JP4135984B2

JP4135984B2 - 医薬製剤

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Publication number: JP4135984B2
Application number: JP52336798A
Authority: JP
Inventors: ドガディナ、アルビナ・ウラディミロウナ; ゴーレビッチ、イゴル・エウゲニェビッチ; イオニネ、ボリス・イオシフォビッチ
Original assignee: アイティーシー・リサーチ・リミテッド
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: EP0942915A1; WO1998022479A1; EP0942915B1; AU5062098A; JP2001506594A; US6184214B1; DK0942915T3; GB9624188D0; DE69738793D1; AU737679B2; ATE399173T1; ES2309994T3

Description

本発明は、ポスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のある種のアミド誘導体、特に、細胞への虚血性損傷を予防するために特に使用されるアミド誘導体、ならびに、ある種のアミド誘導体およびＰＥＰの合成方法に関する。
体の器官への血流が局所要求に対して不充分であり、従って得られる酸素供給が大幅に減少する場合に、虚血性傷害（insult）が結果として起こる。これは、結果的に細胞への虚血性損傷を招き、虚血が長時間にわたる場合には、最終的に器官の死を招く。虚血は通常、心臓に供給する動脈のような血管の疾患の結果であるが、冠状動脈バイパス接合（grafting）または弁交換（valve replacements）および移植手術、一般に心臓移植手術を含む心臓手術の間にも誘発される。
ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、酵素ピルビン酸キナーゼによって触媒されて、アデノシンニ燐酸（ＡＰ）と結合して、ピルビン酸およびアデノシン−５’−三燐酸（ＡＴＰ）を生成する解糖基質である。それは、補助因子としてＭｇ⁺⁺を、生理学的活性化物質としてアルカリ金属カチオン（例えば、Ｋ＋）を必要とする細胞内条件下で不可逆性の発エルゴン反応である。その酵素は、フルクトース１，６−ビス燐酸またはＰＥＰのような解糖中間体の増加によって、または低ＡＴＰ濃度によって活性化され、高ＡＴＰ濃度によって、あるいは脂肪酸またはアセチルＣｏＡのような好気的代謝物が利用可能な（available）場合に、阻害される。
ＷＯ８３／０２３９１号は、ＰＥＰの水溶性塩およびＡＴＰの水溶性塩を含んで成る、虚血性細胞損傷を予防し治療するための、非経口投与の医薬組成物を開示している。ＰＥＰ／ＡＴＰ組成物の適用範囲は、心臓切開手術または他の器官移植に使用される灌流液および保存液、ならびに心不全、溺れ（drowning）または薬剤過量摂取の結果としての脳虚血および心臓損傷の治療である。
同発明者らによる、ＰＥＰ／ＡＴＰ組成物に関して記載している他の化学公表物は、Eur.Surg.Res.15：200〜207（1983）；Thorac.Cardiovasc.Surgeon 34：104〜109（1986）；および、Scand.J.Thor.Cardiovasc.Surg.21：245〜249（1987）である。これらの文献において、心臓麻痺液におけるＰＥＰおよびＡＴＰの組み合わせが、ＰＥＰ単独より優れた、虚血後の機能回復を示すが（ラット心臓）、ＡＴＰ単独より優れていないことが記載されている。J.Reconstructive Microsurgery第11巻、No.6（1995年11月）において、ＰＥＰ／ＡＴＰ注入液（infusion）が、ウサギ骨格筋における虚血−再灌流損傷を減少させることが記載されている。他の研究（British J.Plastic Surgery；42：675〜680（1989））においては、ＰＥＰおよびＡＴＰまたはラジカルスカベンジャーの組成物が、不全虚血皮膚弁（failing ischaemic skin flaps）の臨床的治療に有効であることが見い出された。
ＰＥＰは、他の範囲においても適用できることが示唆されている。従って、肉体的または精神的疲労の治療（ＦＲ−Ａ−３２６４）、抗結石剤（ＵＳ−Ａ−４８２６６７５）、皮膚製剤における美容剤、抗腫瘍剤、および保存血液の有効性を高める薬剤（ＥＰ−Ａ−２７５１９８）に有効である。
Biochemistry、第１１巻、Ｎｏ．３（１９７２）、３３８〜３４５頁において、ＰＥＰの種々の誘導体が合成され、ピルビン酸キナーゼまたはエノラーゼの潜在的な基質として試験された。試験された誘導体の中に、α−（ジヒドロキシホスフィニルオキシ）アクリルアミドのジシクロヘキシルアンモニウム（ＣＨＡ）塩、即ち、ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂］−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂：２ＣＨＡが含まれるが、この塩は、ピルビン酸キナーゼの偽性基質ではなく、（試験された）ピルビン酸キナーゼ反応においてホスホエノールピルビン酸に対して良好な競合阻害剤でもないことが見い出された。前記ジシクロヘキシルアンモニウム塩の合成が、３４０頁に記載されている。使用された合成方法は、以下の通りである：
ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＮ---（Ｈ₂Ｏ₂/ＮａＯＨ）-->ＣＨ₂−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂--（ＨＢｒ）-->ＢｒＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂---（ＣｒＯ₃）--->ＢｒＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂--（Ｐ（ＯＣＨ₂−Ｐｈ）₃）-->ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂］−ＯＰ（ＯＣＨ₂Ｐｈ）₂---（１.Ｈ₂/Ｐｄ；２．２ＣＨＡ--->ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂］−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂ ^*２ＣＨＡ即ちＰＥＰ−アミド^*２ＣＨＡ（ＣＨＡ＝シクロヘキシルアミン：Ｃ₆Ｈ₁₁ＮＨ₂）事実上の構造は塩である。
下記の、ＰＥＰの他のアミド誘導体が記載されている：
ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂、Biorganic and Medical Chemistry Letters、Ｎｏ．３、Ｎｏ．８、１６１５〜１６１８頁（１９９３年）（Shaniら）；ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＯＥｔ］ＯＰ（Ｏ）（ＮＭｅ₂）₂、ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＯＥｔ］ＯＰ（Ｏ）ＭｅＮＭｅ₂、ＣＨ₂＝Ｃ［Ｃ（Ｏ）ＯＥｔ］ＯＰ（Ｏ）ＯＭｅＮＭｅ₂）２；Tetrahedron Letters、第３１巻、Ｎｏ．８、４４７１頁（１９９０年）（Despaxら）；ＣＨ₂＝Ｃ［ＯＰ（ＯＨ）（ＯＥｔ）Ｈ］Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ¹、式中Ｒ¹＝ＰｒまたはＰｈ、J.Am.Chem.Soc.、第１０６巻、４０１７〜４０２０頁（１９８４年）（Klugerら）。
ＷＯ８３/０２３９１号（前記参照）、およびロシア特許第２０４３３５８号（出願番号第９２００８０６２/０４号）のような先行技術においてＰＥＰの種々の合成が開示されている。後者の合成においては、ＰＣｌ₃/Ｏ₂を使用するプロペン酸の誘導体の酸化ハロホスホリル化、次いで生成物の脱ハロゲン化、次いでＰＥＰへの加水分解によって、ＰＥＰが、生成される。
下記式１で示されるＰＥＰの類似体が、特に虚血に関連する症状の予防または治療に関して、良好な薬理学的活性を有することを我々は見い出した。
式１：

［式中：
Ｘ＝ＯまたはＮＨ、
Ｙ＝ＯＨ、ＯＲ¹、ＮＲ¹Ｒ²［式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル（ＯＲ¹に適用される場合は除く）、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルである。］
Ｚ¹およびＺ²はそれぞれ、ＯＨ、ＯＲ¹、ＮＲ¹Ｒ²である。］
で示される化合物、および薬理学的に許容されるそれの塩であり、但し、
（ｉ）ＸがＯであり、Ｚ¹およびＺ²が両方ともＯＨである場合に、ＹはＯＨではなく；
（ii）ＸがＯであり、ＹがＮＨ₂である場合に、Ｚ¹および/またはＺ²は塩Ｏ^-Ｃ₆Ｈ₁₁ＮＨ₃ ⁺ではなく；
（iii）ＸがＮＨであり、ＹがＯＨである場合に、Ｚ¹およびＺ²は両方ともＯＨではなく、または、Ｚ²がＮＭｅ₂である場合に、Ｚ¹はＯＭｅではなく；および
（iv）ＸがＯであり、ＹがＯＣＨ₂ＣＨ₃である場合に、Ｚ¹およびＺ²は両方ともＮＭｅ₂ではない；
ことを条件とする。
式１の化合物およびそれらの塩は、以後「本発明の化合物」と称する。
条件（ｉ）〜（iv）は、ＷＯ８３／０２３９１号（ＰＥＰ）、Stubbeら、Shanniら、およびDespaxらによって公表されている化合物に対する権利を放棄するものである。
好ましくは（同時である必要はないが）、Ｘは酸素であり、ＹはＮＲ¹Ｒ²であり、Ｚ¹およびＺ²はＯＨ基である。
化合物の好ましい群は、式２：

［式中、Ｒ¹およびＲ²は式１のものと同意義である。］
で示される化合物である。
本発明は、式１Ａ：

［式中、Ｒ ¹ およびＲ ² はそれぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ（ＯＲ ¹ に適用される場合は除く）、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルであり、Ｚ ¹ およびＺ ² はそれぞれ、ＯＲ ¹ であり、ここでＲ ¹ はＨ、アルキル、アルケニル、アリール、またはアラルキルである。］
で示されるホスホエノールピルビン酸化合物、または薬理学的に許容されるそれの塩、および薬理学的に許容される担体を含んで成る医薬組成物である。
式２に含まれる化合物のより好ましい群は、Ｒ¹およびＲ²がそれぞれＨまたは低級アルキルであり、例えば、Ｒ¹がＨ、Ｒ²がメチルであり、Ｒ¹がＨ、Ｒ²がエチルであり、あるいはＲ¹およびＲ²が両方ともメチルまたはエチルである。
最も好ましい化合物は、式２で示される第一級アミド（即ち、Ｒ¹およびＲ²が両方ともＨである）、およびモノカリウム塩のようなカリウム塩である。ＩＵＰＡＣ名称化合物（IUPAC name compound）は、２−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパ−２−エノイックアミド（ピルビンアミドエノールホスフェートとしても既知である）である。この化合物の構造は式３に示され、以後「式３の化合物」または「化合物３」と称する。
アルキルという語は、直鎖および分岐鎖アルキル基を包含し、低級アルキルという語は、１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを包含する。
アルケニルという語は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい２〜７個の炭素原子を有する不飽和または部分飽和炭化水素基を意味する。
アルコキシという語は、６個までの炭素原子を有する低級アルコキシ基を意味する。
シクロアルキルという語は、７個までの炭素原子を有する炭化水素環を意味する。
アリールという語は、ベンゼノイド芳香族基を意味するが、好ましくはフェニルである。
アラルキルという語は、１つまたはそれ以上のアルキル基で置換されているアリール基を意味する。
本発明の化合物は、特に虚血に関連する症状の治療において、ＡＴＰと一緒に投与するのが好ましい。
式１で示される生理学的に許容される塩、および生理学的に許容されるそれの誘導体の例は、適切な塩基、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウムおよびＮＸ₄ ⁺（ＸはＣ_1〜4アルキルである。）から誘導される塩を包含する。アミノ基の生理学的に許容される塩は、有機カルボン酸、例えば、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸および琥珀酸、有機スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸、ならびに、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、燐酸およびスルファミド酸の塩を包含する。ヒドロキシ基の化合物の生理学的に許容される塩は、ＮＨ₄ ⁺およびＮＸ₄ ⁺（ＸはＣ_1〜4アルキル基である。）のような好適なカチオンとの組み合わせにおける該化合物のアニオンを包含する。
アルカリ金属塩は、式２の化合物の特に好ましい塩であり、一般にカリウム塩である。
本発明の化合物は、機能的に損なわれた細胞、例えば、心臓組織、神経細胞組織（neuronal tissue）、移植の器官、皮膚（例えば、不全虚血皮膚弁）、および低酸素症によってその生存能が脅かされる筋肉（例えば、骨格筋）組織、の回復を保護しおよび／または補助する働きをする。心臓薬として、および心臓切開手術における心臓麻痺液として本発明の化合物を使用することによって、本発明の化合物は、虚血性細胞損傷また再灌流傷害の予防、保護または治療に特に適用できる。一般に、本発明の化合物は、ストレスまたは外傷（例えば、術後ストレス）下にある移植器官または体組織を保護しまたは保存するために、特に、虚血後の心筋回復を補助するために、使用することができる。本発明の化合物は、低体温条件下でさえ、前記のように作用する。
本発明の化合物によって治療することができる臨床適応症（clinical indications）は、心筋梗塞、敗血症性ショック、心原性ショック（および、心筋のＡＴＰが減少する他の徴候）、四肢の切除、脳虚血による神経細胞損傷に関わる適応症、および損傷が末梢血管虚血（例えば、血管閉塞）に起因する適応症である。
例えば、本発明の化合物は、心不全、溺れまたは薬剤過量摂取の結果としての脳虚血および心臓損傷を治療するために使用することができる。そのような場合、本発明の化合物を、直接注入（例えば、カテーテルを用いる）のための注入液の形態で使用して、損傷器官を治療することができる。
本発明の化合物の他の適用範囲は、心臓切開手術または器官移植におけるような、器官のための灌流液および保存液におけるそれらの使用である。
心臓手術または器官保存のための、心臓麻痺液、灌流液または再灌流液に使用される場合に、本発明の化合物（例えば、式３の化合物）の濃度は、好ましくは１０μmol/Ｌ〜５０，０００μmol/Ｌであり、より好ましくは５０μmol/Ｌ〜１０００μmol/Ｌである。式３の化合物に関しては、１００μmol/Ｌの濃度が適していることが見い出された。
さらに重要な適用範囲は、血液保存および再生、または赤色血液細胞（red blood cells）の回復である。従って、血液銀行は通常、血液を約５週間保存できるに過ぎないが、本発明の化合物、特に化合物３は、血液の生存保存寿命を延長させることができる。本発明の化合物は、血液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ媒体中）に、１０〜１００μmol/Ｌ、好ましくは１５〜６０μmol/Ｌ、例えば４０〜６０μmol/Ｌの濃度で添加するのが好適である。本発明の化合物を含む場合に、血液に好適なｐＨ範囲は、ｐＨ５．５〜６．８、例えば、ｐＨ６．１〜６．５である。
これまでの研究は、本発明の化合物を、化粧品；腫瘍治療における補充薬；肉体的および精神的疲労の治療；抗結石剤または抗カリエス剤；皮膚老化の治療（例えば、ケラチン新陳代謝を促進することによる）；循環不全の治療；血液または尿中の尿素の測定、ならびにコレステロールおよびトリグリセリドの測定のための診断薬（本発明の開示の一部に含まれるＵＳ−Ａ−９９８９０号）；および、炭水化物、グリコール、アルデヒド、ＡＤＰおよび他のヌクレオチドのような天然産物の酵素ホスホリル化；に使用できることも示唆している。
式１の新規化合物だけでなく、（既知の）式１の除外化合物も、前記使用に有効である。
本発明の第二の要旨においては、２−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパ−２−エノイックアミド（即ち、ＰＥＰの第一級アミドである式３の化合物）、またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（式１；Ｘ＝Ｏ、Ｙ＝Ｚ¹＝Ｚ²＝ＯＨ）および薬理学的に許容されるそれの塩の製造方法を提供し、

該方法は、
（ｉ）式４：

［式中、Ｑはハロ化合物である。］
で示される化合物を加水分解して、式３のアミドを形成し、
（ii）該アミドを、例えばデアミナーゼを使用して酵素的に、または、例えば温和アルカリ（例えば、０．１Ｎ水酸化ナトリウム）を使用して温和加水分解（mild hydrolysis）によって、ホスホエノールピルビン酸に随意に変換し、および
（iii）該アミドまたは該ホスホエノールピルピン酸を、随意にそれらの塩に変換する；
ことを含んで成る方法である。式４のニトリルは重要な中間体であり、活性であってもよい。
式４中のシアノ基を加水分解してアミド基を生成できるということは、特に驚くべきことである。これは、加水分解の初期段階の間に、式４の二ハロゲン化物から形成される並列燐酸基の関与によると考えられる。
式４の化合物は、式５：

の化合物を、塩基で処理することによって製造される。
式５の化合物は、アクリロニトリル（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＮ）の酸化ハロホスホリル化によって製造される。
酸化ハロホスホリル化は、酸素（ガス）または酸素供与化合物の存在においてＰＣｌ３を使用して行うのが好ましい。従って、前記式４および５において、Ｑはクロロであるのが好ましい。塩基は、トリエチルアミンのような第三級アミンであるのが好ましい。
好ましい態様においては、２−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）−プロパ−２−エノイックアミドが、三塩化燐および酸素とアクリロニトリルとの反応、それに続くＨＣｌ除去および生成される化合物の加水分解によって製造される。ＰＣｌ₃および酸素と、アクリロニトリルとの反応は、ＰＣｌ₃：アクリロニトリル＝１：５〜３０の相対比において、−３０℃〜＋５０℃の温度範囲で行うのが好ましい。脱ハロゲン化水素は、不活性溶媒（例えば、エーテル、ベンゼンおよび四塩化炭素）中で、種々の塩基（例えば、トリエチルアミンおよびピリジン）を用いて行うことができる。加水分解は、不活性溶媒（例えば、エーテル、ベンゼン、ヘキサン、塩化メチレンまたはクロロホルム）の存在または不存在において、水によって行うことができる。水のみが使用される場合は、凍結乾燥して、過剰の水を除去し、生成物を単離するのが最も好ましい。
一般に式２で示されるＰＥＰの第二級および第三級アミドは、下記のように製造することができる：
１．例えば塩化チオニルとの反応によってＣＨ₂＝Ｃ［ＯＰ（Ｏ）Ｃｌ₂］−Ｃ（Ｏ）Ｃｌに変換し、次いで第一級または第二級アミンと反応させる。
２．アクリリルクロリドＣＨ₂＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃｌを酸化ホルホリル化し、次いで第三級アミンを用いて脱ハロゲン化水素して、前記（１）のトリクロリドを得、次いで第一級または第二級アミンと反応させる。
本発明の化合物の製剤は、経口投与、非経口投与（皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与および関節内投与）、直腸投与、および局所投与（皮膚投与、口内投与（buccal）、舌下投与および眼内投与）に好適な製剤を包含するが、最も適している経路は、例えば患者の症状および傷害に依存する。製剤は、単位投与形態において供給するのが好都合であり、薬学分野において既知の方法によって製造される。全ての方法が、式１の化合物、および全てのそれの塩、エステル、アミドおよび生理学的に許容されるプロドラッグ（有効成分）を、１種類またはそれ以上の補助成分を含んで成る担体と合わせる段階を含む。一般に、有効成分と、液体担体または微細分離固形担体あるいはそれらの両方とを、均質および緊密に合わせ、次いで、必要であれば、その製品を所望の製剤に成形することによって、製剤が製造される。
本発明の化合物の一般的な製剤は、心臓手術および移植手術において使用される心臓麻痺液または再灌流液であり、それらの製剤は、本発明の化合物の他に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよび緩衝剤を含んで成る。特に、心臓麻痺液または再灌流液は、（本発明の化合物の他に）塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、重炭酸カリウム、および重燐酸カリウムを含んで成る。
赤色血液細胞を回復させるために使用される製剤は、本発明の化合物の他に、１つまたはそれ以上のナトリウムまたはマグネシウムＬ−アスコルベートホスフェート、マルトース、マンニトールまたはスクロース、アデニン、クエン酸三ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有する（浸透圧を調節するため）。
経口投与に好適な本発明の製剤は、所定量の有効成分をそれぞれ含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤のような個別単位として；散剤または顆粒剤として；水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として；あるいは、水中油の液体エマルジョンまたは油中水の液体エマルジョンとして；供給することができる。有効成分が、ボーラス（bolus）、舐剤、またはペーストとして存在してもよい。
錠剤は、随意に１種類またはそれ以上の補助成分を使用して、圧縮または成型によって製造される。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性稀釈剤、減摩性、界面活性または分散補助剤と随意に混合して、粉末または顆粒のようなさらさらした形態の有効成分を、適切な機械で圧縮することによって製造される。成型錠剤は、不活性稀釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械で成型することによって製造される。錠剤は、随意に被覆するかまたは溝をつけ（scored）て、その中の有効成分の遅延されたまたは制御された放出を与えるように製剤化することもできる。
非経口投与のための製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する患者の血液と製剤とを等張性にする溶質、を含有する水性または非水性滅菌注射液；ならびに、沈殿防止剤および増粘剤を含有する水性および非水性滅菌懸濁剤を包含する。この製剤は、単位用量（unit-dose）容器または多用量（multi-dose）容器、例えば密封アンプルおよびバイアルにおいて供給することができ、および、滅菌液体担体、例えば生理食塩水または注射用の水を、使用のすぐ前に添加するだけでよい凍結乾燥（freeze-dried）（lyophilized）状態で保存することができる。即席（extemporaneous）注射液および懸濁剤は、前記の種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から製造される。
直腸投与のための製剤は、カカオ脂またはポリエチレングリコールのような通常の担体を使用して、坐薬として供給することができる。
口内投与または舌下投与のような、口中局所投与のため製剤は、スクロースおよびアカシアゴムまたはトラガカントゴムのような風味基剤に有効成分を含んで成るトローチ剤（lozenges）；ならびに、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアゴムのような基剤に有効成分を含んで成るパスチル剤（pastilles）を包含する。
本発明の化合物は、成人に関して、５ｇ〜２５ｇ/日、例えば約１５ｇ/日の投与量範囲において、経口投与または注射による投与を行うことができる。分離単位において供給される錠剤または他の形態は、好都合なことに、そのような用量において有効な所定量の本発明化合物を含有するか、または、複式の用量、例えば、５００ｍｇ、１ｇまたは２ｇを含有する単位であってもよい。
本発明の他の要旨は、以下の通りである。
虚血が起こった、または起こり得る細胞と、本発明の化合物、特に式３の化合物およびそれの塩とを接触させることを含んで成る、虚血傷害の間のまたは後の、患者の心筋回復を補助する方法。
好ましい態様においては、本発明の化合物が、心臓手術、例えば、冠動脈バイパス手術または弁交換または心臓移植手術（または他の器官の移植手術）を受けている患者の心臓を停止させ（arrest）、補助する（support）ために使用される心臓麻痺液に含有される。従って、好ましい方法においては、本発明の心臓麻痺液が、手術の間に心臓を停止し維持するために使用され、次に、心臓が再灌流液で再灌流される。再灌流液も本発明の化合物を含有するのが好ましい。
本発明を、下記実施例によって例示する。
実施例１：２−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパ−２−エノイックアミド（エノールピルビンアミド２−Ｏ−ホスフェート）、式３の化合物
段階１：アクリロニトリルの酸化ハロホスホリル化による、１−シアノ−２−クロロエチル燐酸のジクロリドの合成
反応器にアクロロニトリル（５６ｇ）および三塩化燐（１０５０ｇ）を入れ、発熱反応が終了するまで、激しく攪拌し、冷却して温度を２０℃に維持しながら、０．０１ｍ³/時の容量速度で酸素を泡立たせた。三塩化燐を減圧下に蒸留によって除去し、残渣を約１ｍｍにおいて真空蒸留し、８５℃〜９５℃の沸点を有する留分中の無色留出物として生成物を集めた（１３９．３ｇ）。収率７１％。
ＮＭＲ１Ｈ：３．８９（ＣＨ２Ｃ１，ＪＨＨ５．０）；５．５８（ＣＨ，３ＪＨＰ１１．８）；ＮＭＲ１３Ｃ：４２．２９（ＣＨ２Ｃ１，３ＪＰＣ７．９９）；６６．４２（ＣＨ，２ＪＰＣ７．１９）；１１２．４２（ＣＮ，３ＪＰＣ４．６３）；ＮＭＲ３１Ｐ：９．１１．
段階２：脱ハロゲン化水素による、１−シアノエテン燐酸のジクロリドの合成
段階１から集めた留出物留分（distillate fraction）の溶液を、無水エーテル（５００ｍＬ）に加え、次いで、無水エーテル（１００ｍＬ）中のトリエチルアミン（２６．７ｇ）を１０℃で滴下した。添加終了後、その混合物を２０分間攪拌し、沈殿物を濾過によって分離した。溶媒を、水噴射アスピレーターを使用して真空蒸留によって除去し、残渣を真空蒸留（１ｍｍ）して、生成物を無色留出物として得た（３４．５ｇ、沸点４０℃）。収率７５％。
ＮＭＲ１Ｈ：６．０２（ＨＡ，ＣＨＡＨＢ＝，４ＪＡＰ３．８５，ＪＡＢ３．８５）；５．９４（ＨＢ，ＣＨＡＨＢ＝４ＪＢＰ３．８５）；ＮＭＲ１３Ｃ：１２０．９２（ＣＨ２＝，３ＪＰＣ７．３４）；１２５．２８（−Ｃ（ＯＰ）＝，２ＪＰＣ１１．７２）；１１１．２３（ＣＮ，３ＪＰＣ５．５８）；ＮＭＲ３１Ｐ２．３２．
段階３：加水分解による、エノールピルビンアミドＯ−ホスフェートの合成
クロロホルム（５０ｍＬ）中の１−シアノエテン燐酸（２３．７ｇ）の攪拌溶液に、水（９．５ｇ）を３０℃〜３５℃で滴下した。添加終了後、その反応混合物を２０分にわって４０℃に温めてＨＣｌを除去した。溶媒を真空除去し、アセトニトリル（４００ｍＬ）を残渣に加えた。沈殿物を分離し、真空乾燥して、生成物を白色結晶として得た（１２．８ｇ）。収率５９％。
１ＨＮＭＲ：５．８４（ＨＡ，ＣＨＡＨＢ＝，４ＪＡＰ２．５，ＪＡＢ２．５）；５．４３（ＨＢ，ＣＨＡＨＢ＝，４ＪＢＰ２．５）；１３ＣＮＭＲ（ｓｏｌｖｅｎｔＣＤ３ＯＤ）：１０５．７（ＣＨ２＝）；１４８．０１（−Ｃ（ＯＰ）＝，２ＪＰＣ８．３５）；１６６．２７（Ｃ（Ｏ）ＮＨ２，３ＪＰＣ８．７）；３１ＰＮＭＲ：−４．８６．
実施例２
実施例１を繰り返し、最終生成物を、段階４によってエノールピルビンアミド２−Ｏ−ホスフェートのモノカリウム塩として得た。
段階４：
無水エタノール（５０ｍＬ）中のエノールピルビンアミドホスフェート（４．４ｇ）の攪拌溶液に、無水エタノール（３０ｍＬ）中の水酸化カリウム（１．４８ｇ）を１５℃〜２０℃で滴下した。形成された沈殿物を分離し、真空乾燥して、目的化合物を白色結晶として得た（３．４５ｇ）。収率７５％。
１ＨＮＭＲ：５．６３（ＨＡ，ＣＨＡＨＢ＝，４ＪＡＰ１．９６ＪＡＢ１．９６）；５．２９（ＨＢ，ＣＨＡＨＢ＝，４ＪＢＰ１．９６）；１３ＣＮＭＲ（ｓｏｌｖｅｎｔＤ２０）：１０４．９７（ＣＨ２＝，３ＪＰＣ３．０７）；１４７．０２（−Ｃ（ＯＰ）＝，２ＪＰＣ７．８９）；１６７．８９（Ｃ（Ｏ）ＮＨ２，３ＪＰＣ７．２４）；３１ＰＮＭＲ：−４．５８．
実施例３
４０℃の温度を用いて実施例１の段階１を繰り返した。１−シアノ−２−クロロエチル燐酸のジクロリドの収率は６５％であった。
実施例４
５：１のＰＣｌ３：アクリロニトリルの比率を使用して、実施例１の段階１を繰り返した。１−シアノ−２−クロロエチル燐酸のジクロリドの収率は５４％であった。
実施例５
エーテルの代わりにベンゼン（５０ｍＬ）を使用して、実施例１の段階２を繰り返した。収率は６０％であった。
実施例６
エーテルの代わり四塩化炭素（１００ｍＬ）、およびトリエチルアミンの代わりにピリジンを使用して、実施例１の段階２を繰り返した。収率は４０％であった。
前記合成は、高収率（３つの段階における全般的収率３１％）および高純度（９６〜９９．９％）における、２−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパ−２−エノイックアミドおよびいくつかの誘導体の３段階合成を提供する。
例えば、デアミナーゼ酵素を使用して前記アミドをＰＥＰに単に脱アミノ化することによって、または温和加水分解によって、好都合な方法で前記合成を使用してＰＥＰを生成することもできる。さらに、前記第一級アミドのＣＨ₂＝Ｃ［ＯＰ（Ｏ）Ｃｌ₂］Ｃ（Ｏ）Ｃｌへの変換、それに続く第一級または第二級アミンとの反応によって、第二級および第三級アミドを前記経路によって製造することもできる。これは実施例７〜９に記載されている。
実施例７
アクリル酸クロリド（ＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＯＣｌ）を、三塩化燐および酸素と反応させて、中間体（１）ＣｌＣＨ₂−ＣＨ（ＣＯＣｌ）ＯＰ（Ｏ）Ｃｌ₂および少量のホスホネートＣｌＣＨ₂−ＣＨ（ＣＯＣｌ）Ｐ（Ｏ）Ｃｌ₂を得る。次いで、トリエチルアミンで処理して、ホスフェート（１）をエノールホスフェートトリクロリド（２）ＣＨ₂＝Ｃ（ＣＯＣｌ）ＯＰ（Ｏ）Ｃｌ₂に変換し、次いで、分別蒸留によって精製する。次に、１当量の種々の第二級および第一級アミン、次いで２当量の水で処理して、アミド（３）ＣＨ₂＝Ｃ（ＣＯＮＲ¹Ｒ²）ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂［式中、Ｒ¹＝Ｒ²＝ＥｔまたはＭｅ、式中、Ｒ¹＝Ｃ₆Ｈ₁₁、Ｒ²＝Ｈである。］を得る。
実施例８
実施例１の式３の化合物を、３当量のｔ−カリウムｔ−ブトキシドで処理して、トリカリウム塩を得、次いで、１当量のヨウ化メチルを加えて、式３の化合物のＮ−メチル類似体、即ち、ＣＨ₂＝ＣＨ（ＣＯＮＨＭｅ）ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂を得る。
実施例９
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの存在において、ビルビン酸とジエチルアミンとを縮合させて、ＣＨ₃ＣＯＣＯＮＥｔ₂を生成する。次いで、下記合成経路によって、ＰＥＰのジエチルアミドに変換する：ＣＨ₃ＣＯＣＯＮＥｔ₂---->ＬｉＣＨ₂ＣＯＣＯＮＥｔ₂---ＣｌＰ（Ｏ）（ＯＥｔ）₂-->ＣＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＯＮＥｔ₂）ＯＰ（Ｏ）（ＯＥｔ）₂----ＣｌＳｉＭｅ₃---->ＣＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＯＮＥｔ₂）ＯＰ（Ｏ）（ＯＳｉＭｅ₃）₂----Ｈ₂Ｏ------>ＣＨ₂Ｃ＝Ｃ（ＣＯＮＥｔ₂）ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）₂。
実施例１０
過剰のトリエチルアミン中でトリクロリド（１）を過剰の乾燥メタノールで処理することによって、ホスフェートトリクロリド（１）ＣｌＣＨ₂−Ｃ（ＣＯＣｌ）ＯＰ（Ｏ）Ｃｌ₂を、トリエステルＣＨ₁＝Ｃ（ＣＯＯＭｅ）ＯＰ（Ｏ）（ＯＭｅ）₂に変換することができる。次いで、そのトリエステルを、シリルエステルＣＨ₂＝Ｃ（ＣＯ₂Ｍｅ）ＯＰ（Ｏ）（ＯＳｉＲ₃）₂を経て、モノカルボン酸エステルＣＨ₂＝Ｃ（ＣＯ₂Ｍｅ）ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ₂）に変換することができる。
実施例１１：血液貯蔵（storage）／保存（preservation）
式３の化合物を使用して、長期間にわたって血液を充分に保存することができた。実験計画案は以下の通りであった。３単位の静脈血を、３人のドナーから採取し、（ａ）生理食塩水−アデニン−グルコース−マンニトール（ＳＡＧＭ）−対照、（ｂ）ＳＡＧＭ＋１２５μmol^-1の化合物３、（ｃ）１２５μmol^-1の化合物３、で処理した。次に、これらを４℃で保存した。無菌アリコートを、０、１、４、７、１４、２１、２８、３５、４２および４９日めに抜き取り、２、３ＤＰＧ電解質、ＦＢＣ、ラクテート、メトヘモグロビン、酸素解離、赤色血液細胞（ＲＢＣ）ＡＴＰアッセイ、ＲＢＣ形態、および血液培養に関して評価した。
ヘモグロビン変異体を０日めに評価し、血液培養物を７日めおよび４９日めに評価した。
実施例１２
実施例８に使用される灌流/再灌流液および心臓麻痺液（本発明による）を下記のように構成した。

前記化合物を５リットル容量フラスコに入れ、次に、約５Ｌの脱イオン水を加え、次いで、９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂を含有するガスをその溶液中に約１０〜１５分間にわたって泡立たせる。これによって、ｐＨが７．４に低下し、カルシウムを添加する際の燐酸カルシウムの沈殿が防止される。
泡立たせた後、気体ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏを添加して、容量を５Ｌにし、その溶液を５μｍフィルターで濾過する。随意に、本発明の化合物、好ましくは実施例１の化合物（式３）を、その再灌流液に加える。
心臓麻痺液Ｎｏ．２（ＳＴＨ２）（St.Thomas病院で使用）
実施例１のＰＥＰ−アミドを導入

１Ｌの心臓麻痺液を、各２００ｍＬの前記原液を添加することによって製造した。これによって、各化合物の最終濃度が得られる。

次に、ｐＨを３７℃において７．８に調節し（ホートプレート攪拌器で加熱することによって）、次に、その溶液を５μｍフィルターで濾過した。
実施例１３：心臓機能の回復
実施例１２の心臓麻痺液を、ラット心臓機能の虚血後回復において、、ＰＥＰのモノカリウム塩（ＰＥＰ−Ｋ）の心臓麻痺液と比較した（下記に詳細に記載する）。
単離された機能している（working）ラット心臓の試料を使用した。これは、測定される心臓機能の表示（大動脈流量、冠動脈流量、心拍数、大動脈収縮期圧力および拡張期圧力）、ならびに派生する追加的表示（心拍出量、心拍血液量、鼓動（stroke work））が可能である。この試料を使用して、心肺バイパスを刺激し、心臓麻痺停止および虚血後の支持バイバスを導入することが可能である。この心臓を、実施例１２で製造される９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂を含有するKrebs Henseleit緩衝液（ＫＨＢ）で灌流した。初めに、心臓をLangendorffモードで５分間平衡で灌流し、次に、機能モード（working mode）に１０分間切り替え、好気対照機能（aerobic control function）の測定を行った。次に、心臓をLangendorffモードにさらに５分間再切り替えし、通常のＫＨＢ、または式３の化合物（実施例１）を添加されたＫＨＢのいずれかで灌流し；次に、第２期の対照機能の測定のために、その心臓を機能モードに再切り替えした（ここでも再び、対照ＫＨＢ、またはＫＨＢ＋ＰＥＰ−アミド）。次に、心臓を実施例１２で製造される心臓麻痺液で停止させ、３０分間の正常温度全体的虚血にかけ、次に、Langendorffモードにおいて１５分間で対照ＫＨＢまたは式３の化合物を含有するＫＨＢのいずれかで再灌流した。次に、心臓を、再灌流機能モードに切り替え（ＫＨＢまたはＫＨＢ＋式３の化合物で再灌流）、虚血後機能を測定し、虚血前対照機能の％で表した。最後に、心臓を再びLangendorffモードに５分間切り替え、次に、再び機能モードにさらに１５分間戻し、虚血後機能を再び測定した。この最後の期間においては、心臓をＫＨＢのみで再灌流した。
３つのグループに関して試験した：
１．心臓を、ＫＨＢまたは通常の心臓麻痺液で灌流した。
２．１００μmol/Ｌの式３の化合物を、前処置としてＫＨＢに添加し、心臓麻痺液に添加し、ならびに、初期Langendorffの間、および機能モード再灌流の間に添加した。
３．１００μmol/Ｌの式３の化合物を、前処置としてＫＨＢに添加し、心臓麻痺液に添加し、ならびに、初期Langendorffの間、および機能モード再灌流の間に添加した。
機能の回復
対照心臓においては大動脈流量の回復が２３．５％±３．５％であり、式３の化合物は回復を６９．３±４．３％に向上させた。３つのグループについてそれぞれ測定された心臓特性が図面に示されており、図１〜８はそれぞれ、大動脈流量、冠動脈流量、心拍出量、心拍数、収縮期圧力、拡張期圧力、心拍血液量、および拍動（stroke work）を示す。図９および１０はそれぞれ、再灌流の時間に対する、１０分および２０分における大動脈流量の回復を示す。
従って、式３の化合物は、前処置として、および/または心臓麻痺液への添加剤として、および/または再灌流液への添加剤として使用した場合に、１００μmol/Ｌの用量での使用において、虚血後機能回復を顕著に増加させた。さらに、式３の化合物は、ＰＥＰ−Ｋと比較して、虚血後機能回復を顕著に増加させた（約２５％で増加）。
実施例１４：機能の回復
式３の化合物（化合物３）およびそれのモノカリウム塩（Ｋ−化合物３）を、下記の心臓麻痺液と比較して試験した：Langendorff灌流液（対照）、ホスホクレアチン（ＰＣｒ）−標準／商業的に可能な処置、およびＰＥＰのモノカリウム塩（ＰＥＰ−Ｋ）。機能再灌流の間の回復輪郭が、図１１に示されている。特に図１１は、対照心臓、または、１００μmol/Ｌの化合物３、ＰＥＰ−Ｋ、Ｋ−化合物３、または１０μmol/Ｌのホスホクレアチン（ＰＣｒ）、で処置した心臓における大動脈流量の回復輪郭を示す。Langendorff（Ｌ）灌流液は、淡色バー（light shaded bars）で示されている。結果を、１００％に標準化された第２機能期間の平均％で示す。数値は平均値である（ＳＥＭは簡便のために省略した）。図１２は、対照心臓、および１００μmol/Ｌの化合物３、ＰＥＰ−Ｋ、Ｋ−化合物３、１０μmol/Ｌのホスホクレアチン（ＰＣｒ）で処置した心臓の、５０分間再灌流後の％回復を示す。数値は、平均値±ＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５。
対照心臓、ならびに化合物３およびＫ−化合物３で処置したグループの心臓は、急速に回復し、初期再灌流時間から１０分で安定水準に達する（このとき、どの薬剤処置グループにおいても薬剤がなお存在すると考えられ、これは薬剤が心臓の回復速度を阻害しなかったことを意味している）。これらの心臓のグループは、第２機能再灌流期間に、再灌流液がＫＨ緩衝液のみに置き換えられたときに、向上も低下も示さなかった（薬剤が回復の程度を阻害しないことを示唆している）。この速い速度の回復は、心臓または脳のような非常に重要な組織を救うのに極めて重要である。これと対照的に、１０μmol/ＬのＰＣｒで処置した心臓はゆっくり回復し、１５分間の初期機能再灌流時間にわたって継続的に回復した。これらの心臓は、ＫＨのみで再灌流した際に回復を継続し、この回復は最後の１０分間の再灌流まで安定水準に達しなかった。臨床状況において、化合物３およびＫ−化合物３の最適な投与計画は、再灌流および虚血の間の投与を必要とする。図１２は、全てのグループの最終回復（５０分間の合計再灌流時間の終わりにおける回復）を示している。化合物３で処置した心臓の回復が、対照心臓より顕著に優れており（ｐ＜０．０５）、他の薬剤で処置したグループよりも優れていたことが明らかである。Ｋ−化合物３は、化合物３ほど優れていないが、それでもなお対照グループより高レベルの回復を補助した。
この試験は、虚血前灌流液、心臓麻痺液、および初期再灌流液の添加剤として（および１００μmol/Ｌの用量において）、化合物３およびＫ−化合物３が、正常温度全体虚血を受けるラット心臓において、虚結後機能回復を顕著に向上させることを確認するものである。さらに、化合物３で処置された心臓は、ＰＥＰまたはホスホクレアチンで処置された心臓より優れた回復を示す傾向があることを示している。これは低体温条件下でも同様である。さらに、化合物３およびＫ−化合物３は両方とも、投与後の最初の１０分間において、ホスホクレアチンより速い速度の心臓回復を補助し、これは、心臓および脳のような重要な組織の機能の回復を補助することにおいて極めて重要なことである。

Claims

式１Ａ：

［式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ（ＯＲ¹に適用される場合は除く）、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルであり、Ｚ¹およびＺ²はそれぞれ、ＯＲ¹であり、ここでＲ ¹ はＨ、アルキル、アルケニル、アリール、またはアラルキルである。］
で示されるホスホエノールピルビン酸化合物、または薬理学的に許容されるそれの塩、および薬理学的に許容される担体を含んで成る医薬組成物。
Ｚ¹およびＺ²がＯＨである請求項１に記載の組成物。
Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ、ＨまたはＣ ₁ 〜Ｃ ₆アルキルである請求項２に記載の組成物。
Ｒ¹およびＲ²がＨである請求項３に記載の組成物、および薬理学的に許容されるそれの塩。
ホスホエノールピルビン酸化合物がカリウム塩である請求項４に記載の組成物。
ホスホエノールピルビン酸化合物が、式４：

［式中、Ｑはハロゲンである。］
で示される化合物を加水分解して、該ホスホエノールピルビン酸化合物を形成することを含んで成る請求項４に記載の組成物。
式４の化合物が、式５：

［式中、Ｑは請求項６のものと同意義である。］
で示される化合物を、塩基で処理することによって製造される請求項６に記載の組成物。
式５の化合物が、アクリロニトリルの酸化ハロホスホリル化によって製造される請求項７に記載の組成物。
前記酸化ハロホスホリル化が、酸素ガスまたは酸素供与化合物の存在において、ＰＣｌ ₃ を使用して行われる請求項８に記載の組成物。
塩基が第三級アミンである請求項７に記載の組成物。
Ｑが塩素である請求項６〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
虚血後の心筋回復を補助する心臓麻痺液である請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
再灌流傷害の治療のための再灌流液である請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
医学療法において使用される請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物。
ストレス下の体組織の回復を保護しおよび／または補助する薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。
体組織の生存能が低酸素症によって脅かされる請求項１５に記載の使用。
虚血に関連する症状の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。
症状が、心筋梗塞、敗血症性ショック、心原性ショック（および、心筋のＡＴＰが減少する他の徴候）、四肢の切除、脳虚血による神経細胞損傷に関わる適応症、および損傷が末梢血管虚血に起因する適応症から選択される請求項１７に記載の使用。
薬剤が、心不全、溺れまたは薬剤過量摂取の結果としての脳虚血および心臓損傷を治療するためのものである請求項１７または１８に記載の使用。
虚血後の心筋回復を補助するための薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。
肉体的または精神的疲労、循環不全、癌、および皮膚老化の徴候の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。
保存血液の生存能を強化するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。
診断薬としての、ならびに炭水化物、グリコール、アルデヒドおよびＡＤＰのような天然産物の酵素ホスホリル化のための、請求項１〜１１のいずれかに記載のホスホエノールピルビン酸化合物の使用。