JP4123718B2

JP4123718B2 - Process for producing geranylgeraniol and its related compounds

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Publication number: JP4123718B2
Application number: JP2000401927A
Authority: JP
Inventors: 正善村松; 充生小畑
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: JP2002199884A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はジベレリン生産菌を用いたゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物であるゲラニルゲラニルモノリン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ファルネソール、ファルネシルモノリン酸、ファルネシル二リン酸の製造法に関するものである。該化合物は医薬品・香料・化粧品・食品に利用可能なテルペン類、カロチノイド類、ステロイド類の生合成中間体として有用である。とりわけ、ゲラニルゲラニオールは胃炎薬プラウノトール、制ガン剤であるゲラニルゲラニルアミン誘導体（特開平９−２９１０３０）の原料になる重要な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
ゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物はアセチルＣｏＡからメバロン酸、イソペンテニル二リン酸を経由して合成される。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）はＩＰＰイソメラーゼによってヂメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換され、ＤＭＡＰＰに炭素鎖５のＩＰＰが縮重合することにより、炭素鎖５のイソプレンユニットを構成単位とする一連の鎖長のイソプレノイドが合成される。ゲラニルゲラニル二リン酸はゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素によって４つのイソプレンユニットが縮重合した化合物で、βカロチン、ジベレリン等のジテルペン化合物の出発物質になる。また、ファルネシル二リン酸はファルネシル二リン酸合成酵素によって３つのイソプレンユニットが縮重合した化合物でステロイド、セスキテルペンの出発物質になる。ゲラニルゲラニオールはゲラニルゲラニル二リン酸がフォスファターゼまたは酸・アルカリによって加水分解されることにより合成されると考えられ、多くの植物で見られるが、その存在量はわずかである。最近、トウダイクサ科植物の培養細胞を用いて、ゲラニルゲラニオール及びゲラニルゲラニル二リン酸を合成する方法が開発されたが（特開平９−２３８６９２）、植物の培養細胞を用いることから培養に光照射が必要であり量産化が難しいといった問題がある。また、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を大腸菌で生産し、基質であるＩＰＰ，ＤＭＡＰＰより酵素的にゲラニルゲラニル二リン酸を合成する方法も開発されているが[J.B.C.,269, 20, 14792-14797 (1994)]、化学的に不安定なＩＰＰ、ＤＭＡＰＰを量産することが難しい。
【０００３】
一方、イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroiは植物生長ホルモンであるジベレリンを1g/L培養液あまり合成し，ジベレリンは現在でも本菌により発酵法により生産されている。現在，ジベレリンを量産できる菌はこのほかにキャッサバの徒長病菌Sphaeceloma monihoticola［Biochem.Biophys.Res.Comm.,91,35 (1979)］とPhaeosphaeria sp.（特許２７９７３３１）を含め３種しかなく、これらはこのような複雑な化合物が大量に分泌生産される点からしても異例な微生物であるといえる。ゲラニルゲラニル二リン酸およびその類縁化合物はジベレリンの生合成中間体であることからこれらの菌が生産していることが考えられる。しかしながら、イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroiをはじめとするジベレリン生産菌を用いたジベレリン生産に関する研究は数多くあるが、これまでにこれら微生物においてゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物が合成されたといった報告はなく、実際に本発明者らがこれらを培養し検出を試みても培養条件によってはわずかに合成が確認できる程度の量であった。
【０００４】
イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroiは植物生長ホルモンであるジベレリンを1g/L培養液あまり合成し、ジベレリンは現在でも本菌により発酵法により生産されている。ジベレリンは原料であるアセチルCoAより２０あまりの酵素反応によって合成される。このような複雑な生合成経路にもかかわらず大量に合成されることから、この経路は微生物内において非常に効率的に機能していると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は微生物を用いて、ゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物を合成することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アセチルCoAからジベレリンに至る数段階からなる複雑な生合成経路の上流部分においてゲラニルゲラニオール類が反応中間体として合成されることに着目し、ゲラニルゲラニル二リン酸のすぐ下流の酵素反応、即ち、ゲラニルゲラニル二リン酸からコパリルＣｏＡへの合成反応を触媒するエントカウレン（ent-kaurene）合成酵素を試薬または遺伝子破壊により人為的に阻害することにより、エントカウレン合成酵素活性を低下または欠失させたジベレリン生産菌を培養したところ、ゲラニルゲラニオール類を菌体内外に合成蓄積せしめることに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３）の発明である。
【０００７】
（１）エントカウレン合成酵素活性を低下または欠失させたジベレリン生産菌を培地に培養し、ゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物を菌体内外へ生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、ゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物の製造法。
【０００８】
（２）エントカウレン合成酵素活性の低下または欠失が、ジベレリン生産菌の培養培地にエントカウレン合成酵素阻害剤を添加することにより行われることを特徴とする、上記（１）の方法。
（３）エントカウレン合成酵素活性の低下または欠失が、ジベレリン生産菌の有するエントカウレン合成酵素遺伝子を破壊または改変することにより行われることを特徴とする、上記（１）の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、エントカウレン成酵素活性を低下または欠失させたジベレリン生産菌を培養することによって、ゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物を製造する。
【００１０】
本発明によって得られるゲラニルゲラニオール及びその誘導体とは主として生成されるゲラニルゲラニオール、ゲラニルゲラニル二リン酸、ファルネソール、ファルネシル二リン酸をさすが、これ以外に、菌体内外に蓄積するゲラニルゲラニル二リン酸及びファルネシル二リン酸が酸またはアルカリが触媒となって加水分解し生成するゲラニルリナノール、ネロリドール、ファルネソールの酸化物であるファルネサール、二重結合が一部飽和したジヒドロファルネソールのほか、ゲラニルゲラニルモノリン酸、ファルネシルモノリン酸、リナロール、ゲラニオール、ゲラニルモノリン酸、ゲラニル二リン酸等をも含む。
エントカウレン合成酵素活性の低下または欠失は、エントカウレン合成酵素阻害剤を培地に添加するか、ジベレリン生産菌が有するエントカウレン合成酵素遺伝子を人為的に破壊または改変することにより行う。
【００１１】
ジベレリン生産菌は、ジベレリンを生産することのできる菌株であれば特に制限はないが、イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroi、キャッサバの徒長病菌Sphaeceloma monihoticola 、Phaeosphaeria sp.等のジベレリンの高生産菌が好適に使用できる。具体的には、国内で入手可能な公知の菌株であるGibberella fujikuroi ＩＦＯ５２６８、６３４９、６３５６、６６０４、６６０５、６６０６、６６０７、９９７６、９９７７、３０３３６、３０３３７、３１２５１等、国外ではATCC Gibberella fujikuroi ０７０４、１２６１６、１２７８１、１２７８２、１４１６４、１４８４２、２０１３６、５８１０９、３８９３８、３８９３９、３８９４０、３８９４１、５２１２４、５２１２５、１２７６５、１２７７６、１２７８０、３８９３７、４２０５２、４２１１２、４２１７８、５２１２６、５２１２７、５２１２８、５２１２９、１２７７７、３８９３２、３８９３３、３８９３４、３８９３５、５２１３０、５２１３１、５２１３２、５２１３３、ATCC Sphaceloma monihoticola４４２９１、４４２９２等を挙げることができるが、これらに限定はされない。また、これら以外に微少ではあるがジベレリンが生産されることが報告されているものとして、Nevrospora crassa、Sporisorium reilianum、Rhizobium phaseoli、Azospirillium lipoferumなどのカビを挙げることができる。
【００１２】
本発明の一態様である、エントカウレン合成酵素阻害剤を培地に添加し、培養を行う場合、用いるエントカウレン合成酵素阻害剤としては、特に限定されないが、例えば２’−イソプロピル−４’−(トリメチルアンモニウムクロライド)−５’−メチルフェニルピペリジン−１−カルボキシレート（ＡＭＯ１６１８）または（２−クロルエチル）トリメチルアンモニウムクロライド（サイソセル）またはトリブチルー２、４ジクロロベンジルフォスフォニウムクロライド（フォスフォンＤ）等が挙げられる。
【００１３】
阻害剤の添加量としては０．００００５〜０．２％を培養開始時に添加すればよく、好ましくは０．０００３〜０．０５％がよい。
これらの阻害剤は培養開始時に添加し培養することが好ましいが、培養途中で添加することによっても効果が得られる。
【００１４】
本発明の他の態様である、ジベレリン生産菌が有するエントカウレン合成酵素遺伝子を人為的に破壊または改変する場合は、紫外線照射または化学変異剤処理によるエントカウレン合成酵素欠損株の取得、相同組換えによるエントカウレン合成酵素遺伝子の破壊またはそのプロモーターの改変などにより行う。
【００１５】
紫外線照射または化学変異剤処理によるエントカウレン合成酵素欠損株は以下の手順の操作を行えば得ることができる。
変異処理は菌糸または胞子に対し行えばよいが、ヘテロカリオンであることから胞子に対する処理が効果的である。胞子形成培地で培養したジベレリン生産菌を紫外線照射、放射線照射、ＮＴＧ，ＥＭＳ等を施し突然変異を誘発させることができる。胞子形成培地としてはたとえば0.1％酵母エキス（Difco社製）、0.1％硝酸アンモン、0.1％リン酸２水素カリウム、0.05％硫酸マグネシウムを含む1.6％寒天培地などを挙げることができる。当該菌の紫外線照射、ＮＴＧ処理条件はAppl. Env. Micro., 49, 1, p187-191, (1985)などを参考にして行えばよい。
【００１６】
得られた変異株を培養し、培養液をフォスファターゼ処理した後、ペンタン、石油エーテル等の有機溶媒で抽出し、ＧＣ/ＭＳ分析に供し、ゲラニルゲラニオール生産を分析することにより高生産株を得ることができる。分析数を増やすため９６穴のマイクロタイタプレートで当該菌を培養後、硫酸溶液を添加し蛍光強度を測定し〔Appl. Env. Micro., 57, 11, p3378-3382, (1991)〕、ジベレリン生産のない株を一次スクリーニングしＧＣ/ＭＳに供してもよい。
【００１７】
相同組換えによる変異株は以下の手順の操作を行えば得ることができる。
まず、エントカウレン合成酵素遺伝子を常法に従いクローニングする。クローニング法は、たとえばＰＣＲを用いた方法、オリゴヌクレオチドを使ったコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリぜーション、さらには抗体を用いたクローニングなどを実施することができる。簡便なＰＣＲを用いたクローニングに関して説明すると、ＩＣＩ培地等のジベレリン生産培地で７〜１０日間培養した当該菌より常法によりmRNAを調製し、ｃＤＮＡを合成すればよく、たとえば、mRNA Purification Kit （ファルマシア）とTime Sever cDNA Synthasis Kit（ファルマシア）と組み合わせれば簡単にｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。ＰＣＲを用いたクローニングの場合、プライマー設計がポイントになるが、糸状菌のエントカウレン合成酵素の遺伝子配列はPhaeosphaeria sp.（J. Biol. Chem. 1997, 272, 35, 21706-21712）とGibberella fujikuroi IFO 303306（Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64, 3, 660-664およびCurr. Genet. 1998, 34, 3, 234-240）で明らかにされており、これら糸状菌間で相同性が高い配列から容易に設計することができる。たとえばGibberella fujikuroi IFO 303306の以下に示すアミノ酸配列を基にいずれの糸状菌より当該遺伝子を増幅できるPCRプライマーを設計すればよい。
【００１８】
153-Asp-Thr-Asn-His-Ile-Gly-Val-Glu、
219-Gly-Lys-Leu-Asp-Phe-Asp、
233-Gly-Ser-Met-Met-Ala-Ser-Pro-Ser-Ser-Thr-Ala-Ala、
324-Gly-Val-Ile-Gly-Phe-Ala-Pro-Arg、
334-Asp-Val-Asp-Asp-Thr-Ala-Lys、
383-His-Val-Leu-Leu-Ser-Leu、
426-Leu-Ser-His-Leu-Tyr-Pro-Thr-Met-Leu、
537-Trp-Thr-Ser-Lys-Thr-Ala-Tyr、
541-Ile-Pro-Phe-Thr-Trp-Val-Gly-Cys-Asn-Asn-Arg-Ser-Arg-Thr、
806-His-Val-Ala-Cys-Ala-Tyr-Ser-Phe-Ala-Phe
【００１９】
いうまでもなくPhaeosphaeria spまたはGibberella fujikuroi IFO 303306であれば開示されているcDNA配列のいずれの部分をもとにプライマーを設計しても簡単にエントカウレン合成酵素遺伝子断片を増幅することができる。次に、増幅した断片をプローブに用いゲノムＤＮＡライブラリーより同遺伝子をクローニングすることができる。
【００２０】
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の配列をマーカー配列として挿入破壊したエントカウレン合成酵素遺伝子断片を調製する。ハイグロマイシン耐性遺伝子、即ち、ハイグロマイシンBフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子は、放線菌Streptomyces hygroscopicusよりクローニングされ公知であるので（Nuc.Acids Res., 1986, 14, 4, 1565-1581）、PCRを用いてクローニングすることができる。クローニングしたエントカウレン合成酵素遺伝子（上流、下流部分の非翻訳領域を含む）を分断するようハイグロマイシン耐性遺伝子配列をインフレームで挿入した配列を構築し、たとえばMolecular Plant-Microbe Interactions, 1992, 5, 3, 249-256記載の方法でジベレリン生産菌を相同組換えし、ハイグロマイシン耐性菌をプレートで探せばエントカウレン合成遺伝子の破壊株を得ることができる。また、この他、ベクターを用いたtransformation-mediated mutagenesisの手法（Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 6, 2558-2564）、PCRを用いた遺伝子破壊（Yeast, 1998, 14, 1139-1146）等によっても破壊株を得ることが可能である。
また、相同組換えによりプロモーターを改変しジベレリン生産菌のエントカウレン合成酵素遺伝子のプロモーター活性を低下させ同様の効果を得ることもできる。
【００２１】
以上の変異株を培養すればゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物を培養液または菌体内に生産することができる。
培養に際し、培地としては高いジベレリン生産が行われるものを用いればよい。例えば、ＩＣＩ培地［Plant and Cell Physiology., 20, 75 (1979) ］または以下の組成のオートミール培地等を挙げることができる。
【００２２】
８％グルコース
０．５％イーストエキス
１．５％オートミール
０．１２％ NH₄NO₃
０．５％ KH₂PO₄
１．０１％ MgSO₄・７H₂O
【００２３】
培養方法は当該培地を用いて好気条件下で３〜１０日間液体培養すればよく、たとえば、試験管または坂口フラスコによる振盪培養、シリコセンまたは綿栓をした三角フラスコの回転培養、ジャーファーメンターを用いた通気攪拌培養によって行えばよい。
【００２４】
代表的な通気攪拌培養条件として、培養温度２５〜３０℃、攪拌速度０〜７００ｒｐｍ、通気量０．５〜２ｖｖｍとすることが例示される。いずれの培養方法においても培養は通常２０〜４０℃で行い、培養開始後、５時間〜２０日でゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物を培養液中及び菌体内に生成蓄積させることができる。
【００２５】
次に、このように生産したゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物の精製法について説明する。即ち、培養液を直接ペンタン、酢酸エチル、クロロホルム，ノルマルブタノール等の溶媒抽出に供した後、溶媒層を濃縮することにより高濃度のゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物を得ることができる。また、培養液を活性炭、アルミナ、シリカゲル等を詰めたカラム、ＯＤＳ等の逆相カラム、セファデックス等のゲル濾過カラムに通し、直接高純度のゲラニルゲラニオール類を得ることもできるし、溶媒抽出後にこの操作を行えば高純度の目的物が得られる。その他、蒸留、超臨界抽出等も考えられ、常法と組み合わせることによりさらに純度を上げることができる。
【００２６】
ゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物はほとんどが菌体外に分泌されるため、当該精製法により調製すれば良いが、より生産効率を上げるためには菌体を常法により破砕処理後、単離・抽出すれば菌体内に合成された当該化合物も含めて効率的に抽出することができる。菌体の破砕方法としては、たとえば、超音波破砕、凍結融解による破砕、ガラスビーズ、海砂、金属球等を用いた菌体破砕機、フレンチプレスによる加圧破砕、ペクチナーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ等の細胞壁破砕酵素を用いた溶菌及びこれらの組み合わせが考えられ、一般的にカビ・酵母の菌体破壊に用いられている方法であればいずれでもよい。
【００２７】
また、種々の膜ろ過、ケイ藻土濾過、遠心分離等により菌体を除去した培養上清より種々の溶媒・カラムクロマトグラフィーを用いて当該化合物を大量調製することも可能である。上清液より調製した場合、菌体由来の夾雑物の混入を防ぐことができるため、精製が容易になる。
【００２８】
上記のようにして、ジベレリン生産微生物においてゲラニルゲラニル二リン酸よりコパリル二リン酸への反応を触媒するエントカウレン合成酵素を阻害すれば、ゲラニルゲラニオール及びその類縁化合物を生産することができる。同酵素を阻害した場合、その基質であるゲラニルゲラニル二リン酸を蓄積することができるが、これはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の生成物であることからさらにゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素が阻害され、その基質であるファルネシル二リン酸を蓄積することができる。ファルネソール、ゲラニルゲラニオールが合成されることより、これらイソプレニル二リン酸は菌体内外のフォスファターゼによって加水分解を受け、プレニルアルコールになると考えられる。従って、さらに生産効率を上げるためには培養液、または菌体破砕抽出物をあらかじめフォスファターゼ処理した後、抽出操作を行えばよい。フォスファターゼとしては種々の酸性、中性、アルカリ性フォスファターゼが考えられ、例えば、ポテト酸性フォスファターゼ、小麦胚芽酸性フォスファターゼ、大腸菌アルカリフォスファターゼ、牛小腸アルカリフォスファターゼなどを用いればよい。酵素反応は培養液１ｍｌ当たり数０．１単位〜数十単位加え、数時間〜一晩酵素反応を行なえばよい。また、１０〜５０％のメタノール等のアルコールを添加して加水分解効率を上げることもできる。
【００２９】
【実施例】
以下に本発明を実施例にてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕（エントカウレン合成酵素阻害剤添加培地を用いた培養でのゲラニオゲラニオール類の生産）
（１）菌の培養
Gibberella fujikuroi IFO30336株を８％グルコース、０．５％リン酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム７水和物、０．０４８％硝酸アンモニウム、０．０００３２２％硫酸亜鉛７水和物、０．０００２％硫酸第一鉄７水和物、０．００００３％硫酸銅５水和物、０．００００２％硫酸マンガン７水和物、０．００００２％モリブデン酸アンモニウム４水和物及びジベレリン合成阻害剤（エントカウレン合成酵素阻害剤、エントカウレン酸化酵素阻害剤、３β−ヒドロキシラーゼ阻害剤）を含む培地（ＩＣＩ培地）１００ｍｌを入れたバッフル付３００ｍｌ三角フラスコに一白金耳植菌し、２５℃で１０日間回転培養（１５０ｒｐｍ）した。
それぞれ添加したジベレリン合成阻害剤濃度および入手先を以下に示す。
【００３０】
（エントカウレン合成酵素阻害剤）
Cysocel（サイソセル）（15mg/L) ＧＬサイエンス
AMO1618 （15mg/L) 和光純薬
Phosfone D（フォスフォンＤ）（15mg/L) ＧＬサイエンス
（エントカウレン酸化酵素阻害剤）
Ancimidol（アンシミドール）（15mg/L) ＧＬサイエンス
Inabenfide（イナベンファイド）（15mg/L) ＧＬサイエンス
Paclobutrazol（パークロブトラゾール）（15mg/L) ＧＬサイエンス
Uniconazol（ウニコナゾール）（15mg/L) ＧＬサイエンス
Unikonazol-P（ウニコナゾールＰ）（15mg/L) ＧＬサイエンス
（３β−ヒドロキシラーゼ阻害剤）
Prohexadione（プロヘキサジオン）（15mg/L) 林純薬
【００３１】
（２）菌体破砕・ファオファターゼ処理
培養液２０ｍｌを遠心分離し（５５００ｇ、１０分、４℃）、菌体と上清に分離した。遠心した残渣を２０ｍｌの０．０２５％トリトンX-100を含む２５０ｍM酢酸緩衝液ｐH４．７に懸濁し、ビードビーター（BIOSPEC社製）による破砕に供した。菌体懸濁液全量を同装置の５０ｍｌセルに入れ、酵母破砕用グラスビーズ（シグマ製）をセルの９分目付近まで添加して装置に装着し、氷で冷やしながら３分間破砕した。フォスファターゼ処理が必要な菌体破砕溶液は抽出前に１１unitのポテト酸性フォスファターゼ Type ll （シグマ）を加え37℃で一晩酵素処理した後、以下の抽出に供した。
【００３２】
（３）抽出
（３−１）培養液上清からのゲラニルゲラニオール及びその誘導体の抽出
５０ｍｌコーニングチューブに入れた上清液２０ｍｌに等量（２０ｍｌ）のペンタン及び１０ｍｌのメタノールを添加し十分に攪拌後、遠心分離（１５００ｇ、１０分、４℃）し、ペンタン層を新しいコーニングチューブに移す。湯浴中でペンタンを乾固させ、２００μｌのペンタンに再溶解させバイアル瓶に詰めた。バイアル瓶には内部標準として１０μｌのウンデカノール溶液（１μｌ/ｍｌエタノール）をあらかじめいれおく。
【００３３】
なお、フォスファターゼ処理が必要な上清液は抽出前に５ｍｌの１Ｍ酢酸緩衝溶液 (pH4.8)、125μｌの5%(w/v) Triton X-溶液および１１unitのポテト酸性フォスファターゼ Type ll （シグマ）を加え37℃で一晩酵素処理した後、同様の抽出に供した。
【００３４】
（３−２）菌体破砕液からのゲラニルゲラニオール類及びその誘導体の抽出
ビードビーターで破砕した菌体破砕溶液を５０ｍｌコーニングチューブに移し、１０ｍｌのペンタン２ｍｌ及びメタノールを添加し十分に攪拌後、遠心分離（１６０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、ペンタン層を新しい５０ｍｌコーニングチューブに移す。次に、室温でペンタンを乾固させた後、２００μｌのペンタンに再溶解させバイアル瓶に詰めた。この時、培養液上清の場合と同様にバイアル瓶には内部標準をあらかじめいれておいた。
【００３５】
（４）分析
こうして得られたゲラニルゲラニオール類及びその誘導体はヒューレットパッカード社製ＧＣ/ＭＳ５９７３を用い以下の分析条件で分析した。
【００３６】

【００３７】
ファルネシルピロリン酸、ゲラニルゲラニルピロリン酸はＧＣ/ＭＳでは直接分析することはできない。フォスファターゼ処理した試料はファルネシルピロリン酸、ゲラニルゲラニルピロリン酸がそれぞれゲラニルゲラニオール、ファルネソールに加水分解しＧＣＭＳで測定することができる。従って、フォスファターゼ処理した試料はゲラニルゲラニルピロリン酸とゲラニルゲラニオール、またはファルネシルピロリン酸ファルネソールとが合算した値となる。分析結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
阻害剤非存在下でGibberella fujikuroiを培養した場合、ゲラニルゲラニオール及びファルネソールは検出されないが、エントカウレン合成酵素の阻害剤であるサイソセルまたはAMO1618を培地中に添加すると顕著にファルネソールおよびゲラニルゲラニオールが合成されることがわかる。
【００４０】
〔実施例２〕（エントカウレン合成酵素阻害剤添加培地を用いた培養でのゲラニオゲラニオール類の生産）
実施例１のＩＣＩ培地を８％グルコース、１．２％硝酸アンモニウム、０．５％りん酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム（７水和物）、０．５％酵母エキス（Difco社製）、１．５％オートミール及び終濃度１５ｍｇ/Ｌのサイソセル（ＧＬサイエンス社製）を含む培地（オートミール培地）に換え同様の実験を行なった。分析結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】

【００４２】
実施例１と同様にサイソセル、ＡＭＯ１６１８を添加するとファルネソール、ゲラニルゲラニオールが合成されるが、実施例１のＩＣＩ培地に比べ実施例２のオートミール培地では生産性高いことがわかる。
【００４３】
〔実施例３〕（エントカウレン合成酵素阻害剤濃度によるゲラニオゲラニオール類の生産に対する影響）
実施例２と同様のオートミール培地１０ｍｌに、終濃度０〜２００ｍｇ/Ｌ−培養液のサイソセル（ＧＬサイエンス社製）または終濃度０〜２０００ｍｇ/Ｌ−培養液のフォスフォンＤを添加後、Gibberella fujikuroi IFO30336株を植菌し、１５０ｒｐｍ、２４℃で回転培養した。培養容器はバッフル付きの１００ｍｌ三角フラスコに綿栓したものを用い、サイソセル、フォスフォンＤはメタノールに溶解後フィルター滅菌して添加した。培養開始後、5日、１０日、１４日目にけん濁液０．８ｍｌを２ｍｌのガラスセルにサンプリングし、等量の海砂Ｂを加えた後、安井機械社製マルチビーズショッカーＭＢ−２００を用いて菌体を完全に破砕した（２５００ｒｐｍ、２０分、室温）。次に内容物を内径１６ｍｍ長さ１００ミリの試験管に移し、６ｍＭ塩化マグネシウムを含む２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌ及び２．５ユニットの宝酒造社製大腸菌アルカリフォスファターゼを混合し６５℃、３０分間静置加温し、ゲラニルゲラニル二リン酸の加水分解を行なった。氷上で十分に冷やした後１ｍｌのメタノール及び２ｍｌのペンタンを添加し、十分に攪拌後、ベックマン社製遠心分離機CP Centrifugeで遠心し（５００ｇ、５分、室温）、水層と有機溶媒層とに分離した。有機溶媒層を注意深く新しい内径１６ｍｍ長さ１００ミリの試験管に移し、ドラフト内で一晩風乾した。次に、２００μｌのペンタンに抽出物を溶解し、ＧＣＭＳバイアル瓶に移した。この時、内部標準として１μｌ/ｍｌのウンデカノールを含むエタノール溶液１０μｌをあらかじめバイアル瓶に添加しておいた。生成したゲラニルゲラニオールはヒューレットパカード社製ＧＣＭＳ５９７３にて以下の条件で分析した。
【００４４】

【００４５】
このときの分析結果を表３及び４に示す。表３からわかるように添加するサイソセル濃度は０．５〜２００ｍｇ/Ｌ―培養液が好ましいことがわかる。また、実施例１、２ではフォスフォンＤの添加効果が認められなかったが、サイソセル、ＡＭＯ１６１８に比べ高濃度で用いれば効果があることがわかる。表４から明らかなようにフォスフォンＤでは１５〜２０００ｍｇ/Ｌ―培養液でゲラニルゲラニオール生成効果が認められた。従って、濃度差はあるにせよエントカウレン合成酵素阻害剤を培地中に添加してGibberella fujikuroiを培養すればゲラニルゲラニオール及びファルネソールを生産できることがわかる。
【００４６】
【表３】

【００４７】
【表４】

【００４８】
〔実施例４〕（ジベレリン合成酵素阻害剤の添加時期によるゲラニオゲラニオール類の生産に対する影響）
８％グルコース、１．２％硝酸アンモニウム、０．５％りん酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム（７水和物）、０．５％酵母エキス（Difco社製）、１．５％オートミールを含む培地（オートミール培地）１０ｍｌにGibberella fujikuroi IFO30336株を植菌し、１５０ｒｐｍ、２４℃で１４日間回転培養した。なお、培養開始時、開始後３日、５日、７日目に終濃度１５ｍｇ/Ｌのサイソセルを添加し培養途中に阻害剤を添加した場合の効果を調べた。培養容器はバッフル付きの１００ｍｌ三角フラスコを用い、培養開始後５、１０、１４日目に培養液０．８ｍｌをサンプリングし、実施例３と同様の方法で抽出、ＧＣＭＳ分析した。結果を５に示す。
【００４９】
【表５】

【００５０】
表５から明らかなように培養時、いずれの時期にサイソセルを添加してもゲラニルゲラニオールを合成することができるが、培養初期より添加することが最も効果的であることがわかる。
【００５１】
〔実施例５〕（種々のジベレリン生産株を用いたゲラニオゲラニオール類の生産）
IFO5268、IFO9977、IFO30336、IFO30337、IFO31251株をそれぞれ８％グルコース、１．２％硝酸アンモニウム、０．５％りん酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム（７水和物）、０．５％酵母エキス（Difco社製）、１．５％オートミール１５ｍｇサイソセル（ＧＬサイエンス社製）を含む培地１０ｍｌに植菌し、１５０ｒｐｍ、３０℃で回転培養した。培養容器はバッフル付きの１００ｍｌ三角フラスコに綿栓したものを用いた。培養開始後、5日、９日、１４日目にけん濁液０．８ｍｌを２ｍｌのガラスセルにサンプリングし、実施例３と同様の方法で抽出し、ＧＣＭＳ分析に供した。
このときの分析結果を表６に示す。
【００５２】
【表６】

【００５３】
表６から明らかなようにサイソセルを添加することにより種々のGibberella fujikuroiにおいてゲラニルゲラニオールが生産されることがわかる。
【００５４】
〔実施例６〕
８％グルコース、０．５％りん酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム（７水和物）、０．５％酵母エキス（Difco社製）、１．５％オートミール含むオートミール培地１００ｍｌをバッフル付きの５００ｍｌ三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。別滅菌した硝酸アンモニウム及びメタノールに溶解後フィルター滅菌したサイソセル（ＧＬサイエンス社製）をそれぞれ終濃度１．２％、及び１５ｍｇ/Ｌになるよう添加した。Gibberella fujikuroi IFO30336株のスラントより一白金耳三角フラスコに植菌し、１５０ｒｐｍ、３０℃で3日間回転培養した。次に、４００ｇグルコース、２５ｇりん酸カリウム、５ｇ硫酸マグネシウム（７水和物）、２５ｇ酵母エキス（Difco社製）、３．７５ｇオートミール、５ｍｌアデカノールＬ−６１（旭電化社製）を含む培地５Ｌを丸菱バエイオエンジ社製１０ＬジャーファーメンターＭＳＪ−Ｕ２Ｗに入れ蒸気滅菌した。滅菌後温度が室温に戻った後、別滅菌した１００ｍｌの６％硝酸アンモニウム溶液及びメタノール０．５ｍｌに溶解した７５ｍｇサイソセル（ＧＬサイエンス社製、フィルター滅菌）を添加し本培養液を調製した。三角フラスコの培養液１００ｍｌ全量を加え、30℃、アジテーター４００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、ｐＨ制御なしで８４時間培養した。植菌後、経時的にサンプリングし、実施例３に準じてゲラニルゲラニオール及びその誘導体を抽出し、分析した。この時の培養プロフィールを図１に示す。図１から明らかなように糖源であるグルコースが資化されるとともにゲラニルゲラニオール（ゲラニルゲラニル二リン酸を含む）及びファルネソール（ファルネシル二リン酸を含む）がそれぞれ、１．２mg/L、０．３mg/L生成された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬品・香料・化粧品・食品に利用可能なテルペン類、カロチノイド類、ステロイド類の生合成中間体として有用な、ゲラニルゲラニオールおよびその類縁化合物を大量にかつ安価に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Gibberella fujikuroi IFO30336株のジャーファーメンターを用いた培養プロフィールを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a process for producing geranylgeraniol and its related compounds geranylgeranyl monophosphate, geranylgeranyl diphosphate, farnesol, farnesyl monophosphate, and farnesyl diphosphate using gibberellin-producing bacteria. The compound is useful as a biosynthetic intermediate for terpenes, carotenoids, and steroids that can be used in pharmaceuticals, fragrances, cosmetics, and foods. In particular, geranylgeraniol is an important compound used as a raw material for the gastritis drug prunotol and a geranylgeranylamine derivative (Japanese Patent Laid-Open No. 9-291030) which is an anticancer agent.
[0002]
[Prior art]
Geranylgeraniol and its related compounds are synthesized from acetyl CoA via mevalonic acid and isopentenyl diphosphate. Isopentenyl diphosphate (IPP) is converted to dimethylallyl diphosphate (DMAPP) by IPP isomerase, and IPP of carbon chain 5 is subjected to polycondensation to DMAPP, whereby a series of units comprising isoprene units of carbon chain 5 as structural units. Chain length isoprenoids are synthesized. Geranylgeranyl diphosphate is a compound in which four isoprene units are polycondensed by geranylgeranyl diphosphate synthase, and is a starting material for diterpene compounds such as β-carotene and gibberellin. Farnesyl diphosphate is a compound in which three isoprene units are polycondensed by farnesyl diphosphate synthase and becomes a starting material for steroids and sesquiterpenes. Geranylgeraniol is thought to be synthesized by hydrolyzing geranylgeranyl diphosphate with phosphatase or acid / alkali, and is found in many plants, but its abundance is small. Recently, a method for synthesizing geranylgeraniol and geranylgeranyl diphosphate using cultured cells of Euphorbiaceae plants has been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 9-238692), but light irradiation is required for the culture because of using the cultured cells of the plant. However, there is a problem that mass production is difficult. In addition, a method of producing geranylgeranyl diphosphate synthase in E. coli and synthesizing geranylgeranyl diphosphate enzymatically from IPP and DMAPP as substrates has been developed [JBC, 269, 20, 14792-14797 (1994). )], It is difficult to mass-produce chemically unstable IPP and DMAPP.
[0003]
Meanwhile, rice idiot fungusGibberella fujikuroiSynthesizes 1g / L culture solution of gibberellin, a plant growth hormone, and gibberellin is still produced by the fermentation method using this bacterium. Currently, other bacteria that can mass-produce gibberellins are cassava primates.Sphaeceloma monihoticola[Biochem.Biophys.Res.Comm., 91, 35 (1979)] andPhaeosphaeria There are only three types including sp. (patent 2797331), and these can be said to be unusual microorganisms from the point that such complex compounds are secreted and produced in large quantities. Since geranylgeranyl diphosphate and its related compounds are biosynthetic intermediates of gibberellin, it is considered that these bacteria are producing them. However, rice idiot fungusGibberella fujikuroiThere have been many studies on gibberellin production using gibberellin-producing bacteria, including geranylgeraniol and its related compounds, but there have been no reports of the synthesis of geranylgeraniol and its related compounds so far. However, even when detection was attempted, the amount was such that synthesis could be confirmed slightly depending on the culture conditions.
[0004]
Rice idiot fungusGibberella fujikuroiSynthesizes 1g / L culture solution of gibberellin, which is a plant growth hormone, and gibberellin is still produced by fermentation using this bacterium. Gibberellin is synthesized by more than 20 enzyme reactions from the raw material acetyl-CoA. Despite such a complex biosynthetic pathway, it is synthesized in large quantities, and this pathway is considered to function very efficiently in microorganisms.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to synthesize geranylgeraniol and its related compounds using microorganisms.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have determined that geranylgeraniols are synthesized as a reaction intermediate in the upstream part of a complex biosynthetic pathway consisting of several steps from acetyl-CoA to gibberellin. Paying attention, artificially inhibit ent-kaurene synthase, which catalyzes the enzymatic reaction immediately downstream of geranylgeranyl diphosphate, that is, the synthesis reaction from geranylgeranyl diphosphate to coparyl CoA, by reagent or gene disruption By culturing gibberellin-producing bacteria with reduced or deleted entaurene synthase activity, the inventors succeeded in synthesizing and accumulating geranylgeraniols inside and outside the cells, and completed the present invention.
That is, this invention is invention of the following (1)-(3).
[0007]
(1) A geranylgeraniol obtained by culturing a gibberellin-producing bacterium having reduced or deleted entauuren synthase activity in a medium, accumulating and accumulating geranylgeraniol and its related compounds inside and outside the cell, and collecting the geranylgeraniol And a method for producing the related compound.
[0008]
(2) The method of (1) above, wherein the decrease or deletion of entaurene synthase activity is performed by adding an entaurene synthase inhibitor to the culture medium of gibberellin producing bacteria.
(3) The method according to (1) above, wherein the decrease or deletion of entauuren synthase activity is carried out by destroying or modifying an entaurene synthase gene possessed by a gibberellin producing bacterium.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, geranylgeraniol and its related compounds are produced by culturing gibberellin-producing bacteria having reduced or deleted entaurene synthase activity.
[0010]
The geranylgeraniol and derivatives thereof obtained by the present invention mainly refer to geranylgeraniol, geranylgeranyl diphosphate, farnesol, and farnesyl diphosphate that are produced, but in addition to this, geranylgeranyl diphosphate and farnesyl diphosphate accumulated inside and outside the cell body. In addition to geranyl linanol, nerolidol, farnesol, which is an oxide of farnesol, phosphoric acid hydrolyzed by acid or alkali as a catalyst, dihydrofarnesol partially saturated with double bonds, geranylgeranyl monophosphate, farnesyl monophosphate Also included are acids, linalool, geraniol, geranyl monophosphate, geranyl diphosphate, and the like.
The reduction or deletion of entkaurene synthase activity is performed by adding an entaurene synthase inhibitor to the medium, or by artificially destroying or altering the entaurene synthase gene possessed by the gibberellin producing bacteria.
[0011]
The gibberellin producing bacterium is not particularly limited as long as it is a strain capable of producing gibberellin.Gibberella fujikuroiThe cassava primate fungusSphaeceloma monihoticola ,Phaeosphaeria A high-producing gibberellin-producing bacterium such as sp. can be preferably used. Specifically, it is a well-known strain available in JapanGibberella fujikuroi  IFO 5268, 6349, 6356, 6604, 6605, 6606, 6607, 9976, 9777, 30336, 30337, 31251, etc.Gibberella fujikuroi  0704, 12616, 12781, 12782, 14164, 14842, 20136, 58109, 38938, 38939, 38940, 38941, 52124, 52125, 12765, 12976, 12780, 38937, 42052, 42112, 42178, 52126, 52127, 52128, 52129, 12777, 38932, 38933, 38934, 38935, 52130, 52131, 52132, 52133, ATCCSphaceloma monihoticola44291, 44292 and the like can be mentioned, but are not limited thereto. In addition to these, it is reported that small but gibberellins are produced, such as molds such as Nevrospora crassa, Sporisorium reilianum, Rhizobium phaseoli, Azospirillium lipoferum.
[0012]
When an entaurene synthase inhibitor, which is an embodiment of the present invention, is added to a medium and cultured, the entaurene synthase inhibitor to be used is not particularly limited. For example, 2′-isopropyl-4 ′-(trimethylammonium Chloride) -5′-methylphenylpiperidine-1-carboxylate (AMO1618) or (2-chloroethyl) trimethylammonium chloride (Saisocel) or tributyl-2,4 dichlorobenzylphosphonium chloride (Phosphon D).
[0013]
The inhibitor may be added in an amount of 0.00005 to 0.2% at the start of culture, preferably 0.0003 to 0.05%.
These inhibitors are preferably added and cultured at the start of culture, but the effect can also be obtained by adding them during the culture.
[0014]
In the case of artificially destroying or modifying the entkaurene synthase gene of gibberellin-producing bacteria, which is another embodiment of the present invention, obtaining an entaurene synthase-deficient strain by ultraviolet irradiation or chemical mutagen treatment, entkauren by homologous recombination This is done by disrupting the synthase gene or modifying its promoter.
[0015]
An entkaurene synthase-deficient strain by UV irradiation or chemical mutagen treatment can be obtained by performing the following procedure.
Mutation treatment may be performed on mycelia or spores, but treatment with spores is effective because they are heterokaryons. Gibberellin-producing bacteria cultured in a sporulation medium can be subjected to ultraviolet irradiation, radiation irradiation, NTG, EMS, etc. to induce mutation. Examples of the spore-forming medium include a 1.6% agar medium containing 0.1% yeast extract (manufactured by Difco), 0.1% ammonium nitrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate and 0.05% magnesium sulfate. The ultraviolet irradiation and NTG treatment conditions of the bacteria may be performed with reference to Appl. Env. Micro., 49, 1, p187-191, (1985).
[0016]
After culturing the obtained mutant strain and treating the culture solution with phosphatase, extraction with an organic solvent such as pentane and petroleum ether, GC / MS analysis, and analysis of geranylgeraniol production to obtain a high-producing strain Can do. In order to increase the number of analyses, after culturing the bacteria in a 96-well microtiter plate, a sulfuric acid solution was added and the fluorescence intensity was measured [Appl. Env. Micro., 57, 11, p3378-3382, (1991)]. Strains without production may be subjected to primary screening and subjected to GC / MS.
[0017]
A mutant strain by homologous recombination can be obtained by performing the following procedure.
First, the entaurene synthase gene is cloned according to a conventional method. As the cloning method, for example, a method using PCR, colony hybridization using an oligonucleotide, plaque hybridization, or cloning using an antibody can be performed. To explain the cloning using simple PCR, mRNA may be prepared from the bacterium cultured in gibberellin production medium such as ICI medium for 7 to 10 days by a conventional method, and cDNA may be synthesized. For example, mRNA Purification Kit (Pharmacia) ) And Time Sever cDNA Synthasis Kit (Pharmacia), a cDNA library can be easily prepared. In the case of cloning using PCR, primer design is the key point, but the gene sequence of the filamentous fungus entaurene synthase isPhaeosphaeria sp.(J. Biol. Chem. 1997, 272, 35, 21706-21712) andGibberella fujikuroi IFO 303306 (Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64, 3, 660-664 and Curr. Genet. 1998, 34, 3, 234-240) and homology between these filamentous fungi It can be easily designed from a high array. For exampleGibberella fujikuroi  A PCR primer that can amplify the gene from any filamentous fungus should be designed based on the amino acid sequence shown below of IFO 303306.
[0018]
153-Asp-Thr-Asn-His-Ile-Gly-Val-Glu,
219-Gly-Lys-Leu-Asp-Phe-Asp,
233-Gly-Ser-Met-Met-Ala-Ser-Pro-Ser-Ser-Thr-Ala-Ala,
324-Gly-Val-Ile-Gly-Phe-Ala-Pro-Arg,
334-Asp-Val-Asp-Asp-Thr-Ala-Lys,
383-His-Val-Leu-Leu-Ser-Leu,
426-Leu-Ser-His-Leu-Tyr-Pro-Thr-Met-Leu,
537-Trp-Thr-Ser-Lys-Thr-Ala-Tyr,
541-Ile-Pro-Phe-Thr-Trp-Val-Gly-Cys-Asn-Asn-Arg-Ser-Arg-Thr,
806-His-Val-Ala-Cys-Ala-Tyr-Ser-Phe-Ala-Phe
[0019]
Needless to sayPhaeosphaeria spOrGibberella fujikuroi  In the case of IFO 303306, an encaurene synthase gene fragment can be easily amplified by designing a primer based on any part of the disclosed cDNA sequence. The amplified fragment can then be used as a probe to clone the gene from a genomic DNA library.
[0020]
Next, an enkaurene synthase gene fragment in which the hygromycin resistance gene sequence is inserted and destroyed as a marker sequence is prepared. The hygromycin resistance gene, ie, the hygromycin B phosphotransferase gene is an actinomycete.Streptomyces hygroscopicusSince it is more well known and cloned (Nuc. Acids Res., 1986, 14, 4, 1565-1581), it can be cloned using PCR. A sequence in which the hygromycin resistance gene sequence is inserted in-frame to disrupt the cloned entaurene synthase gene (including upstream and downstream untranslated regions) is constructed. For example, Molecular Plant-Microbe Interactions, 1992, 5, 3 , 249-256, homologous recombination of gibberellin-producing bacteria and searching for hygromycin-resistant bacteria on a plate can yield a disrupted strain of the entaurene synthesis gene. In addition, transformation-mediated mutagenesis using vectors (Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 6, 2558-2564), gene disruption using PCR (Yeast, 1998, 14, 1139-1146) It is also possible to obtain a disrupted strain by, for example.
It is also possible to obtain the same effect by modifying the promoter by homologous recombination to reduce the promoter activity of the entaurene synthase gene of the gibberellin producing bacterium.
[0021]
If the above mutant strains are cultured, geranylgeraniol and its related compounds can be produced in the culture solution or in the cells.
What is necessary is just to use what performs high gibberellin production as a culture medium in the case of culture | cultivation. Examples thereof include ICI medium [Plant and Cell Physiology., 20, 75 (1979)] or oatmeal medium having the following composition.
[0022]
8% glucose
0. 5% yeast extract
1. 5% oatmeal
0.12% NH_FourNO_Three
0. 5% KH₂PO_Four
1. 01% MgSO_Four・ 7H₂O
[0023]
The culture method may be liquid culture using the medium for 3 to 10 days under aerobic conditions. For example, shaking culture using a test tube or Sakaguchi flask, rotating culture of a conical flask with silicosene or cotton plug, and jar fermenter What is necessary is just to perform by the aeration stirring culture | cultivation used.
[0024]
Typical aeration and agitation culture conditions include a culture temperature of 25 to 30 ° C., an agitation speed of 0 to 700 rpm, and an aeration rate of 0.5 to 2 vvm. In any culture method, the culture is usually performed at 20 to 40 ° C., and geranylgeraniol and its related compounds can be produced and accumulated in the culture solution and in the microbial cells within 5 hours to 20 days after the start of the culture.
[0025]
Next, a method for purifying geranylgeraniol and related compounds produced in this manner will be described. That is, the culture solution is directly subjected to solvent extraction with pentane, ethyl acetate, chloroform, normal butanol and the like, and then the solvent layer is concentrated to obtain high-concentration geranylgeraniol and its related compounds. In addition, the culture solution can be directly passed through a column packed with activated carbon, alumina, silica gel, etc., a reverse phase column such as ODS, or a gel filtration column such as Sephadex to obtain high-purity geranylgeraniols. By performing this operation, a high-purity target product can be obtained. In addition, distillation, supercritical extraction, etc. can be considered, and the purity can be further increased by combining with conventional methods.
[0026]
Since most of geranylgeraniol and its related compounds are secreted outside the cells, it can be prepared by the purification method. To increase the production efficiency, the cells are isolated and extracted after crushing them by conventional methods. By doing so, it is possible to efficiently extract the compound synthesized in the fungus body. Examples of cell disruption methods include ultrasonic disruption, freeze-thaw disruption, cell disruption using glass beads, sea sand, metal spheres, etc., pressure disruption using a French press, pectinase, cellulase, chitinase, glucanase The lysis using cell wall crushing enzymes such as these and combinations thereof are conceivable, and any method may be used as long as it is generally used for fungal and yeast cell destruction.
[0027]
It is also possible to prepare a large amount of the compound from the culture supernatant from which the cells have been removed by various membrane filtration, diatomaceous earth filtration, centrifugation and the like, using various solvents and column chromatography. When prepared from the supernatant, it is possible to prevent contamination from bacterial cells, so that purification is facilitated.
[0028]
As described above, geranylgeraniol and its related compounds can be produced by inhibiting entaurene synthase, which catalyzes the reaction of geranylgeranyl diphosphate to coparyl diphosphate in a gibberellin-producing microorganism. When the enzyme is inhibited, the substrate geranylgeranyl diphosphate synthase can be accumulated, but since this is a product of geranylgeranyl diphosphate synthase, geranylgeranyl diphosphate synthase is further inhibited, The substrate farnesyl diphosphate can be accumulated. By synthesizing farnesol and geranylgeraniol, it is considered that these isoprenyl diphosphates are hydrolyzed by phosphatases inside and outside the cells to become prenyl alcohol. Therefore, in order to further increase the production efficiency, the culture solution or the microbial cell disruption extract may be subjected to a phosphatase treatment in advance and then an extraction operation may be performed. Various acid, neutral and alkaline phosphatases can be considered as the phosphatase. For example, potato acid phosphatase, wheat germ acid phosphatase, Escherichia coli alkaline phosphatase, bovine small intestine alkaline phosphatase and the like may be used. The enzyme reaction may be carried out by adding several 0.1 units to several tens units per ml of the culture solution and performing the enzyme reaction for several hours to overnight. In addition, hydrolysis efficiency can be increased by adding 10 to 50% alcohol such as methanol.
[0029]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] (Production of geranigeraniols in culture using a medium supplemented with entaurene synthase inhibitor)
(1) Bacterial culture
Gibberella fujikuroi IFO30336 strain with 8% glucose, 0. 5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate heptahydrate, 0.048% ammonium nitrate, 0.000322% zinc sulfate heptahydrate, 0.0002% ferrous sulfate heptahydrate, 0 0.00003% copper sulfate pentahydrate, 0.00002% manganese sulfate heptahydrate, 0.00002% ammonium molybdate tetrahydrate and gibberellin synthesis inhibitor (entaurene synthase inhibitor, entaurene oxidase inhibitor, One platinum ear was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask with baffle containing 100 ml of a medium (ICI medium) containing 3β-hydroxylase inhibitor, and rotated (150 rpm) at 25 ° C. for 10 days.
The concentrations of gibberellin synthesis inhibitors added and their sources are shown below.
[0030]
(Entokaurene synthase inhibitor)
Cysocel (15mg / L) GL Science
AMO1618 (15mg / L) Wako Pure Chemical
Phosfone D (15mg / L) GL Science
(Entaurene oxidase inhibitor)
Ancimidol (15mg / L) GL Science
Inabenfide (15mg / L) GL Science
Paclobutrazol (15mg / L) GL Science
Uniconazol (15mg / L) GL Science
Unikonazol-P (15mg / L) GL Science
(3β-hydroxylase inhibitor)
Prohexadione (15mg / L) Hayashi Junyaku
[0031]
(2) Cell disruption and phosphatase treatment
20 ml of the culture solution was centrifuged (5500 g, 10 minutes, 4 ° C.), and separated into cells and supernatant. The centrifuged residue was suspended in 20 ml of 250 mM acetate buffer pH 4.7 containing 0.025% Triton X-100 and subjected to crushing with a bead beater (manufactured by BIOSPEC). The whole cell suspension was placed in a 50 ml cell of the same apparatus, and glass beads for yeast disruption (manufactured by Sigma) were added up to the vicinity of the ninth minute of the cell, mounted on the apparatus, and disrupted for 3 minutes while cooling with ice. The bacterial cell disruption solution requiring phosphatase treatment was subjected to the following extraction after adding 11 units of potato acid phosphatase Type ll (Sigma) and performing enzyme treatment overnight at 37 ° C. before extraction.
[0032]
(3) Extraction
(3-1) Extraction of geranylgeraniol and its derivatives from the culture supernatant
Add an equal volume (20 ml) of pentane and 10 ml of methanol to 20 ml of the supernatant in a 50 ml Corning tube, stir well, and then centrifuge (1500 g, 10 minutes, 4 ° C.) to place the pentane layer in a new Corning tube. Transfer. Pentane was dried in a hot water bath, redissolved in 200 μl of pentane and filled in a vial. In the vial, 10 μl of undecanol solution (1 μl / ml ethanol) is placed in advance as an internal standard.
[0033]
The supernatant that requires phosphatase treatment is 5 ml of 1 M acetate buffer (pH 4.8), 125 μl of 5% (w / v) Triton X-solution and 11 units of potato acid phosphatase Type ll (Sigma) before extraction. And the enzyme treatment was performed overnight at 37 ° C. and then subjected to the same extraction.
[0034]
(3-2) Extraction of geranylgeraniols and their derivatives from the cell disruption solution
Transfer the cell disruption solution crushed by the bead beater to a 50 ml Corning tube, add 2 ml of 10 ml of pentane and methanol, stir well, then centrifuge (16000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), and add the pentane layer to a new 50 ml Corning tube. Move to. Next, pentane was dried at room temperature, and then redissolved in 200 μl of pentane and packed in a vial. At this time, as in the case of the culture supernatant, an internal standard was previously placed in the vial.
[0035]
(4) Analysis
The geranylgeraniols and derivatives thus obtained were analyzed under the following analysis conditions using GC / MS5973 manufactured by Hewlett-Packard Company.
[0036]

[0037]
Farnesyl pyrophosphate and geranylgeranyl pyrophosphate cannot be directly analyzed by GC / MS. The phosphatase-treated sample can be measured by GCMS after farnesyl pyrophosphate and geranylgeranyl pyrophosphate are hydrolyzed to geranylgeraniol and farnesol, respectively. Therefore, the phosphatase-treated sample is a sum of geranylgeranyl pyrophosphate and geranylgeraniol or farnesyl pyrophosphate farnesol. The analysis results are shown in Table 1.
[0038]
[Table 1]

[0039]
In the absence of inhibitorsGibberella fujikuroWhen i is cultured, geranylgeraniol and farnesol are not detected, but it can be seen that farnesol and geranylgeraniol are remarkably synthesized when saicocell or AMO1618, which is an inhibitor of entaurene synthase, is added to the medium.
[0040]
[Example 2] (Production of geranigeraniols in culture using a medium supplemented with entaurene synthase inhibitor)
The ICI medium of Example 1 was prepared using 8% glucose, 1.2% ammonium nitrate, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate (7 hydrate), 0.5% yeast extract (manufactured by Difco). ) And 1.5% oatmeal and a medium (oatmeal medium) containing 15 mg / L final concentration of lysocell (manufactured by GL Science), and the same experiment was performed. The analysis results are shown in Table 2.
[0041]
[Table 2]

[0042]
In the same manner as in Example 1, farnesol and geranylgeraniol are synthesized when adding Sisocell and AMO1618, but it is understood that the productivity of the oatmeal medium of Example 2 is higher than that of the ICI medium of Example 1.
[0043]
[Example 3] (Effect of production of geranigeraniols by concentration of entaurene synthase inhibitor)
To 10 ml of the same oatmeal medium as in Example 2, after adding lysocell (manufactured by GL Science) with a final concentration of 0 to 200 mg / L-cultured solution or Phosphon D with a final concentration of 0 to 2000 mg / L-cultured solution,Gibberella fujikuroi IFO30336 strain was inoculated and rotationally cultured at 150 rpm and 24 ° C. The culture vessel used was a 100 ml Erlenmeyer flask with a baffle, which was plugged with cotton, and Sisocell and Phosphon D were dissolved in methanol and then sterilized with a filter and added. On the 5th, 10th, and 14th days after the start of the culture, 0.8 ml of the suspension was sampled into a 2 ml glass cell, and an equal amount of sea sand B was added, and then multi-bead shocker MB-200 manufactured by Yasui Machinery Co., Ltd. The cells were completely disrupted using (2500 rpm, 20 minutes, room temperature). Next, the contents were transferred to a test tube having an inner diameter of 16 mm and a length of 100 mm, and 0.5 ml of 2M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 6 mM magnesium chloride and 2.5 units of E. coli alkaline phosphatase from Takara Shuzo were mixed. The geranylgeranyl diphosphate was hydrolyzed by standing and heating at 65 ° C. for 30 minutes. After sufficiently cooling on ice, add 1 ml of methanol and 2 ml of pentane, and after sufficient stirring, centrifuge in a Beckman centrifuge CP Centrifuge (500 g, 5 minutes, room temperature). Separated. The organic solvent layer was carefully transferred to a new test tube with an inner diameter of 16 mm and a length of 100 mm and air-dried overnight in a fume hood. The extract was then dissolved in 200 μl pentane and transferred to a GCMS vial. At this time, 10 μl of an ethanol solution containing 1 μl / ml undecanol as an internal standard was previously added to the vial. The generated geranylgeraniol was analyzed by GCMS5973 manufactured by Hewlett-Packard Co. under the following conditions.
[0044]

[0045]
The analysis results at this time are shown in Tables 3 and 4. As can be seen from Table 3, the concentration of saisocell added is preferably 0.5 to 200 mg / L-culture medium. In addition, in Examples 1 and 2, the effect of adding Phosphon D was not observed, but it can be seen that it is effective when used at a higher concentration than Sisocell and AMO1618. As is clear from Table 4, in phosphophone D, an effect of producing geranylgeraniol was observed at 15 to 2000 mg / L-culture solution. Therefore, even if there is a difference in concentration, add entaurene synthase inhibitor to the medium.Gibberella fujikuroiIt can be seen that geranylgeraniol and farnesol can be produced by cultivating
[0046]
[Table 3]

[0047]
[Table 4]

[0048]
[Example 4] (Effect of the addition timing of gibberellin synthase inhibitor on the production of geranigeraniols)
8% glucose, 1.2% ammonium nitrate, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate (7 hydrate), 0.5% yeast extract (Difco), 1.5% oatmeal 10 ml of medium containing oatmeal (oatmeal medium)Gibberella fujikuroi IFO30336 strain was inoculated and rotationally cultured at 150 rpm and 24 ° C. for 14 days. In addition, the effect at the time of a culture | cultivation start and adding the inhibitor in the middle of culture | cultivation by adding 15 mg / L saisocell on the 3rd, 5th, and 7th day after the start was investigated. A 100 ml Erlenmeyer flask with a baffle was used as a culture container, and 0.8 ml of the culture solution was sampled on the 5th, 10th, and 14th days after the start of culture, extracted in the same manner as in Example 3, and subjected to GCMS analysis. The results are shown in 5.
[0049]
[Table 5]

[0050]
As is clear from Table 5, geranylgeraniol can be synthesized at any time during culturing, even if saisocell is added, but it can be seen that adding geranylgeraniol is most effective from the initial stage of culturing.
[0051]
[Example 5] (Production of geranigeraniols using various gibberellin producing strains)
IFO5268, IFO9977, IFO30336, IFO30337, and IFO31251 are 8% glucose, 1.2% ammonium nitrate, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate (7 hydrate), and 0.5% yeast, respectively. Inoculated into 10 ml of a medium containing an extract (Difco) and 1.5% oatmeal 15 mg Saisocell (GL Science), and rotationally cultured at 150 rpm and 30 ° C. The culture container used was a 100 ml Erlenmeyer flask with baffle plugged with cotton. On the 5th, 9th and 14th days after the start of the culture, 0.8 ml of the suspension was sampled into a 2 ml glass cell, extracted in the same manner as in Example 3, and subjected to GCMS analysis.
The analysis results at this time are shown in Table 6.
[0052]
[Table 6]

[0053]
As can be seen from Table 6, the addition of lysocellGibberella fujikuroiShows that geranylgeraniol is produced.
[0054]
Example 6
Baffle 100 ml of oatmeal medium containing 8% glucose, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate (7 hydrate), 0.5% yeast extract (Difco), 1.5% oatmeal The mixture was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. SAISOCEL (manufactured by GL Science) dissolved in separately sterilized ammonium nitrate and methanol and then sterilized by filter was added to final concentrations of 1.2% and 15 mg / L, respectively.Gibberella fujikuroiOne platinum ear Erlenmeyer flask was inoculated from slant of IFO30336 strain and rotationally cultured at 150 rpm and 30 ° C. for 3 days. Next, 5 L of medium containing 400 g glucose, 25 g potassium phosphate, 5 g magnesium sulfate (7 hydrate), 25 g yeast extract (Difco), 3.75 g oatmeal, 5 ml Adecanol L-61 (Asahi Denka) Was placed in a 10 L jar fermenter MSJ-U2W manufactured by Maruhishi Bayei Engineering Co., Ltd. and steam sterilized. After returning to room temperature after sterilization, separately sterilized 100 ml of 6% ammonium nitrate solution and 75 mg lysocell (GL Science, filter sterilized) dissolved in 0.5 ml of methanol were added to prepare a main culture solution. A total volume of 100 ml of the Erlenmeyer flask culture solution was added, and the mixture was cultured at 30 ° C., agitator 400 rpm, aeration rate 1 vvm, and pH control for 84 hours. After inoculation, sampling was performed over time, and geranylgeraniol and its derivatives were extracted and analyzed according to Example 3. The culture profile at this time is shown in FIG. As is apparent from FIG. 1, glucose as a sugar source is assimilated and geranylgeraniol (including geranylgeranyl diphosphate) and farnesol (including farnesyl diphosphate) are 1.2 mg / L and 0.3 mg, respectively. / L generated.
[0055]
【The invention's effect】
According to the present invention, geranylgeraniol and related compounds useful as biosynthetic intermediates for terpenes, carotenoids, and steroids that can be used in pharmaceuticals, fragrances, cosmetics, and foods can be produced in large quantities and at low cost. it can.
[Brief description of the drawings]
[Figure 1]Gibberella fujikuroi The culture profile using the jar fermenter of IFO30336 strain | stump | stock is shown.

Claims

Gerberylgeraniol and its analogs are characterized by cultivating gibberellin-producing bacteria with reduced or deleted entauuren synthase activity in a medium, and accumulating and collecting geranylgeraniol and its related compounds inside and outside the cells. Compound production method .

The method according to claim 1, wherein the decrease or deletion of entauuren synthase activity is performed by adding an entaurene synthase inhibitor to a culture medium of gibberellin-producing bacteria.

Entocaurene synthase activator is 2′-isopropyl-4 ′-(trimethylammonium chloride) -5′-methylphenylpiperidine-1-carboxylate or (2-chloroethyl) trimethylammonium chloride or tributyl - 2,4 dichlorobenzyl phosphate The method of claim 2, wherein the method is phonium chloride.

The method according to claim 1, wherein the decrease or deletion of entauuren synthase activity is performed by destroying or modifying an entaurene synthase gene possessed by a gibberellin-producing bacterium.

2. The method according to claim 1 , wherein geranylgeraniol and its related compounds produced and accumulated outside and inside the bacterium after culture are collected by adding, mixing, extracting and concentrating an organic solvent.

6. The method according to claim 5, comprising a step of crushing gibberellin-producing bacteria after culturing and before adding / mixing the organic solvent.

6. The method according to claim 5, comprising a step of adding and warming phosphatase after the cultivation and before adding and mixing the organic solvent.

The method according to claim 5, comprising a step of disrupting gibberellin-producing bacteria, adding phosphatase, and heating after the cultivation and before adding / mixing the organic solvent.

The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the gibberellin-producing bacterium belongs to the genus Gibberella .

10. The geranylgeraniol produced and its related compounds are geranylgeraniol, geranylgeranyl monophosphate, geranylgeranyl diphosphate, farnesol, farnesyl monophosphate, farnesyl diphosphate, any one of claims 1-9 The method described in 1.