JP4170633B2 - 拡張型心筋症の原因となる新規点突然変異を有するデスミン遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子を解明したものである。本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子、変異した蛋白質、点変異部分を含むオリゴヌクレオチド、及びそれを用いた遺伝性心筋症を検出、同定する方法に関する。また、本発明は、変異したデスミン遺伝子のみを含有した疾患モデル動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心臓は全身に血液を送るための重要な臓器である。心臓のポンプとしての機能を担っているのが心筋である。心筋は不随意筋ではあるが、骨格筋と同じ横紋筋で構成されている。横紋筋は、筋原繊維におけるアクチンフィラメントとミオシンフィラメントからなる筋節（サルコメア）が暗帯（ミオシンフィラメント部分）と明帯（筋節の末端のＺ線部分）との縞模様に観察されることから命名された筋肉組織である。筋細胞は、細長い繊維状の細胞であり、その細胞質（筋形質）には多数の筋原繊維やミトコンドリアが存在し、細胞質は筋鞘と呼ばれる細胞膜で包まれている。
筋形質に存在する筋原繊維は、アクチンフィラメントとミオシンフィラメントからなる筋節（サルコメア）からなり、各筋節の間には細い横線状のＺ線がある。Ｚ線部分には、筋形質膜表面に伝わった電気的興奮を深部の筋原線維に瞬時に伝搬する機能を有するＴ管が存在する。筋細胞に伝達された電気的興奮はＴ管を経由して筋節に伝達され、筋収縮が起こることになる。
【０００３】
心筋はこのような筋細胞（心筋細胞）の網でできており、心臓をらせん状にとりまいており、自律的な収縮を繰り返して血液を全身に送っている。心臓の負荷が長期間継続すると、心筋は細胞分裂により心筋組織を大きくするのではなく、心筋細胞自体の長さや太さが増加する。これを心筋の肥大という。心筋が肥大しても、心筋細胞に酸素や栄養を供給する冠状動脈などがそれに見合って発達することは無く、心筋の肥大により心筋細胞に対する充分な血液の供給ができなくなる。一般に、心臓の重量が５００ｇを越えるとこのような現象が起こることになる。
心筋症は、心筋の異常による疾患であり、生命維持に必須な心臓には自発再生能がなく、その進行性変性疾患である心筋症は極めて重篤である。心筋症は、拡張型心筋症（うっ血性心筋症）や肥大型心筋症のような原発性心筋症と感染性心筋症のような二次性心筋症に分類される。原発性心筋症には、心筋の肥大による肥大型心筋症と、他の要因による拡張型心筋症がある。
【０００４】
遺伝性心筋症の代表的なモデル動物である心筋症ハムスターは１９６２年に発見され、これまでに病理学、薬理学、生理学など様々な見地から研究されてきた。プロトタイプである肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（以下、Ｂと略す。）から肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（ＴＯ−２、以下、Ｔと略す。）が分離されている。
図１にこれらの心筋症ハムスターの特徴を図面に代わる写真で示す。図１の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図１の上段の（Ａ）は各ハムスターの左心室のヘマトキシリン＆エオジン（hematoxylin & eosin）染色による光学顕微鏡像を示す。Ｂ及びＴ共に壊死、線維化、石灰化が見られる。（Ａ）のバーは２００μｍを示す。図１の（Ｂ）は各ハムスターの左心室の水平断面像を示す。Ｂでは残存心筋の代償性肥大が顕著に見られるのに対し、Ｔの心室壁は極めて薄い。（Ｂ）のバーは２ｍｍを示す。図１の下段の（Ｃ）は各ハムスターの心電図の胸部第一誘導を示す。ゴールデン（Ｇ）、ＢＩＯ１４．６（Ｂ）、ＴＯ−２（Ｔ）におけるＱＲＳコンプレックス（complex）の電位はそれぞれ、０．５５±０．０６、０．９８±０．０６、０．２２±０．０６Ｖである。（Ｃ）の縦方向のバーは０．５Ｖを示し、横方向のバーは１秒を示す。
【０００５】
これらの心筋症ハムスターに共通の遺伝子異常は、ジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質の一つであるδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失であることを本発明者らが明らかにしてきた（Sakamoto A,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997,94(13873-13878）；Sakamoto A, et al. FEBS Lett. 1999, 447,124-128.）。
しかし、Ｔのハムスターには心筋の肥大は観察されず、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失のみでこれらのハムスターの心筋症の原因を論ずることはできず、Ｔのハムスターの心筋症の原因についてはさらなる解明が必要とされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（Ｂ）から分離された肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（Ｔ）の心筋症の原因を解明し、拡張型心筋症の病因を明かにし、もってその予防・治療方法を確立することを目的としている。
また、本発明は、亜系Ｔのみの心筋症の原因となる遺伝子を含有する新規疾患モデル動物を提供すること、及びこれらの動物を用いた遺伝性心筋症に対する新たな治療法（医薬品、遺伝子治療、再生医療など）の開発あるいは評価方法を提供することを目的としている。
さらに本発明は、ＴＯ−２ハムスターあるいはその亜系動物を用いて、心筋における筋原線維と筋形質膜（Ｔ管を含む）との架橋構造の解明をするための手法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子に関する。より詳細には、点変異が、ＧからＡへの変異である点変異したデスミン遺伝子に関する。
本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置を含む５〜２５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００８】
また、本発明は、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定するために、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置の点変異を検出、同定する方法に関する。より詳細には、検出、同定する方法が、ＰＣＲを用いて検出する方法、又は前記オリゴヌクレオチドを用いる方法である、点変異を検出、同定する方法に関する。
さらに、本発明は、このようなＰＣＲのためのプライマーや、デスミンの各領域を増幅するためのプライマーに関する。
本発明は、前記したプライマーや、前記してきたオリゴヌクレオチドを用いて、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置の点変異を検出、同定するための測定キットに関する。
【０００９】
また、本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミン、及びデスミンのヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチド、これらのコイル−１領域に存在する１９１番目のアミノ酸であるアラニンがスレオニンに変異しているポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドに対する抗体に関する。
さらに、本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子のみにより遺伝子異常が生じている疾患モデル動物、より詳細には、ＴＯ−２ハムスターを他のハムスター、例えば正常ハムスターとを交配させて得られる遺伝性心筋症の疾患モデル動物、及びこの疾患モデル動物を用いて、遺伝性心筋症に対する予防、治療法又は予防、治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【００１０】
遺伝性心筋症の代表的なモデル動物である心筋症ハムスターのプロトタイプである肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（以下、Ｂと略す。）から肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（ＴＯ−２、以下、Ｔと略す。）が分離されている。
本発明者らは、これらの心筋症ハムスターに共通の遺伝子異常は、ジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質の一つであるδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失であることを明らかにしてきた（Sakamoto A,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997,94(13873-13878）；Sakamoto A, et al. FEBS Lett. 1999, 447,124-128.）。しかし、Ｔのハムスターには心筋の肥大は観察されず、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失のみでこれらのハムスターの心筋症の原因を論ずることはできず、Ｔのハムスターの心筋症の原因についてはさらなる解明が必要とされていた。
【００１１】
心筋細胞は圧負荷や低酸素負荷に対して、細胞分裂はせずにその容積を増やすという特徴がある（代償性心肥大）。そこでまず、これに関連する遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲで検討した。この結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図２の各段は上から、内部標準であるＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）、α−骨格筋型アクチン（α−Skeletal Muscle Actin）、β−ミオシン重鎖（β−Myosin heavy chain）、ｃ−ミック（c-myc）、ｃ−Ｈ−ラス（c-H-ras）、プレプロＥＴ−１（prepro-endothelin-1）、Brain Natriuretic Peptide（ＢＮＰ）、及びＧＡＴＡ−４である。ＰＣＲのサイクルは、各々左から４０、３５、３０、２５で、バンドがより右側で検出できるほど発現量は多いことになる。測定に用いたゴールデン（Ｇ）、ＢＩＯ１４．６（Ｂ）、ＴＯ−２（Ｔ）のｃＤＮＡが等量であることは、内部標準であるＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）の増幅が同一であることから確認できる。
この結果、予想外なことにプレプロ−エンドセリン−１（prepro-endothelin-1）、Ｃ−ミック（c-myc）、β−ミオシン重鎖（β−myosin heavy chain）など心肥大に関連する遺伝子の発現はいずれもＢよりＴの方が亢進していた。
【００１２】
次に病理学的な観点から、心筋細胞のアポトーシスとネクローシスについて検討した。まず、心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ（TdT-mediated X-dUTP nick end labeling）陽性細胞数とゲノムＤＮＡのラダーリングを検討した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側の（Ａ）は心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ陽性細胞数をＧ、Ｂ及びＴのハムスターの６、１２及び２６週齢において検討した結果を示す。図３の右側の（Ｂ）は心筋から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動をＧ、Ｂ及びＴのハムスターの１２及び２６週齢において検討した結果を示す。
この結果、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数はＢ及びＴ共にやや多いが、両者の違いに有意差はなかった。また、ゲノムＤＮＡのラダーリングについてもＢＩＯ１４．６、ＴＯ−２いずれにおいても、アポトーシスに特異的な１８０塩基単位のラダーは検出されなかった。
【００１３】
ネクローシスに関する検討ではいずれも２６週齢のハムスターを用いてマッソントリクローム（Masson trichrome）染色とトルイジンブルー（Toluidine blue）染色を行った。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図４の上段の（Ａ）はマッソントリクローム（Masson trichrome）染色の場合を示し、図４の下段の（Ｂ）はトルイジンブルー（Toluidine blue）染色の場合を示す。
この結果、ＴＯ−２では、線維化（青く染色）が激しく（図４（Ａ））、炎症細胞浸潤（ａｒｒｏｗ）が激しい（図４（Ｂ））ことが分かった。
このように、Ｔでは線維化と炎症細胞浸潤が強く（図４）、心筋変性の実体はアポトーシスではなくネクローシス（壊死）であることが分かった。
【００１４】
さらに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び超音波画像診断によりこれらのハムスターの病理を観察した。透過型電子顕微鏡の観察の結果を図５に図面に代わる写真で示し、超音波画像診断の観察の結果を図６に図面に代わる写真で示す。図５の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図６の左側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。
この結果、ＴＯ−２のＺ線（矢頭印）は細く、部分的に断裂し、間隔が不均一なところも見られる。また、ＴＯ−２ではＴ管（矢印）の数が少なく、Ｔの左心室筋には、（１）筋原線維の横紋に相当するＺ線は細く、部分的に分断され、（２）Ｔ管の数が少なく、（３）Ｚ線の間隔が不均一なところがある、という３つの形態異常を見出した（図５参照）。さらに、超音波画像診断により、ＢＩＯ１４．６の心室壁は同心円状に収縮するが、ＴＯ−２の心室壁は単に薄いのみでなく、心室全体としての動きに協調性がなく、心室の動きが空間的に無秩序であることも見出した（図６参照）。
【００１５】
以上のことから、Ｔの心筋ではＺ線が細く、部分的に分断されていることが観察され、ＴではＺ線の構成タンパク質に異常が存在することが示された。生後６週の左心室筋から筋原線維を抽出し、さらに図７の左側に示される精製プロトコールに従ってミオシンとアクチンを段階的に除去し、Ｚ線の構成タンパク質を濃縮した標品を調製した。そして、既知のＺ線構成タンパク質であるα−アクチニンとデスミンの存否をイムノブロット（immunoblot）で追跡した。図７の右側はＺ線の構成タンパク質を濃縮する工程における各段階での正常ゴールデンハムスター（Ｇ）とＴＯ−２（Ｔ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）及びイムノブロット（下段）の結果を示す図面に代わる写真である。即ち、心筋のホモジネート段階をＷとし、界面活性剤で可溶化した後の筋原繊維の分画をＰ１とし、他の分画をＳ１とし、Ｐ１の分画からミオシンを除去した分画をＰ２とし、さらにＰ２の分画からアクチンを除去した分画をＰ３とした。
α−アクチニンとデスミンは、生後６週のＴの全ホモジネート（whole homogenate）、筋原線維画分、ミオシン除去の筋原線維画分ではＧと変化はなかったが、アクチンの除去により共に激減した（図７参照）。Ｚ線と結合するタンパク質であるアクチンの除去は、Ｚ線を人為的に不安定化させることを意味する。従って、その結果としてα−アクチニンとデスミンが激減することは、ＴのＺ線が構造的に脆いことを示唆し、ＴＥＭの所見と一致する。心筋は死ぬまで収縮を続けそれによる機械的ストレスは加齢と共に蓄積する。そこで次に、Ｇ、Ｂ、及びＴ（６、１２、２８、及び４５週齢）の左心室の全ホモジネート（whole homogenate）におけるα−アクチニンとデスミンの加齢による変化を追跡した。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の上段はＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色の写真であり、下段はイムノブロットの写真である。その結果、Ｔでは加齢と共にデスミンは徐々に減少するがα−アクチニンの量に変化はなかった。以上から、ＴではＺ線構成タンパク質、特にデスミンが極めて不安定であることが分かった。
【００１６】
デスミンは骨格筋あるいは心筋のＺ線に位置する中間系フィラメントタンパク質（intermediate filament protein）であり、その遺伝子異常は筋ジストロフィー症を合併する心筋症の原因となることが知られている（Goebel H.H.,et al.Muscle&Nerve,18:1306-1320,1995）。そのモデル動物としてはこれまでに、デスミン遺伝子を完全に破壊させたいわゆるノックアウトマウス（knock out mouse）が独立した２つのグループによって作成されている（Milner D.J.,et al.J Cell Biol.,134:1255-1270,1996:Li Z.,et al.Dev.Biol.,175:362-366,1996）。ところで、これまでに見出されたデスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症には、デスミン遺伝子の完全欠失はなく、全て点突然変異である。この場合、デスミンタンパク質は小児期には存在するが、加齢と共に徐々にＺ線から逸脱し、結果として心筋症が発症する。それに対してデスミンのノックアウトマウスでは、デスミンタンパク質は生下時にすでに完全に欠損し、筋原線維、ミトコンドリアなど心筋あるいは骨格筋細胞内の微細構造の破綻ならびに心筋症は速やかに起こる。そのため、デスミン遺伝子の異常による心筋細胞崩壊の経時的変化の追跡が難しく、また、発症前から予防的に行う心筋症の新規治療法の開発には不向きであるという問題点があった。
シリアンハムスターのデスミン遺伝子並びにｃＤＮＡ自体はすでに単離され（Quax W.,et.al. Cell.1985;43(1):327-38.）、その遺伝子発現調節やタンパク質複合体形成に関する研究に用いられてきた。しかし、遺伝性心筋症ハムスターの原因及び発症機構における意義という観点で研究に用いられたことはない。
【００１７】
すでに公表されたシリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの塩基配列を基に、翻訳領域全体をＲＴ−ＰＣＲで増幅するプライマーセットと反応条件を見出した（図９に示されるＤｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）。そして、ＧとＴのデスミンｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定した。Ｇのデスミン遺伝子の翻訳領域（open reading frame）は、１４０７塩基で、４６９残基のアミノ酸からなる分子量５３，４４５のポリペプチドをコードすると考えられた。アミノ酸配列のコンピューター解析（Lupas,A.,Van Dyke,M.,and Stock,J.(1991)."Predicting Coled Coils from Protein Sequences" Science 252:1162-1164. http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）の結果、デスミンはコイルド−コイル（coiled-coil）構造をしたタンパク質であり、アミノ末端のヘッド（ｈｅａｄ）部分、中央の二つのコイル（ｃｏｉｌ）部分、そしてカルボキシル末端のテイル（ｔａｉｌ）部分からなることが予測された（図１４の（Ａ）参照）。
【００１８】
図９は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの塩基配列を示す。翻訳されるアミノ酸を対応コドンの上部に一文字表記で記した。塩基の番号は翻訳領域だけを対象とした。全翻訳領域をカバーするデスミンｃＤＮＡは、図９中のＤｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲによるＲＴ−ＰＣＲ産物を、ボックスで表記した制限酵素（Ｓａｌ Ｉ）の認識部位で結合して得ることができる（図１２参照）。デスミンの４つのドメイン（図１４参照）を増幅するためのプライマーも矢印で明記した。
図１２は、ゴールデンハムスターの左心室筋から合成したｃＤＮＡを鋳型とし、図９に示される２種類のプライマーセット（Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）でＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｍはマーカーである。この結果、Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲでＰＣＲを行った場合には５９３ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｄｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲでＰＣＲを行った場合には９７３ｂｐのＰＣＲ産物が得られることがわかる。
【００１９】
そして、ＴのハムスターのデスミンのｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定した結果、Ｔでは、ｃｏｉｌ−１内に位置し、既知の全ての種で保存される１９１番目のアラニンをスレオニンに変える点変異（point mutation（Ｇ５７１Ａ））が存在することがわかった。ＢＩＯ１４．６ハムスターはこの塩基変異はなく、ＴＯ−２における第二の遺伝子異常は、Ｚ線を構成するデスミン遺伝子のミスセンス変異（missense mutation）であると考えられた。
図１３は、拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２におけるゲノムの塩基変異とＰＣＲによるその検出を示したものである。図１３の（Ａ）は、ゴールデンとＴＯ−２ハムスターにおける、デスミン遺伝子の点突然変異（Ｇ５７１Ａ）周辺のゲノムの塩基配列を示したものである。両者で共通のものはドット（・）で表示したある。大文字と小文字は、それぞれ第一エクソン、第一イントロン内の塩基配列であることを示す。番号は図９のｃＤＮＡ配列に対応する。遺伝子診断に用いたプライマーの例を矢印で示した。図１３の（Ｂ）は、プライマーセット（ＤｅｓＦ／ｄｅｓＧＲ）あるいは（ＤｅｓＦ／ＤｅｓＴＲ）を用いたゲノムのＰＣＲの結果を示す図面に代わる写真である。それぞれ、デスミンの５７１番目の塩基がＧあるいはＡに特異的なバンドを増幅することがわかる。ゴールデン、ＢＩＯ１４．６、ＴＯ−２におけるこのアレルは、（Ｇ／Ｇ）、（Ｇ／Ｇ）、（Ａ／Ａ）であることもわかった。
【００２０】
デスミンの分子構造と各ドメインの組み換えタンパク質の発現の結果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の（Ａ）は、デスミンの分子構造を模式的に示したものであり、ＴＯ−２におけるアミノ酸変異（図１４（Ａ）の○印）は、コイル−１（Ｃｏｉｌ−１）内に位置する。図１４の（Ｂ）は、デスミンの全長及び各ドメインの組み換えタンパク質である。各ドメインのｃＤＮＡを図１のプライマーセットを用いて増幅し、発現ベクターｐＥＴ３３ｂに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた結果を示す図面に代わる写真である。図は、各大腸菌の全溶出物（whole lysate）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけＣＢＢで染色したものである。目的のタンパク質に対応するバンドには星印（＊）を付した。レーン１は全長のものであり、レーン２はヘッド（head）部分のものであり、レーン３はコイル−２（Coli-2）のものであり、レーン４はテイル（Tail）部分のものであり、レーン５は正常なコイル−１（normal coil-1）（１９１Ａ）のものであり、レーン６は変異コイル−１（mutant coil-1（１９１Ｔ））のものである。
【００２１】
ＴＯ−２のデスミンには点突然変異（Ｇ５７１Ａ）があり（図１３参照）、そのため１９１番目のアミノ酸が正常のＡ（アラニン）からＴ（スレオニン）に変わったものである。この点変異したＴＯ−２のデスミンの塩基配列を配列表の配列番号１に示し、その翻訳領域の対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
次に、デスミンの機能を調べるために、心筋の筋形質膜と筋原線維の架橋構造を検討した。
本発明者らは、正常ハムスター（Ｇ）の心筋ではジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質であるα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）は、心筋のＴ管にも存在するが、４５週のＴではほとんど存在しないことを、単離心筋細胞の免疫染色により初めて見い出した。心筋の全ホモジネート（whole homogenate）を用いたイムノブロット（immunoblot）の結果を図１０に図面に代わる写真で示す。α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）の消失は、心筋症ハムスターの共通原因遺伝子δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）の欠失に依存せず、デスミンの消失した４５週のＴＯ−２に特異的であった。
これらの結果とＴではＴ管がほとんど存在しないという透過型電顕の所見と考え合わせると、心筋の筋形質膜と筋原線維は、Ｔ管上のα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とＺ線上のデスミンとが直接あるいは間接的に結合することで架橋されていることが推測される。この構造を模式的にして図１１に示す。図１１はこれらの結果から予想される筋形質膜と筋原線維の架橋モデルを示しており、α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とデスミンを介した心筋形質膜と筋原線維との架橋構造は、筋形質膜の電気的興奮を筋原線維に伝搬させる一方、筋原線維の張力を筋形質膜に伝達させる働きがあると考えられる。α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とデスミンとの結合が、直接的なものか何らかの分子（docking molecule）を介した間接的なものかは、現時点では不明であるが、これらの分子が相互に作用するものであることが明らかにされた。
そして、Ｔでは、心筋細胞（透過型電顕像、図５）さらには心臓全体（超音波画像診断、図６）の収縮が空間的に不均一であるが、そのことは、デスミン遺伝子の異常によりＴ管の構造的異常が引き起こされ、筋形質膜から筋原線維への電気的興奮の伝搬が不均一になることで容易に理解できる。
【００２３】
以上のように、本発明によりＴＯ−２に存在する心筋症の第二原因遺伝子が解明された。さらに、Ｔ管と筋原線維との架橋の支持体としての、デスミンの機能的意義の発見は本発明が世界で初である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、遺伝性心筋症の原因のひとつが心筋のＴ管に関連するデスミンの遺伝子の点変異であることを見出したものである。本発明の点変異の位置は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置であり、この位置がデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域のどの位置になるかは動物によって異なることがあり、必ずしも５７１番目ということではない。例えば、ヒトのデスミンにおいてこの位置がデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の何番目に相当するかということは、アミノ酸配列の相同性やペプチドの立体配置などを考慮して決定されることである。したがって、本発明における「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」とは、デスミンのペプチドとしての機能における同様な機能を果たす位置に相当することを意味しており、動物の種類に応じてデスミンのアミノ酸配列の相同性やペプチドの立体配置などにより決定されるいる位置を意味している。
【００２５】
シリアンハムスターにおいては、当該点変異はＧからＡへの変異であることを本発明は明らかにしてきたが、本発明はＧからＡへの変異に限定されるものではなく、本発明において重要なことはその位置の点変異により心筋症が発症してくるということであり、動物の種類による遺伝子の各種の変異を本発明は包含するものである。
シリアンハムスターにおける具体例においては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が示される。この配列表においては、翻訳開始の塩基が８２番目であるから、点変異の位置は６５２番目に示されている。本来のデスミンは、６５２番目から６５４番目までの塩基配列が「ｇｃｃ」でアラニンをコードするものであるが、本発明の遺伝子は「ａｃｃ」に点変異してスレオニンをコードする配列となっている。
【００２６】
本発明は、このようなデスミンの遺伝子の点変異により遺伝性心筋症が発症することを明らかにするものであり、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」の点変異を検出、同定することにより、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定することができる。被検体としては、ヒト、ハムスター、ラットなどの動物のゲノムを使用することができる。
本発明の検出、同定する方法としては、通常の各種の遺伝子の検出、同定手段を使用することができる。例えば、点変異の前後の塩基配列を利用したＰＣＲ法などにより、点変異を含む部分の遺伝子を増幅させて、増幅の有無や増幅された遺伝子の解析により点変異の有無を検出、同定することができる。ＰＣＲ法における好ましいプライマーとしては、配列番号９に記載の塩基配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号１０に記載の塩基配列を有するリバースプライマー、又は配列番号１１に記載の塩基配列を有するリバースプライマー若しくは配列番号１２に記載の塩基配列を有するリバースプライマーとの組み合わせが挙げられる。
また、点変異を含む部分のオリゴヌクレオチドを固定化させたＤＮＡチップを用いて、ゲノムのＳＮＰを検出、同定する方法と同様な手法により本発明の点変異を検出、同定することもできる。
【００２７】
本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」を含む５〜２５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の点変異を検出、同定などに使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの長さとしては、検出、同定に必要な充分な長さがあればよく、例えば５〜２５０塩基、５〜１５０塩基、５〜５０塩基、５〜３０塩基、５〜２０塩基、又は。７〜２５０塩基、７〜１５０塩基、７〜５０塩基、７〜３０塩基、７〜２０塩基、さらには１０〜２５０塩基、１０〜１５０塩基、１０〜５０塩基、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基程度の各種の長さでその目的に応じて使用することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーやプローブとして使用することができ、プローブとしては標識化して使用することや、ＤＮＡチップのように担体に固定されて使用することができる。
【００２８】
さらに、本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」の点変異を検出、同定するための測定キットを提供するものである。このような測定キットとしては通常の遺伝子の検出、同定に使用されるキットを使用することができる。例えば、ＰＣＲ法などによる増幅により検出、同定しようとする場合には、増幅のためのプライマーセット、増幅処理に必要な試薬類、増幅産物を検出、同定するための試薬類などから測定キットとなる。また、ＤＮＡチップなどの場合には、点変異を検出、同定するためのオリゴヌクレオチドが固定化されたＤＮＡチップ、それを処理するための試薬類などからなる測定キットが挙げられる。
本発明の測定キットにより、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定することができる。
【００２９】
本発明は、デスミン遺伝子の各領域を増幅するためのプライマーを提供する。デスミンは図１４に示されるように、ヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチドであり、この各領域の１つ又は連続した２個以上の領域を増幅するためのプライマーセットを提供するものである。より詳細には、図９に示されるように、ヘッド領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＨＤ−Ｆ（配列表の配列番号１３）をリバースプライマーとしてＨＤ−Ｒ（配列表の配列番号１４）を使用することができ、コイル−１領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＣＬ１−Ｆ（配列表の配列番号１５）をリバースプライマーとしてＣＬ１−Ｒ（配列表の配列番号１６）を使用することができ、コイル−２領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＣＬ２−Ｆ（配列表の配列番号１７）をリバースプライマーとしてＣＬ２−Ｒ（配列表の配列番号１８）を使用することができ、又はテイル領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＴＬ−Ｆ（配列表の配列番号１９）をリバースプライマーとしてＴＬ−Ｒ（配列表の配列番号２０）を使用することができる。また、これらのプライマーを適宜組み合わせることにより、２つ以上の連続した領域を同時に増幅することもできる。
【００３０】
また、デスミンの５’端領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓ５Ｆ（配列表の配列番号５）をリバースプライマーとしてＤｅｓ５Ｒ（配列表の配列番号６）を使用することができ、デスミンの３’端領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓ３Ｆ（配列表の配列番号７）をリバースプライマーとしてＤｅｓ３Ｒ（配列表の配列番号８）を使用することができる。
さらに、点変異を含む領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓＦ（配列表の配列番号９）をリバースプライマーとしてＤｅｓＧＲ（配列表の配列番号１０）を使用することができ、点変異体を特異的に増幅させるためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓＦ（配列表の配列番号９）をリバースプライマーとしてＤｅｓＴＲ（配列表の配列番号１２）又はより短いＤｅｓＴＲ（配列表の配列番号１１）を使用することができる。
本発明は、これらのプライマーセットを提供するものである。
【００３１】
本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」が点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンを提供するものであり、本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンとしては、ハムスター、ヒト、ラットなどの動物から得られるポリペプチドが挙げられる。本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンは、心筋などの横紋筋における構造解析や機能解析に有用であるばかりでなく、Ｔ管における神経伝達機構の解明などにも有用なポリペプチドである。本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンの具体例としては、配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。このアミノ酸配列は本発明のポリペプチドのひとつの例示であり、このアミノ酸配列のみに限定されるものではなく、同様な機能を有するものであれば一部のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、又は他のアミノ酸がさらに付加されたものであってもよい。言い換えれば、本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンとは、点変異を起こしたアミノ酸が存在するデスミンの機能を有するポリペプチドであるということもできる。
【００３２】
また、本発明は、図１４に示されるように、デスミンのヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチドを提供するものである。デスミンのコイル−１領域は、本発明の点変異を含むものであり、本発明は、コイル−１領域のひとつのアラニンがスレオニンに変異しているデスミンのコイル−１領域からなるポリペプチドを提供するものである。
さらに、本発明は、これらの本発明のポリペプチドに対する抗体を提供するものである。本発明の抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、本発明の前記したポリペプチドを用いて通常の抗体の製造方法、例えば免疫感作させたラットやウサギなどの動物の細胞を用いた細胞融合法などにより製造することができる。
【００３３】
本発明は、デスミンの遺伝子の特定の位置の点変異が遺伝性の心筋症の原因であることを明らかにしたものであり、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」が点変異したデスミン遺伝子を用いて遺伝子異常が生じている疾患モデル動物を製造することができる。本発明の疾患モデル動物としては、ヒトを除く動物であれば特に制限はないが、マウス、ハムスター、ラット、ニワトリ、ウサギ、イヌなどの各種の動物が挙げられる。本発明の疾患モデル動物は、本発明の点変異した遺伝子を用いてＥＳ細胞や受精卵により、ジーンターゲッティング法などの遺伝子操作法により製造することもできるが、疾患モデル動物が、ハムスターである場合には、ＴＯ−２ハムスターを他の正常ハムスターと交配させて製造することもできる。
【００３４】
例えば、ＴＯ−２ハムスターとＧｏｌｄｅｎハムスターを交配させ、その子孫の耳介からゲノムＤＮＡを抽出する。これらの子孫には、ＴＯ−２に由来するδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失とデスミン遺伝子の点突然変異がありうるが、前者は本発明者らがすでに開発した方法（Sakamoto A,et al.FEBS Lett.1999,447,124-128.）で、後者は本発明で開示した方法に従い遺伝子診断を行う。そして、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子は正常ホモで、かつデスミン遺伝子は異常ホモであるオス、メスの個体を得、最終的にコンジェニックな系統を樹立する。
この新規遺伝性心筋症のモデル動物は発症が緩徐であることが予想され、デスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症のよいモデル動物として期待できる。その具体的な応用例を以下にあげる。
（ａ）デスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症に対し、その発症前から行う新しい治療法を開発するモデル動物として有用である。
（ｂ）ＴＯ−２の心室筋では、心筋変性に適応するために様々な遺伝子の発現が変動している（図２参照）。従って、ＴＯ−２及び、上記方法で創出した動物の心筋サンプルは、ディファレンシャルディスプレー（differential display）法などにより、正常心筋と発現量が異なることを指標とし、新規の機能遺伝子の単離に有用である。
（ｃ）デスミンタンパク質の脱落とＴ管の構造破綻との経時的相関関係の追跡に有用である。
【００３５】
さらに、本発明は、このような疾患モデル動物を用いて、遺伝性心筋症に対する予防、治療法又は予防、治療剤をスクリーニングする方法を提供するものである。このような疾患モデル動物は、デスミンのみに異常が生じた動物であり、そしてデスミンは横紋筋に共通するポリペプチドであり、図１０及び図１１に示されるように、デスミンはα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）との結合を介し、Ｔ管の構造の支持に重要であることから、横紋筋の異常に関する筋ジストローフィーなどの原因の解明やその予防、治療方法の開発にも有用である。
【００３６】
このように、本発明によれば、デスミンはα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）との結合を介しＴ管の構造の支持に重要であることが明らかにされ、本明細書で示した方法で得たデスミンの各ドメイン・タンパク質は、Ｔ管の構造支持を含め、デスミン分子の様々な機能解析に極めて有用である。特に未知の結合タンパク質の同定に威力を発揮することが期待される。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３８】
実施例１ （ハムスターのデスミンｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅）
ゴールデン及びＴＯ−２の各々の左心室筋より抽出した全ＲＮＡ（total RNA）から、定法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sakamoto A,et al. Proc Natl Acad
Sci USA.1997;94(25):13873-8.）。
ＰＣＲは以下の反応スケールで、ＡＢＩ９７００を用いて行った。
【００３９】
デスミンの５’側の増幅に用いたプライマーセットは、
Ｄｅｓ５Ｆ： TGC CTC CTC TGT GCG TCT GC
Ｄｅｓ５Ｒ： CGA TCA AGT TGT CGC GCT CC
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分）の３８サイクルで、４℃であった。
【００４０】
デスミンの３’側の増幅に用いたプライマーセットは、
Ｄｅｓ３Ｆ： CCA GCG TGC CCG TGT CGA CG
Ｄｅｓ３Ｒ： GGT GTG ACA TCC GAG AGT GG
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分）の３８サイクルで、４℃であった。
この結果、それぞれ、５９３ｂｐと９７３ｂｐの特異的な産物が増幅された（図１２参照）。
【００４１】
実施例２ （ＴＯ−２ハムスターにおけるデスミンの点突然変異のゲノムＰＣＲ
による検出）
ハムスターの組織（肝臓、耳介など）から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、以下の反応スケールでＡＢＩ９７００を用いてＰＣＲを行った。
【００４２】
正常アレル（５７１Ｇ）の検出に用いたプライマーセットは、
ＤｅｓＦ ： GAA AGT GCG CTT CTT GGA GC
ＤｅｓＧＲ： GTG CCC TCA CTT GGC
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６７℃、３０秒；７２℃、１分）で３５サイクルで、４℃であった。
【００４３】
異常アレル（５７１Ａ）の検出に用いたプライマーセットは、
ＤｅｓＦ ： GAA AGT GCG CTT CTT GGA GC
ＤｅｓＴＲ： CCG TGC CCT CAC TTG GT
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６７℃、３０秒；７２℃、１分）で３５サイクルで、４℃であった。
この結果、それぞれ、ゴールデンあるいはＴＯ−２に特異的な産物が増幅された（図１３参照）。
【００４４】
実施例３ （デスミンの４つの構造的ドメインに対応するｃＤＮＡの増幅と発現）
実施例１で調製したゴールデンあるいはＴＯ−２の全長デスミンｃＤＮＡを鋳型とし、以下の反応スケールでＡＢＩ９７００を用いてＰＣＲを行った。
反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；５５℃、３０秒；７２℃、１分）で３０サイクルで、４℃であった。
【００４５】
各ドメインを増幅させるために用いたプライマーセットは以下の通りである。
ヘッド（Head）部分
ＨＤ−Ｆ： GGCATATGAGTCAGGCCTACTC
ＨＤ−Ｒ： CCGAATTCTAGAACTCCTGGTTCACCG
コイル−１部分（Coil-1）
ＣＬ１−Ｆ： GGCATATGCTGGCCACGCGCACCAAC
ＣＬ１−Ｒ： CCGAATTCTAGTCCATCTCCACCTGGAC
コイル−２部分（Coil-2）
ＣＬ２−Ｆ： GGCATATGTCCAAGCCAGACCTC
ＣＬ２−Ｒ： CCGAATTCTACTCCACATCCAAGGCCATC
テイル部分（Tail）
ＴＬ−Ｆ： GGCATATGATTGCCACCTACCGCAAG
ＴＬ−Ｒ： CCGAATTCTAGAGCACCTCGTGTTG
【００４６】
下線部分は、ハムスターのデスミンのｃＤＮＡに特異的な配列である。それ以外はストップコドン（ＴＡＧ）と大腸菌の発現ベクターｐＥＴ３３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）とＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）部位に挿入するための配列である。
各発現コンストラクトで形質転換させた大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＯＤ６００＝０．８）の培養液に、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、２５℃で１時間培養した。各全溶出物（whole lysate）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後にＣＢＢで染色し、期待される分子量のタンパク質が誘導されることを確認した（図１４参照）。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は、拡張型心筋症の発症原因が心筋を形成する横紋筋のＴ管に関連するポリペプチドであるデスミンの遺伝子の点変異であることを明らかにしたものである。これによる心筋症は緩慢に発症するが、発症後はデスミン及びこれに関連するポリペプチドの脱落により致命的な疾患となる。
本発明は、このような拡張型心筋症の原因となる遺伝子の検出、同定方法を提供するものであり、遺伝性心筋症の予防、治療に有用なものである。また、本発明はこのような遺伝子を有する疾患モデル動物を提供するものであり、遺伝性心筋症の予防、治療の開発のみならず、横紋筋の異常に関連する各種疾患の原因の解明や予防、治療方法の確立の有用なものである。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの特徴を示す図面に代わる写真である。図１のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図１の（Ａ）は各ハムスターの左心室のヘマトキシリンとエオジン染色による光学顕微鏡像を示し、（Ｂ）はその水平断面像を示し、（Ｃ）はこれらのハムスターの心電図の胸部第一誘導を示す。
【図２】図２は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのＲＴ−ＰＣＲによる心肥大関連遺伝子の定量の結果を示す図面に代わる写真である。図２のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。ＰＣＲのサイクルは、各々左から４０、３５、３０、２５である。内部標準としてＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）を用いた。
【図３】図３は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのアポトーシスに関する検討を行った結果を示す図面に代わる写真である。図３のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図３の（Ａ）は心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ陽性細胞数を示し、（Ｂ）は心筋から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動を示す。
【図４】図４は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのネクローシスに関する検討を行った結果を示す図面に代わる写真である。図４のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図４の（Ａ）はマッソントリクローム染色の場合を示し、（Ｂ）はトルイジンブルー染色の場合を示す。。ＴＯ−２における矢印は炎症細胞浸潤が激しい箇所を示す。検体はいずれも、生後２６週である。
【図５】図５は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの左心室の透過型電子顕微鏡像を示す図面に代わる写真である。図５のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。ＴＯ−２の矢頭印は細くなったＺ線を示し、矢印はＴ管を示す。検体は全て、生後１４週である。
【図６】図６は、心筋症ハムスターの心臓の超音波画像診断を示す図面に代わる写真である。図６のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図６の上段は拡張期の映像であり、下段は収縮期の映像である。検体は全て、生後２６週である。
【図７】図７は、正常ハムスターと拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターの心筋筋原線維の段階的精製工程とＺ線タンパク質の挙動を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図７の（Ａ）は精製プロトコールを示し、各精製段階をＷ、Ｓ１、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３とした。（Ｂ）は各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）とイムノブロット（下段）の結果を示す。サンプルは、生後６週である。
【図８】図８は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの加齢によるＺ線タンパク質の変動を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図８のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。心筋の全ホモジネートを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）とイムノブロット（下段）を示す。
【図９】図９は、正常シリアンハムスターのデスミンｃＤＮＡの塩基配列とＴＯ−２における点突然変異を示す。翻訳されるアミノ酸を対応コドンの上部に一文字表記で記している。塩基の番号は翻訳領域だけを対象とした。全翻訳領域をカバーするデスミンｃＤＮＡは、Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲによるＲＴ−ＰＣＲ産物を、ボックスで表記した制限酵素（Ｓａｌ Ｉ）認識部位で結合して得る（図１２参照）。デスミンの４つのドメイン（図１４参照）を増幅するプライマーも明記した。ＴＯ−２のデスミンには点突然変異（Ｇ５７１Ａ）があり（図１３参照）、そのため１９１番目のアミノ酸が正常のＡ（アラニン）からＴ（スレオニン）に変わる。
【図１０】図１０は、心筋症ハムスターＴＯ−２におけるα−ジストロブレビンの特異的消失を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図１０のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。心筋の全ホモジネートを用いたイムノブロットの結果を示す。図１０の上段は、δ−サルコグリカンを示し、下段はα−ジストロブレビンを示す。
【図１１】図１１は、Ｔ管部分における筋形質膜と筋原線維の架橋モデルを模式的に示したものである。α−ジストロブレビンとデスミンとの結合は直接的なものであるかもしれないが、図１１に示されるように何らかのドッキング分子を介した間接的なものかもしれない。
【図１２】図１２は、正常ゴールデンハムスターの左心室筋から合成したｃＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマーセット（Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）でＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｍはマーカーを示す。
【図１３】図１３は、拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２におけるゲノムの塩基変異とＰＣＲによるその検出を示す図面に代わる写真である。図１３の（Ａ）は正常ゴールデンハムスターと拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２における、デスミン遺伝子の点突然変異（Ｇ５７１Ａ）周辺のゲノムの塩基配列を示す。両者で共通のものはドット（・）で表示した。大文字と小文字はそれぞれ第一エクソン、第一イントロン内の配列であることを示す。番号は図９のｃＤＮＡ配列に対応する。遺伝子診断に用いたプライマーを矢印で示した。図１３の（Ｂ）は矢印で示したプライマーセット（ＤｅｓＦ／ｄｅｓＧＲ）あるいは（ＤｅｓＦ／ＤｅｓＴＲ）を用いたゲノムＰＣＲの結果を示す図面に代わる写真である。この部位におけるアレルは、各々（Ｇ／Ｇ）、（Ｇ／Ｇ）、（Ａ／Ａ）である。
【図１４】図１４は、デスミンの分子構造と各ドメインの組み換えタンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。図１４の（Ａ）はデスミンの４個の領域を模式図で示したものであり、ＴＯ−２におけるアミノ酸変異を丸印（○）で示した。図１４の（Ｂ）はデスミンの全長及び各ドメインの組み換えタンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。各ドメインのｃＤＮＡを図９に示すプライマーセットを用いて増幅し、発現ベクターｐＥＴ３３ｂに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。各大腸菌の全溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけＣＢＢで染色したものである。目的のタンパク質に対応するバンドには＊を付した。レーン１は全長のものであり、レーン２はヘッド領域のものであり、レーン３はコイル−２領域のものであり、レーン４はテイル領域のものであり、レーン５は正常ハムスターのコイル−１領域（１９１Ａ）のものであり、レーン６は変異したコイル−１領域（１９１Ｔ）のものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子を解明したものである。本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子、変異した蛋白質、点変異部分を含むオリゴヌクレオチド、及びそれを用いた遺伝性心筋症を検出、同定する方法に関する。また、本発明は、変異したデスミン遺伝子のみを含有した疾患モデル動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心臓は全身に血液を送るための重要な臓器である。心臓のポンプとしての機能を担っているのが心筋である。心筋は不随意筋ではあるが、骨格筋と同じ横紋筋で構成されている。横紋筋は、筋原繊維におけるアクチンフィラメントとミオシンフィラメントからなる筋節（サルコメア）が暗帯（ミオシンフィラメント部分）と明帯（筋節の末端のＺ線部分）との縞模様に観察されることから命名された筋肉組織である。筋細胞は、細長い繊維状の細胞であり、その細胞質（筋形質）には多数の筋原繊維やミトコンドリアが存在し、細胞質は筋鞘と呼ばれる細胞膜で包まれている。
筋形質に存在する筋原繊維は、アクチンフィラメントとミオシンフィラメントからなる筋節（サルコメア）からなり、各筋節の間には細い横線状のＺ線がある。Ｚ線部分には、筋形質膜表面に伝わった電気的興奮を深部の筋原線維に瞬時に伝搬する機能を有するＴ管が存在する。筋細胞に伝達された電気的興奮はＴ管を経由して筋節に伝達され、筋収縮が起こることになる。
【０００３】
心筋はこのような筋細胞（心筋細胞）の網でできており、心臓をらせん状にとりまいており、自律的な収縮を繰り返して血液を全身に送っている。心臓の負荷が長期間継続すると、心筋は細胞分裂により心筋組織を大きくするのではなく、心筋細胞自体の長さや太さが増加する。これを心筋の肥大という。心筋が肥大しても、心筋細胞に酸素や栄養を供給する冠状動脈などがそれに見合って発達することは無く、心筋の肥大により心筋細胞に対する充分な血液の供給ができなくなる。一般に、心臓の重量が５００ｇを越えるとこのような現象が起こることになる。
心筋症は、心筋の異常による疾患であり、生命維持に必須な心臓には自発再生能がなく、その進行性変性疾患である心筋症は極めて重篤である。心筋症は、拡張型心筋症（うっ血性心筋症）や肥大型心筋症のような原発性心筋症と感染性心筋症のような二次性心筋症に分類される。原発性心筋症には、心筋の肥大による肥大型心筋症と、他の要因による拡張型心筋症がある。
【０００４】
遺伝性心筋症の代表的なモデル動物である心筋症ハムスターは１９６２年に発見され、これまでに病理学、薬理学、生理学など様々な見地から研究されてきた。プロトタイプである肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（以下、Ｂと略す。）から肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（ＴＯ−２、以下、Ｔと略す。）が分離されている。
図１にこれらの心筋症ハムスターの特徴を図面に代わる写真で示す。図１の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図１の上段の（Ａ）は各ハムスターの左心室のヘマトキシリン＆エオジン（hematoxylin & eosin）染色による光学顕微鏡像を示す。Ｂ及びＴ共に壊死、線維化、石灰化が見られる。（Ａ）のバーは２００μｍを示す。図１の（Ｂ）は各ハムスターの左心室の水平断面像を示す。Ｂでは残存心筋の代償性肥大が顕著に見られるのに対し、Ｔの心室壁は極めて薄い。（Ｂ）のバーは２ｍｍを示す。図１の下段の（Ｃ）は各ハムスターの心電図の胸部第一誘導を示す。ゴールデン（Ｇ）、ＢＩＯ１４．６（Ｂ）、ＴＯ−２（Ｔ）におけるＱＲＳコンプレックス（complex）の電位はそれぞれ、０．５５±０．０６、０．９８±０．０６、０．２２±０．０６Ｖである。（Ｃ）の縦方向のバーは０．５Ｖを示し、横方向のバーは１秒を示す。
【０００５】
これらの心筋症ハムスターに共通の遺伝子異常は、ジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質の一つであるδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失であることを本発明者らが明らかにしてきた（Sakamoto A,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997,94(13873-13878）；Sakamoto A, et al. FEBS Lett. 1999, 447,124-128.）。
しかし、Ｔのハムスターには心筋の肥大は観察されず、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失のみでこれらのハムスターの心筋症の原因を論ずることはできず、Ｔのハムスターの心筋症の原因についてはさらなる解明が必要とされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（Ｂ）から分離された肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（Ｔ）の心筋症の原因を解明し、拡張型心筋症の病因を明かにし、もってその予防・治療方法を確立することを目的としている。
また、本発明は、亜系Ｔのみの心筋症の原因となる遺伝子を含有する新規疾患モデル動物を提供すること、及びこれらの動物を用いた遺伝性心筋症に対する新たな治療法（医薬品、遺伝子治療、再生医療など）の開発あるいは評価方法を提供することを目的としている。
さらに本発明は、ＴＯ−２ハムスターあるいはその亜系動物を用いて、心筋における筋原線維と筋形質膜（Ｔ管を含む）との架橋構造の解明をするための手法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子に関する。より詳細には、点変異が、ＧからＡへの変異である点変異したデスミン遺伝子に関する。
本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置を含む５〜２５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００８】
また、本発明は、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定するために、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置の点変異を検出、同定する方法に関する。より詳細には、検出、同定する方法が、ＰＣＲを用いて検出する方法、又は前記オリゴヌクレオチドを用いる方法である、点変異を検出、同定する方法に関する。
さらに、本発明は、このようなＰＣＲのためのプライマーや、デスミンの各領域を増幅するためのプライマーに関する。
本発明は、前記したプライマーや、前記してきたオリゴヌクレオチドを用いて、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置の点変異を検出、同定するための測定キットに関する。
【０００９】
また、本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミン、及びデスミンのヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチド、これらのコイル−１領域に存在する１９１番目のアミノ酸であるアラニンがスレオニンに変異しているポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドに対する抗体に関する。
さらに、本発明は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置が点変異したデスミン遺伝子のみにより遺伝子異常が生じている疾患モデル動物、より詳細には、ＴＯ−２ハムスターを他のハムスター、例えば正常ハムスターとを交配させて得られる遺伝性心筋症の疾患モデル動物、及びこの疾患モデル動物を用いて、遺伝性心筋症に対する予防、治療法又は予防、治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【００１０】
遺伝性心筋症の代表的なモデル動物である心筋症ハムスターのプロトタイプである肥大型心筋症ハムスターＢＩＯ１４．６（以下、Ｂと略す。）から肉眼的な心肥大を伴わない重症な亜系（ＴＯ−２、以下、Ｔと略す。）が分離されている。
本発明者らは、これらの心筋症ハムスターに共通の遺伝子異常は、ジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質の一つであるδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失であることを明らかにしてきた（Sakamoto A,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997,94(13873-13878）；Sakamoto A, et al. FEBS Lett. 1999, 447,124-128.）。しかし、Ｔのハムスターには心筋の肥大は観察されず、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失のみでこれらのハムスターの心筋症の原因を論ずることはできず、Ｔのハムスターの心筋症の原因についてはさらなる解明が必要とされていた。
【００１１】
心筋細胞は圧負荷や低酸素負荷に対して、細胞分裂はせずにその容積を増やすという特徴がある（代償性心肥大）。そこでまず、これに関連する遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲで検討した。この結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図２の各段は上から、内部標準であるＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）、α−骨格筋型アクチン（α−Skeletal Muscle Actin）、β−ミオシン重鎖（β−Myosin heavy chain）、ｃ−ミック（c-myc）、ｃ−Ｈ−ラス（c-H-ras）、プレプロＥＴ−１（prepro-endothelin-1）、Brain Natriuretic Peptide（ＢＮＰ）、及びＧＡＴＡ−４である。ＰＣＲのサイクルは、各々左から４０、３５、３０、２５で、バンドがより右側で検出できるほど発現量は多いことになる。測定に用いたゴールデン（Ｇ）、ＢＩＯ１４．６（Ｂ）、ＴＯ−２（Ｔ）のｃＤＮＡが等量であることは、内部標準であるＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）の増幅が同一であることから確認できる。
この結果、予想外なことにプレプロ−エンドセリン−１（prepro-endothelin-1）、Ｃ−ミック（c-myc）、β−ミオシン重鎖（β−myosin heavy chain）など心肥大に関連する遺伝子の発現はいずれもＢよりＴの方が亢進していた。
【００１２】
次に病理学的な観点から、心筋細胞のアポトーシスとネクローシスについて検討した。まず、心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ（TdT-mediated X-dUTP nick end labeling）陽性細胞数とゲノムＤＮＡのラダーリングを検討した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側の（Ａ）は心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ陽性細胞数をＧ、Ｂ及びＴのハムスターの６、１２及び２６週齢において検討した結果を示す。図３の右側の（Ｂ）は心筋から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動をＧ、Ｂ及びＴのハムスターの１２及び２６週齢において検討した結果を示す。
この結果、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数はＢ及びＴ共にやや多いが、両者の違いに有意差はなかった。また、ゲノムＤＮＡのラダーリングについてもＢＩＯ１４．６、ＴＯ−２いずれにおいても、アポトーシスに特異的な１８０塩基単位のラダーは検出されなかった。
【００１３】
ネクローシスに関する検討ではいずれも２６週齢のハムスターを用いてマッソントリクローム（Masson trichrome）染色とトルイジンブルー（Toluidine blue）染色を行った。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図４の上段の（Ａ）はマッソントリクローム（Masson trichrome）染色の場合を示し、図４の下段の（Ｂ）はトルイジンブルー（Toluidine blue）染色の場合を示す。
この結果、ＴＯ−２では、線維化（青く染色）が激しく（図４（Ａ））、炎症細胞浸潤（ａｒｒｏｗ）が激しい（図４（Ｂ））ことが分かった。
このように、Ｔでは線維化と炎症細胞浸潤が強く（図４）、心筋変性の実体はアポトーシスではなくネクローシス（壊死）であることが分かった。
【００１４】
さらに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び超音波画像診断によりこれらのハムスターの病理を観察した。透過型電子顕微鏡の観察の結果を図５に図面に代わる写真で示し、超音波画像診断の観察の結果を図６に図面に代わる写真で示す。図５の左側のＧは正常ゴールデンハムスターであり、中側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。図６の左側のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスターであり、右側のＴは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターである。
この結果、ＴＯ−２のＺ線（矢頭印）は細く、部分的に断裂し、間隔が不均一なところも見られる。また、ＴＯ−２ではＴ管（矢印）の数が少なく、Ｔの左心室筋には、（１）筋原線維の横紋に相当するＺ線は細く、部分的に分断され、（２）Ｔ管の数が少なく、（３）Ｚ線の間隔が不均一なところがある、という３つの形態異常を見出した（図５参照）。さらに、超音波画像診断により、ＢＩＯ１４．６の心室壁は同心円状に収縮するが、ＴＯ−２の心室壁は単に薄いのみでなく、心室全体としての動きに協調性がなく、心室の動きが空間的に無秩序であることも見出した（図６参照）。
【００１５】
以上のことから、Ｔの心筋ではＺ線が細く、部分的に分断されていることが観察され、ＴではＺ線の構成タンパク質に異常が存在することが示された。生後６週の左心室筋から筋原線維を抽出し、さらに図７の左側に示される精製プロトコールに従ってミオシンとアクチンを段階的に除去し、Ｚ線の構成タンパク質を濃縮した標品を調製した。そして、既知のＺ線構成タンパク質であるα−アクチニンとデスミンの存否をイムノブロット（immunoblot）で追跡した。図７の右側はＺ線の構成タンパク質を濃縮する工程における各段階での正常ゴールデンハムスター（Ｇ）とＴＯ−２（Ｔ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）及びイムノブロット（下段）の結果を示す図面に代わる写真である。即ち、心筋のホモジネート段階をＷとし、界面活性剤で可溶化した後の筋原繊維の分画をＰ１とし、他の分画をＳ１とし、Ｐ１の分画からミオシンを除去した分画をＰ２とし、さらにＰ２の分画からアクチンを除去した分画をＰ３とした。
α−アクチニンとデスミンは、生後６週のＴの全ホモジネート（whole homogenate）、筋原線維画分、ミオシン除去の筋原線維画分ではＧと変化はなかったが、アクチンの除去により共に激減した（図７参照）。Ｚ線と結合するタンパク質であるアクチンの除去は、Ｚ線を人為的に不安定化させることを意味する。従って、その結果としてα−アクチニンとデスミンが激減することは、ＴのＺ線が構造的に脆いことを示唆し、ＴＥＭの所見と一致する。心筋は死ぬまで収縮を続けそれによる機械的ストレスは加齢と共に蓄積する。そこで次に、Ｇ、Ｂ、及びＴ（６、１２、２８、及び４５週齢）の左心室の全ホモジネート（whole homogenate）におけるα−アクチニンとデスミンの加齢による変化を追跡した。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の上段はＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色の写真であり、下段はイムノブロットの写真である。その結果、Ｔでは加齢と共にデスミンは徐々に減少するがα−アクチニンの量に変化はなかった。以上から、ＴではＺ線構成タンパク質、特にデスミンが極めて不安定であることが分かった。
【００１６】
デスミンは骨格筋あるいは心筋のＺ線に位置する中間系フィラメントタンパク質（intermediate filament protein）であり、その遺伝子異常は筋ジストロフィー症を合併する心筋症の原因となることが知られている（Goebel H.H.,et al.Muscle&Nerve,18:1306-1320,1995）。そのモデル動物としてはこれまでに、デスミン遺伝子を完全に破壊させたいわゆるノックアウトマウス（knock out mouse）が独立した２つのグループによって作成されている（Milner D.J.,et al.J Cell Biol.,134:1255-1270,1996:Li Z.,et al.Dev.Biol.,175:362-366,1996）。ところで、これまでに見出されたデスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症には、デスミン遺伝子の完全欠失はなく、全て点突然変異である。この場合、デスミンタンパク質は小児期には存在するが、加齢と共に徐々にＺ線から逸脱し、結果として心筋症が発症する。それに対してデスミンのノックアウトマウスでは、デスミンタンパク質は生下時にすでに完全に欠損し、筋原線維、ミトコンドリアなど心筋あるいは骨格筋細胞内の微細構造の破綻ならびに心筋症は速やかに起こる。そのため、デスミン遺伝子の異常による心筋細胞崩壊の経時的変化の追跡が難しく、また、発症前から予防的に行う心筋症の新規治療法の開発には不向きであるという問題点があった。
シリアンハムスターのデスミン遺伝子並びにｃＤＮＡ自体はすでに単離され（Quax W.,et.al. Cell.1985;43(1):327-38.）、その遺伝子発現調節やタンパク質複合体形成に関する研究に用いられてきた。しかし、遺伝性心筋症ハムスターの原因及び発症機構における意義という観点で研究に用いられたことはない。
【００１７】
すでに公表されたシリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの塩基配列を基に、翻訳領域全体をＲＴ−ＰＣＲで増幅するプライマーセットと反応条件を見出した（図９に示されるＤｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）。そして、ＧとＴのデスミンｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定した。Ｇのデスミン遺伝子の翻訳領域（open reading frame）は、１４０７塩基で、４６９残基のアミノ酸からなる分子量５３，４４５のポリペプチドをコードすると考えられた。アミノ酸配列のコンピューター解析（Lupas,A.,Van Dyke,M.,and Stock,J.(1991)."Predicting Coled Coils from Protein Sequences" Science 252:1162-1164. http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）の結果、デスミンはコイルド−コイル（coiled-coil）構造をしたタンパク質であり、アミノ末端のヘッド（ｈｅａｄ）部分、中央の二つのコイル（ｃｏｉｌ）部分、そしてカルボキシル末端のテイル（ｔａｉｌ）部分からなることが予測された（図１４の（Ａ）参照）。
【００１８】
図９は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの塩基配列を示す。翻訳されるアミノ酸を対応コドンの上部に一文字表記で記した。塩基の番号は翻訳領域だけを対象とした。全翻訳領域をカバーするデスミンｃＤＮＡは、図９中のＤｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲによるＲＴ−ＰＣＲ産物を、ボックスで表記した制限酵素（Ｓａｌ Ｉ）の認識部位で結合して得ることができる（図１２参照）。デスミンの４つのドメイン（図１４参照）を増幅するためのプライマーも矢印で明記した。
図１２は、ゴールデンハムスターの左心室筋から合成したｃＤＮＡを鋳型とし、図９に示される２種類のプライマーセット（Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）でＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｍはマーカーである。この結果、Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲでＰＣＲを行った場合には５９３ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｄｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲでＰＣＲを行った場合には９７３ｂｐのＰＣＲ産物が得られることがわかる。
【００１９】
そして、ＴのハムスターのデスミンのｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定した結果、Ｔでは、ｃｏｉｌ−１内に位置し、既知の全ての種で保存される１９１番目のアラニンをスレオニンに変える点変異（point mutation（Ｇ５７１Ａ））が存在することがわかった。ＢＩＯ１４．６ハムスターはこの塩基変異はなく、ＴＯ−２における第二の遺伝子異常は、Ｚ線を構成するデスミン遺伝子のミスセンス変異（missense mutation）であると考えられた。
図１３は、拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２におけるゲノムの塩基変異とＰＣＲによるその検出を示したものである。図１３の（Ａ）は、ゴールデンとＴＯ−２ハムスターにおける、デスミン遺伝子の点突然変異（Ｇ５７１Ａ）周辺のゲノムの塩基配列を示したものである。両者で共通のものはドット（・）で表示したある。大文字と小文字は、それぞれ第一エクソン、第一イントロン内の塩基配列であることを示す。番号は図９のｃＤＮＡ配列に対応する。遺伝子診断に用いたプライマーの例を矢印で示した。図１３の（Ｂ）は、プライマーセット（ＤｅｓＦ／ｄｅｓＧＲ）あるいは（ＤｅｓＦ／ＤｅｓＴＲ）を用いたゲノムのＰＣＲの結果を示す図面に代わる写真である。それぞれ、デスミンの５７１番目の塩基がＧあるいはＡに特異的なバンドを増幅することがわかる。ゴールデン、ＢＩＯ１４．６、ＴＯ−２におけるこのアレルは、（Ｇ／Ｇ）、（Ｇ／Ｇ）、（Ａ／Ａ）であることもわかった。
【００２０】
デスミンの分子構造と各ドメインの組み換えタンパク質の発現の結果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の（Ａ）は、デスミンの分子構造を模式的に示したものであり、ＴＯ−２におけるアミノ酸変異（図１４（Ａ）の○印）は、コイル−１（Ｃｏｉｌ−１）内に位置する。図１４の（Ｂ）は、デスミンの全長及び各ドメインの組み換えタンパク質である。各ドメインのｃＤＮＡを図１のプライマーセットを用いて増幅し、発現ベクターｐＥＴ３３ｂに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた結果を示す図面に代わる写真である。図は、各大腸菌の全溶出物（whole lysate）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけＣＢＢで染色したものである。目的のタンパク質に対応するバンドには星印（＊）を付した。レーン１は全長のものであり、レーン２はヘッド（head）部分のものであり、レーン３はコイル−２（Coli-2）のものであり、レーン４はテイル（Tail）部分のものであり、レーン５は正常なコイル−１（normal coil-1）（１９１Ａ）のものであり、レーン６は変異コイル−１（mutant coil-1（１９１Ｔ））のものである。
【００２１】
ＴＯ−２のデスミンには点突然変異（Ｇ５７１Ａ）があり（図１３参照）、そのため１９１番目のアミノ酸が正常のＡ（アラニン）からＴ（スレオニン）に変わったものである。この点変異したＴＯ−２のデスミンの塩基配列を配列表の配列番号１に示し、その翻訳領域の対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
次に、デスミンの機能を調べるために、心筋の筋形質膜と筋原線維の架橋構造を検討した。
本発明者らは、正常ハムスター（Ｇ）の心筋ではジストロフィン（dystrophin）結合タンパク質であるα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）は、心筋のＴ管にも存在するが、４５週のＴではほとんど存在しないことを、単離心筋細胞の免疫染色により初めて見い出した。心筋の全ホモジネート（whole homogenate）を用いたイムノブロット（immunoblot）の結果を図１０に図面に代わる写真で示す。α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）の消失は、心筋症ハムスターの共通原因遺伝子δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）の欠失に依存せず、デスミンの消失した４５週のＴＯ−２に特異的であった。
これらの結果とＴではＴ管がほとんど存在しないという透過型電顕の所見と考え合わせると、心筋の筋形質膜と筋原線維は、Ｔ管上のα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とＺ線上のデスミンとが直接あるいは間接的に結合することで架橋されていることが推測される。この構造を模式的にして図１１に示す。図１１はこれらの結果から予想される筋形質膜と筋原線維の架橋モデルを示しており、α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とデスミンを介した心筋形質膜と筋原線維との架橋構造は、筋形質膜の電気的興奮を筋原線維に伝搬させる一方、筋原線維の張力を筋形質膜に伝達させる働きがあると考えられる。α−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）とデスミンとの結合が、直接的なものか何らかの分子（docking molecule）を介した間接的なものかは、現時点では不明であるが、これらの分子が相互に作用するものであることが明らかにされた。
そして、Ｔでは、心筋細胞（透過型電顕像、図５）さらには心臓全体（超音波画像診断、図６）の収縮が空間的に不均一であるが、そのことは、デスミン遺伝子の異常によりＴ管の構造的異常が引き起こされ、筋形質膜から筋原線維への電気的興奮の伝搬が不均一になることで容易に理解できる。
【００２３】
以上のように、本発明によりＴＯ−２に存在する心筋症の第二原因遺伝子が解明された。さらに、Ｔ管と筋原線維との架橋の支持体としての、デスミンの機能的意義の発見は本発明が世界で初である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、遺伝性心筋症の原因のひとつが心筋のＴ管に関連するデスミンの遺伝子の点変異であることを見出したものである。本発明の点変異の位置は、シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置であり、この位置がデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域のどの位置になるかは動物によって異なることがあり、必ずしも５７１番目ということではない。例えば、ヒトのデスミンにおいてこの位置がデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の何番目に相当するかということは、アミノ酸配列の相同性やペプチドの立体配置などを考慮して決定されることである。したがって、本発明における「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」とは、デスミンのペプチドとしての機能における同様な機能を果たす位置に相当することを意味しており、動物の種類に応じてデスミンのアミノ酸配列の相同性やペプチドの立体配置などにより決定されるいる位置を意味している。
【００２５】
シリアンハムスターにおいては、当該点変異はＧからＡへの変異であることを本発明は明らかにしてきたが、本発明はＧからＡへの変異に限定されるものではなく、本発明において重要なことはその位置の点変異により心筋症が発症してくるということであり、動物の種類による遺伝子の各種の変異を本発明は包含するものである。
シリアンハムスターにおける具体例においては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列が示される。この配列表においては、翻訳開始の塩基が８２番目であるから、点変異の位置は６５２番目に示されている。本来のデスミンは、６５２番目から６５４番目までの塩基配列が「ｇｃｃ」でアラニンをコードするものであるが、本発明の遺伝子は「ａｃｃ」に点変異してスレオニンをコードする配列となっている。
【００２６】
本発明は、このようなデスミンの遺伝子の点変異により遺伝性心筋症が発症することを明らかにするものであり、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」の点変異を検出、同定することにより、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定することができる。被検体としては、ヒト、ハムスター、ラットなどの動物のゲノムを使用することができる。
本発明の検出、同定する方法としては、通常の各種の遺伝子の検出、同定手段を使用することができる。例えば、点変異の前後の塩基配列を利用したＰＣＲ法などにより、点変異を含む部分の遺伝子を増幅させて、増幅の有無や増幅された遺伝子の解析により点変異の有無を検出、同定することができる。ＰＣＲ法における好ましいプライマーとしては、配列番号９に記載の塩基配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号１０に記載の塩基配列を有するリバースプライマー、又は配列番号１１に記載の塩基配列を有するリバースプライマー若しくは配列番号１２に記載の塩基配列を有するリバースプライマーとの組み合わせが挙げられる。
また、点変異を含む部分のオリゴヌクレオチドを固定化させたＤＮＡチップを用いて、ゲノムのＳＮＰを検出、同定する方法と同様な手法により本発明の点変異を検出、同定することもできる。
【００２７】
本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」を含む５〜２５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の点変異を検出、同定などに使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの長さとしては、検出、同定に必要な充分な長さがあればよく、例えば５〜２５０塩基、５〜１５０塩基、５〜５０塩基、５〜３０塩基、５〜２０塩基、又は。７〜２５０塩基、７〜１５０塩基、７〜５０塩基、７〜３０塩基、７〜２０塩基、さらには１０〜２５０塩基、１０〜１５０塩基、１０〜５０塩基、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基程度の各種の長さでその目的に応じて使用することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーやプローブとして使用することができ、プローブとしては標識化して使用することや、ＤＮＡチップのように担体に固定されて使用することができる。
【００２８】
さらに、本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」の点変異を検出、同定するための測定キットを提供するものである。このような測定キットとしては通常の遺伝子の検出、同定に使用されるキットを使用することができる。例えば、ＰＣＲ法などによる増幅により検出、同定しようとする場合には、増幅のためのプライマーセット、増幅処理に必要な試薬類、増幅産物を検出、同定するための試薬類などから測定キットとなる。また、ＤＮＡチップなどの場合には、点変異を検出、同定するためのオリゴヌクレオチドが固定化されたＤＮＡチップ、それを処理するための試薬類などからなる測定キットが挙げられる。
本発明の測定キットにより、遺伝性心筋症の原因となる遺伝子であるかどうかを判定することができる。
【００２９】
本発明は、デスミン遺伝子の各領域を増幅するためのプライマーを提供する。デスミンは図１４に示されるように、ヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチドであり、この各領域の１つ又は連続した２個以上の領域を増幅するためのプライマーセットを提供するものである。より詳細には、図９に示されるように、ヘッド領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＨＤ−Ｆ（配列表の配列番号１３）をリバースプライマーとしてＨＤ−Ｒ（配列表の配列番号１４）を使用することができ、コイル−１領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＣＬ１−Ｆ（配列表の配列番号１５）をリバースプライマーとしてＣＬ１−Ｒ（配列表の配列番号１６）を使用することができ、コイル−２領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＣＬ２−Ｆ（配列表の配列番号１７）をリバースプライマーとしてＣＬ２−Ｒ（配列表の配列番号１８）を使用することができ、又はテイル領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＴＬ−Ｆ（配列表の配列番号１９）をリバースプライマーとしてＴＬ−Ｒ（配列表の配列番号２０）を使用することができる。また、これらのプライマーを適宜組み合わせることにより、２つ以上の連続した領域を同時に増幅することもできる。
【００３０】
また、デスミンの５’端領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓ５Ｆ（配列表の配列番号５）をリバースプライマーとしてＤｅｓ５Ｒ（配列表の配列番号６）を使用することができ、デスミンの３’端領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓ３Ｆ（配列表の配列番号７）をリバースプライマーとしてＤｅｓ３Ｒ（配列表の配列番号８）を使用することができる。
さらに、点変異を含む領域を増幅すためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓＦ（配列表の配列番号９）をリバースプライマーとしてＤｅｓＧＲ（配列表の配列番号１０）を使用することができ、点変異体を特異的に増幅させるためのプライマーセットとしてはフォーワードプライマーとしてＤｅｓＦ（配列表の配列番号９）をリバースプライマーとしてＤｅｓＴＲ（配列表の配列番号１２）又はより短いＤｅｓＴＲ（配列表の配列番号１１）を使用することができる。
本発明は、これらのプライマーセットを提供するものである。
【００３１】
本発明は、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」が点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンを提供するものであり、本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンとしては、ハムスター、ヒト、ラットなどの動物から得られるポリペプチドが挙げられる。本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンは、心筋などの横紋筋における構造解析や機能解析に有用であるばかりでなく、Ｔ管における神経伝達機構の解明などにも有用なポリペプチドである。本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンの具体例としては、配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。このアミノ酸配列は本発明のポリペプチドのひとつの例示であり、このアミノ酸配列のみに限定されるものではなく、同様な機能を有するものであれば一部のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、又は他のアミノ酸がさらに付加されたものであってもよい。言い換えれば、本発明の点変異したデスミン遺伝子がコードしてなるデスミンとは、点変異を起こしたアミノ酸が存在するデスミンの機能を有するポリペプチドであるということもできる。
【００３２】
また、本発明は、図１４に示されるように、デスミンのヘッド領域、コイル−１領域、コイル−２領域、又はテイル領域からなるポリペプチドを提供するものである。デスミンのコイル−１領域は、本発明の点変異を含むものであり、本発明は、コイル−１領域のひとつのアラニンがスレオニンに変異しているデスミンのコイル−１領域からなるポリペプチドを提供するものである。
さらに、本発明は、これらの本発明のポリペプチドに対する抗体を提供するものである。本発明の抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、本発明の前記したポリペプチドを用いて通常の抗体の製造方法、例えば免疫感作させたラットやウサギなどの動物の細胞を用いた細胞融合法などにより製造することができる。
【００３３】
本発明は、デスミンの遺伝子の特定の位置の点変異が遺伝性の心筋症の原因であることを明らかにしたものであり、「シリアンハムスターのデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目に相当する位置」が点変異したデスミン遺伝子を用いて遺伝子異常が生じている疾患モデル動物を製造することができる。本発明の疾患モデル動物としては、ヒトを除く動物であれば特に制限はないが、マウス、ハムスター、ラット、ニワトリ、ウサギ、イヌなどの各種の動物が挙げられる。本発明の疾患モデル動物は、本発明の点変異した遺伝子を用いてＥＳ細胞や受精卵により、ジーンターゲッティング法などの遺伝子操作法により製造することもできるが、疾患モデル動物が、ハムスターである場合には、ＴＯ−２ハムスターを他の正常ハムスターと交配させて製造することもできる。
【００３４】
例えば、ＴＯ−２ハムスターとＧｏｌｄｅｎハムスターを交配させ、その子孫の耳介からゲノムＤＮＡを抽出する。これらの子孫には、ＴＯ−２に由来するδ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子の欠失とデスミン遺伝子の点突然変異がありうるが、前者は本発明者らがすでに開発した方法（Sakamoto A,et al.FEBS Lett.1999,447,124-128.）で、後者は本発明で開示した方法に従い遺伝子診断を行う。そして、δ−サルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子は正常ホモで、かつデスミン遺伝子は異常ホモであるオス、メスの個体を得、最終的にコンジェニックな系統を樹立する。
この新規遺伝性心筋症のモデル動物は発症が緩徐であることが予想され、デスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症のよいモデル動物として期待できる。その具体的な応用例を以下にあげる。
（ａ）デスミン遺伝子の異常によるヒト心筋症に対し、その発症前から行う新しい治療法を開発するモデル動物として有用である。
（ｂ）ＴＯ−２の心室筋では、心筋変性に適応するために様々な遺伝子の発現が変動している（図２参照）。従って、ＴＯ−２及び、上記方法で創出した動物の心筋サンプルは、ディファレンシャルディスプレー（differential display）法などにより、正常心筋と発現量が異なることを指標とし、新規の機能遺伝子の単離に有用である。
（ｃ）デスミンタンパク質の脱落とＴ管の構造破綻との経時的相関関係の追跡に有用である。
【００３５】
さらに、本発明は、このような疾患モデル動物を用いて、遺伝性心筋症に対する予防、治療法又は予防、治療剤をスクリーニングする方法を提供するものである。このような疾患モデル動物は、デスミンのみに異常が生じた動物であり、そしてデスミンは横紋筋に共通するポリペプチドであり、図１０及び図１１に示されるように、デスミンはα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）との結合を介し、Ｔ管の構造の支持に重要であることから、横紋筋の異常に関する筋ジストローフィーなどの原因の解明やその予防、治療方法の開発にも有用である。
【００３６】
このように、本発明によれば、デスミンはα−ジストロブレビン（α−dystrobrevin）との結合を介しＴ管の構造の支持に重要であることが明らかにされ、本明細書で示した方法で得たデスミンの各ドメイン・タンパク質は、Ｔ管の構造支持を含め、デスミン分子の様々な機能解析に極めて有用である。特に未知の結合タンパク質の同定に威力を発揮することが期待される。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３８】
実施例１ （ハムスターのデスミンｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅）
ゴールデン及びＴＯ−２の各々の左心室筋より抽出した全ＲＮＡ（total RNA）から、定法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sakamoto A,et al. Proc Natl Acad
Sci USA.1997;94(25):13873-8.）。
ＰＣＲは以下の反応スケールで、ＡＢＩ９７００を用いて行った。
デスミンの５’側の増幅に用いたプライマーセットは、
Ｄｅｓ５Ｆ： TGC CTC CTC TGT GCG TCT GC
Ｄｅｓ５Ｒ： CGA TCA AGT TGT CGC GCT CC
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分）の３８サイクルで、４℃であった。
【００４０】
デスミンの３’側の増幅に用いたプライマーセットは、
Ｄｅｓ３Ｆ： CCA GCG TGC CCG TGT CGA CG
Ｄｅｓ３Ｒ： GGT GTG ACA TCC GAG AGT GG
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分）の３８サイクルで、４℃であった。
この結果、それぞれ、５９３ｂｐと９７３ｂｐの特異的な産物が増幅された（図１２参照）。
【００４１】
実施例２ （ＴＯ−２ハムスターにおけるデスミンの点突然変異のゲノムＰＣＲ
による検出）
ハムスターの組織（肝臓、耳介など）から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、以下の反応スケールでＡＢＩ９７００を用いてＰＣＲを行った。
正常アレル（５７１Ｇ）の検出に用いたプライマーセットは、
ＤｅｓＦ ： GAA AGT GCG CTT CTT GGA GC
ＤｅｓＧＲ： GTG CCC TCA CTT GGC
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６７℃、３０秒；７２℃、１分）で３５サイクルで、４℃であった。
【００４３】
異常アレル（５７１Ａ）の検出に用いたプライマーセットは、
ＤｅｓＦ ： GAA AGT GCG CTT CTT GGA GC
ＤｅｓＴＲ： CCG TGC CCT CAC TTG GT
であり、反応条件は、９４℃、２分；（９４℃、２０秒；６７℃、３０秒；７２℃、１分）で３５サイクルで、４℃であった。
この結果、それぞれ、ゴールデンあるいはＴＯ−２に特異的な産物が増幅された（図１３参照）。
【００４４】
実施例３ （デスミンの４つの構造的ドメインに対応するｃＤＮＡの増幅と発現）
実施例１で調製したゴールデンあるいはＴＯ−２の全長デスミンｃＤＮＡを鋳型とし、以下の反応スケールでＡＢＩ９７００を用いてＰＣＲを行った。
【００４５】
各ドメインを増幅させるために用いたプライマーセットは以下の通りである。
ヘッド（Head）部分
ＨＤ−Ｆ： GGCATATGAGTCAGGCCTACTC
ＨＤ−Ｒ： CCGAATTCTAGAACTCCTGGTTCACCG
コイル−１部分（Coil-1）
ＣＬ１−Ｆ： GGCATATGCTGGCCACGCGCACCAAC
ＣＬ１−Ｒ： CCGAATTCTAGTCCATCTCCACCTGGAC
コイル−２部分（Coil-2）
ＣＬ２−Ｆ： GGCATATGTCCAAGCCAGACCTC
ＣＬ２−Ｒ： CCGAATTCTACTCCACATCCAAGGCCATC
テイル部分（Tail）
ＴＬ−Ｆ： GGCATATGATTGCCACCTACCGCAAG
ＴＬ−Ｒ： CCGAATTCTAGAGCACCTCGTGTTG
【００４６】
下線部分は、ハムスターのデスミンのｃＤＮＡに特異的な配列である。それ以外はストップコドン（ＴＡＧ）と大腸菌の発現ベクターｐＥＴ３３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）とＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）部位に挿入するための配列である。
各発現コンストラクトで形質転換させた大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＯＤ６００＝０．８）の培養液に、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、２５℃で１時間培養した。各全溶出物（whole lysate）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後にＣＢＢで染色し、期待される分子量のタンパク質が誘導されることを確認した（図１４参照）。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は、拡張型心筋症の発症原因が心筋を形成する横紋筋のＴ管に関連するポリペプチドであるデスミンの遺伝子の点変異であることを明らかにしたものである。これによる心筋症は緩慢に発症するが、発症後はデスミン及びこれに関連するポリペプチドの脱落により致命的な疾患となる。
本発明は、このような拡張型心筋症の原因となる遺伝子の検出、同定方法を提供するものであり、遺伝性心筋症の予防、治療に有用なものである。また、本発明はこのような遺伝子を有する疾患モデル動物を提供するものであり、遺伝性心筋症の予防、治療の開発のみならず、横紋筋の異常に関連する各種疾患の原因の解明や予防、治療方法の確立の有用なものである。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの特徴を示す図面に代わる写真である。図１のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図１の（Ａ）は各ハムスターの左心室のヘマトキシリンとエオジン染色による光学顕微鏡像を示し、（Ｂ）はその水平断面像を示し、（Ｃ）はこれらのハムスターの心電図の胸部第一誘導を示す。
【図２】図２は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのＲＴ−ＰＣＲによる心肥大関連遺伝子の定量の結果を示す図面に代わる写真である。図２のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。ＰＣＲのサイクルは、各々左から４０、３５、３０、２５である。内部標準としてＧＡＰＤＨ（Glyceraldyde 3-Phosphate Dehydrogenase）を用いた。
【図３】図３は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのアポトーシスに関する検討を行った結果を示す図面に代わる写真である。図３のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図３の（Ａ）は心臓正中断面でのＴＵＮＥＬ陽性細胞数を示し、（Ｂ）は心筋から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動を示す。
【図４】図４は、正常ハムスターと心筋症ハムスターのネクローシスに関する検討を行った結果を示す図面に代わる写真である。図４のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図４の（Ａ）はマッソントリクローム染色の場合を示し、（Ｂ）はトルイジンブルー染色の場合を示す。。ＴＯ−２における矢印は炎症細胞浸潤が激しい箇所を示す。検体はいずれも、生後２６週である。
【図５】図５は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの左心室の透過型電子顕微鏡像を示す図面に代わる写真である。図５のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。ＴＯ−２の矢頭印は細くなったＺ線を示し、矢印はＴ管を示す。検体は全て、生後１４週である。
【図６】図６は、心筋症ハムスターの心臓の超音波画像診断を示す図面に代わる写真である。図６のＢは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図６の上段は拡張期の映像であり、下段は収縮期の映像である。検体は全て、生後２６週である。
【図７】図７は、正常ハムスターと拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターの心筋筋原線維の段階的精製工程とＺ線タンパク質の挙動を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。図７の（Ａ）は精製プロトコールを示し、各精製段階をＷ、Ｓ１、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３とした。（Ｂ）は各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）とイムノブロット（下段）の結果を示す。サンプルは、生後６週である。
【図８】図８は、正常ハムスターと心筋症ハムスターの加齢によるＺ線タンパク質の変動を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図８のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。心筋の全ホモジネートを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色（上段）とイムノブロット（下段）を示す。
【図９】図９は、正常シリアンハムスターのデスミンｃＤＮＡの塩基配列とＴＯ−２における点突然変異を示す。翻訳されるアミノ酸を対応コドンの上部に一文字表記で記している。塩基の番号は翻訳領域だけを対象とした。全翻訳領域をカバーするデスミンｃＤＮＡは、Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３ＲによるＲＴ−ＰＣＲ産物を、ボックスで表記した制限酵素（Ｓａｌ Ｉ）認識部位で結合して得る（図１２参照）。デスミンの４つのドメイン（図１４参照）を増幅するプライマーも明記した。ＴＯ−２のデスミンには点突然変異（Ｇ５７１Ａ）があり（図１３参照）、そのため１９１番目のアミノ酸が正常のＡ（アラニン）からＴ（スレオニン）に変わる。
【図１０】図１０は、心筋症ハムスターＴＯ−２におけるα−ジストロブレビンの特異的消失を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図１０のＧは正常ゴールデンハムスター、Ｂは肥大型心筋症ＢＩＯ１４．６ハムスター、Ｔは拡張型心筋症ＴＯ−２ハムスターを示す。心筋の全ホモジネートを用いたイムノブロットの結果を示す。図１０の上段は、δ−サルコグリカンを示し、下段はα−ジストロブレビンを示す。
【図１１】図１１は、Ｔ管部分における筋形質膜と筋原線維の架橋モデルを模式的に示したものである。α−ジストロブレビンとデスミンとの結合は直接的なものであるかもしれないが、図１１に示されるように何らかのドッキング分子を介した間接的なものかもしれない。
【図１２】図１２は、正常ゴールデンハムスターの左心室筋から合成したｃＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマーセット（Ｄｅｓ５Ｆ／Ｄｅｓ５ＲとＤｅｓ３Ｆ／Ｄｅｓ３Ｒ）でＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。Ｍはマーカーを示す。
【図１３】図１３は、拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２におけるゲノムの塩基変異とＰＣＲによるその検出を示す図面に代わる写真である。図１３の（Ａ）は正常ゴールデンハムスターと拡張型心筋症ハムスターＴＯ−２における、デスミン遺伝子の点突然変異（Ｇ５７１Ａ）周辺のゲノムの塩基配列を示す。両者で共通のものはドット（・）で表示した。大文字と小文字はそれぞれ第一エクソン、第一イントロン内の配列であることを示す。番号は図９のｃＤＮＡ配列に対応する。遺伝子診断に用いたプライマーを矢印で示した。図１３の（Ｂ）は矢印で示したプライマーセット（ＤｅｓＦ／ｄｅｓＧＲ）あるいは（ＤｅｓＦ／ＤｅｓＴＲ）を用いたゲノムＰＣＲの結果を示す図面に代わる写真である。この部位におけるアレルは、各々（Ｇ／Ｇ）、（Ｇ／Ｇ）、（Ａ／Ａ）である。
【図１４】図１４は、デスミンの分子構造と各ドメインの組み換えタンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。図１４の（Ａ）はデスミンの４個の領域を模式図で示したものであり、ＴＯ−２におけるアミノ酸変異を丸印（○）で示した。図１４の（Ｂ）はデスミンの全長及び各ドメインの組み換えタンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。各ドメインのｃＤＮＡを図９に示すプライマーセットを用いて増幅し、発現ベクターｐＥＴ３３ｂに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。各大腸菌の全溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけＣＢＢで染色したものである。目的のタンパク質に対応するバンドには＊を付した。レーン１は全長のものであり、レーン２はヘッド領域のものであり、レーン３はコイル−２領域のものであり、レーン４はテイル領域のものであり、レーン５は正常ハムスターのコイル−１領域（１９１Ａ）のものであり、レーン６は変異したコイル−１領域（１９１Ｔ）のものである。
Claims (10)
- 拡張型心筋症ハムスター由来のデスミン遺伝子であって、配列表の配列番号１に記載のデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目が、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に点変異したデスミン遺伝子。
- 心筋症モデルハムスターにおいて、配列表の配列番号１に記載のデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目におけるグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への点変異を検出、同定する方法であって、当該方法が、前記変異遺伝子が心筋症モデルハムスターの心筋症の原因遺伝子であるかどうかを判定するための方法である、点変異を検出、同定する方法。
- 検出、同定する方法が、ＰＣＲを用いて検出、同定する方法である請求項２に記載の方法。
- プライマーが、点変異の塩基を含むものである請求項３に記載の方法。
- プライマーが、配列番号９に記載の塩基配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号１０に記載の塩基配列からなるリバースプライマー、又は配列番号１１に記載の塩基配列からなるリバースプライマー若しくは配列番号１２に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる請求項３又は４に記載の方法。
- 心筋症モデルハムスターにおいて、請求項５に記載のプライマーを用いて、配列表の配列番号１に記載のデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目におけるグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への点変異を検出、同定するための測定キットであって、当該キットが、前記変異遺伝子が心筋症モデルハムスターの心筋症の原因遺伝子であるかどうかを判定するためのキットである、測定キット。
- 拡張型心筋症ハムスター由来のデスミンであって、配列表の配列番号１に記載のデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目におけるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に点変異したデスミン遺伝子がコードしてなる配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるデスミン。
- 配列表の配列番号１に記載のデスミンのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列の５７１番目におけるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に点変異したデスミン遺伝子のみにより遺伝子異常が生じている、拡張型心筋症モデルハムスター。
- ＴＯ−２ハムスターを他のハムスターと交配させて得られる請求項８に記載の拡張型心筋症モデルハムスター。
- 請求項８又は９に記載の拡張型心筋症モデルハムスターを用いて、遺伝性拡張型心筋症に対する予防、治療剤をスクリーニングする方法。
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