACE kit (Life Technologies, Inc.) according to the instructions of the kit. That is, a gene-specific primer 1 comprising 0.4 μg of total RNA derived from a human Lovo cell line and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (5′-CAGGTGGCGAAATGTCTT-3 ′, corresponding to base numbers 814-797 in SEQ ID NO: 1) The first cDNA strand was synthesized using (gene-specific primer 1; GSP1). Subsequently, Nested PCR was carried out using an adapter primer and a gene-specific primer 2 (gene-specific consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 (5'-CCCCAGAAGCGGTTGGACAT-3 ', corresponding to nucleotide numbers 708-689 in SEQ ID NO: 1)). Primer 2; GSP2) was used. As a result, a 679 bp fragment having an initiation codon conforming to Kozak's rule (Cell, 44, 283-292 (1986)) was obtained.
[0061]
(3) Screening of human cDNA library by hybridization
The 5′RACE product obtained as described above (corresponding to base numbers 29-687 in SEQ ID NO: 1) was converted to Megaprime ^TM DNA labeling system (Megaprime ^TM DNA labeling system (Amersham) ³² P-labeled and used to screen the human melanoma cell line SK-MEL-37 (a gift from Dr. LJ Old, Sloan-Kettering Cancer Center) cDNA library. Approximately 4 x 10 derived from the SK-MEL-37 cell cDNA library ^Five Of Escherichia coli MC1061 / P3 were screened by colony hybridization. Colony hybridization was performed using GeneScreen Plus membrane (NEN). As a result, 5 independent positive clones were obtained.
[0062]
CDNA was extracted from the above positive clones, and its nucleotide sequence was determined by the dideoxy termination method using the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)). The entire open reading frame was included, and the determined amino acid sequence and the amino acid sequence encoded by the same nucleotide sequence are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The position of the AUG start codon is It was determined according to Kozak's consensus sequence (Cell, 44, 283-292 (1986)).
[0063]
The thus cloned gene was designated as XGalT-1 gene. The gene encodes a protein composed of 327 amino acids with a molecular weight of 37,405 daltons.
[0064]
The protein has one strong N-linked sugar chain binding site. The hydropathy determined by Kyte and Doolittle method (J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982)) is the amino terminal site (Val ³¹ -Ala ⁵⁸ ), A prominent hydrophobic region of 28 amino acid residues, which is presumed to be a protein with type 2 transmembrane structure, as with many other glycosyltransferases that have been cloned so far. (FIG. 1).
[0065]
Primary structure of the identified cDNA, abbreviated as human β4-galactosyltransferase I (β4GalT-1); GenBank accession number X14085) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 157 (2), 657-63 (1988) ) Structure, it was revealed that 82 residues (25%) of 327 amino acids were identical. Similar results were obtained from this newly cloned gene and other human β4-galactosyltransferases (β4GalT-II, III, IV, V, and VI) (J. Biol. Chem., 272 (51), 31979-91 (1997), J. Biol. Chem., 273 (45), 29331-40 (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (2), 472-7 ( 1998)), J. Biol. Chem., 273 (22), 13570-7 (1998), Glycobiology 8 (5), 517-26 (1998)). In contrast, this gene has 38% homology (127 residues out of 327 amino acids) with the nematode sqv-3 gene, indicating that this gene is an ortholog of sqv-3 in humans (in different species) Corresponding genes, suggesting that they are genes of other species that have the same evolutionary origin and similar structure and function. These results indicate that this newly cloned gene product is a novel member of the β4-galactose transferase gene family.
[0066]
[Example 2]
Production and properties of human galactose transferase (XGalT-1)
<1> Enzyme activity of XGalT-1 gene product
(1) Construction of XGalT-1 expression vector
In order to measure the activity of galactose transferase, which is a human sqv-3 ortholog, the cloned cDNA was introduced into L cells to prepare an expression product.
[0067]
First, an expression vector for expressing the cDNA was constructed as follows. 5 ′ primer having XhoI site 5′-CTCGAGACGATGTTCCCCTCGCGGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) (corresponding to base numbers 38-58 in SEQ ID NO: 1), and 3 ′ primer having SpeI site 5′-TCTAGAAGCTCAGCTGAATGTGCACCA-3 ′ ( A cDNA fragment encoding the open reading frame of XGalT-1 was prepared by PCR using SEQ ID NO: 8) (corresponding to nucleotide numbers 1027-1007 in SEQ ID NO: 1) as a primer and the cloned cDNA fragment as a template. The PCR product was inserted into the XhoI and SpeI sites of the pMIKneo vector (given by Dr. Kazuo Maruyama of Tokyo Medical and Dental University) to obtain the XGalT-1 expression vector pMIKneo-XGalT-1. PMIKneo contains a neomycin resistance gene as a marker and an SRα promoter.
[0068]
Next, an expression vector for expressing XGalT-1 lacking 53 amino acids at the N-terminal was constructed as follows. 5 ′ primer having EcoRI site 5′-CAGCTCGAATTCTCTGGGGACGTGGCCCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) (base numbers 200-217 in SEQ ID NO: 1) and 3 ′ primer having XhoI site 5′-TGTCCACTCGAGTCAGCTGAATGTGCACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 10) A DNA fragment encoding XGalT-1 lacking 53 amino acids at the N-terminus is prepared by PCR using the cloned cDNA fragment as a template (corresponding to nucleotide numbers 1024-1007 in SEQ ID NO: 1). did. The PCR product was digested with EcoRI and XhoI and subcloned into these restriction enzyme sites of the pCD-SA vector (a gift from Dr. Takaichi Tsuji from RIKEN) to obtain pCDSA-XGalT-1. The pCD-SA vector contains the SRα promoter. The DNA fragment inserted into EcoRI and XhoI of pCD-SA is expressed as a fusion protein with protein A (protA) by the same promoter.
[0069]
(2) Preparation of XGalT-1 gene product
(i) Preparation of insoluble XGalT-1 (membrane fraction)
At least 48 hours prior to transfection, mouse L cells that are mouse fibroblasts 3 × 10 ⁶ The pieces were spread on a 10cm dish. L cells were transfected with the XGalT-1 gene expression vector pMIKneo-XGalT-1 (4 μg) by the DEAE-dextran method (J. Biol. Chem., 267, 12082-12089 (1992)). . Transfected cells were cultured in D-MEM containing 7.5% FCS for 48 hours, and then removed by trypsin and collected. The obtained cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), and then in nitrogen-cavitation apparatus (Parr Instrument Co.) in ice-cold PBS containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). ) And 400 psi for 30 minutes (Cancer Res., 49, 6258-6264 (1989)). Nuclei were removed by low speed centrifugation and the supernatant was centrifuged at 100,000g for 1 hour at 4 ° C. The precipitate was resuspended in ice-cold 100 mM sodium cacodylate buffer (pH 6.0).
[0070]
The cell lysis extract obtained as described above was used as UDP- [ ¹⁴ C] Gal was used as a donor and subjected to measurement of galactose transferase activity using various acceptor substrates. Galactosyltransferase activity was performed by slightly modifying the method of Lugemwa et al. (J. Biol. Chem., 271 (32), 19159-65 (1996)). Assay mix (25 μl) is 1 μl Me ₂ SO, 15 mM MnCl ₂ , 50 mM KCl, 1% Triton X-100, 100 mM MES buffer (pH 6.0), 0.6 mM UDP-Gal, 5,000 dpm / μl UDP- [ ¹⁴ C] Gal (Du Pont-New England Nuclear), 1 μg enzyme solution and 2 mM substrate. After incubating at 37 ° C for 30 minutes, the reaction was terminated by adding 1 ml of water, and Sep-Pak C ₁₈ Applied to cartridge (Waters). The cartridge was washed with 10 ml water and eluted with 5 ml methanol. In methanol eluate ¹⁴ The amount of C] Gal was measured with a liquid scintillation counter (Beckman). The results are shown in Table 1. The activity was expressed as the amount (nmol) of Gal to which 1 mg of enzyme protein was transferred per minute.
[0071]
[Table 1]

[0072]
As a result, a certain transferase activity was observed for p-Nph-β-D-Xyl, a primer for glycosaminoglycan sugar chain formation. However, all other substrates, including p-Nph-β-D-GlcNAc, which should normally be a substrate for galactose transferase in glycoproteins and glycolipids, did not become receptors at all. Note that the extract from cells into which a pseudogene (mock) was introduced instead of XGalT-1 showed almost no enzyme activity.
[0073]
The approximate Km value for the p-Nph-β-D-Xyl substrate was 3.4 mM. These results indicate that the expressed protein is galactose transferase I (UDP-D-galactose: D-xylose β-1,4-D-galactosyltransferase; EC 2.4.1.133) (J. Biol. Chem., 250 (13), 5200-7 (1975)). Similar results have been obtained with the following soluble fusion enzyme (XGalT-1-protA).
[0074]
(ii) Preparation of soluble XGalT-1
In the same manner as described above, pCDSA-XGalT-1 (4 μg) was transfected into L cells (10 cm dish) by DEAE-dextran method, and cultured in D-MEM containing 7.5% FCS for 16 hours. Thereafter, the medium was replaced with serum-free ITS (insulin, transferrin and selenite) medium (Becton Dickinson), and the cells were further cultured for 32 hours. 48 hours after transfection, the culture medium was collected, concentrated 100 times using Molcut-L (Millipore), dialyzed against 100 mM sodium cacodylate buffer (pH 6.0), and soluble enzyme (XGalT-1 -protA) solution was obtained.
[0075]
To prepare samples for NMR analysis, the soluble enzyme was further purified using IgG-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech), and enzyme-bound beads were used as the enzyme source. Specifically, 25 μl of culture medium concentrated 100 times was incubated overnight at 4 ° C. with 10 μl of IgG-Sepharose. The beads recovered by centrifugation were washed with 100 mM MES buffer (pH 6.0) and resuspended in this buffer.
[0076]
<2> Analysis of XGalT-1 reaction products
To identify galactosyltransferase reaction products, the soluble fusion enzyme XGalT-1-protA was used as the enzyme source and p-Nph-β-D-Xyl was [ ¹⁴ Isotope labeled with C] Gal. Generated label product [ ¹⁴ C] Galβ1-4Xylβ1-p-Nph 1 μg was dissolved in a 200 μl solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.3), 50 mM NaCl and 20 μg β-galactosidase (from E. coli; Boehringer Mannheim) Incubated for 7 hours at ° C. As a result, 99% or more of the labeled product was decomposed.
[0077]
Meanwhile, the labeled product [ ¹⁴ C] Galβ1-4Xylβ1-p-Nph was treated with β-galactosidase specific for the binding mode. Specifically, in 100 μl of 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) containing 100 mM NaCl and 100 μg / ml BSA, 1 μg of the labeled product was converted into 20 mU of diplococcal (derived from bacilli) β-galactosidase (Boehringer Mannheim) And digested at 37 ° C. for 23 hours. Dilute digestion product with 1 ml water and use Sep-Pak C as above ₁₈ Separated using a cartridge, radioactivity was measured with a liquid scintillation counter. As a result, the labeled product was also completely cleaved by diplococcal β-galactosidase degradation, which specifically catalyzes the hydrolysis of the terminal β-1,4 galactose binding structure.
[0078]
The above results indicate that the XGalT-1-protA fusion protein catalyzes the transfer of UDP-Gal to galactose to a receptor having a β-1,4 binding structure.
[0079]
<3> XGalT-1 reaction product structure determination
In order to determine the β-1,4-bond of the reaction product, XGalT-1-protA fusion protein immobilized on IgG-Sepharose was used as an enzyme source, and a large amount of reaction product was prepared.
[0080]
50 μl enzyme-linked IgG-Sepharose, 2.7 mg p-Nph-β-D-Xyl, 10 μl Me ₂ SO, 15 mM MnCl ₂ The reaction was performed in 250 μl of a mixture containing 50 mM KCl, 1% Triton X-100, 100 mM MES buffer (pH 6.0) and 75 mM UDP-Gal. The formation of the reaction product was monitored by high-speed thin layer chromatography using a solvent system of ethanol / pyridine / n-butanol / acetic acid / water (100: 10: 10: 3: 30), and was carried out for 24 hours until completion. . The reaction product is Sep-Pak C as described above. ₁₈ The product was purified using a cartridge, and further purified by HPLC (using a Jasco 880-PU pump and MD915 detector) using a Develosil ODS HG-5 column (4.6 mmφ × 250 mm; Nomura Chemical). To avoid overloading the column, the sample was loaded in four portions. Elution was monitored by absorbance at 300 nm. 10% acetonitrile aqueous solution (solution A) and 30% acetonitrile aqueous solution (solution B) were used as eluents, and the following concentration gradient was used. The flow rate was 1 ml / min and the temperature was 40 ° C.
[0081]
0 to 2 minutes 0% to 30% linear concentration gradient of solution B
2-30 minutes Hold with 30% solution B
30-40 minutes 30% to 100% linear concentration gradient of solution B
[0082]
Fractions containing the main product were collected and used for analysis by NMR. Before analyzing by NMR, the sample is D ₂ Dissolve in O (99.9 atom% D), dry under reduced pressure and finally 600 μl D ₂ Dissolved in O (99.96 atom% D).
[0083]
Proton nuclear magnetic resonance ( ¹ (H NMR) spectrum (600 MHz) was measured at 25 ° C. using JEOL JMNα-600 (manufactured by JEOL Ltd.). D ₂ O was the measurement solvent, t-butanol (δ1.23) was the internal standard, and 1D, 1D-HOHAHA, NOE difference spectrum and COZY were recorded in ppm. FABMS data was recorded using JEOL MSTATION (manufactured by JEOL Ltd.) using m-nitrobenzyl alcohol as a matrix.
[0084]
434 m / z (M + 1) and 456 m / z (M + Na) by FAB MS (fast atom bombardment mass spectrometry) ⁺ ), The product molecular weight was determined to be 433. This can be attributed to the galactose binding product of the starting material Xylβ1-p-Nph.
[0085]
¹ The 1 H-NMR spectrum showed a p-nitrophenyl moiety and 2 glycosyl residues. All signals of the sugar component were identified by 1D-HOHAHA spectra and COZY irradiated with the respective anomeric signals (δ = 4.49 and δ = 5.25) (FIG. 2). The structure of the p-Nph-β-D-Xyl moiety was confirmed by comparison with the spectrum of the starting molecule. (Spin) coupling constant of galactose residue (J _1,2 = 7.7 Hz, J _2,3 = 9.9 Hz, J _3,4 = 3.7 Hz, J _4,5 = 0 Hz) indicates that this galactoside is β-pyranoside. The binding of galactoside was determined by NOE difference spectrum. By irradiation with Gal H1, strong NOE (interaction) was observed at Xyl H-4, GalH-3 and Gal H-5 positions, and Gal H-1 (spectrum) was observed by irradiation with Xyl H-4. Increased strongly. From these results, it was shown that the structure of the product was Galβ1-4Xylβ1-p-Nph (Eur. J. Biochem., 247 (3), 1083-90 (1997)).
[0086]
<3> Recovery of glycosaminoglycan synthesis by cloned XGalT-1 in glycosaminoglycan-deficient mutant cells
In order to confirm that the enzyme of the present invention is involved in biosynthesis of glycosaminoglycan in vivo, pMIKneo-XGalT-1 was added to mutant CHO cell pgsB-761 (galactose transferase I-deficient). Transiently introduced (transfected). The transfected cells were stained with a HepSS-1 monoclonal antibody specific for heparan sulfate and then analyzed with a flow cytometer.
[0087]
2 × 10 ⁶ Seed CHO pgsB-761 cells in a 10cm dish and the next day, 45μl Lipofectamine ^TM Reagent (Life Technologies, Inc.) was used to transfect 10 μg of plasmid DNA according to the reagent instructions. After 3 days, the cells are detached with PBS containing 0.5 mM EDTA and 0.25% trypsin and about 1 × 10 ⁶ Cells were incubated with HepSS-1 monoclonal antibody (40 μg / ml) diluted 1:25 for 30 minutes in ice. After washing twice, cells were stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated goat anti-mouse IgM (μ chain specific) (Zymed Laboratories) diluted 1: 200. After incubating for 30 minutes in ice, the cells are washed twice and Cell Quest ^TM Analyzed by FACSCalibur (Becton Dickinson) using version 3.1f software.
[0088]
As a result, about 50% of the cells were stained with the monoclonal antibody HepSS-1, but cells into which the pseudogene (mock) was introduced were negative (FIG. 3). This indicates that the DNA of the present invention is a gene encoding galactose transferase I that promotes glycosaminoglycan chain formation.
[0089]
<4> Analysis of XGalT-1 gene expression in various tissues
To analyze the gene expression of XGalT-1, Northern blot analysis was performed using the full-length cDNA fragment as a probe.
[0090]
Human Multiple Tissue Northern Blot ^TM (Clontech Laboratories) and gel-purified [α- ³² P] dCTP-labeled XGalT-1 cDNA or polyglycerides derived from various human adult tissues (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas) using glyceraldehyde phosphate dehydrogenase gene (GAPDH) as a probe A ⁺ Northern blotting was performed on RNA. The blot was exposed to an imaging plate and analyzed with a BAS2000 imaging analyzer (Fuji Photo Film).
[0091]
As a result, the XGalT-1 gene was expressed in all human tissues as long as it was examined, and a 1.8 kb transcript (mRNA) was detected.
[0092]
【The invention's effect】
The enzyme of the present invention is useful as a production tool for proteoglycans and glycosaminoglycans. The DNA of the present invention is useful as a tool for mass production of the polypeptide of the present invention. In addition, it is expected to be applied to gene therapy for disease patients whose gene abnormality or expression of the enzyme of the present invention is reduced.
[0093]
The recombinant vector of the present invention is useful for a large-scale preparation tool of the enzyme of the present invention, gene therapy, and the like. In addition, the transformed cell of the present invention is useful as a tool for mass production of the enzyme of the present invention.
[0094]
[Sequence Listing]

[0095]

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a hydropathy plot of human galactose transferase (XGalT-1) protein.
[Fig. 2] Proton nuclear magnetic field of the enzyme preparation of the present invention ( ¹ (H NMR) shows a resonance spectrum.
A: Structure of the product prepared by the cloned cDNA product.
B: measured for galactose and xylose residues ¹ H Chemical shift (ppm) and ¹ H- ¹ The H coupling constant (Hz) is summarized.
FIG. 3 shows a flow cytometric analysis of CHO mutant pgsB-761 cells transfected with XGalT-1 expression vector. The thin line shows the results using the monoclonal antibody, and the solid line shows the control.
A: CHO-K1 cells (positive control)
B: pgsB-761 cells (negative subjects)
C: XGalT-1-deficient CHO mutant pgsB-761 cells into which the vector MIKneo without cDNA was introduced.
D: pgsB-761 cells into which pMIKneo containing XGalT-1 cDNA was introduced.

Claims

DNA encoding the following polypeptide (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzymatic activity to transfer the C1 position of a galactose residue to

The DNA according to claim 1, comprising a base sequence represented by base numbers 41 to 1021 in SEQ ID NO: 1.

A recombinant vector retaining the DNA according to claim 1 or 2.

A transformed cell obtained by introducing the DNA according to claim 1 or 2 or the recombinant vector according to claim 3 into a host cell.

The transformed cell according to claim 4, wherein the host cell is a fibroblast cell line.

A transformed cell according to claim 4 or 5 is cultured, and the polypeptide (a) or (b) encoded by the DNA according to claim 1 is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide is produced from the culture. A method for producing a galactose transferase, characterized in that

C4-position specific galactosylation method of β-D-xylose residue, comprising at least a step of allowing a galactose donor to act on β-D-xylose residue in the presence of the following polypeptide (a) or (b) .
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) the amino acid sequence (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged, and from the galactose donor, the C4 position of the acceptor β-D-xylose residue A polypeptide having an enzymatic activity to transfer the C1 position of a galactose residue to