JP4155779B2

JP4155779B2 - Glycosulfating agent

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Publication number: JP4155779B2
Application number: JP2002272334A
Authority: JP
Inventors: 脩躬羽渕; しおり大竹; 有紀伊藤; 雅一福田; 喬村松; 寿子村松; 啓子市原; パンゾウ
Original assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Seikagaku Corp
Current assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Seikagaku Corp
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2022-09-18
Also published as: JP2003289882A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素活性を有する融合タンパク質に関し、より詳細にはコンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を有する融合タンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献】
特開平１３−５７８８２号公報
【非特許文献】
J. Biol. Chem. 275, 34728-34736(2000)
【０００３】
従来、コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を有する酵素（GalNAc4S-6ST）としてはイカ軟骨から抽出した酵素が特許文献及び非特許文献に開示されている。しかし、イカ軟骨から抽出して得られた上記酵素は、糖鎖硫酸化剤として使用するだけの量の確保が困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
糖鎖硫酸化剤として酵素を使用するためには、遺伝子組換技術によって酵素の大量調製が必須となる。また遺伝子治療に当該遺伝子を利用する場合にも、当該遺伝子の解明が不可欠である。にもかかわらず、上記GalNAc4S-6STの遺伝子はこれまでに得られていなかったため、GalNAc4S-6STの大量調製は不可能だった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を鑑み、鋭意検討した結果、イカ軟骨由来のGalNAc4S-6STの部分アミノ酸配列を基に、イカのGalNAc4S-6STのcDNAを見つけだし、更にその塩基配列を基に遺伝子データベースを検索し、ヒトのGalNAc4S-6STのcDNAを得て、これを融合タンパク質として発現するように組換えることによりヒトのGalNAc4S-6STの大量合成を可能として、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してなることを特徴とする融合タンパク質。
（２）コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を有することを特徴とする（１）記載の融合タンパク質。
（３）クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸には硫酸基供与体から硫酸基を転移する活性を有するが、ヘパラン硫酸及び完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化ヘパリンには実質的に硫酸基を転移する活性を有しないことを特徴とする（１）又は（２）記載の融合タンパク質。
（４）識別ペプチドがシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGタンパク質、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB、HAタグ、Trxタグ、CBPタグ、CBDタグ、CBRタグ、β-lac/blu、β-gal、luc、HP-Thio、HSP、Lnγ、Fn、GFP、YFP、CFP、BFP、DsRed、DsRed2、MBP、LacZ、IgG、アビジン、及びプロテインGからなる群から選択されるいずれか一のペプチドであることを特徴とする（１）乃至（３）いずれか記載の融合タンパク質。
（５）（１）乃至（４）いずれか記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）（５）記載のＤＮＡを含むベクター。
（７）（６）記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
（８）（７）記載の形質転換体を生育させ、生育物から単離、精製することを特徴とする（１）乃至（４）いずれか記載の融合タンパク質の製造方法。
（９）配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するＮ−アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を有する糖鎖硫酸化剤。
（１０）配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと識別ポリペプチドとの融合タンパク質を含むことを特徴とする糖鎖硫酸化剤。
（１１）コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位へ、硫酸基供与体から硫酸基を転移して、N-アセチルガラクトサミン4,6硫酸を基本骨格に含むコンドロイチン硫酸を製造するための、（９）又は（１０）記載の糖鎖硫酸化剤の使用。
（１２）（９）又は（１０）記載の糖鎖硫酸化剤を用いて、コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位へ、硫酸基供与体から硫酸基を転移することを特徴とする、N-アセチルガラクトサミン4,6硫酸を基本骨格に含むコンドロイチン硫酸の製造方法。
（１３）基本骨格中の4,6硫酸化されているN-アセチルガラクトサミン残基の含量が、N-アセチルガラクトサミン残基の全量に対して50%以上であることを特徴とするコンドロイチン硫酸。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。
（１）本発明物質
本発明物質は配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する酵素活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【０００８】
ここで、識別ペプチドとは、融合タンパク質を遺伝子組み換えによって調製する場合に、該ペプチドを目的タンパク質に連結して発現させることにより、形質転換体の生育物から融合タンパク質の分泌、分離、精製、又は検出を容易にすることが可能なペプチドであり、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、FLAGペプチド（８アミノ酸配列からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の１１アミノ酸配列）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の１５アミノ酸配列）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの２２アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸配列）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（βガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインGからなる群から選択されるいずれかのペプチドを指称し、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明物質の発現、精製がより容易となることから好ましい。
【０００９】
本発明物質中での配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの配置は、識別ペプチドが配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのC末端側につながっていても或いはN末端側につながっていても、本発明物質がコンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性（以下、「GalNAc4S-6ST活性」とも記載する）を有する限りにおいて制限はされない。
【００１０】
ここで、GalNAc4S-6ST活性は、例えばJ. Biol. Chem. 275 (2000), 34728-34736に記載の方法にならって、基質として例えばクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（生化学工業株式会社製：主な構成二糖単位がD-グルクロン酸１−３ガラクトサミン４硫酸であるコンドロイチン硫酸：コンドロイチン硫酸Ａとも呼ばれている）を用いることにより検出することが可能である。
【００１１】
尚、一般に、酵素タンパク質のアミノ酸配列のうち、１又は数個（通常は２以上１０以下）の構成アミノ酸が置換、欠失、挿入、或いは転位しても酵素活性が維持されることが知られ、同一酵素のバリアントであるということができるが、本発明物質においても配列番号１４記載のアミノ酸配列に一又は数個（２以上１０以下）の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、或いは転位が起こっていても融合タンパク質がGlcNAc4S-6ST活性を保持している限りにおいて、本発明物質と実質的に同一の物質であるということができる（このような配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に部分的な変異を有するタンパク質を便宜的に「修飾タンパク質」と記載する）。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、FASTAのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができ、このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
【００１２】
このような本発明物質は、グリコサミノグリカンの基本骨格中、「4位ヒドロキシル基に硫酸基が置換し、６位ヒドロキシル基に硫酸基が置換していないガラクトサミン残基」（Ｎ−アセチルガラクトサミン4硫酸残基）に対して、当該６位ヒドロキシル基に硫酸基を転移する活性を有した融合タンパク質であり、後述の本発明糖鎖硫酸化剤に利用することができる。
【００１３】
尚、本発明物質はヘパラン硫酸及び完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化ヘパリンには実質的に硫酸基を転移する活性を実質的に有しないことが好ましく、具体的にはそのような活性は1pmol/分/ml未満、より好ましくは0.1pmol/分/ml未満、最も好ましくは検出されない。このような硫酸基転移活性の確認は、例えば実施例１＜５＞に記載された方法に従って行うことができる。
【００１４】
（２）本発明物質の調製法
本発明物質の調製は、配列番号１４記載のアミノ酸配列をコードするDNAと識別ペプチドをコードするDNAを同一読み出し領域に配置してなり、且つ配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとが発現しうるようなプロモーター領域を有するベクターを、適当な宿主細胞に組み込んで組換体とし、これを生育させることで、生育物として調製を行うことが可能である。尚、ここで宿主細胞とは原核細胞（例えば大腸菌等）又は真核細胞（例えば酵母、哺乳動物由来の細胞又は昆虫由来の細胞等）を指す。特に配列番号１４記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は本来真核細胞中で発現しているタンパク質であることから真核細胞が宿主細胞として好ましく、特に通常本発明物質の酵素活性を有する酵素は哺乳類で発現している点から哺乳類細胞が好ましく、また本発明物質の大量合成に極めて適する点から昆虫細胞も好ましい。
【００１５】
ここで、宿主細胞の生育とは、宿主細胞を培養することの他、宿主細胞を生体などに投与し、その生体内で宿主細胞を生育させることも含む概念である。また、生育物とは、培養された宿主細胞、培養上清の他、宿主細胞を生体内で生育させた場合には、その生体の排泄物、分泌物なども含む概念である。
【００１６】
本発明者らは、実施例記載の方法によりGenBank受け入れ番号AB11170のcDNAが、ヒトのGalNAc4S-6STをコードするDNAであることを明らかとしたため、当該cDNAを基に本発明物質を調製することも可能である。
本発明物質の識別ペプチドとして例えばFLAGペプチドを使用し、宿主細胞として哺乳動物由来の細胞を使用する場合には、例えばpFLAG-CMV-2ベクター（米コダック社製）などを発現ベクターとして使用することができる。
【００１７】
pBluescriptIIプラスミドに挿入されている上記cDNA（AB11170）をpFLAG-CMV-2ベクターに挿入するためには、pBluescriptIIプラスミドベクターから適当な制限酵素を用いてcDNAを切り出して、必要に応じてcDNAの粘着末端を平滑化して、pFLAG-CMV-2ベクターに挿入するために適当な制限末端を連結させて、適当な制限酵素で処理したpFLAG-CMV-2ベクターに挿入することもできる。また、pBluescriptIIプラスミドに挿入されたcDNAを例えば配列番号１５の5'プライマー及び配列番号１６の3'プライマーを用いてPCR法により増幅することで5'末端にEcoRI制限領域を、3'末端にHindIII制限領域を有するヒト由来のGalNAc4S-6SのcDNAが増幅されるため、このPCR産物をHindIII及びEcoRIで消化した後、HindIII及びEcoRIで消化したpFLAG-CMV-2ベクターに常法により連結させることが可能である。
【００１８】
このようにして調製したpFLAG-CMV-2ベクター（pFLAGGalNAc4S-6ST）を、例えばpFLAG-CMV-2ベクターの宿主細胞として機能するCOS-1細胞やCOS-7細胞等の哺乳類由来の細胞にエレクトロポレーション法などの常法を用いて導入して形質転換体を得ることができる。
【００１９】
形質転換体を、それが生育するのに適した条件下で生育させて、本発明物質をコードするDNAを発現させてその生育物から本発明物質を調製することができる。例えばCOS-7細胞を宿主細胞として選択した場合には、in vitroで形質転換体を培養し、その培養物（培養後の形質転換体及び培養上清）から本発明物質を精製することが可能である。上記pFLAG-CMV-2ベクターを用いた場合には本発明物質はFLAGペプチドを含むことになるので、本発明物質は例えば抗FLAG抗体を用いて、例えばアフィニティー精製などの方法で本発明物質を単離、精製することが可能である。単離、精製の方法は、本発明物質における識別ペプチドによって適宜、適当な方法を常套的に選択することが可能である。
【００２０】
（３）本発明糖鎖硫酸化剤
本発明糖鎖硫酸化剤は、配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、コンドロイチン硫酸の基本骨格中に存在するＮ−アセチルガラクトサミン4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を有する。
【００２１】
本発明糖鎖硫酸化剤は、配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと識別ポリペプチドとの融合タンパク質であることが好ましく、前記本発明物質によってなる。
【００２２】
本発明糖鎖硫酸化剤は、コンドロイチン硫酸の基本骨格に存在するＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸残基に対して硫酸基を転移して過硫酸化コンドロイチン硫酸を合成する酵素剤として使用することが可能である。また、本発明糖鎖硫酸化剤を構成する目的酵素活性を有する部分である配列番号１４記載のアミノ酸配列がヒト由来のアミノ酸配列であるため、ヒトへの投与を行ったとしても抗原性が低いことが期待され、また培養軟骨などを本発明糖鎖硫酸化剤で修飾した後に生体に対して移植したとしても、本発明糖鎖硫酸化剤に起因する抗原抗体反応、炎症は惹起されないことが期待される。
【００２３】
特に、基本骨格中にＮ−アセチルガラクトサミン4硫酸残基を有するコンドロイチン硫酸に対して、本発明糖鎖硫酸化剤を作用させて硫酸基供与体から硫酸基を転移させることで、Ｎ−アセチルガラクトサミン4,6硫酸残基を基本骨格中に有する過硫酸化コンドロイチン硫酸（いわゆるうコンドロイチン硫酸E）が得られる。本発明糖鎖硫酸化剤は、非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸残基に主に硫酸基を転移する働きを有するが、高濃度（0.1%(w/v)以上、好ましくは0.3%(w/v)以上）の活性硫酸（以下「PAPS」とも記載する）共存下においては、基本骨格の非還元末端以外のＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸残基に対しても硫酸基を転移する性質も併せて有し（後述実施例２＜２＞参照）、このような性質を利用して、基本骨格中のＮ−アセチルガラクトサミン残基のうちの50%以上、好ましくは60%以上が、4,6硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン（コンドロイチン硫酸E構造）であるコンドロイチン硫酸の合成に使用することができる。なお、コンドロイチン硫酸E構造はミッドカインに対する強い親和性を示すことが知られており（J. Biol. Chem., 275, 37407-37413(2000)）、上記の通りコンドロイチン硫酸を本発明糖鎖硫酸化剤で処理した後の反応生成物を、例えばミッドカインを結合したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法により、上記コンドロイチン硫酸E構造が多く含まれるコンドロイチン硫酸を含む画分を容易に得ることが可能である。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例：硫酸基転移酵素反応の測定
GalNAc4S-6STの酵素活性の測定はJ. Biol. Chem. 275, 34728-34736の方法を改変して行った。標準反応液は50μl中に、2.5μmolのイミダゾール-HCl（pH6.8）、0.5μmolのCaCl₂、1μmolの還元型グルタチオン、ガラクトサミン換算で25nmolのコンドロイチン硫酸（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製：コンドロイチン硫酸Ａ）、50pmolの[³⁵S]PAPS（約5.0×10⁵cpm：Anal. Biochem., 148(1985), 303-310に従って調製した）、及び酵素を含む。反応液を37℃で20分間インキュベートし、反応の停止は1分間反応チューブを沸騰水中で加熱して行った。反応停止後、³⁵Sでラベルされたグリコサミノグリカンをエタノールで沈殿させ、J. Biol. Chem. 268, 21968-21974に記載された方法で高速脱塩カラムを用いたゲルクロマトグラフィーを行って放射能を測定した。
【００２５】
他のグリコサミノグリカンに対する硫酸基転移活性を測定するためにはコンドロイチン硫酸Aに代えて25nmolの他のグリコサミノグリカン又はそのオリゴ糖［コンドロイチン硫酸C（サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸：生化学工業株式会社製）及びデルマタン硫酸（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、4硫酸化コンドロイチンオリゴ糖（三糖及び五糖：何れも生化学工業株式会社製のクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸をJ. Biol. Chem. 275(2000), 34728-34736の記載に従ってウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼによって消化して調製した）、非硫酸化コンドロイチンオリゴ糖（三糖及び五糖：何れも生化学工業株式会社製のクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸をBiochem. J., 226(1985), 705-714の記載に従ってウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼによって消化して調製した）の量はガラクトサミン量に換算；ヘパラン硫酸（ウシ腎臓由来：生化学工業株式会社製）、CDSNSヘパリン及びケラタン硫酸（ウシ角膜由来：生化学工業株式会社製）の量はグルコサミン量に換算］を用いた。コンドロイチン硫酸Ａ又はデルマタン硫酸への硫酸基転移部位を調べるために、³⁵SでラベルされたグリコサミノグリカンをコンドロイチナーゼACII、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼACIIとコンドロ-６-スルファターゼ、又はコンドロイチナーゼABCとコンドロ-6-スルファターゼ（何れも生化学工業株式会社製）を使用してJ. Biol. Chem. 275, 34728-34736に記載された方法で測定を行った。酵素による消化で生じた放射能を有する消化産物を、Whatman Partisil-10 SAXカラムで分離し（Whatman Partisil-10 SAXカラム(4.6×25cm)を10mmol/lのKH₂PO₄で平衡化し、10mmol/lのKH₂PO₄で10分間展開した後、KH₂PH₄濃度を10〜450mmol/lへ変化させる濃度勾配溶出を行った）、³⁵Sの放射能を測定した。オリゴ糖を硫酸基の受容体として使用した際は、反応液を直接Superdex30カラムに通筒（Superdex 30 16/60カラムを0.2mol/lのNH₄HCO₃で平衡化し、流速2ml/分で1mlずつの画分を回収した）し、³⁵Sでラベルされたオリゴ糖を³⁵SO₄ ^2-及び[³⁵S]PAPSと分離した。
【００２６】
実施例１
＜１＞イカGalNAc4S-6STの調製及びプライマーの調製
J. Biol. Chem. 275, 34728-34736記載の方法に従ってイカ軟骨からGalNAc4S-6STを精製した。その後タンパク質量で10ngのイカGalNAc4S-6STを10%のゲルを用いたメルカプトエタノールによる還元条件下でのSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）をLaemmliらの方法（Nature 227, 680-685）によって行った。クマシーブリリアントブルーで泳動後のゲルを染色した結果、63kDaのタンパク質のバンドが検出された。
【００２７】
このバンドを泳動ゲルごと切り出し、プロテイナーゼ Lys-Cで限定消化後に逆相HPLC分析してペプチドの断片を分離し、アミノ末端のアミノ酸配列の分析を行い、５種類のアミノ酸配列を特定した（表１）。
【００２８】
【表１】
表１

【００２９】
ペプチド４及び５のアミノ酸配列に基づき配列番号６乃至９記載のプライマー（4a-1（アンチセンスプライマー）：配列番号６、4a-2（アンチセンスプライマー）：配列番号７、5s-1（センスプライマー）：配列番号８、5s-2（センスプライマー）：配列番号９）を常法に従って調製した（図１）。
【００３０】
＜２＞イカのポリ(A)⁺RNAの調製
イカの頭蓋軟骨を取り出し、コットンを用いて軟組織を取り除き、軟骨を液体窒素により凍結させた。凍結した軟骨を液体窒素中ですり潰して粉末状にし、この軟骨粉を10倍量のグアニジンチオシアナート溶液に入れ、ポリトロンホモジナイザーを用いてすり潰し、その後100,000×gで30分間超遠心分離を行った。遠心上清を分離し、グアニジンチオシアナート／塩化セシウム法（Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Suppl.36, pp.4.2.3-4.2.9, John Wiley & Sons, New York）による全RNA（ポリ(A)⁺RNA）の調製を行った。
【００３１】
＜３＞イカGalNAc4S-6STcDNAの調製
全RNA（ポリ(A)⁺RNA）を鋳型としてオリゴdT又はランダムプライマーを使用して逆転写反応を行って調製した一次cDNAを作成し、これを使用してPCR法によりイカGalNAc4S-6STcDNAを調製した。すなわち、2μgのポリ(A)⁺RNA、0.5μgのオリゴdT及びランダムプライマー、10mmol/lのジチオスレイトール、0.5mMの各塩基を含むデオキシヌクレオチド三リン酸、30UのRNase阻害剤（宝酒造株式会社）、及び400Uの逆転写酵素（SuperscriptII、ライフテクノロジーズ社製）を含む20μlの水溶液で逆転写反応を行った。反応は42℃で50分間行った。反応後、反応液を70℃で15分間加熱することで反応を停止させ、0.5UのRNaseH（ライフテクノロジーズ社製）を加え、37℃で20分間反応させて、ポリ(A)⁺RNAを分解した。PCR反応は各々25pmolの5s-1及び4a-2オリゴヌクレオチドプライマー、1μlの逆転写反応後の反応液、各々0.2mMの4種類の塩基を含むデオキシヌクレオチド三リン酸、及び1.5UのTaqポリメラーゼ（キアゲン社製）を含む終量25μlの水溶液を使用して行った。増幅反応は熱変性反応（94℃で45秒）、アニーリング反応（45秒の反応であって3サイクルごとに48℃から28℃まで4℃ずつ低下させ、28℃まで低下した後はその温度で行った）及び伸長反応（72℃で1分）の3反応を40回繰り返して行った。更にこのPCR産物を使用して、上記と同様のPCR法（二次PCR）をプライマー5s-2（配列番号９）及び4a-1（配列番号６）を用いて行った。二次PCRの産物をアガロースゲル電気泳動して分離した（図２）。増幅されたDNAのバンドを常法に従って切り出し、センスプライマー5s-2及びアンチセンスプライマー4a-1をシークエンスプライマーとして用い、塩基配列をデオキシチェインターミネーション法によってDNAシークエンサー（モデル373A：アプライドバイオシステム社製）で解析した（配列番号１０）。
【００３２】
このように解析して得られたイカGalNAc4S-6STcDNAの塩基配列を使用して、インターネット上でFASTA検索を行い、該DNAと高い相同性を有しヒト脳細胞の第１０染色体から得られたcDNAクローン（受け入れ番号AB011170：DNA Res. 5, 31-39：配列番号１１）及びそれに高い相同性を有するクローン（受け入れ番号AF026477：ヒトのB細胞RAG関連遺伝子(hBRAG)として報告されている（Eur. J. Immunol. 28, 2839-2853）：配列番号１２）を選択した。前者のcDNAクローンは増幅されたイカGalNAc4S-6STcDNAと塩基配列レベルで最大40%、アミノ酸配列レベルで最大61%の相同性を有していた（図３）。このクローンは一の読み出し領域（配列番号１３）を有しており、塩基配列から561アミノ酸からなるタンパク質（配列番号１４）をコードしていることが示唆された。アミノ酸配列を解析した結果、このタンパク質は一の膜貫通領域を有するタイプIIの膜タンパク質であり、活性硫酸（PAPS）結合領域を有しており、新たな硫酸基転移酵素をコードしていることが示唆された。尚、この解析によって明らかとなったヒトのGalNAc4S-6STのcDNAの塩基配列は、B(D)J組換に重要な役割を示す(Annu. Rev. Immunol., 10(1992), 359-383)B細胞RAG関連遺伝子のコード領域の塩基配列と高い相同性（99%）を有しているため、GalNAc4S-6STは免疫系の働きに何らかの関与をしている可能性が示された。
【００３３】
＜４＞ヒトGalNAc4S-6STcDNAの調製及びヒトGalNAc4S-6STcDNAの発現
GenBank受け入れ番号AB11170のcDNAを含むpBluescriptIIプラスミド（かずさDNA研究所より恵与）をEcoRIで切断し、2258bpの断片をpcDNA3.1（インビトロゲン社製）のEcoRI領域に常法に従って挿入、連結して、pcDNAGalNAc4S-6STを得た。
【００３４】
宿主細胞としてはCOS-7細胞を用いて、これにpcDNAGalNAc4S-6STをDEAE-デキストラン法（Current Protocols in Molecular Biology, Vol.3, Suppl.43,pp.16.13.1-16.13.7, John Wiley & Sons, New York、J. Biol. Chem. 270, 18575-18580）により形質転換して、組換体を得た。
【００３５】
組換体は67時間培養した後、0.15mol/l NaCl、10mmol/l Tris-HCl（pH7.2）、10mmol/l MgCl₂、2mmol/l CaCl₂、0.5% Triton X-100（商標名：ICN社製）、及び20%グリセロール中で30分間ロータリーシェーカーを使用して撹拌することで組換体を溶解し、10,000×gで10分間遠心分離し、この上清を抽出液とした。抽出液の硫酸基転移酵素活性をコンドロイチン硫酸A（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）及び4硫酸化三糖（生化学工業株式会社製のクジラ由来のコンドロイチン硫酸ＡをJ. Biol. Chem. 275(2000), 34728-34736に従ってウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼによって消化して調製）を硫酸基受容体として使用して各々測定した（図４）。ヒトのcDNAを含むプラスミドを導入したCOS-7の抽出液を用いて基質として4硫酸化三糖を使用した酵素活性を測定した場合には、陰性対照のpcDNA3を導入したCOS-7の抽出液と比して5倍以上に酵素活性が上昇したが、コンドロイチン硫酸Aに対する酵素活性は2倍にしか増加しなかった。コンドロイチン硫酸Aよりも4硫酸化三糖の方が酵素活性が高かったことから、この酵素は非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン4硫酸残基に特異的に硫酸基を転移する酵素であることが示唆された。
【００３６】
＜５＞ヒトGalNAc4S-6ST-FLAGペプチド融合タンパク質の基質特異性の検討
ヒトGalNAc4S-6STの基質特異性を調べるために、発現したヒトGalNAc4S-6ST-FLAGペプチド融合タンパク質の精製を行った。すなわち、アフィニティーカラムを用いた精製を容易とするために、GalNAc4S-6STをFLAGペプチドとの融合タンパク質として発現するベクターpFLAGGalNAc4S-6STを構築して、このベクターをCOS-7細胞に導入した。pFLAGGalNAc4S-6STを構築は、かずさDNA研究所より恵与されたcDNA（受け入れ番号AB011170：遺伝子番号KIAA0598）を鋳型として使用し、5'プライマーとして配列番号１５、3'プライマーとして配列番号１６のプライマーを各々用いて上述と同様の手法でPCR法を行ってPCR産物を得た。センスプライマー（5'プライマー）の末端にはHindIII認識配列が設けられており、アンチセンスプライマー（3'プライマー）の末端にはEcoRI認識配列が設けられているため、PCR産物をHindIII及びEcoRIで消化してpFLAG-CMV-2プラスミド（米コダック社製）に常法に従って挿入した。
【００３７】
このプラスミドベクターを導入したCOS-7細胞を67時間培養し、上記と同様に抽出液を得た。この上清を抗FLAGモノクローナル抗体結合アガロースカラム（0.5ml：シグマ社製）に通筒した。カラムへの吸着画分は、説明書に記載された条件下でFLAGペプチドを含む緩衝液1.5mlを使用してヒトGalNAc4S-6ST-FLAGペプチド融合タンパク質（以下「本発明物質１」とも記載する）を溶出させた。
【００３８】
このようにして得た本発明物質１の酵素活性をコンドロイチン（生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸A（ＣＳ−Ａ：クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸C（ＣＳ−Ｃ：サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸E（ＣＳ−Ｅ：イカ軟骨由来コンドロイチン硫酸：生化学工業株式会社製）、デルマタン硫酸（ＤＳ：ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、ケラタン硫酸（生化学工業株式会社製）、ヘパラン硫酸（生化学工業株式会社製）、完全脱硫酸化N再硫酸化ヘパリン（CDSNSヘパリン：生化学工業株式会社製）、４硫酸化コンドロイチン三糖（4硫酸化三糖）、４硫酸化コンドロイチン五糖（4硫酸化五糖）（何れも生化学工業株式会社製のクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸をJ. Biol. Chem. 275(2000), 34728-34736に従ってウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼによって消化して調製）、非硫酸化コンドロイチン三糖（非硫酸化三糖）、非硫酸化コンドロイチン五糖（非硫酸化五糖）（何れも生化学工業株式会社製のクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸をBiochem. J., 226(1985), 705-714に従ってウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼによって消化して調製）を使用して観察した。その結果、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸は硫酸基の転移が盛んになされる基質として適した糖鎖であって、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｅに対しては弱い硫酸基転移酵素活性を有し、ヘパラン硫酸及びCDSNSヘパリンは、ほとんど硫酸基を転移せず、基質としては働かないことが明らかとなった。尚、ベクターのみを導入した陰性対照のCOS-7細胞の培養液は何れの硫酸基受容体を用いても0.6pmol/分/ml未満の値しか得られなかった。
【００３９】
【表２】
表２

【００４０】
また、³⁵Sでラベルされたコンドロイチン硫酸Ａを参考例に記載された方法でPartisil-10 SAXカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した。その結果、³⁵Sでラベルしたコンドロイチン硫酸AをコンドロイチナーゼACIIで消化した際に、放射能がGalNAc(4,6-bisSO₄)及びΔDi-diS_Eに観察された（図５Ａ）。尚、図５及び図７中、矢印は以下の物質の溶出点を示しており、略語は明細書中で使用するものと共通である。
【００４１】
１：ΔDi-0S（2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エノピラノシルウロン酸)-D-ガラクトース）
２：Ｎ−アセチルガラクトサミン6硫酸（GalNAc(6SO₄)とも記載する）
３：Ｎ−アセチルガラクトサミン4硫酸（GalNAc(4SO₄)とも記載する）
４：ΔDi-6S（2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクトース）
５：ΔDi-4S（2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エノピラノシルウロン酸)-4-O-スルホ-D-ガラクトース）
６：Ｎ−アセチルガラクトサミン4,6硫酸（GalNAc(4,6-bisSO₄)とも記載する）
７：硫酸イオン（SO₄ ^2-）
８：ΔDi-diS_D（2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(2-O-スルホ-β-D-グルコ-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクトース）
９：ΔDi-diS_E（2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エノピラノシルウロン酸)-4,6-bis-O-スルホ-D-ガラクトース）
【００４２】
³⁵Sでラベルしたコンドロイチン硫酸Aの4位と6位の硫酸基の何れが放射能を有しているかを調べるために、コンドロイチナーゼACIIによる消化産物を、さらにコンドロ-6-スルファターゼで消化し、SAXカラムを用いてHPLCで分析した（図５Ｂ）。その結果、GalNAc(4,6-bisSO₄)の放射能ピークは消失し、放射能は無機硫酸の画分に移行した。このことから³⁵SO₄ ^2-は非還元末端と糖鎖の内部に存在するGlcNAc(4SO₄)の双方に同様な割合でその6位に転移されていたことが明らかとなった。
【００４３】
³⁵Sでラベルしたデルマタン硫酸をコンドロイチナーゼABCで消化した場合、放射能はGalNAc(4,6-bisSO₄)に検出され、ΔDi-diS_Eには小さなピークが現れただけであった（図５Ｃ）。³⁵Sでラベルしたコンドロイチン硫酸Aと同様に³⁶Sでラベルしたデルマタン硫酸をコンドロ-6-スルファターゼで消化した場合には、ほとんどの放射能は無機硫酸の画分に移行した（図５Ｄ）。GlcNAc(4,6-bisSO₄)に残っていた若干の放射能も、さらなるコンドロ-6-スルファターゼによる消化で消失したため、デルマタン硫酸は主にイズロン酸に隣接した非還元末端のGalNAc(4SO₄)の6位に硫酸基が結合することが明らかとなった。コンドロイチンを硫酸基受容体として使用した場合、コンドロイチン中にはほとんどない構造であるにもかかわらず非還元末端と内部のGalNAc(4SO₄)残基への硫酸基の転移が観察された。
【００４４】
デルマタン硫酸がコンドロイチン硫酸Aと比してより硫酸基の受容体として弱くしか働かない理由は、非還元末端のGalNAc(4SO₄)残基が少ないことに起因することを明らかとするために、内部のGalNAc(4SO₄)残基と非還元末端のGalNAc(4SO₄)残基のモル比をSAX-HPLCを使用してJ. Biol. Chem. 275, 34728-34736の方法で分析した。GalNAc(4SO₄)に相当するピークはコンドロイチン硫酸A及びデルマタン硫酸の何れを分解した際にも観察された（図６Ｂ及びＣの矢印）。非還元末端のGalNAc(4SO₄)残基と内部のGalNAc(4SO₄)残基とのモル比の計算値は、コンドロイチン硫酸Ａで0.011、デルマタン硫酸で0.021となった。コンドロイチン硫酸ＣをコンドロイチナーゼACIIで消化して同様に分析した場合、GalNAc(4SO₄)のピークは同条件のクロマトグラフィーでは検出されなかった。
【００４５】
J. Biol. Chem.275, 34728-34726によると、コンドロイチン硫酸Ａとデルマタン硫酸を不飽和二糖に分解した場合、ΔDi-4Sは全体の不飽和二糖のうちの0.74（コンドロイチン硫酸Ａ）と0.90（デルマタン硫酸）となる。従ってGalNAc(4SO₄)残基は計算上ではコンドロイチン硫酸Ａでは0.008、デルマタン硫酸では0.019となり、非還元末端と内部のGalNAc(4SO₄)は何れもデルマタン硫酸の方が多いはずであるが、コンドロイチン硫酸Ａの方が高い硫酸基受容体としての働きを示したということは、デルマタン硫酸に含まれるイズロン酸がヒトのGalNAc4S-6STの活性を阻害したということを示唆している。
【００４６】
表２より、4硫酸化コンドロイチンオリゴ糖（4硫酸化三糖及び4硫酸化五糖）に本発明物質１が硫酸基を転移しており、これらの何れの箇所に硫酸基を転移しているかを調べるために、³⁵Sラベルした三糖及び五糖をコンドロイチナーゼACIIで消化し、上記と同様にSAX-HPLCカラムで分析した（図７）。何れのオリゴ糖も、放射能はGalNAc(4,6-bisSO₄)に観察された（図７Ａ、図７Ｃ）。³⁵SO₄ ^2-が転移された部位を特定するために、コンドロイチナーゼACIIで消化した後の³⁵Sラベルされたオリゴ糖をコンドロ-6-スルファターゼで消化し、上記と同様にSAX-HPLCカラムで分析したところ、GalNAc(4,6-bisSO₄)の放射能を有するピークは消滅し、放射能を有する無機硫酸のピークが生じた（図７Ｂ、図７Ｄ）。このことから、ヒトのGalNAc4S-6STが硫酸基を非還元末端のGalNAc(4SO₄)残基の6位に転移し、還元末端のGalNAc(4SO₄)や内部のGalNAc(4SO₄)残基への硫酸基転移量は相対的に少ないことが示唆された。
【００４７】
実施例２
＜１＞ヒトGalNAc4S-6ST-Hisタグ融合タンパク質の昆虫細胞系での発現
ヒトGalNAc4S-6ST-Hisタグ融合タンパク質の昆虫細胞系での大量発現を行なった。得られたヒトGalNAc4S-6ST-Hisタグ融合タンパク質はHisタグを有するため、アフィニティーカラムを用いて精製をするのに適する。ヒトGalNAc4S-6STをHisタグとの融合タンパク質として発現するベクターpVL1393GalNAc4S-6STを構築して、このベクターをSf-21細胞（J. Biochem., 119(1996), 1150-1156）に導入した。pVL1393GalNAc4S-6STの構築は、以下の手法に従って行った。すなわち、かずさDNA研究所より恵与されたcDNA（受け入れ番号AB011170：遺伝子番号KIAA0598）を鋳型として使用し、5'プライマーとして配列番号１７、3'プライマーとして配列番号１８のプライマーを各々用いて上述と同様の手法でPCR法を行ってPCR産物を得た。センスプライマー（5'プライマー）の末端にはBamHI認識配列が設けられており、アンチセンスプライマー（3'プライマー）の末端にはStuI認識配列が設けられているため、PCR産物をSpeI及びEcoRIで消化したpBluescript SKII(-)プラスミド（ストラタジーン社製）に、MK transferベクターからBiochem. Biophys. Res. Commun., 236, 66-70(1997)に従って単離したNheI/BamHIcDNA断片（メリチンシグナル配列、6個のHisからなるHisタグ、及びエンテロキナーゼ感受性配列をコードしている）と共に連結して挿入した。そしてこのプラスミドからXbaI及びEcoRVにより切り出した断片をXbaI及びSmaIで消化したバキュロウイルス用ベクターpVL1393（ファルミノゲン社製）に挿入した。
【００４８】
このようにして得たpVL1393GalNAc4S-6STをJ. Biochem., 119, 1150-1156(1996)に従ってSf-21細胞にトランスフェクションして組換体を得た。組換体を培養し、600mlの培養上清に分泌されたヒトGalNAc4S-6ST-Hisタグ融合タンパク質（以下「本発明物質２」とも記載する）を、0.15mol/lでNaClを含む50mmol/lのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で平衡化した1mlのヘパリンセファロースCl-6Bカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に通筒した。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、0.5mol/lでNaClを含む6mlの50mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で本発明物質２を溶出させた。更に精製するために、溶出液をHisTrapキレートHPカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に通筒し、40mmol/lのイミダゾール緩衝液で洗浄し、5mlの0.1mol/l及び0.2mol/lのイミダゾール緩衝液でカラムの説明書に従って溶出を行った。
【００４９】
本発明物質２を0.2mol/lのイミダゾールで溶出し、SDS-PAGEで単一のバンドとなっていることを確認し、セントリコンYM-10（ミリポア社製）を使って本発明物質２を濃縮、脱塩した。600mlの培養液から150μgの本発明物質２が得られた。
【００５０】
＜２＞本発明物質２を用いたコンドロイチン硫酸Eの合成
クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（コンドロイチン4硫酸構造を多く含む：生化学工業株式会社製）、チョウザメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（コンドロイチン4硫酸構造を多く含む：生化学工業株式会社製）を用いて本発明物質２で硫酸基の転移を行なった。
1mlの20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4：10mmol/l CaCl₂、20mmol/l 還元型グルタチオン、50mmol/l イミダゾールを含む）に250μgのコンドロイチン硫酸を74μgの本発明物質２及び500μgのPAPSを添加して37℃で12時間インキュベートした。反応後、ミッドカインが結合したアフィニティーカラムに通筒し、カラムに吸着した画分を0.15mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、及び0.7mol/lのNaCl水溶液で溶出させて回収した。
この各々の画分に含まれるコンドロイチン硫酸をJ. Biol. Chem., 270, 18575-18580(1995)に従ってコンドロイチナーゼABC（生化学工業株式会社製）で分解した後、二糖分析を行なった（表３）。
【表３】
表３

単位：%
【００５１】
その結果、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸もチョウザメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸もΔDi-diS_E構造が大幅に増加しており、コンドロイチン硫酸E構造を大量に含むコンドロイチン硫酸の合成に本発明物質２を使用することができることが明かとなった。このようにコンドロイチン硫酸E構造が大量に含まれるコンドロイチン硫酸が得られたことから、高濃度のPAPS共存下においては、本発明物質２はコンドロイチン骨格の非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸残基のみではなく、非還元末端以外のＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸残基に対しても硫酸基を転移している可能性が示唆された。
なお、通常のコンドロイチン硫酸Eと呼ばれる天然のコンドロイチン硫酸は、上記と同様な二糖分析を行なった場合にはΔDi-diS_Eが30%程度しか検出されず、また、J. Biol. Chem. 275, 34728-34736(2000)記載の方法で修飾されたコンドロイチン硫酸であってもΔdi-diS_E構造は50%に満たないが、高濃度のPAPS共存下で本発明物質２を作用させることでΔDi-diS_E構造が50%以上含まれるコンドロイチン硫酸の画分がはじめて得られた。
【００５２】
実施例３
ヒト組織におけるGalNAc4S-6STの発現
(1)ドットブロットハイブリダイゼーション法
ヒト各組織の全RNAドットブロット膜を使用し、GlcNAc4S-6STの発現を、hGlcNAc4S-6STのコード領域の塩基配列部分（配列番号１４）とのハイブリダイゼーション法（発現ハイブリダイゼーション法）により解析した（図８）。ブロット膜上の組織の配置は表４の通りである。その結果、何れの組織においてもGlcNAc4S-6STは発現しており、特に肺、脾臓、末梢血白血球、リンパ節、甲状腺、胎児脳、胎児脾臓でGlcNAc4S-6STは強く発現していることが明らかとなった。
【００５３】
【表４】
表４

【００５４】
尚、ハイブリダイゼーションとオートラジオグラフィーは以下の条件で行った。ニトロセルロースフィルターを3×SSC溶液（1×SSC溶液：NaCl 0.15M、クエン酸ナトリウム(pH7.0) 0.015M）に浸し、65℃で30分間処理した。その後、1%SDS、5×SSC、1×デンハルト液（BSA フラクションV（シグマ社製） 0.2%、ポリビニルピロリドン 0.2%、Ficoll 400（ファルマシア社製） 0.2%)）からなるプレハイブリダイゼーション液に浸し、65℃で2時間処理した。更にこのような処理をしたニトロセルロース膜をプラスチックバック中で、NaCl 0.75mol/l、Tris-HCl(pH8.0) 50mmol/l、EDTA 2mmol/l、1×デンハルト液、SDS 0.1%、変性サケ精子DNA 50μg/ml、変性させた[³²P]標識hGlcNAc4S-6STコード領域DNA（10⁶cpm/ml）からなるハイブリダイゼーション液を加え、65℃で1晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション終了後、100mlの2×SSC、0.1%SDS溶液に浸し、室温で5分間軽く振盪し、次に溶液を0.2×SSC-0.1%SDS溶液に換え、65℃で30分間インキュベートし、更に同じ組成の溶液に換えて65℃で30分間インキュベートした。そしてニトロセルロース膜を2×SSCで軽くすすぎ、風乾後、両面をサランラップで覆って、オートラジオグラフィーを行った。
【００５５】
(2)ノザンブロットハイブリダイゼーション
ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓について、GlcNAc4S-6STのRNAの発現をノザンブロットハイブリダイゼーションによって解析した（図９：左のレーンから心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓と配置してある）。すなわち、アガロースゲル電気泳動により上記各組織から調製した全RNAを分画した後、泳動したRNAをニトロセルロース膜に転写し、この膜を乾熱乾燥させた後、(1)のドットブロットハイブリダイゼーションと同条件でハイブリダイゼーション処理を行った。
その結果、何れの組織においても5.2kbpのRNAのバンドに放射能が検出された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によりヒト由来のGalNAc4S-6STの大量調製に必要となる、融合タンパク質が提供される。
【００５７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチド４及びペプチド５のアミノ酸配列とＰＣＲ用プライマー（4a-1、4a-2、5s-1、及び5s-2）の構築を示す図。
【図２】ＰＣＲ法によって増幅されたイカ軟骨由来のGalNAc4S-6STのｃＤＮＡ断片を示す図。
【図３】ＰＣＲ産物、ペプチド断片とヒト由来のGalNAc4S-6STのアミノ酸配列の関係を示す図。
【図４】ヒト由来のGalNAc4S-6STのコンドロイチン硫酸Ａ及び４硫酸化三糖への硫酸基転移酵素活性を示す図。
【図５】ヒト由来のGalNAc4S-6STのコンドロイチン硫酸Ａ及びデルマタン硫酸への硫酸基転移部位をSAX-HPLCを用いて分析した図。
【図６】コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の非還元末端のGalNAc(4ST)をSAX-HPLCカラムを用いて分析した図。
【図７】ヒト由来のGalNAc4S-6STの４硫酸化オリゴ糖への硫酸基転移部位をSAX-HPLCを用いて分析した図。
【図８】各組織におけるヒト由来のGalNAc4S-6STのDNAの転写量をドットブロット分析により分析した図。
【図９】ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓におけるGalNAc4S-6STのDNAの転写量をノザンブロット法により解析した図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a fusion protein having enzyme activity, and more particularly to a fusion protein having an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate.
[0002]
[Prior art]
[Patent Literature]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 13-57882
[Non-patent literature]
J. Biol. Chem. 275, 34728-34736 (2000)
[0003]
Conventionally, as an enzyme (GalNAc4S-6ST) having an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue existing in the basic skeleton of chondroitin sulfate, an enzyme extracted from squid cartilage is not disclosed in the patent literature and non-patent documents. It is disclosed in the patent literature. However, it has been difficult to ensure the amount of the enzyme obtained by extraction from squid cartilage to be used as a sugar chain sulfating agent.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In order to use an enzyme as a sugar chain sulfating agent, it is essential to prepare a large amount of the enzyme by a gene recombination technique. In addition, when the gene is used for gene therapy, it is essential to clarify the gene. Nevertheless, since the gene for GalNAc4S-6ST has not been obtained so far, large-scale preparation of GalNAc4S-6ST was impossible.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent studies in view of the above problems, the present inventor found a squid GalNAc4S-6ST cDNA based on the partial amino acid sequence of GalNAc4S-6ST derived from squid cartilage, and further searched a gene database based on the base sequence. Thus, human GalNAc4S-6ST cDNA was obtained and recombined so that it was expressed as a fusion protein, thereby enabling mass synthesis of human GalNAc4S-6ST, thereby completing the present invention.
[0006]
That is, the present invention is as follows.
(1) A fusion protein comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and an identification peptide fused together.
(2) The fusion protein according to (1), which has an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate.
(3) Chondroitin sulfate derived from whale cartilage has the activity of transferring sulfate groups from sulfate donors, but heparan sulfate and fully desulfated N-resulfated heparin has the activity of transferring sulfate groups substantially. The fusion protein according to (1) or (2), wherein the fusion protein is not.
(4) Identification peptide is signal peptide, protein kinase A, protein A, glutathione S transferase, His tag, myc tag, FLAG protein, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB, HA tag, Trx tag, CBP tag, CBD tag, CBR tag, β-lac / blu, β-gal, luc, HP-Thio, HSP, Lnγ, Fn, GFP, YFP, CFP, BFP, DsRed, DsRed2, MBP, LacZ, IgG, avidin, and protein The fusion protein according to any one of (1) to (3), which is any one peptide selected from the group consisting of G.
(5) DNA encoding the fusion protein according to any one of (1) to (4).
(6) A vector comprising the DNA according to (5).
(7) A transformant obtained by introducing the vector according to (6) into a host cell.
(8) The method for producing a fusion protein according to any one of (1) to (4), wherein the transformant according to (7) is grown, isolated and purified from the growth.
(9) A sugar chain sulfation having an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate, comprising a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 Agent.
(10) A sugar chain sulfating agent, comprising a fusion protein of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and an identification polypeptide.
(11) The sulfate group is transferred from the sulfate group donor to the 6-position of the N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate, and N-

acetylgalactosamine

4,6 sulfate is included in the basic skeleton. Use of the sugar chain sulfating agent according to (9) or (10) for producing chondroitin sulfate.
(12) From the sulfate group donor to the 6-position of the N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate using the sugar chain sulfating agent according to (9) or (10) A method for producing chondroitin sulfate containing N-

acetylgalactosamine

4,6 sulfate in the basic skeleton, wherein
(13) Chondroitin sulfate, wherein the content of 4,6-sulfated N-acetylgalactosamine residues in the basic skeleton is 50% or more based on the total amount of N-acetylgalactosamine residues.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
(1) Substance of the present invention
The substance of the present invention is obtained by fusing a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and an identification peptide, and having a sulfate group at the 6-position of the N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate. It is a fusion protein characterized by having an enzyme activity to transfer.
[0008]
Here, when the fusion protein is prepared by genetic recombination, the identification peptide means that the fusion protein is secreted, separated, purified, or purified from the transformant by expressing the peptide linked to the target protein. Peptides that can facilitate detection, such as signal peptides (present at the N-terminus of many proteins and functioning in cells for sorting proteins in the intracellular membrane permeation mechanism 15-30 Peptides consisting of amino acid residues: For example, OmpA, OmpT, Dsb, etc., protein kinase A, protein A (a protein with a molecular weight of about 42,000, a component of S. aureus cell wall), glutathione S transferase, His tag (histidine residue) 6-10 sequences arranged side by side), myc tag (13 amino acid sequence derived from cMyc protein), FLAG peptide ( Analytical marker consisting of amino acid sequence), T7 tag (first 11 amino acid sequence of gene10 protein), S tag (15 amino acid sequence derived from pancreatic RNaseA), HSV tag, pelB (22 amino acid sequence of E. coli outer membrane protein pelB), HA tag (10 amino acid sequence derived from hemagglutinin), Trx tag (thioredoxin sequence), CBP tag (calmodulin binding peptide), CBD tag (cellulose binding domain), CBR tag (collagen binding domain), β-lac / blu (β lactamase) ), Β-gal (β-galactosidase), luc (luciferase), HP-Thio (His-patch thioredoxin), HSP (heat shock peptide), Lnγ (laminin γ peptide), Fn (fibronectin partial peptide), GFP (green fluorescence) Peptide), YFP (yellow fluorescent peptide), CFP (cyan fluorescent peptide), BFP (blue fluorescent peptide), DsRed, D sRed2 (red fluorescent peptide), MBP (maltose binding peptide), LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avidin, and protein G are designated as any peptide. Even it can be used. Among them, signal peptide, protein kinase A, protein A, glutathione S transferase, His tag, myc tag, FLAG peptide, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB or HA tag are substances of the present invention by genetic engineering techniques. This is preferable because the expression and purification of the protein can be facilitated.
[0009]
The arrangement of the polypeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 and the identification peptide in the substance of the present invention is such that the identification peptide is connected to the C-terminal side of the polypeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 or N Even if it is connected to the terminal side, the substance of the present invention has an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of N-acetylgalactosamine 4sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate (hereinafter also referred to as "GalNAc4S-6ST activity") There is no restriction as long as it has
[0010]
Here, GalNAc4S-6ST activity is determined according to the method described in, for example, J. Biol. Chem. 275 (2000), 34728-34736, for example, chondroitin sulfate derived from whale cartilage (manufactured by Seikagaku Corporation: main) This can be detected by using chondroitin sulfate (also called chondroitin sulfate A), which is a D-glucuronic acid 1-3 galactosamine tetrasulfate.
[0011]
In general, it is known that enzyme activity is maintained even if one or several (usually 2 or more and 10 or less) constituent amino acids in the amino acid sequence of an enzyme protein are substituted, deleted, inserted, or rearranged. Although it can be said that it is a variant of the same enzyme, even in the substance of the present invention, substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several (2 or more and 10 or less) constituent amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 As long as the fusion protein retains GlcNAc4S-6ST activity even if it occurs, it can be said that it is substantially the same substance as the substance of the present invention (such a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14). A protein having a partial mutation is referred to as a “modified protein” for convenience). The amino acid sequence of such a modified protein preferably has a homology of 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. Amino acid sequence homology can be easily calculated using well-known computer software such as FASTA, and such software is also available on the Internet.
[0012]
Such a substance of the present invention comprises a “galactosamine residue in which a sulfate group is substituted at the 4-position hydroxyl group and a sulfate group is not substituted at the 6-position hydroxyl group” in the basic skeleton of glycosaminoglycan (N-acetylgalactosamine). It is a fusion protein having an activity to transfer a sulfate group to the 6-position hydroxyl group with respect to (4 sulfate residue), and can be used for the sugar chain sulfating agent of the present invention described later.
[0013]
The substance of the present invention preferably has substantially no activity of transferring a sulfate group to heparan sulfate and completely desulfated N-resulfated heparin. Specifically, such activity is 1 pmol / min. / ml, more preferably less than 0.1 pmol / min / ml, most preferably not detected. Such confirmation of sulfate group transfer activity can be carried out, for example, according to the method described in Example 1 <5>.
[0014]
(2) Preparation method of the substance of the present invention
The substance of the present invention is prepared by arranging a DNA encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 and a DNA encoding the identification peptide in the same readout region, and a polypeptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 and the identification peptide It is possible to prepare a growth product by incorporating a vector having a promoter region that can be expressed into a suitable host cell to produce a recombinant and growing it. Here, the host cell refers to a prokaryotic cell (for example, E. coli or the like) or a eukaryotic cell (for example, a cell derived from yeast, a mammal or an insect). In particular, since the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is a protein that is originally expressed in eukaryotic cells, eukaryotic cells are preferred as host cells. In particular, the enzyme having the enzyme activity of the substance of the present invention is usually a mammal. Mammalian cells are preferable from the viewpoint of expression, and insect cells are also preferable from the viewpoint of being extremely suitable for mass synthesis of the substance of the present invention.
[0015]
Here, the growth of the host cell is a concept including culturing the host cell and administering the host cell to a living body and growing the host cell in the living body. Further, the term “growth” is a concept that includes not only cultured host cells and culture supernatant, but also the excrements and secretions of the living organism when the host cells are grown in vivo.
[0016]
Since the present inventors have clarified that the cDNA of GenBank accession number AB11170 is a DNA encoding human GalNAc4S-6ST by the method described in the Examples, the substance of the present invention can also be prepared based on the cDNA. Is possible.
When, for example, a FLAG peptide is used as the identification peptide of the substance of the present invention and a cell derived from a mammal is used as a host cell, for example, a pFLAG-CMV-2 vector (manufactured by Kodak Co., Ltd.) should be used as an expression vector. Can do.
[0017]
In order to insert the cDNA (AB11170) inserted into the pBluescriptII plasmid into the pFLAG-CMV-2 vector, the cDNA is excised from the pBluescriptII plasmid vector using an appropriate restriction enzyme, and if necessary, the sticky end of the cDNA. Can be made blunt and ligated with appropriate restriction ends for insertion into a pFLAG-CMV-2 vector, and inserted into a pFLAG-CMV-2 vector treated with an appropriate restriction enzyme. In addition, the cDNA inserted into the pBluescriptII plasmid is amplified by PCR using, for example, the 5 ′ primer of SEQ ID NO: 15 and the 3 ′ primer of SEQ ID NO: 16, thereby providing an EcoRI restriction region at the 5 ′ end and HindIII at the 3 ′ end. Since a human-derived GalNAc4S-6S cDNA having a restriction region is amplified, this PCR product can be digested with HindIII and EcoRI and then ligated to the pFLAG-CMV-2 vector digested with HindIII and EcoRI by a conventional method. Is possible.
[0018]
The thus prepared pFLAG-CMV-2 vector (pFLAGGalNAc4S-6ST) is electroporated into cells derived from mammals such as COS-1 cells and COS-7 cells that function as host cells for the pFLAG-CMV-2 vector. The transformant can be obtained by introduction using a conventional method such as a ration method.
[0019]
A transformant can be grown under conditions suitable for the growth of the transformant to express a DNA encoding the substance of the present invention, and the substance of the present invention can be prepared from the grown product. For example, when COS-7 cells are selected as host cells, the transformant can be cultured in vitro and the substance of the present invention can be purified from the culture (transformed and cultured supernatant after culture). It is. When the above-described pFLAG-CMV-2 vector is used, the substance of the present invention contains a FLAG peptide. Therefore, the substance of the present invention can be obtained by using, for example, an anti-FLAG antibody and the substance of the present invention by a method such as affinity purification. Separation and purification. As an isolation and purification method, an appropriate method can be routinely selected depending on the identification peptide in the substance of the present invention.
[0020]
(3) The sugar chain sulfating agent of the present invention
The sugar chain sulfating agent of the present invention comprises a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and has an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate. Have
[0021]
The sugar chain sulfating agent of the present invention is preferably a fusion protein of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and an identification polypeptide, and consists of the substance of the present invention.
[0022]
The sugar chain sulfating agent of the present invention can be used as an enzyme agent for synthesizing persulfated chondroitin sulfate by transferring a sulfate group to the N-acetylgalactosamine tetrasulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate. It is. In addition, since the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, which is a portion having the target enzyme activity constituting the sugar chain sulfating agent of the present invention, is a human-derived amino acid sequence, it has low antigenicity even when administered to humans. In addition, even when cultured cartilage or the like is modified with the sugar chain sulfating agent of the present invention and transplanted into a living body, the antigen-antibody reaction and inflammation caused by the sugar chain sulfating agent of the present invention may not be induced. Be expected.
[0023]
In particular, N-acetylgalactosamine is produced by transferring a sulfate group from a sulfate group donor by acting the sugar chain sulfating agent of the present invention on chondroitin sulfate having an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue in the basic skeleton. Persulfated chondroitin sulfate (so-called chondroitin sulfate E) having 4,6 sulfate residues in the basic skeleton is obtained. The sugar chain sulfating agent of the present invention has a function of mainly transferring a sulfate group to a non-reducing terminal N-acetylgalactosamine tetrasulfate residue, but has a high concentration (0.1% (w / v) or more, preferably 0.3%). (w / v) or higher) in the presence of active sulfuric acid (hereinafter also referred to as “PAPS”), the ability to transfer sulfate groups to N-acetylgalactosamine tetrasulfate residues other than the non-reducing end of the basic skeleton. (Refer to Example 2 <2> described later), and using such properties, 50% or more, preferably 60% or more, of N-acetylgalactosamine residues in the basic skeleton are 4% or more. , 6-sulfated N-acetylgalactosamine (chondroitin sulfate E structure) can be used for the synthesis of chondroitin sulfate. The chondroitin sulfate E structure is known to show a strong affinity for midkine (J. Biol. Chem., 275, 37407-37413 (2000)). The fraction containing the chondroitin sulfate containing a large amount of the chondroitin sulfate E structure can be easily obtained by, for example, affinity chromatography using a column coupled with midkine, after the reaction product is treated with the agent. Is possible.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
Reference example: Measurement of sulfotransferase reaction
The enzyme activity of GalNAc4S-6ST was measured by modifying the method of J. Biol. Chem. 275, 34728-34736. The standard reaction solution is 2.5 μmol imidazole-HCl (pH 6.8), 0.5 μmol CaCl in 50 μl.₂1 μmol of reduced glutathione, 25 nmol of chondroitin sulfate (derived from whale cartilage: Seikagaku Corporation: chondroitin sulfate A) in terms of galactosamine, 50 pmol [³⁵S] PAPS (approximately 5.0 × 10^Fivecpm: prepared according to Anal. Biochem., 148 (1985), 303-310), and enzymes. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 20 minutes, and the reaction was stopped by heating the reaction tube in boiling water for 1 minute. After stopping the reaction³⁵S-labeled glycosaminoglycan was precipitated with ethanol and subjected to gel chromatography using a high-speed desalting column by the method described in J. Biol. Chem. 268, 21968-21974, and the radioactivity was measured. .
[0025]
In order to measure the transsulfation group activity for other glycosaminoglycans, instead of chondroitin sulfate A, 25 nmol other glycosaminoglycan or its oligosaccharide [chondroitin sulfate C (shark cartilage-derived chondroitin sulfate: Seikagaku Corporation) Co., Ltd.) and dermatan sulfate (pig skin derived: Seikagaku Corporation), 4-sulfated chondroitin oligosaccharide (trisaccharide and pentasaccharide: both are chondroitin sulfate derived from whale cartilage manufactured by Seikagaku Corporation Biol. Chem. 275 (2000), 34728-34736, prepared by digestion with bovine testicular hyaluronidase and β-glucuronidase, non-sulfated chondroitin oligosaccharides (trisaccharide and pentasaccharide: both biochemical Chondroitin sulfate derived from whale cartilage manufactured by Kogyo Co., Ltd. was used as described in Biochem. J., 226 (1985), 705-714. The amount of nidase and β-glucuronidase prepared by digestion was converted to the amount of galactosamine; heparan sulfate (derived from bovine kidney: manufactured by Seikagaku Corporation), CDSNS heparin and keratan sulfate (derived from bovine cornea: Seikagaku Corporation) The amount of product) was converted to the amount of glucosamine]. To investigate the site of sulfate group transfer to chondroitin sulfate A or dermatan sulfate,³⁵Chondroitinase ACII, chondroitinase ABC, chondroitinase ACII and chondro-6-sulfatase, or chondroitinase ABC and chondro-6-sulfatase (all of which are Seikagaku Corporation) The measurement was performed by the method described in J. Biol. Chem. 275, 34728-34736. The radioactive digestion product generated by enzymatic digestion is separated on a Whatman Partisil-10 SAX column (Whatman Partisil-10 SAX column (4.6 × 25 cm) is separated by 10 mmol / l KH).₂PO_FourEquilibrated with 10 mmol / l KH₂PO_FourAfter 10 minutes deployment at KH₂PH_FourConcentration elution was performed to change the concentration from 10 to 450 mmol / l),³⁵S radioactivity was measured. When an oligosaccharide was used as a sulfate group acceptor, the reaction solution was directly passed through a Superdex30 column (Superdex 30 16/60 column was 0.2 mol / l NH_FourHCO_ThreeAnd 1 ml fractions were collected at a flow rate of 2 ml / min)³⁵S labeled oligosaccharide³⁵SO_Four ^2-as well as[³⁵Separated from [S] PAPS.
[0026]
Example 1
<1> Preparation of squid GalNAc4S-6ST and preparation of primers
GalNAc4S-6ST was purified from squid cartilage according to the method described in J. Biol. Chem. 275, 34728-34736. After that, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) under the reducing condition of mercaptoethanol with 10 ng of squid GalNAc4S-6ST with 10% gel was performed by the method of Laemmli et al. (Nature 227, 680). -685). As a result of staining the gel after electrophoresis with Coomassie Brilliant Blue, a 63 kDa protein band was detected.
[0027]
This band was cut out together with the electrophoresis gel, and after limited digestion with proteinase Lys-C, reverse-phase HPLC analysis was performed to separate peptide fragments, and amino acid sequences at the amino terminus were analyzed to identify five amino acid sequences (Table 1). ).
[0028]
[Table 1]
Table 1

[0029]
Based on the amino acid sequences of

peptides

4 and 5, the primers described in SEQ ID NOs: 6 to 9 (4a-1 (antisense primer): SEQ ID NO: 6, 4a-2 (antisense primer): SEQ ID NO: 7, 5s-1 (sense primer) ): SEQ ID NO: 8, 5s-2 (sense primer): SEQ ID NO: 9) was prepared according to a conventional method (FIG. 1).
[0030]
<2> Squid Poly (A)⁺RNA preparation
Squid skull cartilage was removed, soft tissue was removed using cotton, and cartilage was frozen with liquid nitrogen. Frozen cartilage was ground in liquid nitrogen to form a powder, and this cartilage powder was placed in a 10-fold amount of guanidine thiocyanate solution, ground using a Polytron homogenizer, and then ultracentrifuged at 100,000 × g for 30 minutes. . Centrifugation supernatant was separated and completely analyzed by guanidine thiocyanate / cesium chloride method (Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Suppl.36, pp.4.2.3-4.2.9, John Wiley & Sons, New York) RNA (Poly (A)⁺RNA) was prepared.
[0031]
<3> Preparation of squid GalNAc4S-6ST cDNA
Total RNA (Poly (A)⁺RNA) was used as a template to prepare a primary cDNA prepared by reverse transcription using oligo dT or a random primer, and squid GalNAc4S-6ST cDNA was prepared by PCR using this cDNA. That is, 2 μg of poly (A)⁺RNA, 0.5 μg oligo dT and random primer, 10 mmol / l dithiothreitol, deoxynucleotide triphosphate containing 0.5 mM of each base, 30 U RNase inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.), and 400 U reverse transcriptase ( The reverse transcription reaction was performed with 20 μl of an aqueous solution containing Superscript II (manufactured by Life Technologies). The reaction was carried out at 42 ° C. for 50 minutes. After the reaction, the reaction solution was heated at 70 ° C for 15 minutes to stop the reaction, 0.5 U RNaseH (Life Technologies) was added, and the reaction was carried out at 37 ° C for 20 minutes.⁺RNA was degraded. Each PCR reaction was 25 pmol of 5s-1 and 4a-2 oligonucleotide primers, 1 μl of the reaction solution after reverse transcription reaction, deoxynucleotide triphosphates each containing 0.2 mM of 4 bases, and 1.5 U Taq polymerase ( A final volume of 25 μl of aqueous solution containing Qiagen) was used. Amplification reaction is thermal denaturation reaction (94 ° C for 45 seconds), annealing reaction (45 second reaction, 4 ° C decrease from 48 ° C to 28 ° C every 3 cycles, and then decrease to 28 ° C at that temperature. Performed) and extension reaction (1 minute at 72 ° C.) were repeated 40 times. Further, using this PCR product, the same PCR method (secondary PCR) as described above was performed using primers 5s-2 (SEQ ID NO: 9) and 4a-1 (SEQ ID NO: 6). Secondary PCR products were separated by agarose gel electrophoresis (FIG. 2). The amplified DNA band is excised in accordance with a conventional method, and the DNA primer is modeled by the deoxy chain termination method using the sense primer 5s-2 and antisense primer 4a-1 as a sequence primer (Model 373A: manufactured by Applied Biosystems) (SEQ ID NO: 10).
[0032]
Using the base sequence of the squid GalNAc4S-6ST cDNA obtained by the analysis as described above, a FASTA search is performed on the Internet, and cDNA obtained from chromosome 10 of human brain cells having high homology with the DNA. Clone (Accession No. AB011170: DNA Res. 5, 31-39: SEQ ID No. 11) and a clone having high homology to it (Accession No. AF026477: human B cell RAG-related gene (hBRAG) has been reported (Eur. J. Immunol. 28, 2839-2853): SEQ ID NO: 12) was selected. The former cDNA clone had homology of up to 40% at the nucleotide sequence level and up to 61% at the amino acid sequence level with the amplified squid GalNAc4S-6ST cDNA (FIG. 3). This clone had one readout region (SEQ ID NO: 13), suggesting that it encodes a protein consisting of 561 amino acids (SEQ ID NO: 14) from the base sequence. As a result of analyzing the amino acid sequence, this protein is a type II membrane protein having one transmembrane region, having an active sulfate (PAPS) binding region, and encoding a new sulfate group. Was suggested. The nucleotide sequence of human GalNAc4S-6ST cDNA revealed by this analysis shows an important role in B (D) J recombination (Annu. Rev. Immunol., 10 (1992), 359-383). ) Since it has high homology (99%) with the base sequence of the coding region of the B cell RAG-related gene, it is possible that GalNAc4S-6ST may be involved in the immune system.
[0033]
<4> Preparation of human GalNAc4S-6ST cDNA and expression of human GalNAc4S-6ST cDNA
The pBluescriptII plasmid containing the cDNA of GenBank accession number AB11170 (given from Kazusa DNA Research Institute) is digested with EcoRI, and the 2258 bp fragment is inserted into the EcoRI region of pcDNA3.1 (Invitrogen) and ligated in the usual manner. PcDNAGalNAc4S-6ST was obtained.
[0034]
COS-7 cells were used as host cells, and pcDNAGalNAc4S-6ST was added to the DEAE-dextran method (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, Suppl. 43, pp. 16.13.1-16.13.7, John Wiley & Sons, New York, J. Biol. Chem. 270, 18575-18580) to obtain recombinants.
[0035]
The recombinant is cultured for 67 hours, then 0.15 mol / l NaCl, 10 mmol / l Tris-HCl (pH 7.2), 10 mmol / l MgCl₂, 2mmol / l CaCl₂, 0.5% Triton X-100 (trade name: manufactured by ICN), and 20% glycerol by stirring for 30 minutes using a rotary shaker and lysing the recombinant, and centrifuging at 10,000 × g for 10 minutes, This supernatant was used as an extract. The sulfate group transferase activity of the extract was changed to chondroitin sulfate A (derived from whale cartilage: manufactured by Seikagaku Corporation) and tetrasulfated trisaccharide (chondroitin sulfate A derived from whale manufactured by Seikagaku Corporation) by J. Biol. 275 (2000), 34728-34736, prepared by digestion with bovine testes-derived hyaluronidase and β-glucuronidase) as sulfate group receptors, respectively (FIG. 4). When the enzyme activity using tetrasulfated trisaccharide as a substrate was measured using an extract of COS-7 introduced with a plasmid containing human cDNA, the extract of COS-7 introduced with the negative control pcDNA3 Enzyme activity increased more than 5 times compared to, but enzyme activity against chondroitin sulfate A increased only 2 times. Since the tetrasulfated trisaccharide had higher enzyme activity than chondroitin sulfate A, this enzyme is an enzyme that specifically transfers a sulfate group to the N-acetylgalactosamine tetrasulfate residue at the non-reducing end. It was suggested.
[0036]
<5> Examination of substrate specificity of human GalNAc4S-6ST-FLAG peptide fusion protein
In order to examine the substrate specificity of human GalNAc4S-6ST, the expressed human GalNAc4S-6ST-FLAG peptide fusion protein was purified. That is, in order to facilitate purification using an affinity column, a vector pFLAGGalNAc4S-6ST that expresses GalNAc4S-6ST as a fusion protein with a FLAG peptide was constructed, and this vector was introduced into COS-7 cells. pFLAGGalNAc4S-6ST was constructed using cDNA (accession number AB011170: gene number KIAA0598) provided by Kazusa DNA Research Institute as a template, SEQ ID NO: 15 as 5 ′ primer, and SEQ ID NO: 16 as 3 ′ primer. PCR products were obtained using the same methods as described above to obtain PCR products. Since the HindIII recognition sequence is provided at the end of the sense primer (5 'primer) and the EcoRI recognition sequence is provided at the end of the antisense primer (3' primer), the PCR product is digested with HindIII and EcoRI. Then, it was inserted into pFLAG-CMV-2 plasmid (manufactured by Kodak Co., USA) according to a conventional method.
[0037]
COS-7 cells introduced with this plasmid vector were cultured for 67 hours, and an extract was obtained in the same manner as described above. The supernatant was passed through an anti-FLAG monoclonal antibody-conjugated agarose column (0.5 ml: manufactured by Sigma). The fraction adsorbed on the column was human GalNAc4S-6ST-FLAG peptide fusion protein (hereinafter also referred to as “substance 1 of the present invention”) using 1.5 ml of a buffer containing FLAG peptide under the conditions described in the instructions. Was eluted.
[0038]
The enzyme activity of the substance 1 of the present invention obtained in this way was chondroitin (manufactured by Seikagaku Corporation), chondroitin sulfate A (CS-A: whale cartilage-derived chondroitin sulfate: manufactured by Seikagaku Corporation), chondroitin sulfate C ( CS-C: shark cartilage-derived chondroitin sulfate: manufactured by Seikagaku Corporation, chondroitin sulfate E (CS-E: squid cartilage-derived chondroitin sulfate: manufactured by Seikagaku Corporation), dermatan sulfate (DS: pig skin derived: raw Chemical Industries, Ltd.), Keratan Sulfate (Seikagaku Corporation), Heparan Sulfate (Seikagaku Corporation), Fully Desulfated N Resulfated Heparin (CDSNS Heparin: Seikagaku Corporation), 4 Sulfated chondroitin trisaccharide (tetrasulfated trisaccharide), tetrasulfated chondroitin pentasaccharide (tetrasulfated pentasaccharide) (both manufactured by Seikagaku Corporation) Bone-derived chondroitin sulfate is prepared by digestion with bovine testicular hyaluronidase and β-glucuronidase according to J. Biol. Chem. 275 (2000), 34728-34736), non-sulfated chondroitin trisaccharide (non-sulfated trisaccharide) , Non-sulfated chondroitin pentasaccharide (non-sulfated pentasaccharide) (both chondroitin sulfate derived from whale cartilage manufactured by Seikagaku Corporation) hyaluronidase derived from bovine testicles according to Biochem. J., 226 (1985), 705-714 And prepared by digestion with β-glucuronidase. As a result, chondroitin sulfate A and dermatan sulfate are sugar chains suitable as substrates on which sulfate group transfer is actively performed, and have weak sulfate group transferase activity against chondroitin sulfate C and chondroitin sulfate E, It was revealed that heparan sulfate and CDSNS heparin hardly transfer sulfate groups and do not act as substrates. In addition, the culture solution of the negative control COS-7 cell into which only the vector was introduced was only able to obtain a value of less than 0.6 pmol / min / ml using any sulfate group receptor.
[0039]
[Table 2]
Table 2

[0040]
Also,³⁵S-labeled chondroitin sulfate A was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using a Partisil-10 SAX column by the method described in Reference Example. as a result,³⁵When chondroitin sulfate A labeled with S was digested with chondroitinase ACII, the radioactivity was GalNAc (4,6-bisSO_Four) And ΔDi-diS_E(Fig. 5A). 5 and 7, arrows indicate the elution points of the following substances, and abbreviations are the same as those used in the specification.
[0041]
1: ΔDi-0S (2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid) -D-galactose)
2: N-acetylgalactosamine 6 sulfate (GalNAc (6SO_Four))
3: N-acetylgalactosamine tetrasulfate (GalNAc (4SO_Four))
4: ΔDi-6S (2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid) -6-O-sulfo-D-galactose)
5: ΔDi-4S (2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid) -4-O-sulfo-D-galactose)
6: N-

acetylgalactosamine

4,6 sulfate (GalNAc (4,6-bisSO_Four))
7: Sulfate ion (SO_Four ^2-)
8: ΔDi-diS_D(2-acetamido-2-deoxy-3-O- (2-O-sulfo-β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid) -6-O-sulfo-D-galactose)
9: ΔDi-diS_E(2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid) -4,6-bis-O-sulfo-D-galactose)
[0042]
³⁵In order to investigate whether the 4-position or 6-position sulfate group of chondroitin sulfate A labeled with S has radioactivity, the digestion product by chondroitinase ACII is further digested with chondro-6-sulfatase, Analysis by HPLC using a SAX column (FIG. 5B). As a result, GalNAc (4,6-bisSO_Four) Disappeared and the radioactivity shifted to the inorganic sulfuric acid fraction. From this³⁵SO_Four ^2-GlcNAc (4SO_Four) Was transferred to the 6th position at a similar rate.
[0043]
³⁵When dermatan sulfate labeled with S was digested with chondroitinase ABC, the radioactivity was GalNAc (4,6-bisSO_Four) And ΔDi-diS_EOnly a small peak appeared in (FIG. 5C).³⁵Similar to chondroitin sulfate A labeled with S³⁶When dermatan sulfate labeled with S was digested with chondro-6-sulfatase, most of the radioactivity was transferred to the inorganic sulfate fraction (FIG. 5D). GlcNAc (4,6-bisSO_Four) Also lost some radioactivity in the digestion with further chondro-6-sulfatase, so dermatan sulfate is mainly non-reducing GalNAc (4SO_Four) Was found to bind to the 6-position of sulfate. When chondroitin is used as a sulfate group receptor, the non-reducing end and internal GalNAc (4SO_Four) Transfer of sulfate groups to residues was observed.
[0044]
The reason that dermatan sulfate works weakly as a sulfate group acceptor compared to chondroitin sulfate A is that GalNAc (4SO_FourIn order to make it clear that there are few residues, the internal GalNAc (4SO_Four) Residues and non-reducing end GalNAc (4SO)_Four) The molar ratio of residues was analyzed by the method of J. Biol. Chem. 275, 34728-34736 using SAX-HPLC. GalNAc (4SO_Four) Was observed when both chondroitin sulfate A and dermatan sulfate were decomposed (arrows in FIGS. 6B and C). Non-reducing end GalNAc (4SO_Four) Residues and internal GalNAc (4SO_Four) The calculated molar ratio with the residue was 0.011 for chondroitin sulfate A and 0.021 for dermatan sulfate. When chondroitin sulfate C was digested with chondroitinase ACII and analyzed in the same manner, GalNAc (4SO_Four) Was not detected by chromatography under the same conditions.
[0045]
According to J. Biol. Chem. 275, 34728-34726, when chondroitin sulfate A and dermatan sulfate are decomposed into unsaturated disaccharides, ΔDi-4S is 0.74 of the total unsaturated disaccharides (chondroitin sulfate A). 0.90 (dermatan sulfate). Therefore GalNAc (4SO_Four) Residues are calculated to be 0.008 for chondroitin sulfate A and 0.019 for dermatan sulfate, and the non-reducing end and internal GalNAc (4SO_Four) Should have more dermatan sulfate, but chondroitin sulfate A showed higher activity as a sulfate group acceptor, indicating that the iduronic acid contained in dermatan sulfate is human GalNAc4S-6ST. This suggests that the activity was inhibited.
[0046]
From Table 2, the substance 1 of the present invention has transferred sulfate groups to tetrasulfated chondroitin oligosaccharides (tetrasulfated trisaccharides and tetrasulfated pentasaccharides), and to which of these sulfate groups have been transferred To find out³⁵S-labeled trisaccharide and pentasaccharide were digested with chondroitinase ACII and analyzed on a SAX-HPLC column in the same manner as above (FIG. 7). All oligosaccharides have a radioactivity of GalNAc (4,6-bisSO_Four) (FIGS. 7A and 7C).³⁵SO_Four ^2-After the digestion with chondroitinase ACII to identify the site where³⁵S-labeled oligosaccharides were digested with chondro-6-sulfatase and analyzed on a SAX-HPLC column in the same manner as described above. GalNAc (4,6-bisSO_Four) Disappeared, and a radioactive inorganic sulfuric acid peak was generated (FIGS. 7B and 7D). From this, human GalNAc4S-6ST has sulfate group converted to non-reducing end GalNAc (4SO_Four) Residue 6-position, GalNAc (4SO_Four) And internal GalNAc (4SO_FourIt was suggested that the amount of sulfate group transfer to the residue was relatively small.
[0047]
Example 2
<1> Expression of human GalNAc4S-6ST-His tag fusion protein in insect cell systems
Mass expression of human GalNAc4S-6ST-His tag fusion protein in insect cell system was performed. Since the obtained human GalNAc4S-6ST-His tag fusion protein has a His tag, it is suitable for purification using an affinity column. A vector pVL1393GalNAc4S-6ST expressing human GalNAc4S-6ST as a fusion protein with a His tag was constructed, and this vector was introduced into Sf-21 cells (J. Biochem., 119 (1996), 1150-1156). pVL1393GalNAc4S-6ST was constructed according to the following method. That is, using cDNA (Accession No. AB011170: Gene No. KIAA0598) provided by Kazusa DNA Research Institute as a template, using the primers of SEQ ID No. 17 as 5 ′ primer and SEQ ID No. 18 as 3 ′ primer, respectively. A PCR product was obtained by the PCR method in the same manner. Since the BamHI recognition sequence is provided at the end of the sense primer (5 'primer) and the StuI recognition sequence is provided at the end of the antisense primer (3' primer), the PCR product is digested with SpeI and EcoRI. PBluescript SKII (-) plasmid (Stratagene) was added to the NheI / BamHI cDNA fragment isolated from the MK transfer vector according to Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 66-70 (1997) (melittin signal sequence, 6 And a His tag consisting of a single His and an enterokinase sensitive sequence). A fragment excised from this plasmid with XbaI and EcoRV was inserted into a baculovirus vector pVL1393 (manufactured by Farminogen) digested with XbaI and SmaI.
[0048]
The recombinant pVL1393GalNAc4S-6ST thus obtained was transfected into Sf-21 cells according to J. Biochem., 119, 1150-1156 (1996). Recombinant was cultured, human GalNAc4S-6ST-His tag fusion protein (hereinafter also referred to as “substance 2 of the present invention”) secreted in 600 ml of culture supernatant was added at 0.15 mol / l of NaCl containing 50 mmol / l. The sample was passed through a 1 ml heparin Sepharose Cl-6B column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with sodium phosphate buffer (pH 7.4). After washing the column with the same buffer, the substance 2 of the present invention was eluted with 6 ml of 50 mmol / l sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing NaCl at 0.5 mol / l. For further purification, the eluate was passed through a HisTrap chelate HP column (Amersham Pharmacia Biotech), washed with 40 mmol / l imidazole buffer, 5 ml 0.1 mol / l and 0.2 mol / l imidazole. Elution was performed with buffer according to the column instructions.
[0049]
Inventive substance 2 is eluted with 0.2 mol / l imidazole, confirmed to be a single band by SDS-PAGE, and concentrated in Centricon YM-10 (Millipore). , Desalted. 150 μg of the substance 2 of the present invention was obtained from 600 ml of the culture solution.
[0050]
<2> Synthesis of chondroitin sulfate E using substance 2 of the present invention
The present invention uses chondroitin sulfate derived from whale cartilage (including many chondroitin 4 sulfate structures: manufactured by Seikagaku Corporation) and chondroitin sulfate derived from sturgeon cartilage (containing many chondroitin 4 sulfate structures: manufactured by Seikagaku Corporation). Substance 2 undergoes a sulfate group transfer.
1 ml of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4: 10 mmol / l CaCl₂20 mmol / l reduced glutathione and 50 mmol / l imidazole) were added to 250 μg of chondroitin sulfate, 74 μg of the substance 2 of the present invention and 500 μg of PAPS, and incubated at 37 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was passed through an affinity column bound with midkine, and the fraction adsorbed on the column was recovered by eluting with 0.15 mol / l, 0.3 mol / l, 0.5 mol / l, and 0.7 mol / l NaCl aqueous solution. did.
The chondroitin sulfate contained in each fraction was digested with chondroitinase ABC (manufactured by Seikagaku Corporation) according to J. Biol. Chem., 270, 18575-18580 (1995), and then disaccharide analysis was performed. (Table 3).
[Table 3]
Table 3

unit:%
[0051]
As a result, both chondroitin sulfate derived from whale cartilage and chondroitin sulfate derived from sturgeon cartilage were treated with ΔDi-diS._EThe structure has greatly increased, and it has been revealed that the substance 2 of the present invention can be used for the synthesis of chondroitin sulfate containing a large amount of chondroitin sulfate E structure. Thus, chondroitin sulfate containing a large amount of chondroitin sulfate E structure was obtained. Therefore, in the presence of high concentration of PAPS, the substance 2 of the present invention is an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue at the non-reducing end of the chondroitin skeleton. It was suggested that the sulfate group may be transferred not only to the non-reducing end but also to N-acetylgalactosamine tetrasulfate residues.
In addition, natural chondroitin sulfate called normal chondroitin sulfate E is a ΔDi-diS when disaccharide analysis similar to the above is performed._EIs detected only about 30%, and even if it is chondroitin sulfate modified by the method described in J. Biol. Chem. 275, 34728-34736 (2000), Δdi-diS_EAlthough the structure is less than 50%, ΔDi-diS can be obtained by applying the substance 2 of the present invention in the presence of high concentration of PAPS_EA chondroitin sulfate fraction containing more than 50% of the structure was obtained for the first time.
[0052]
Example 3
Expression of GalNAc4S-6ST in human tissues
(1) Dot blot hybridization method
Using the total RNA dot blot membrane of each human tissue, the expression of GlcNAc4S-6ST was analyzed by the hybridization method (expression hybridization method) with the base sequence part (SEQ ID NO: 14) of the coding region of hGlcNAc4S-6ST ( FIG. 8). The arrangement of the tissues on the blot membrane is as shown in Table 4. As a result, GlcNAc4S-6ST is expressed in all tissues, and it is clear that GlcNAc4S-6ST is strongly expressed in lung, spleen, peripheral blood leukocytes, lymph nodes, thyroid gland, fetal brain, fetal spleen. became.
[0053]
[Table 4]
Table 4

[0054]
Hybridization and autoradiography were performed under the following conditions. The nitrocellulose filter was immersed in 3 × SSC solution (1 × SSC solution: NaCl 0.15M, sodium citrate (pH 7.0) 0.015M) and treated at 65 ° C. for 30 minutes. Then, soak in a prehybridization solution consisting of 1% SDS, 5 × SSC, 1 × Denhardt's solution (BSA Fraction V (Sigma) 0.2%, Polyvinylpyrrolidone 0.2%, Ficoll 400 (Pharmacia) 0.2%)). And treated at 65 ° C. for 2 hours. Furthermore, the nitrocellulose membrane treated in this way was placed in a plastic bag, NaCl 0.75 mol / l, Tris-HCl (pH 8.0) 50 mmol / l, EDTA 2 mmol / l, 1 × Denhardt's solution, SDS 0.1%, modified salmon Sperm DNA 50 μg / ml, denatured [³²P] -labeled hGlcNAc4S-6ST coding region DNA (10⁶cpm / ml) was added and incubated overnight at 65 ° C. After hybridization, soak in 100 ml of 2 × SSC, 0.1% SDS solution, shake gently for 5 minutes at room temperature, then replace the solution with 0.2 × SSC-0.1% SDS solution, incubate at 65 ° C. for 30 minutes, and further The solution was changed to the same composition and incubated at 65 ° C. for 30 minutes. The nitrocellulose membrane was rinsed lightly with 2 × SSC, air-dried, and then covered with saran wrap for autoradiography.
[0055]
(2) Northern blot hybridization
For human heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and pancreas, GlcNAc4S-6ST RNA expression was analyzed by Northern blot hybridization (FIG. 9: heart, brain, placenta, lung from the left lane). , Liver, skeletal muscle, kidney, pancreas). That is, after fractionating the total RNA prepared from each tissue by agarose gel electrophoresis, the migrated RNA was transferred to a nitrocellulose membrane, this membrane was dried with heat and dried, and then the dot blot hybridization of (1) Hybridization treatment was performed under the same conditions as above.
As a result, radioactivity was detected in a 5.2 kbp RNA band in any tissue.
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a fusion protein which is required for large-scale preparation of human-derived GalNAc4S-6ST.
[0057]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing the amino acid sequences of Peptide 4 and Peptide 5 and the construction of PCR primers (4a-1, 4a-2, 5s-1, and 5s-2).
FIG. 2 shows a cDNA fragment of GalNAc4S-6ST derived from squid cartilage amplified by PCR.
FIG. 3 is a view showing the relationship between a PCR product, a peptide fragment, and the amino acid sequence of GalNAc4S-6ST derived from human.
FIG. 4 is a graph showing sulfate group transferase activity of human-derived GalNAc4S-6ST to chondroitin sulfate A and tetrasulfated trisaccharide.
FIG. 5 shows the analysis of the sulfate group transfer site of human-derived GalNAc4S-6ST to chondroitin sulfate A and dermatan sulfate using SAX-HPLC.
FIG. 6 is an analysis of GalNAc (4ST) at the non-reducing end of chondroitin sulfate and dermatan sulfate using a SAX-HPLC column.
FIG. 7 shows the analysis of the sulfate group transfer site of human-derived GalNAc4S-6ST to a tetrasulfated oligosaccharide using SAX-HPLC.
FIG. 8 is a diagram showing the amount of transcription of human-derived GalNAc4S-6ST DNA in each tissue analyzed by dot blot analysis.
FIG. 9 shows analysis of the amount of GalNAc4S-6ST DNA transcription in the human heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and pancreas by Northern blotting.

Claims

A sugar chain sulfating agent comprising a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and having an activity of transferring a sulfate group to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate.

A sugar chain sulfating agent, comprising a fusion protein of a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 and an identification polypeptide.

Chondroitin sulfate containing N-acetylgalactosamine 4,6 sulfate in the basic skeleton is transferred to the 6-position of the N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate. Use of the sugar chain sulfating agent according to claim 1 or 2 for production.

Using the sugar chain sulfating agent according to claim 1 or 2 , transferring a sulfate group from a sulfate group donor to the 6-position of an N-acetylgalactosamine 4-sulfate residue present in the basic skeleton of chondroitin sulfate. A method for producing chondroitin sulfate comprising N-acetylgalactosamine 4,6 sulfate as a basic skeleton, which is characterized.