JP4122530B2 - 単球の成熟分化因子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体培養において、単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させるとともに、成熟及び分化させる作用を有する新しい生理活性物質（以下、ＭＭＤＦと称する）とその製造方法、クロ−ン化したＭＭＤＦをコードする遺伝子ならびに、ＭＭＤＦ又はその一部を含む医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
単球又はマクロファ−ジは、生体において老廃物を排除する細胞であるとともに生体防御機構において重要な役割を担う細胞である。即ち、外来刺激の認識、貪食、消化、生理活性因子の分泌、抗原提示などの様々な機能により生体防御に関与し、抗菌作用及び抗腫瘍作用などを有する重要な細胞である。このような作用を有する単球又はマクロファージに対し、インビトロで種々の作用を示す物質が発見されてきている。
単球又はマクロファ−ジを活性化する因子としては、インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＭＡＦ（Ｄ．Ｇｅｍｓａら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１、８８３（１９８８））等が公知であり、コロニ−形成刺激因子としては、マクロファ−ジ（単球）コロニ−形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等が公知である。
【０００３】
単球又はマクロファ−ジを感染あるいは炎症の局所に呼び寄せる作用をもつと考えられているマクロファ−ジ遊走因子としては、ＭＣＰ−１（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２４４，４８７−４９３（１９８９）），ＲＡＮＴＥＳ／ＳＩＳ（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌら；Ｎａｔｕｒｅ，３４７，６６９−６７１（１９９０）），ＭＣＡＦ（Ｙ．Ｆｕｒｕｔａｎｉら；ＷＯ９００７８６３）等が明らかにされている。さらに、これら以外にもＭＳＰ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｌｅｏｎａｒｄら；ＵＳ７５８６０８５）と言った因子の存在も示されている。また、無血清培養において、Ｍ−ＣＳＦが単球を生存維持させ、分化させる作用も有することも示されている（Ｗ．Ｂｒｕｇｇｅｒら；Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．，４９，４８３−４８８（１９９１））。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、単球又はマクロファージは、体内に侵入した異物（抗原）や生体内の老廃物の貪食処理、抗原提示、生理活性因子（ＩＬ−１，腫瘍壊死因子ＴＮＦα，インターフェロン等）の分泌等により、生体防御に関与し、抗菌作用、抗腫瘍作用を有する細胞である。しかし、通常、液体培養では単球又はマクロファージは死滅していき、培養６日目頃には殆どの細胞が死んでしまう。
本発明は、かかる技術的背景の下に、単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ作用）を有する蛋白質を、特に遺伝子操作技術を用いて生産し、この蛋白質を種々の薬剤に応用することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために種々検討した結果、単球又はマクロファージを活性化する作用、走化性を刺激する作用あるいはコロニー形成を刺激する作用という従来の生理活性因子の作用とは異なった作用、即ち、単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用、即ちＭＭＤＦ活性をヒト癌細胞株の培養液に見出した。ＭＭＤＦが存在すると、液体培養においても単球又はマクロファージは長期生存維持され、成熟及び分化していく。この作用に着目し、該蛋白質の分離精製ならびに遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は液体培養において、単球またはマクロファ−ジを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（以下、ＭＭＤＦ活性という）を有する蛋白質であることを特徴とする単球の成熟分化因子である。
【０００７】
また、本発明は液体培養において、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡである。
【０００８】
さらに、本発明は発現制御配列を機能しうる形で随伴した、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を含み、微生物、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等の形質転換体の培養において、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベクタ−である。
【０００９】
本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクタ−で形質転換された、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現する能力を有する形質転換体である。
【００１０】
また、本発明は以下の工程を包含する、前述の単球の成熟分化因子を製造する方法である。
（１）ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベクタ−で形質転換された形質転換体を培養する工程。
（２）培養物からＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を採取する工程。
【００１１】
本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を治療上有効な量で含有する医薬組成物である。
【００１２】
本発明は癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、及び創傷治療剤から選ばれる前記医薬組成物である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に係わる、液体培養において単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させ、成熟及び分化させる作用、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質（ＭＭＤＦ）について、次に記す。
ＭＭＤＦ活性測定用の単球は次のようにして調製される。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社）を使用した密度勾配遠心法により、健康な人の末梢血液から単核球細胞を分離し、非働化した血清を含む培地を分注した培養容器に播種する。そして、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にてインキュベ−ションし、壁着性細胞を付着させる。その後、培養容器基面を新鮮な培地で洗浄することにより、非壁着性細胞を洗浄除去する。次に、０．５％ＥＤＴＡと５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含有させた二価金属イオン不含のダルベッコリン酸緩衝液で培養基面を処理することにより、壁着性細胞を剥離する。剥離回収した細胞を新鮮な培地で洗浄し、低血清濃度含有培地を分注したマルチタイタ−ウェルに播種した後、種々のサンプルを各ウェルに添加する。
【００１４】
ＭＭＤＦ活性は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７０、２５７−２６８（１９８４））による細胞数の測定及び、顕微鏡下での細胞形態観察により行う。また、 3Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定することにより、蛋白質の合成能に対する影響を調べる。
その結果、ヒト由来の細胞、好ましくは血液由来の白血球を除く細胞、例えばヒト癌組織由来又はヒト正常組織由来の細胞株、好ましくはヒト甲状腺癌細胞株，さらに好ましくはＴＣＯ−１の培養液に、末梢血由来の単球又はマクロファ−ジを１％以下の低血清濃度添加培地中で、１４日間以上長期生存維持させながら、成熟及び分化させる蛋白質性因子を見出すことができる。
上記活性測定方法を用いて、各種培養細胞や初代培養細胞の培養液、または尿、血清、血漿中のＭＭＤＦ活性の有無を測定することにより、ＭＭＤＦを産生する培養細胞や組織を選択することができ、天然のＭＭＤＦの供給源を特定できる。そして、ここで用いた培養細胞は、樹立された細胞株に限らず、初代培養細胞も含まれる。又、培養細胞の培養上清の調製は、無血清が望ましいが、１−１０％の牛胎児血清又は、０．１−０．５％牛血清アルブミンを含有する培地等でも行われる。
活性測定に使用する血清濃度は、１％以下が好ましいが、基礎培地等の選択によっては、１％以上の血清濃度でも測定可能である。
【００１５】
本発明では、天然のＭＭＤＦの供給源として、ヒト癌細胞株、好ましくはヒト甲状腺癌細胞株，さらに好ましくはＴＣＯ−１を使用し、基礎培地として、例えばＤＭＥＭ培地（日水製薬）とハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を使用する。使用できる培地としては、前述の培地に限られたものではなく市販されているＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等が挙げられる。基礎培地を使って２×１０5 個／ｍｌになるように細胞を調製し、２２５cm2 の培養用フラスコ（コ−スタ−社）等に４０−６０ｍｌ播種し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベ−タ−内で培養する。細胞の増殖がコンフルエント前になったら、培養液を除去し、新鮮な同じ培地と交換する。この培養液の採取回収並びに新鮮培地との交換は好ましくは７日毎に行うが、特に限定されたものではない。
【００１６】
本発明におけるＭＭＤＦ活性を有する物質は、種々の分離操作により単離精製することができる。単離精製方法としては、次の方法が用いられる。
上記ヒト細胞株の培養液を原材料として、種々の分離操作により単離精製することができる。このような方法としては、蛋白沈殿による方法、限外濾過による方法、イオン交換クロマトグラフィ−による方法、疎水クロマトグラフィ−による方法、ゲル濾過又は分子篩クロマトグラフィ−による方法、高速液体クロマトグラフィ−による方法、逆相クロマトグラフィ−による方法、アフィニティ−クロマトグラフィ−による方法、吸着クロマトグラフィ−による方法、色素クロマトグラフィ−による方法、電気泳動による方法などが挙げられる。
蛋白沈殿による方法では、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いることが好ましい。
イオン交換クロマトグラフィ−による方法では、例えば、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、アミノエチル或いは、４級アミノエチル基を官能基として有する陰イオン交換体並びに、カルボキシメチル或いはスルホメチルプロピル基を官能基として有する陽イオン交換体を用いることができる。
疎水クロマトグラフィ−による方法では、フェニルセファロ−ス、オクチルセファロ−ス、ブチルトヨパ−ル等を用いることができる。
吸着クロマトグラフィ−による方法としては、ハイドロキシアパタイト等を用いることが好ましい。
アフィニティ−クロマトグラフィ−による方法としては、抗体結合担体特に、抗体としてはモノクロ−ナル抗体を用いたものが好ましい。
【００１７】
原材料である上記ヒト癌細胞株の培養液を、２．５Ｍ ＮａＣｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた疎水クロマトグラフィ−例えば、ブチルトヨパ−ル（東ソー社）に付し、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出する。該溶出活性画分を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ−（バイオラッド社）に付し、１．４Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出する。ＭＭＤＦ活性を有する該溶出活性画分を、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水クロマトグラフィ−例えば、フェニルセファロ−ス（ファルマシア社）に付し、１．５Ｍから０Ｍへの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配に変化させたトリス塩酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させると、０．７Ｍ付近の硫酸アンモニウム濃度でＭＭＤＦ活性物質が溶出される。該溶出活性画分を、約０．１Ｍ ＮａＣｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、例えば、Ｑ−セファロースカラム（ファルマシア社）に付し、０．１Ｍから０．４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配に変化させたトリス塩酸緩衝液で溶出させる。
その結果、約０．３Ｍ ＮａＣｌ濃度付近にＭＭＤＦ活性物質が溶出される。このようにして得たＭＭＤＦ活性物質を含む画分（以下Ｆｒ．Ｑという）をゲル濾過カラム、例えば、ス−パ−ロ−ズ１２（ファルマシア社）を装着したＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ファルマシア社）に付すと、標準蛋白質との比較によりＭＭＤＦ活性を有する物質の分子量は（４５±５）ＫＤと推定される。
【００１８】
次に、Ｆｒ．Ｑを非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、電気泳動後、ゲルを銀染色キット（和光純薬社）で染色しバンドを確認する。同時に平行して、同条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。電気泳動後、分子量マ−カ−を参考にしてゲルを、１０ＫＤ以下、１０−１６ＫＤ、１６−２２ＫＤ、２２−３１ＫＤ、３１−４６ＫＤ、４６ＫＤ以上の６画分に分割して切り取る。切り取ったゲルを破砕し、０．３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中インキュベ−ションすることにより、蛋白質を抽出後、ＳＤＳ除去カラム、例えば、Ａｍｐｕｒｅ ＤＴ（アマシャム社）に付してＳＤＳを除去する。その後、抽出した試料について活性を測定した結果、１６−２２ＫＤ画分にだけ活性を認める。
【００１９】
Ｆｒ．ＱをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、クマシ−ブリリアントブル−染色を行い、分子量２０ＫＤ付近のバンドの見える箇所のゲルを切り出し、水で脱色を行う。その後、ゲルをエッペンドルフチュ−ブ内ですりつぶし、０．３％ＳＤＳを含むトリス塩酸緩衝液を加えてよく混合後、リシルエンドペプチダ−ゼ（和光純薬社）を加えて３７℃で１５時間インキュベ−ションする。反応液を濾過後、４ＳＤＳガ−ドカ−トリッジ（ポリＬＣ社）を装着させたマイクロボンダスフェア−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（ウォ−タ−ズ社）に付すことによりペプチド断片を分離する。溶離液Ａとして、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、溶離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソプロピルアルコ−ルとアセトニトリルの１：１の混合液を用い、０％から９５％までＢ液の濃度を直線的に増加させることによりペプチド断片を溶出させる。さらに、分離したペプチド断片をプロテインシ−クエンサ−（４７７Ａ形 アプライドバイオシステムズ社又は、ＰＰＳＱ−１０形 島津製作所）に付してエドマン分解し、そのアミノ酸配列を読み取り決定する。その結果、天然のＭＭＤＦには、少なくとも配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１に示されるアミノ酸配列を含むことが明らかになる。
【００２０】
天然のＭＭＤＦに含まれる部分アミノ酸配列を基に、その配列をコ−ドすると考えられるＤＮＡの塩基配列を予測することができる。
方法としては、次の方法を用いる。
【００２１】
ＭＭＤＦの産生細胞であるヒト癌細胞株、例えばヒト甲状腺癌細胞株，好ましくはＴＣＯ−１から全ＲＮＡを抽出後、ｍＲＮＡを精製する。そして、天然のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析により明らかにされた配列番号４−１１を基に、その配列をコ−ドすると考えられるＤＮＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ型、アプライドバイオシステムズ社）で合成する。この合成したオリゴヌクレオチドをプライマ−とし、ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した結果、プライマ−として使用したアミノ酸配列以外に、部分アミノ酸配列の解析で得られた他の部分アミノ酸配列をもコ−ドするＤＮＡ断片を得る。次に、該ヒト癌細胞株のｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡライブラリ−を作製し、得られたライブラリ−より上記ＲＴ−ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプロ−ブとしてスクリ−ニングする。
【００２２】
その結果、得られた陽性クロ−ンを大腸菌に感染させ培養した後、ファ−ジＤＮＡを調製する。さらに、このファ−ジＤＮＡを制限酵素で消化後、プラスミドベクタ−に挿入し、クロ−ン化プラスミドＤＮＡを得る。このＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素切断点地図を得、さらに全塩基配列を決定する（配列番号２）。次に、その塩基配列より推定されるコ−ド領域のアミノ酸配列を決定する（配列番号１）。得られたｃＤＮＡクロ−ンが求めるＭＭＤＦをコ−ドするものであるかどうかの確認は、天然のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列が、クローンにコードされているかどうかで判断できる。推定したアミノ酸配列には、分泌シグナルであると予想される配列に続き、アミノ末端と考えられる配列及び部分アミノ酸配列解析で得られたすべての配列が含まれていることを確認できる。
【００２３】
本発明の蛋白質は、上記のアミノ酸配列を有する蛋白質に限定されるものではなく、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸、該アミノ酸配列のうち、少なくとも１つが削除または置換されたアミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質等が包含される。また、本発明のＤＮＡは、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、例えば配列番号２に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド、該ヌクレオチド配列のうち、少なくとも１つが削除または置換されたヌクレオチド配列を有するか、または該ヌクレオチド配列に少なくとも１つのヌクレオチドが付加又は挿入されたヌクレオチド配列を有し、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡが包含される。
【００２４】
以上の様にして前述のＤＮＡを得、そのｃＤＮＡ又はその主要部分を挿入した発現ベクタ−により、形質転換用の宿主、例えば微生物、好ましくは大腸菌、枯草菌、及び酵母からなる群から選択される微生物、又は昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞、好ましくはＣＯＳ−１，ＣＨＯ，ＢＨＫ及びＣ１２７Ｉからなる群から選択される哺乳動物細胞を形質転換させ形質転換体を得る。得られた形質転換体を用いて組換えＤＮＡ技術を適用することにより発現させ、活性の確認をおこなう。その場合、宿主によって、使用するベクタ−は使い分けられる。このようにしてＭＭＤＦを発現させる。
【００２５】
本発明により得られるＭＭＤＦ活性を有する蛋白質は、貪食能、生体防御作用、抗菌作用、抗腫瘍作用を有する単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用があることから、通常使用される担体等と共に医薬組成物とされ、癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤として利用することができる。
本発明におけるＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を含有する癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤は、経口あるいは静注、点滴、皮下注射により投与されうる。その投与に際しては、それぞれの投与経路に応じて適当な形態、例えば経口製剤、注射剤，外用剤として製剤される。これらの製剤はそれぞれ常法によって製造され、通常それぞれの剤型に応じた製薬上許容される担体又は添加物が配合される。当該治療剤に含有される、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質の量は、投与方法、剤型、適用疾患等に応じて適宜変更されうるので特に限定されない。
当該治療剤の投与量は、適用疾患、疾患の程度、投与方法、患者の年齢等により異なるが、例えば癌患者に対して、静脈点滴により投与する場合、通常１００〜１０００μｇ／ｍ ２ を１日１回投与する。
【００２６】
【実施例】
次に実施例により、本発明の単球の成熟分化因子（ＭＭＤＦ）の活性測定、精製、部分アミノ酸配列、遺伝子クロ−ニング並びに発現について説明する。
実施例１ ＭＭＤＦ活性測定用単球の調製およびその活性測定方法
ヒト末梢血１００ｍｌに等量のハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を混合して希釈血液を調製し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ、登録商標：Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ 社）１５ｍｌに対し、該希釈血液を３０ｍｌの割合で、両液が混じらないように静かに重層し、１６００ｒｐｍで３０分間、２５℃で遠心した。
中間部に形成された単核球層を回収し、ハムＦ−１０培地に分散させ、１６００ｒｐｍで１５分間、２５℃で遠心分離を行った。得られた細胞集塊を、再度、ハムＦ−１０培地に分散させ、１２００ｒｐｍで５分間、２５℃で遠心分離を行った。
次に、得られた細胞集塊を非働化した牛胎児血清（ＦＣＳ）１０％を含有するハムＦ−１０培地に分散させ、チュルク染色液を使って細胞数の測定を行い、約７×１０6 個／ｍｌに調整し、非働化ＦＣＳ１０％含有ハムＦ−１０培地の入った培養用プラスティック製フラスコ（コ−スタ−社）に播種した。
その後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて１時間インキュベ−ションし、培養液を除き、新鮮な同培地で４回培養基面を洗浄した。その後、基面に壁着している単球を剥離させるため、０．５％ＥＤＴＡと非働化ＦＣＳ５％を含有するダルベッコリン酸緩衝液（日水製薬）を上記フラスコに添加し、４℃で３０分間インキュベ−ションした。
最後に、フラスコを手で叩いて衝撃を与えて細胞を剥離させ、細胞を回収し、活性測定用の単球として使用した。
このようにして得た単球浮遊液をダルベッコリン酸緩衝液に希釈し、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上清を廃棄した。
次に、１％非働化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に細胞を浮遊させ、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上清を廃棄し、最終的に１％非働化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に浮遊させた。
チュルク染色液で細胞数を測定し、２×１０5 個／ｍｌに調整して９６穴マイクロタイタ−プレ−ト（コ−スタ−社）に５０μｌ／穴を播種した。
その後、試料を５０μｌ／穴に添加し、炭酸ガスインキュベ−タ−内にて培養を行った。培養中、２〜３日毎に１回、ＭＴＴ法で細胞数を測定し、培養の経過を追跡した。
【００２７】
また、上記のように調整した単球を９６穴マイクロタイタ−プレ−トに１×１０4 個／穴で播種し、培養の途中で、測定の前日より放射性標識物質である 3Ｈ−ロイシンを１μＣｉ／ｍｌ添加して２４時間パルス標識した後、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ含有のトリプシン溶液で処理することにより細胞を剥離し、セルハ−ベスタ−（スカルトン社）によりガラスフィルタ−上に細胞を捕獲した。その後、４℃でトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中にガラスフィルタ−上に捕獲した細胞を浸積し、洗浄後、乾燥した。そして、シンチレ−タ−（アムライト、登録商標：デュポン社）３ｍｌを添加したバイアル内にフィルタ−を入れ、液体シンチレ−ションカウンタ−でＴＣＡ不溶性画分への取り込み量を測定した。
【００２８】
実施例２ ヒト末梢血由来の単球に対する作用
実施例１で示した活性測定法により、粗精製のＭＭＤＦの活性を測定した。図１に示されるように、粗精製したＭＭＤＦを総蛋白濃度で０．０１〜１μｇ／ｍｌまで添加し、ＭＴＴ法で細胞数をカウントし、培養経過を追跡した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、長期間即ち１４日間以上単球が生存維持されることが認められた。その時、細胞形態を顕微鏡下で観察すると、無添加コントロ−ル群では形態に変化はなく、細胞は死んでいき、培養６日目頃には殆ど死滅したが、ＭＭＤＦ添加群では、殆どの細胞が生存し、マクロファ−ジ様に大きくなって成熟及び分化していくのが認められた。
【００２９】
また、実施例１で示した 3Ｈ−ロイシンの取り込み法により、単球の蛋白質合成能に対するＭＭＤＦの影響を調べた。今回、培養経過の内、培養開始日、６日目、及び９日目の細胞について 3Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、表１に示すように、培養６日目並びに９日目ともに著しく 3Ｈ−ロイシンの取り込み量が増加されることが認められた。すなわち、単球がＭＭＤＦにより成熟及び分化させられた結果、単球の蛋白質の合成が活発に促進されたものと考えられる。
【００３０】
【表１】
【００３１】
次に、実施例１で示した方法と同様な方法でヒト単核球を分離し、末梢血供与者の自己血清を１％含有するハムＦ−１０培地にその細胞を浮遊させ、チュルク染色液で細胞数をカウントし、１×１０6 個／ｍｌに調整した。その単核球を１×１０6 個／穴で２４穴マルチウェルデッシュ（ファルコン社）に播種した。その後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内に３時間インキュベ−ションし、壁着性細胞を基面に付着させた。次に、パスツ−ルピペットを使いピペッテング洗浄により非壁着性細胞を取り除いた。再度、ダルベッコリン酸緩衝液を約１ｍｌ／穴添加し、ピペッテング洗浄により非壁着性細胞を取り除いた。そこに上記と同様の血清及びＭＭＤＦを含むハムＦ−１０培地を添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて培養を行い、２〜３日毎に核カウントを行って培養経過を追跡した。培養基面に付着して残っている細胞が、９０％以上単球であることを、非特異的エステラ−ゼ染色により確認した。また、核カウントは、培養液除去後、０．１％クエン酸ナトリウム、１％セタブロン（Ｃｅｔｈｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）と０．０５％ナフト−ルブル−ブラックを含有する溶液を５０μｌ／穴添加し、３７℃で３０分間インキュベ−ションして細胞質の溶解並びに核染色を行い、血球計算盤により測定を行った。その結果、ＭＭＤＦを添加すると殆どの単球が、１４日間以上生存維持され、マクロファ−ジ様に成熟及び分化されることが認められた。
【００３２】
実施例３ 甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培養液からのＭＭＤＦの精製
甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養は、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イ−グル最小必須培地：ニッスイ製薬）とハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を用い、無血清培地下で炭酸ガスインキュベ−タ−を使い、５％炭酸ガス濃度及び３７℃の条件で行った。
甲状腺癌細胞株からＭＭＤＦを産生させるには、次のようにして行った。上記培地を用いて該細胞を２×１０5 個／ｍｌの細胞数に調整し、培養面積２２５ｃｍ2 の培養フラスコ（コ−スタ−社）に４５ｍｌずつ播種した。培養は、５％炭酸ガス濃度，３７℃で行なった。細胞の増殖がコンフルエント前になったら、新鮮な培地３０ｍｌに交換し、７日毎に培養液採取並びに新鮮培地との交換を行い、ＭＭＤＦの生産を行った。
【００３３】
以上のようにして得た培養液１０〜２０リットルを、２．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性クロマト樹脂であるブチルトヨパ−ル（東ソ−社）を充填したカラムに付し、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。次に、該溶出活性画分を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（バイオラッド社）を充填したカラムに付し、１．４Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。
【００３４】
次に、該溶出活性画分に、最終濃度が１．５Ｍになるように硫酸アンモニウムを加え、混合攪拌した。この溶液を、１．５Ｍ 硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性クロマト樹脂であるフェニルセファロ−ス（ファルマシア社）を充填したカラムに付し、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０Ｍの濃度までの直線的勾配で蛋白質を溶出させた。その結果、約０．７Ｍ 硫酸アンモニウム濃度でＭＭＤＦ活性を有する物質が溶出された。得られた該活性画分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロ−スハイパフォ−マンス（ファルマシア社）を充填したカラムに付し、塩濃度を０．１Ｍから０．４Ｍまでの直線的勾配で上昇させることによりＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。その結果、図２に示されるように、約０．２５Ｍ ＮａＣｌで溶出される画分に活性ピ−クを認めた。さらに、該活性画分をゲル濾過樹脂であるス−パ−ロ−ズ１２ＨＲ１０／３０（ファルマシア社）を充填したカラムでＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶出し、各画分の活性測定を行った。その結果、分子量約４４ＫＤにＭＭＤＦ活性ピ−クを認めた。
【００３５】
実施例４ 甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培養液から精製したＭＭＤＦのポリアクリルアミドゲル電気泳動
０．１％のＳＤＳを含む分離用１６％ポリアクリルアミドゲルに、実施例２で得られた試料、すなわち、Ｑ−セファロースハイパフォーマンスカラムで分画されたＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を付し、非還元条件下及び還元条件下で電気泳動を行った。ゲル内には０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、泳動内には０．１％ＳＤＳと１９２ｍＭグリシンを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた。１５ｍＡの定電流で２時間泳動後に、ゲル中の蛋白質を銀染色キット（和光純薬社）で染色し、泳動の結果を図３に示す。標準分子量マーカーの分子量（ＫＤ）をレーン左側に記載した。レーン１は標準分子量マーカー（ファルマシア社）、レーン２は、実施例２で精製した画分を還元下で泳動した結果を示し、レーン３は、非還元下で泳動した結果を示す。同時に平行して、非還元下の同条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、電気泳動後のゲルを６画分に切り取った。すなわち、標準分子量マ−カ−との相対的位置からの算定により、１０ＫＤ以下、１０〜１６ＫＤ、１６〜２２ＫＤ、２２〜３１ＫＤ、３１〜４６ＫＤ、４６ＫＤ以上の６画分にゲルを分割して切り取った。切り取ったゲルを破砕し、０．３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中インキュベ−ションすることにより蛋白質をゲルから抽出した。その後、ＳＤＳ除去カラムのＡｍｐｕｒｅ ＤＴに付して、ＳＤＳを除去した試料について、実施例１で示した方法によりＭＭＤＦ活性を測定した。その結果、１６〜２２ＫＤ画分にだけ活性が認められた。
【００３６】
実施例５ 甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養液から精製されたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析
実施例３で精製したＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を約５μｇ／レーン相当で１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、クマシーブリリアントブルーで染色を行った。その後、２０ＫＤ付近のバンドの見える箇所のゲルを切り出し、水で脱色を行った。さらに、該ゲルをエッペンドルフチュ−ブ内でよくすり潰し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）と０．３％ＳＤＳ溶液を加えて良く混ぜた後、２５０ｐｍｏｌｅのリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）を加えて、３７℃で１５時間インキュベーションを行った。消化後、１μｌのβ−メルカプトエタノールを添加し、さらに３７℃で１時間インキュベーションを行い、０．２２μｍのフィルターで濾過し、４ＳＤＳガードカートリッジ（ポリＬＣ社）を繋いだマイクロボンダスフェアーＣ１８（５μｍ、３００Å）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社）を用いてペプチド断片を分離した。溶離液Ａとして、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、溶離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソプロピルアルコールとアセトニトリルの１：１の混合液を用い、４０分間に０％から４０％までＢ液を直線的に増加させた後、次の２０分間に４０％から８０％まで直線的に増加させ、さらに、次の１０分間に８０％から９５％まで増加させ、最終的に１０分間、９５％で流しペプチド断片を溶出させた。次に、分離されたペプチド断片をプロテインシークエンサー（４７７Ａ形 アプライドバイオシステムズ社又はＰＰＳＱ−１０形 島津製作所）を用いてアミノ酸配列を読み取り決定した。その結果、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１に示されるアミノ酸配列が決定され、天然のＭＭＤＦには、少なくともこれら配列番号４−１１に示されるアミノ酸配列が含まれることが明らかになった。
【００３７】
次に、上記と同様に実施例３で精製したＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）をさらにフェニル５ＰＷ ＲＰ逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社）に付し、分離精製を行った。溶離液Ａ及びＢは、上記マイクロボンダスフェアーＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムの場合と同じ組成の溶液を使用し、３５分間に５％から４０％までＢ液を直線的に増加させた後、次の２０分間で４０％から８０％まで直線的に増加させ、ＭＭＤＦ活性画分をさらに分離精製した。そして、５本の蛋白質ピークが得られたので、それらを分画し、マススペクトル分析を行った（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：フィニガンマット社）。その結果、１６３４３．５ダルトン、１７３２１．９ダルトン、１７７１２．０ダルトン、１７８３３．６ダルトン、１８５７７．９ダルトンのスペクトルが観測された。マススペクトルの精度を約０．０４％とし、配列番号１を参考にすると、Ｃ末端アミノ酸は、１７７番のグリシン（Ｇｌｙ），１８６番のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、１９０番のバリン（Ｖａｌ），１９１番のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ）であると推定された。従って、ＴＣＯ−１細胞由来の天然のＭＭＤＦは、プロセッシングによりＣ末端にヘテロジェネイティーを有していることが示唆され、少なくとも配列番号１で示される２５番のスレオニンから１７７番のグリシンまでを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１８６番のアスパラギン酸までを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１９０番のバリンまでを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１９１番のグルタミン酸までを含む蛋白質、及び２５番のスレオニンから１９７番のグルタミン酸までを含む蛋白質が含まれていることが考えられた。
【００３８】
実施例６ ＭＭＤＦをコ−ドするｃＤＮＡのクロ−ニング
ＭＭＤＦを産生するヒト甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１をＲＮＡ調製の供給源とした。細胞は、ＤＭＥＭ培地とハムＦ−１０培地を３：１に混合した培地で維持した。全ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，（１９８７））に従い抽出した。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ Ｓｕｐｅｒ（日本合成ゴム株式会社）を使用した。
実施例５で得られたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列解析の結果の中より、配列番号８に含まれるＩｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを基に、５’−ｄ［ＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＧ］−３’、配列番号１１に含まれるＧｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎを基に、５’−ｄ［ＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣ］−３’の配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ形、アプライドバイオシテムズ社）を用いて合成した。上記ｍＲＮＡ０．２μｇを鋳型としてＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（アマシャム社）を用いて、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６８（１９８３））で１本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、これを鋳型に上記２種のオリゴヌクレオチド及びＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジ−ン社）を使用して９５℃で５分を１サイクル、９５℃で１分、６５℃で２５分、７５℃で３分を４０サイクルの条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。その結果、得られた３２１塩基対のＤＮＡ断片を、一旦、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミドベクタ−（ストラタジ−ン社）の制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位にサブクローン化した後、塩基配列をＰＲＩＳＭＤｙｅＤｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ と３７３Ａ型ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマ−社）を用いて決定した結果、ＰＣＲプライマーの設計に使用したアミノ酸配列以外に、部分アミノ酸配列の解析で得られていた他の部分アミノ酸配列がコードされていることが確認された。
【００３９】
次に、上記ＭＭＤＦ産生細胞のｍＲＮＡ３μｇを鋳型にしてｃＤＮＡライブラリ−を作製した。すなわち、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｌｕｓ（アマシャム社）を用いて合成した２本鎖ｃＤＮＡに、Ｒａｐｉｄ ａｄａｐｔｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム社）を用いて、ＥｃｏＲＩアダプタ−を付加したものを、ＥｃｏＲＩ消化済のλｇｔ１０ア−ム（ストラタジ−ン社）に結合した後、ＧｉｇａｐａｃｋII ｇｏｌｄ（ストラタジ−ン社）を用いてパッケ−ジングした。上記ＲＴ−ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍと［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社）で標識したものをプロ−ブとして使い、得られたｃＤＮＡライブラリ−のうち、４０万個の組換えファ−ジを以下の方法でスクリ−ニングした。すなわち、２３cm×２３cmのＬＢ寒天培地上に、組換えファ−ジ１０万個と大腸菌ＮＭ５１４株と０．７％アガロ−スを含むＬＢ軟寒天培地と共に重層したものを４枚調製し、３７℃で１２時間、４℃で１時間保温した。生じたプラークをニトロセルロースフィルターに移し、１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に１分、１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５分、２×ＳＳＣに５分浸した後、風乾し、ベーキング処理を８０℃で２時間行ってＤＮＡを固定した。
該フィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有６×ＳＳＣに浸し、６０℃で２０分保温した後６×ＮＥＴ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１％ＳＤＳ及び大腸菌ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で、６５℃で２時間保温し、次いで同じ組成溶液で標識プロ−ブを含むハイブリダイゼ−ション溶液中で６５℃で１８時間保温した。保温後、フィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣに浸し、６５℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルムと増感スクリ−ンをあてて、−８０℃で４８時間露光した。現像後、陽性プラ−ク候補を選択した。
同様の方法で２次スクリーニングを実施し、７クローンの陽性が確認された。得られた７クロ−ンについて、以下のようにしてサブクローニングを実施した。
【００４０】
大腸菌ＮＭ５１４株にクローンのファージ懸濁液を感染させたものにＮＺＹＭ培地を加えた後、３７℃で１８時間振とうして溶菌液を得た。遠心分離した上澄みにＤＮａｓｅとＲＮａｓｅをそれぞれ１０μｇ／ｍｌを添加し、３７℃で２０分保温後、ＰＥＧ６０００を１０％、ＮａＣｌを１．２５Ｍになるように添加して氷上で１時間冷却した。その後、遠心分離によってファ−ジ粒子を含む沈殿を得、１％ＳＤＳ存在下、６５℃で５分保温した後フェノ−ル抽出及びエタノ−ル沈殿を行ってファージＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。それぞれのサブクローンプラスミドＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素切断点地図を作製したところ、これらクローンは同様のパターンを示したので、その中から３クローン（＃３、＃５、＃１１）を選び、塩基配列を決定した。その結果、クロ−ン間に塩基配列の不一致は認められなかったので、最長のクロ−ン（＃５）を選び、以下の実験に使用することとした。
【００４１】
＃５の塩基配列（配列番号２）から推定されたコ−ド領域中のアミノ酸配列（配列番号１）中には、分泌シグナルであると予想される配列に続き、アミノ末端と考えられる配列（配列番号４）並びに、部分アミノ酸配列解析で得られた全ての配列が含まれていることが確認された。クローン＃５ｃＤＮＡのコード領域を含むＳｍａＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿入してｐＢＳ［ＭＭＤＦ＃５］を得た。このプラスミドＤＮＡにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＢＳ（ＭＭＤＦ＃５）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１２月２５日に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３７１）。
【００４２】
実施例７ ＣＯＳ−１細胞によるＭＭＤＦの発現
動物細胞での発現ベクタ−であるｐＣＤＭｍｃｓに実施例６で得られたｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入した。すなわち、発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓは、Ｓｅｅｄ（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２（１９８７））によって開発されたｐＣＤＭ８のクローニング部位を含むＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片をプラスミドＲｃ／ＲＳＶ（インビトロジェン社）の同断片で置き換えたものである。
次に、実施例６で得たプラスミドＤＮＡｐＢＳ［ＭＭＤＦ＃５］を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｈｏＩで切断して生じた断片を、ｐＣＤＭｍｃｓのＥｃｏＲＶとＸｈｏＩの消化部位に挿入して発現ベクタ−ｐＣＤＭｍｃｓ［ＭＭＤＦ＃５］を得た。
次に、調製したプラスミドＤＮＡ２μｇ／ｍｌ、ＤＥＡＥデキストラン１００μｇ／ｍｌ、およびクロロキン１００μＭを含むＤＭＥＭ培地３ｍｌを、予めＣＯＳ−１細胞１×１０6 個を播種したディッシュに添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキュベーションした。その後、培地を抜き取り１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）および１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１．５ｍｌを添加して室温で２分間インキュベ−ションした後、ゲンタシン５０μｇ／ｍｌ及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地３ｍｌと培地交換をした。２４時間インキュベ−ション後、再度、ＤＭＥＭ培地３ｍｌと培地交換をし、同じ５％炭酸ガスインキュベータ内で培養した。６日間培養後、培養液を回収し組換え型ＭＭＤＦ（ｒＭＭＤＦ）のサンプルとした。
【００４３】
次に、上記と同様にして、配列番号１に示される１番のメチオニンから１９７番のグルタミン酸までをコ−ドする遺伝子、１番のメチオニンから１８６番のアスパラギン酸までをコ−ドする遺伝子を各々別々に発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓに挿入し、各々の発現ベクタ−を作製した。さらに、同条件でＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションさせ、６日間培養後の培養液を回収した。以下、配列番号１をコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ、１番のメチオニンから１９７番のグルタミン酸までをコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）、１番のメチオニンから１８６番のアスパラギン酸までをコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）とよぶこととした。
【００４４】
実施例８ 各種組換え型ＭＭＤＦの活性測定
実施例７で示したように、得られた各種組換え体の培養液、すなわち、ｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）、ｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）について、実施例１で示した活性測定方法で活性を測定した。同時に、ＭＭＤＦの遺伝子を含まない発現ベクタ−で形質転換させた細胞（Ｍｏｃｋ細胞）の培養液についても、並行して、その活性を測定した。その結果、形質転換体の培養液であるｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）およびｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）にはＭＭＤＦ活性が認められたが、Ｍｏｃｋ細胞の培養上清にはＭＭＤＦ活性は認められなかった。
【００４５】
実施例９ 各種臓器及び細胞株におけるＭＭＤＦ遺伝子の発現
ヒトの各種臓器から抽出したｍＲＮＡを各２μｇずつ、予めナイロンメンブランに固定してあるＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（クロンテック社）のＨｕｍａｎ，ＨｕｍａｎIIを５×ＳＳＰＥ，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳおよび超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で、４２℃で３時間保温した後、実施例６で示したものと同じ標識プロ−ブを含むプレハイブリダイゼ−ション溶液と同組成のハイブリダイゼ−ション溶液中で、４２℃で１８時間保温した。その後、メンブランを０．１％ＳＤＳ含有の１×ＳＳＣに浸し６５℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルムと増感スクリ−ンをあてて、−８０℃で７２時間露光後、現像した。
以上のようにして、ＭＭＤＦ遺伝子の発現分布をノ−ザンブロッティングで調べた。その結果、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および結腸にＭＭＤＦ遺伝子の発現を示す約３．０ｋｂと約２．１ｋｂのバンドが認められたが、末梢血由来白血球にはその存在は認められなかった。
【００４６】
次に、ヒト由来細胞株であるＡ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２９）、ＫＡＴＯ−III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）、ＴＣＯ−１（ＪＣＲＢ０２３９）の細胞より調製したｍＲＮＡ各３μｇを、５０％ホルムアミド、７．２％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 酢酸ナトリウム、エチジウムブロマイド２０μｇ／ｍｌからなる溶液２０μｌに溶解し、６５℃で１０分間保温した。その後、１．２％アガロ−ス、６．６％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 酢酸ナトリウムからなるアガロ−スゲルに付し、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ 酢酸ナトリウムからなる泳動用溶液中で電気泳動を行った。
【００４７】
電気泳動後、ゲルを水に５分間浸した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ中で３０分、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分処理し、ゲル中のｍＲＮＡを、１０×ＳＳＣを用いたキャピラリ−法でナイロンメンブランに移した。そのメンブランを２×ＳＳＣでリンスした後、風乾し、８０℃で２時間ベーキングしてＲＮＡを固定した。次に、メンブランを０．１％ＳＤＳ含有の４×ＳＳＣに浸し、５０℃で１０分間保温した後、６×ＳＳＰＥ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド及び超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で４５℃で２時間保温した。そして、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌおよび上記と同様に実施例６で示したものと同じ標識プロ−ブからなるハイブリダイゼ−ション溶液中で４５℃で１８時間保温した。その後、メンブランを上記と同様に洗浄、乾燥、露光の操作を実施した結果、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及び、ＴＣＯ−１にＭＭＤＦ遺伝子の発現を認めた。
【００４８】
実施例１０ 白血病細胞株（Ｕ９３７）に対するＭＭＤＦの作用
白血病細胞株（Ｕ９３７）を１０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地に浮遊させ、２×１０５個／ｍｌに調製後、９６穴マイクロタイタープレート（コースター社）に５０μｌ／穴を播種した。その後、粗精製したＭＭＤＦを総蛋白質濃度で０．１μｇ／ｍｌ添加し、組換え型ＭＭＤＦについては、実施例７で示したように、得られた組換え体の培養液（ｒＭＭＤＦ）並びに、Ｍｏｃｋ細胞の培養液を各１０％添加して３日間培養を行った。ＭＴＴ法で細胞数をカウントした結果、Ｍｏｃｋ細胞の培養液添加群では細胞にまったく影響はなかったが、粗精製ＭＭＤＦ添加群では約４０％の増殖抑制が認められ、ｒＭＭＤＦ添加群では約３０％の増殖抑制が認められた。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、外来刺激の認識、貪食、消化、生理活性物質の分泌、抗原提示などの様々な機能により、生体防御に関与し、抗菌作用および抗腫瘍作用などを有する細胞である単球或いはマクロファージに対し長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用をもつＭＭＤＦが得られた。その結果、抗癌剤、免疫賦活剤、感染症治療剤として医薬への応用が可能になった。また本発明により、ＭＭＤＦのｃＤＮＡがクローン化され、組換え型ＭＭＤＦの活性も確認されたことから、遺伝子操作技術の方法を用い、ＭＭＤＦの大量生産も可能になった。
【００５０】
【配列表】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト末梢血由来の単球を使い、ＭＭＤＦの活性をＭＴＴ法で測定した結果を示す図である。
【図２】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−による、ＭＭＤＦの精製結果を示す図である。
【図３】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−により精製されたＭＭＤＦのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体培養において、単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させるとともに、成熟及び分化させる作用を有する新しい生理活性物質（以下、ＭＭＤＦと称する）とその製造方法、クロ−ン化したＭＭＤＦをコードする遺伝子ならびに、ＭＭＤＦ又はその一部を含む医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
単球又はマクロファ−ジは、生体において老廃物を排除する細胞であるとともに生体防御機構において重要な役割を担う細胞である。即ち、外来刺激の認識、貪食、消化、生理活性因子の分泌、抗原提示などの様々な機能により生体防御に関与し、抗菌作用及び抗腫瘍作用などを有する重要な細胞である。このような作用を有する単球又はマクロファージに対し、インビトロで種々の作用を示す物質が発見されてきている。
単球又はマクロファ−ジを活性化する因子としては、インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＭＡＦ（Ｄ．Ｇｅｍｓａら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１、８８３（１９８８））等が公知であり、コロニ−形成刺激因子としては、マクロファ−ジ（単球）コロニ−形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等が公知である。
【０００３】
単球又はマクロファ−ジを感染あるいは炎症の局所に呼び寄せる作用をもつと考えられているマクロファ−ジ遊走因子としては、ＭＣＰ−１（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２４４，４８７−４９３（１９８９）），ＲＡＮＴＥＳ／ＳＩＳ（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌら；Ｎａｔｕｒｅ，３４７，６６９−６７１（１９９０）），ＭＣＡＦ（Ｙ．Ｆｕｒｕｔａｎｉら；ＷＯ９００７８６３）等が明らかにされている。さらに、これら以外にもＭＳＰ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｌｅｏｎａｒｄら；ＵＳ７５８６０８５）と言った因子の存在も示されている。また、無血清培養において、Ｍ−ＣＳＦが単球を生存維持させ、分化させる作用も有することも示されている（Ｗ．Ｂｒｕｇｇｅｒら；Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．，４９，４８３−４８８（１９９１））。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、単球又はマクロファージは、体内に侵入した異物（抗原）や生体内の老廃物の貪食処理、抗原提示、生理活性因子（ＩＬ−１，腫瘍壊死因子ＴＮＦα，インターフェロン等）の分泌等により、生体防御に関与し、抗菌作用、抗腫瘍作用を有する細胞である。しかし、通常、液体培養では単球又はマクロファージは死滅していき、培養６日目頃には殆どの細胞が死んでしまう。
本発明は、かかる技術的背景の下に、単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ作用）を有する蛋白質を、特に遺伝子操作技術を用いて生産し、この蛋白質を種々の薬剤に応用することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために種々検討した結果、単球又はマクロファージを活性化する作用、走化性を刺激する作用あるいはコロニー形成を刺激する作用という従来の生理活性因子の作用とは異なった作用、即ち、単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用、即ちＭＭＤＦ活性をヒト癌細胞株の培養液に見出した。ＭＭＤＦが存在すると、液体培養においても単球又はマクロファージは長期生存維持され、成熟及び分化していく。この作用に着目し、該蛋白質の分離精製ならびに遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は液体培養において、単球またはマクロファ−ジを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（以下、ＭＭＤＦ活性という）を有する蛋白質であることを特徴とする単球の成熟分化因子である。
【０００７】
また、本発明は液体培養において、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡである。
【０００８】
さらに、本発明は発現制御配列を機能しうる形で随伴した、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を含み、微生物、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等の形質転換体の培養において、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベクタ−である。
【０００９】
本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクタ−で形質転換された、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現する能力を有する形質転換体である。
【００１０】
また、本発明は以下の工程を包含する、前述の単球の成熟分化因子を製造する方法である。
（１）ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベクタ−で形質転換された形質転換体を培養する工程。
（２）培養物からＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を採取する工程。
【００１１】
本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を治療上有効な量で含有する医薬組成物である。
【００１２】
本発明は癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、及び創傷治療剤から選ばれる前記医薬組成物である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に係わる、液体培養において単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させ、成熟及び分化させる作用、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質（ＭＭＤＦ）について、次に記す。
ＭＭＤＦ活性測定用の単球は次のようにして調製される。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社）を使用した密度勾配遠心法により、健康な人の末梢血液から単核球細胞を分離し、非働化した血清を含む培地を分注した培養容器に播種する。そして、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にてインキュベ−ションし、壁着性細胞を付着させる。その後、培養容器基面を新鮮な培地で洗浄することにより、非壁着性細胞を洗浄除去する。次に、０．５％ＥＤＴＡと５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含有させた二価金属イオン不含のダルベッコリン酸緩衝液で培養基面を処理することにより、壁着性細胞を剥離する。剥離回収した細胞を新鮮な培地で洗浄し、低血清濃度含有培地を分注したマルチタイタ−ウェルに播種した後、種々のサンプルを各ウェルに添加する。
【００１４】
ＭＭＤＦ活性は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７０、２５７−２６８（１９８４））による細胞数の測定及び、顕微鏡下での細胞形態観察により行う。また、 3Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定することにより、蛋白質の合成能に対する影響を調べる。
その結果、ヒト由来の細胞、好ましくは血液由来の白血球を除く細胞、例えばヒト癌組織由来又はヒト正常組織由来の細胞株、好ましくはヒト甲状腺癌細胞株，さらに好ましくはＴＣＯ−１の培養液に、末梢血由来の単球又はマクロファ−ジを１％以下の低血清濃度添加培地中で、１４日間以上長期生存維持させながら、成熟及び分化させる蛋白質性因子を見出すことができる。
上記活性測定方法を用いて、各種培養細胞や初代培養細胞の培養液、または尿、血清、血漿中のＭＭＤＦ活性の有無を測定することにより、ＭＭＤＦを産生する培養細胞や組織を選択することができ、天然のＭＭＤＦの供給源を特定できる。そして、ここで用いた培養細胞は、樹立された細胞株に限らず、初代培養細胞も含まれる。又、培養細胞の培養上清の調製は、無血清が望ましいが、１−１０％の牛胎児血清又は、０．１−０．５％牛血清アルブミンを含有する培地等でも行われる。
活性測定に使用する血清濃度は、１％以下が好ましいが、基礎培地等の選択によっては、１％以上の血清濃度でも測定可能である。
【００１５】
本発明では、天然のＭＭＤＦの供給源として、ヒト癌細胞株、好ましくはヒト甲状腺癌細胞株，さらに好ましくはＴＣＯ−１を使用し、基礎培地として、例えばＤＭＥＭ培地（日水製薬）とハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を使用する。使用できる培地としては、前述の培地に限られたものではなく市販されているＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等が挙げられる。基礎培地を使って２×１０5 個／ｍｌになるように細胞を調製し、２２５cm2 の培養用フラスコ（コ−スタ−社）等に４０−６０ｍｌ播種し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベ−タ−内で培養する。細胞の増殖がコンフルエント前になったら、培養液を除去し、新鮮な同じ培地と交換する。この培養液の採取回収並びに新鮮培地との交換は好ましくは７日毎に行うが、特に限定されたものではない。
【００１６】
本発明におけるＭＭＤＦ活性を有する物質は、種々の分離操作により単離精製することができる。単離精製方法としては、次の方法が用いられる。
上記ヒト細胞株の培養液を原材料として、種々の分離操作により単離精製することができる。このような方法としては、蛋白沈殿による方法、限外濾過による方法、イオン交換クロマトグラフィ−による方法、疎水クロマトグラフィ−による方法、ゲル濾過又は分子篩クロマトグラフィ−による方法、高速液体クロマトグラフィ−による方法、逆相クロマトグラフィ−による方法、アフィニティ−クロマトグラフィ−による方法、吸着クロマトグラフィ−による方法、色素クロマトグラフィ−による方法、電気泳動による方法などが挙げられる。
蛋白沈殿による方法では、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いることが好ましい。
イオン交換クロマトグラフィ−による方法では、例えば、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、アミノエチル或いは、４級アミノエチル基を官能基として有する陰イオン交換体並びに、カルボキシメチル或いはスルホメチルプロピル基を官能基として有する陽イオン交換体を用いることができる。
疎水クロマトグラフィ−による方法では、フェニルセファロ−ス、オクチルセファロ−ス、ブチルトヨパ−ル等を用いることができる。
吸着クロマトグラフィ−による方法としては、ハイドロキシアパタイト等を用いることが好ましい。
アフィニティ−クロマトグラフィ−による方法としては、抗体結合担体特に、抗体としてはモノクロ−ナル抗体を用いたものが好ましい。
【００１７】
原材料である上記ヒト癌細胞株の培養液を、２．５Ｍ ＮａＣｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた疎水クロマトグラフィ−例えば、ブチルトヨパ−ル（東ソー社）に付し、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出する。該溶出活性画分を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ−（バイオラッド社）に付し、１．４Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出する。ＭＭＤＦ活性を有する該溶出活性画分を、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水クロマトグラフィ−例えば、フェニルセファロ−ス（ファルマシア社）に付し、１．５Ｍから０Ｍへの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配に変化させたトリス塩酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させると、０．７Ｍ付近の硫酸アンモニウム濃度でＭＭＤＦ活性物質が溶出される。該溶出活性画分を、約０．１Ｍ ＮａＣｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、例えば、Ｑ−セファロースカラム（ファルマシア社）に付し、０．１Ｍから０．４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配に変化させたトリス塩酸緩衝液で溶出させる。
その結果、約０．３Ｍ ＮａＣｌ濃度付近にＭＭＤＦ活性物質が溶出される。このようにして得たＭＭＤＦ活性物質を含む画分（以下Ｆｒ．Ｑという）をゲル濾過カラム、例えば、ス−パ−ロ−ズ１２（ファルマシア社）を装着したＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ファルマシア社）に付すと、標準蛋白質との比較によりＭＭＤＦ活性を有する物質の分子量は（４５±５）ＫＤと推定される。
【００１８】
次に、Ｆｒ．Ｑを非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、電気泳動後、ゲルを銀染色キット（和光純薬社）で染色しバンドを確認する。同時に平行して、同条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。電気泳動後、分子量マ−カ−を参考にしてゲルを、１０ＫＤ以下、１０−１６ＫＤ、１６−２２ＫＤ、２２−３１ＫＤ、３１−４６ＫＤ、４６ＫＤ以上の６画分に分割して切り取る。切り取ったゲルを破砕し、０．３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中インキュベ−ションすることにより、蛋白質を抽出後、ＳＤＳ除去カラム、例えば、Ａｍｐｕｒｅ ＤＴ（アマシャム社）に付してＳＤＳを除去する。その後、抽出した試料について活性を測定した結果、１６−２２ＫＤ画分にだけ活性を認める。
【００１９】
Ｆｒ．ＱをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、クマシ−ブリリアントブル−染色を行い、分子量２０ＫＤ付近のバンドの見える箇所のゲルを切り出し、水で脱色を行う。その後、ゲルをエッペンドルフチュ−ブ内ですりつぶし、０．３％ＳＤＳを含むトリス塩酸緩衝液を加えてよく混合後、リシルエンドペプチダ−ゼ（和光純薬社）を加えて３７℃で１５時間インキュベ−ションする。反応液を濾過後、４ＳＤＳガ−ドカ−トリッジ（ポリＬＣ社）を装着させたマイクロボンダスフェア−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（ウォ−タ−ズ社）に付すことによりペプチド断片を分離する。溶離液Ａとして、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、溶離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソプロピルアルコ−ルとアセトニトリルの１：１の混合液を用い、０％から９５％までＢ液の濃度を直線的に増加させることによりペプチド断片を溶出させる。さらに、分離したペプチド断片をプロテインシ−クエンサ−（４７７Ａ形 アプライドバイオシステムズ社又は、ＰＰＳＱ−１０形 島津製作所）に付してエドマン分解し、そのアミノ酸配列を読み取り決定する。その結果、天然のＭＭＤＦには、少なくとも配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１に示されるアミノ酸配列を含むことが明らかになる。
【００２０】
天然のＭＭＤＦに含まれる部分アミノ酸配列を基に、その配列をコ−ドすると考えられるＤＮＡの塩基配列を予測することができる。
方法としては、次の方法を用いる。
【００２１】
ＭＭＤＦの産生細胞であるヒト癌細胞株、例えばヒト甲状腺癌細胞株，好ましくはＴＣＯ−１から全ＲＮＡを抽出後、ｍＲＮＡを精製する。そして、天然のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析により明らかにされた配列番号４−１１を基に、その配列をコ−ドすると考えられるＤＮＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ型、アプライドバイオシステムズ社）で合成する。この合成したオリゴヌクレオチドをプライマ−とし、ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した結果、プライマ−として使用したアミノ酸配列以外に、部分アミノ酸配列の解析で得られた他の部分アミノ酸配列をもコ−ドするＤＮＡ断片を得る。次に、該ヒト癌細胞株のｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡライブラリ−を作製し、得られたライブラリ−より上記ＲＴ−ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプロ−ブとしてスクリ−ニングする。
【００２２】
その結果、得られた陽性クロ−ンを大腸菌に感染させ培養した後、ファ−ジＤＮＡを調製する。さらに、このファ−ジＤＮＡを制限酵素で消化後、プラスミドベクタ−に挿入し、クロ−ン化プラスミドＤＮＡを得る。このＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素切断点地図を得、さらに全塩基配列を決定する（配列番号２）。次に、その塩基配列より推定されるコ−ド領域のアミノ酸配列を決定する（配列番号１）。得られたｃＤＮＡクロ−ンが求めるＭＭＤＦをコ−ドするものであるかどうかの確認は、天然のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列が、クローンにコードされているかどうかで判断できる。推定したアミノ酸配列には、分泌シグナルであると予想される配列に続き、アミノ末端と考えられる配列及び部分アミノ酸配列解析で得られたすべての配列が含まれていることを確認できる。
【００２３】
本発明の蛋白質は、上記のアミノ酸配列を有する蛋白質に限定されるものではなく、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸、該アミノ酸配列のうち、少なくとも１つが削除または置換されたアミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質等が包含される。また、本発明のＤＮＡは、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、例えば配列番号２に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド、該ヌクレオチド配列のうち、少なくとも１つが削除または置換されたヌクレオチド配列を有するか、または該ヌクレオチド配列に少なくとも１つのヌクレオチドが付加又は挿入されたヌクレオチド配列を有し、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡが包含される。
【００２４】
以上の様にして前述のＤＮＡを得、そのｃＤＮＡ又はその主要部分を挿入した発現ベクタ−により、形質転換用の宿主、例えば微生物、好ましくは大腸菌、枯草菌、及び酵母からなる群から選択される微生物、又は昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞、好ましくはＣＯＳ−１，ＣＨＯ，ＢＨＫ及びＣ１２７Ｉからなる群から選択される哺乳動物細胞を形質転換させ形質転換体を得る。得られた形質転換体を用いて組換えＤＮＡ技術を適用することにより発現させ、活性の確認をおこなう。その場合、宿主によって、使用するベクタ−は使い分けられる。このようにしてＭＭＤＦを発現させる。
【００２５】
本発明により得られるＭＭＤＦ活性を有する蛋白質は、貪食能、生体防御作用、抗菌作用、抗腫瘍作用を有する単球又はマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用があることから、通常使用される担体等と共に医薬組成物とされ、癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤として利用することができる。
本発明におけるＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を含有する癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤は、経口あるいは静注、点滴、皮下注射により投与されうる。その投与に際しては、それぞれの投与経路に応じて適当な形態、例えば経口製剤、注射剤，外用剤として製剤される。これらの製剤はそれぞれ常法によって製造され、通常それぞれの剤型に応じた製薬上許容される担体又は添加物が配合される。当該治療剤に含有される、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質の量は、投与方法、剤型、適用疾患等に応じて適宜変更されうるので特に限定されない。
当該治療剤の投与量は、適用疾患、疾患の程度、投与方法、患者の年齢等により異なるが、例えば癌患者に対して、静脈点滴により投与する場合、通常１００〜１０００μｇ／ｍ ２ を１日１回投与する。
【００２６】
【実施例】
次に実施例により、本発明の単球の成熟分化因子（ＭＭＤＦ）の活性測定、精製、部分アミノ酸配列、遺伝子クロ−ニング並びに発現について説明する。
実施例１ ＭＭＤＦ活性測定用単球の調製およびその活性測定方法
ヒト末梢血１００ｍｌに等量のハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を混合して希釈血液を調製し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ、登録商標：Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ 社）１５ｍｌに対し、該希釈血液を３０ｍｌの割合で、両液が混じらないように静かに重層し、１６００ｒｐｍで３０分間、２５℃で遠心した。
中間部に形成された単核球層を回収し、ハムＦ−１０培地に分散させ、１６００ｒｐｍで１５分間、２５℃で遠心分離を行った。得られた細胞集塊を、再度、ハムＦ−１０培地に分散させ、１２００ｒｐｍで５分間、２５℃で遠心分離を行った。
次に、得られた細胞集塊を非働化した牛胎児血清（ＦＣＳ）１０％を含有するハムＦ−１０培地に分散させ、チュルク染色液を使って細胞数の測定を行い、約７×１０6 個／ｍｌに調整し、非働化ＦＣＳ１０％含有ハムＦ−１０培地の入った培養用プラスティック製フラスコ（コ−スタ−社）に播種した。
その後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて１時間インキュベ−ションし、培養液を除き、新鮮な同培地で４回培養基面を洗浄した。その後、基面に壁着している単球を剥離させるため、０．５％ＥＤＴＡと非働化ＦＣＳ５％を含有するダルベッコリン酸緩衝液（日水製薬）を上記フラスコに添加し、４℃で３０分間インキュベ−ションした。
最後に、フラスコを手で叩いて衝撃を与えて細胞を剥離させ、細胞を回収し、活性測定用の単球として使用した。
このようにして得た単球浮遊液をダルベッコリン酸緩衝液に希釈し、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上清を廃棄した。
次に、１％非働化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に細胞を浮遊させ、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上清を廃棄し、最終的に１％非働化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に浮遊させた。
チュルク染色液で細胞数を測定し、２×１０5 個／ｍｌに調整して９６穴マイクロタイタ−プレ−ト（コ−スタ−社）に５０μｌ／穴を播種した。
その後、試料を５０μｌ／穴に添加し、炭酸ガスインキュベ−タ−内にて培養を行った。培養中、２〜３日毎に１回、ＭＴＴ法で細胞数を測定し、培養の経過を追跡した。
【００２７】
また、上記のように調整した単球を９６穴マイクロタイタ−プレ−トに１×１０4 個／穴で播種し、培養の途中で、測定の前日より放射性標識物質である 3Ｈ−ロイシンを１μＣｉ／ｍｌ添加して２４時間パルス標識した後、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ含有のトリプシン溶液で処理することにより細胞を剥離し、セルハ−ベスタ−（スカルトン社）によりガラスフィルタ−上に細胞を捕獲した。その後、４℃でトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中にガラスフィルタ−上に捕獲した細胞を浸積し、洗浄後、乾燥した。そして、シンチレ−タ−（アムライト、登録商標：デュポン社）３ｍｌを添加したバイアル内にフィルタ−を入れ、液体シンチレ−ションカウンタ−でＴＣＡ不溶性画分への取り込み量を測定した。
【００２８】
実施例２ ヒト末梢血由来の単球に対する作用
実施例１で示した活性測定法により、粗精製のＭＭＤＦの活性を測定した。図１に示されるように、粗精製したＭＭＤＦを総蛋白濃度で０．０１〜１μｇ／ｍｌまで添加し、ＭＴＴ法で細胞数をカウントし、培養経過を追跡した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、長期間即ち１４日間以上単球が生存維持されることが認められた。その時、細胞形態を顕微鏡下で観察すると、無添加コントロ−ル群では形態に変化はなく、細胞は死んでいき、培養６日目頃には殆ど死滅したが、ＭＭＤＦ添加群では、殆どの細胞が生存し、マクロファ−ジ様に大きくなって成熟及び分化していくのが認められた。
【００２９】
また、実施例１で示した 3Ｈ−ロイシンの取り込み法により、単球の蛋白質合成能に対するＭＭＤＦの影響を調べた。今回、培養経過の内、培養開始日、６日目、及び９日目の細胞について 3Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、表１に示すように、培養６日目並びに９日目ともに著しく 3Ｈ−ロイシンの取り込み量が増加されることが認められた。すなわち、単球がＭＭＤＦにより成熟及び分化させられた結果、単球の蛋白質の合成が活発に促進されたものと考えられる。
【００３０】
【表１】
次に、実施例１で示した方法と同様な方法でヒト単核球を分離し、末梢血供与者の自己血清を１％含有するハムＦ−１０培地にその細胞を浮遊させ、チュルク染色液で細胞数をカウントし、１×１０6 個／ｍｌに調整した。その単核球を１×１０6 個／穴で２４穴マルチウェルデッシュ（ファルコン社）に播種した。その後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内に３時間インキュベ−ションし、壁着性細胞を基面に付着させた。次に、パスツ−ルピペットを使いピペッテング洗浄により非壁着性細胞を取り除いた。再度、ダルベッコリン酸緩衝液を約１ｍｌ／穴添加し、ピペッテング洗浄により非壁着性細胞を取り除いた。そこに上記と同様の血清及びＭＭＤＦを含むハムＦ−１０培地を添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて培養を行い、２〜３日毎に核カウントを行って培養経過を追跡した。培養基面に付着して残っている細胞が、９０％以上単球であることを、非特異的エステラ−ゼ染色により確認した。また、核カウントは、培養液除去後、０．１％クエン酸ナトリウム、１％セタブロン（Ｃｅｔｈｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）と０．０５％ナフト−ルブル−ブラックを含有する溶液を５０μｌ／穴添加し、３７℃で３０分間インキュベ−ションして細胞質の溶解並びに核染色を行い、血球計算盤により測定を行った。その結果、ＭＭＤＦを添加すると殆どの単球が、１４日間以上生存維持され、マクロファ−ジ様に成熟及び分化されることが認められた。
【００３２】
実施例３ 甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培養液からのＭＭＤＦの精製
甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養は、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イ−グル最小必須培地：ニッスイ製薬）とハムＦ−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を用い、無血清培地下で炭酸ガスインキュベ−タ−を使い、５％炭酸ガス濃度及び３７℃の条件で行った。
甲状腺癌細胞株からＭＭＤＦを産生させるには、次のようにして行った。上記培地を用いて該細胞を２×１０5 個／ｍｌの細胞数に調整し、培養面積２２５ｃｍ2 の培養フラスコ（コ−スタ−社）に４５ｍｌずつ播種した。培養は、５％炭酸ガス濃度，３７℃で行なった。細胞の増殖がコンフルエント前になったら、新鮮な培地３０ｍｌに交換し、７日毎に培養液採取並びに新鮮培地との交換を行い、ＭＭＤＦの生産を行った。
【００３３】
以上のようにして得た培養液１０〜２０リットルを、２．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性クロマト樹脂であるブチルトヨパ−ル（東ソ−社）を充填したカラムに付し、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。次に、該溶出活性画分を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（バイオラッド社）を充填したカラムに付し、１．４Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。
【００３４】
次に、該溶出活性画分に、最終濃度が１．５Ｍになるように硫酸アンモニウムを加え、混合攪拌した。この溶液を、１．５Ｍ 硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性クロマト樹脂であるフェニルセファロ−ス（ファルマシア社）を充填したカラムに付し、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０Ｍの濃度までの直線的勾配で蛋白質を溶出させた。その結果、約０．７Ｍ 硫酸アンモニウム濃度でＭＭＤＦ活性を有する物質が溶出された。得られた該活性画分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロ−スハイパフォ−マンス（ファルマシア社）を充填したカラムに付し、塩濃度を０．１Ｍから０．４Ｍまでの直線的勾配で上昇させることによりＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。その結果、図２に示されるように、約０．２５Ｍ ＮａＣｌで溶出される画分に活性ピ−クを認めた。さらに、該活性画分をゲル濾過樹脂であるス−パ−ロ−ズ１２ＨＲ１０／３０（ファルマシア社）を充填したカラムでＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶出し、各画分の活性測定を行った。その結果、分子量約４４ＫＤにＭＭＤＦ活性ピ−クを認めた。
【００３５】
実施例４ 甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培養液から精製したＭＭＤＦのポリアクリルアミドゲル電気泳動
０．１％のＳＤＳを含む分離用１６％ポリアクリルアミドゲルに、実施例２で得られた試料、すなわち、Ｑ−セファロースハイパフォーマンスカラムで分画されたＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を付し、非還元条件下及び還元条件下で電気泳動を行った。ゲル内には０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、泳動内には０．１％ＳＤＳと１９２ｍＭグリシンを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた。１５ｍＡの定電流で２時間泳動後に、ゲル中の蛋白質を銀染色キット（和光純薬社）で染色し、泳動の結果を図３に示す。標準分子量マーカーの分子量（ＫＤ）をレーン左側に記載した。レーン１は標準分子量マーカー（ファルマシア社）、レーン２は、実施例２で精製した画分を還元下で泳動した結果を示し、レーン３は、非還元下で泳動した結果を示す。同時に平行して、非還元下の同条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、電気泳動後のゲルを６画分に切り取った。すなわち、標準分子量マ−カ−との相対的位置からの算定により、１０ＫＤ以下、１０〜１６ＫＤ、１６〜２２ＫＤ、２２〜３１ＫＤ、３１〜４６ＫＤ、４６ＫＤ以上の６画分にゲルを分割して切り取った。切り取ったゲルを破砕し、０．３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中インキュベ−ションすることにより蛋白質をゲルから抽出した。その後、ＳＤＳ除去カラムのＡｍｐｕｒｅ ＤＴに付して、ＳＤＳを除去した試料について、実施例１で示した方法によりＭＭＤＦ活性を測定した。その結果、１６〜２２ＫＤ画分にだけ活性が認められた。
【００３６】
実施例５ 甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養液から精製されたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析
実施例３で精製したＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を約５μｇ／レーン相当で１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、クマシーブリリアントブルーで染色を行った。その後、２０ＫＤ付近のバンドの見える箇所のゲルを切り出し、水で脱色を行った。さらに、該ゲルをエッペンドルフチュ−ブ内でよくすり潰し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）と０．３％ＳＤＳ溶液を加えて良く混ぜた後、２５０ｐｍｏｌｅのリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）を加えて、３７℃で１５時間インキュベーションを行った。消化後、１μｌのβ−メルカプトエタノールを添加し、さらに３７℃で１時間インキュベーションを行い、０．２２μｍのフィルターで濾過し、４ＳＤＳガードカートリッジ（ポリＬＣ社）を繋いだマイクロボンダスフェアーＣ１８（５μｍ、３００Å）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社）を用いてペプチド断片を分離した。溶離液Ａとして、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、溶離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソプロピルアルコールとアセトニトリルの１：１の混合液を用い、４０分間に０％から４０％までＢ液を直線的に増加させた後、次の２０分間に４０％から８０％まで直線的に増加させ、さらに、次の１０分間に８０％から９５％まで増加させ、最終的に１０分間、９５％で流しペプチド断片を溶出させた。次に、分離されたペプチド断片をプロテインシークエンサー（４７７Ａ形 アプライドバイオシステムズ社又はＰＰＳＱ−１０形 島津製作所）を用いてアミノ酸配列を読み取り決定した。その結果、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１に示されるアミノ酸配列が決定され、天然のＭＭＤＦには、少なくともこれら配列番号４−１１に示されるアミノ酸配列が含まれることが明らかになった。
【００３７】
次に、上記と同様に実施例３で精製したＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）をさらにフェニル５ＰＷ ＲＰ逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社）に付し、分離精製を行った。溶離液Ａ及びＢは、上記マイクロボンダスフェアーＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムの場合と同じ組成の溶液を使用し、３５分間に５％から４０％までＢ液を直線的に増加させた後、次の２０分間で４０％から８０％まで直線的に増加させ、ＭＭＤＦ活性画分をさらに分離精製した。そして、５本の蛋白質ピークが得られたので、それらを分画し、マススペクトル分析を行った（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：フィニガンマット社）。その結果、１６３４３．５ダルトン、１７３２１．９ダルトン、１７７１２．０ダルトン、１７８３３．６ダルトン、１８５７７．９ダルトンのスペクトルが観測された。マススペクトルの精度を約０．０４％とし、配列番号１を参考にすると、Ｃ末端アミノ酸は、１７７番のグリシン（Ｇｌｙ），１８６番のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、１９０番のバリン（Ｖａｌ），１９１番のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ）であると推定された。従って、ＴＣＯ−１細胞由来の天然のＭＭＤＦは、プロセッシングによりＣ末端にヘテロジェネイティーを有していることが示唆され、少なくとも配列番号１で示される２５番のスレオニンから１７７番のグリシンまでを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１８６番のアスパラギン酸までを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１９０番のバリンまでを含む蛋白質、２５番のスレオニンから１９１番のグルタミン酸までを含む蛋白質、及び２５番のスレオニンから１９７番のグルタミン酸までを含む蛋白質が含まれていることが考えられた。
【００３８】
実施例６ ＭＭＤＦをコ−ドするｃＤＮＡのクロ−ニング
ＭＭＤＦを産生するヒト甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１をＲＮＡ調製の供給源とした。細胞は、ＤＭＥＭ培地とハムＦ−１０培地を３：１に混合した培地で維持した。全ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，（１９８７））に従い抽出した。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ Ｓｕｐｅｒ（日本合成ゴム株式会社）を使用した。
実施例５で得られたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列解析の結果の中より、配列番号８に含まれるＩｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを基に、５’−ｄ［ＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＧ］−３’、配列番号１１に含まれるＧｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎを基に、５’−ｄ［ＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣ］−３’の配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ形、アプライドバイオシテムズ社）を用いて合成した。上記ｍＲＮＡ０．２μｇを鋳型としてＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（アマシャム社）を用いて、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６８（１９８３））で１本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、これを鋳型に上記２種のオリゴヌクレオチド及びＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジ−ン社）を使用して９５℃で５分を１サイクル、９５℃で１分、６５℃で２５分、７５℃で３分を４０サイクルの条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。その結果、得られた３２１塩基対のＤＮＡ断片を、一旦、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミドベクタ−（ストラタジ−ン社）の制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位にサブクローン化した後、塩基配列をＰＲＩＳＭＤｙｅＤｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ と３７３Ａ型ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマ−社）を用いて決定した結果、ＰＣＲプライマーの設計に使用したアミノ酸配列以外に、部分アミノ酸配列の解析で得られていた他の部分アミノ酸配列がコードされていることが確認された。
【００３９】
次に、上記ＭＭＤＦ産生細胞のｍＲＮＡ３μｇを鋳型にしてｃＤＮＡライブラリ−を作製した。すなわち、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｌｕｓ（アマシャム社）を用いて合成した２本鎖ｃＤＮＡに、Ｒａｐｉｄ ａｄａｐｔｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム社）を用いて、ＥｃｏＲＩアダプタ−を付加したものを、ＥｃｏＲＩ消化済のλｇｔ１０ア−ム（ストラタジ−ン社）に結合した後、ＧｉｇａｐａｃｋII ｇｏｌｄ（ストラタジ−ン社）を用いてパッケ−ジングした。上記ＲＴ−ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍと［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社）で標識したものをプロ−ブとして使い、得られたｃＤＮＡライブラリ−のうち、４０万個の組換えファ−ジを以下の方法でスクリ−ニングした。すなわち、２３cm×２３cmのＬＢ寒天培地上に、組換えファ−ジ１０万個と大腸菌ＮＭ５１４株と０．７％アガロ−スを含むＬＢ軟寒天培地と共に重層したものを４枚調製し、３７℃で１２時間、４℃で１時間保温した。生じたプラークをニトロセルロースフィルターに移し、１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に１分、１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５分、２×ＳＳＣに５分浸した後、風乾し、ベーキング処理を８０℃で２時間行ってＤＮＡを固定した。
該フィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有６×ＳＳＣに浸し、６０℃で２０分保温した後６×ＮＥＴ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１％ＳＤＳ及び大腸菌ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で、６５℃で２時間保温し、次いで同じ組成溶液で標識プロ−ブを含むハイブリダイゼ−ション溶液中で６５℃で１８時間保温した。保温後、フィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣに浸し、６５℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルムと増感スクリ−ンをあてて、−８０℃で４８時間露光した。現像後、陽性プラ−ク候補を選択した。
同様の方法で２次スクリーニングを実施し、７クローンの陽性が確認された。得られた７クロ−ンについて、以下のようにしてサブクローニングを実施した。
【００４０】
大腸菌ＮＭ５１４株にクローンのファージ懸濁液を感染させたものにＮＺＹＭ培地を加えた後、３７℃で１８時間振とうして溶菌液を得た。遠心分離した上澄みにＤＮａｓｅとＲＮａｓｅをそれぞれ１０μｇ／ｍｌを添加し、３７℃で２０分保温後、ＰＥＧ６０００を１０％、ＮａＣｌを１．２５Ｍになるように添加して氷上で１時間冷却した。その後、遠心分離によってファ−ジ粒子を含む沈殿を得、１％ＳＤＳ存在下、６５℃で５分保温した後フェノ−ル抽出及びエタノ−ル沈殿を行ってファージＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。それぞれのサブクローンプラスミドＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素切断点地図を作製したところ、これらクローンは同様のパターンを示したので、その中から３クローン（＃３、＃５、＃１１）を選び、塩基配列を決定した。その結果、クロ−ン間に塩基配列の不一致は認められなかったので、最長のクロ−ン（＃５）を選び、以下の実験に使用することとした。
【００４１】
＃５の塩基配列（配列番号２）から推定されたコ−ド領域中のアミノ酸配列（配列番号１）中には、分泌シグナルであると予想される配列に続き、アミノ末端と考えられる配列（配列番号４）並びに、部分アミノ酸配列解析で得られた全ての配列が含まれていることが確認された。クローン＃５ｃＤＮＡのコード領域を含むＳｍａＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿入してｐＢＳ［ＭＭＤＦ＃５］を得た。このプラスミドＤＮＡにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＢＳ（ＭＭＤＦ＃５）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１２月２５日に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３７１）。
【００４２】
実施例７ ＣＯＳ−１細胞によるＭＭＤＦの発現
動物細胞での発現ベクタ−であるｐＣＤＭｍｃｓに実施例６で得られたｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入した。すなわち、発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓは、Ｓｅｅｄ（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２（１９８７））によって開発されたｐＣＤＭ８のクローニング部位を含むＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片をプラスミドＲｃ／ＲＳＶ（インビトロジェン社）の同断片で置き換えたものである。
次に、実施例６で得たプラスミドＤＮＡｐＢＳ［ＭＭＤＦ＃５］を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｈｏＩで切断して生じた断片を、ｐＣＤＭｍｃｓのＥｃｏＲＶとＸｈｏＩの消化部位に挿入して発現ベクタ−ｐＣＤＭｍｃｓ［ＭＭＤＦ＃５］を得た。
次に、調製したプラスミドＤＮＡ２μｇ／ｍｌ、ＤＥＡＥデキストラン１００μｇ／ｍｌ、およびクロロキン１００μＭを含むＤＭＥＭ培地３ｍｌを、予めＣＯＳ−１細胞１×１０6 個を播種したディッシュに添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキュベーションした。その後、培地を抜き取り１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）および１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１．５ｍｌを添加して室温で２分間インキュベ−ションした後、ゲンタシン５０μｇ／ｍｌ及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地３ｍｌと培地交換をした。２４時間インキュベ−ション後、再度、ＤＭＥＭ培地３ｍｌと培地交換をし、同じ５％炭酸ガスインキュベータ内で培養した。６日間培養後、培養液を回収し組換え型ＭＭＤＦ（ｒＭＭＤＦ）のサンプルとした。
【００４３】
次に、上記と同様にして、配列番号１に示される１番のメチオニンから１９７番のグルタミン酸までをコ−ドする遺伝子、１番のメチオニンから１８６番のアスパラギン酸までをコ−ドする遺伝子を各々別々に発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓに挿入し、各々の発現ベクタ−を作製した。さらに、同条件でＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションさせ、６日間培養後の培養液を回収した。以下、配列番号１をコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ、１番のメチオニンから１９７番のグルタミン酸までをコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）、１番のメチオニンから１８６番のアスパラギン酸までをコ−ドする遺伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）とよぶこととした。
【００４４】
実施例８ 各種組換え型ＭＭＤＦの活性測定
実施例７で示したように、得られた各種組換え体の培養液、すなわち、ｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）、ｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）について、実施例１で示した活性測定方法で活性を測定した。同時に、ＭＭＤＦの遺伝子を含まない発現ベクタ−で形質転換させた細胞（Ｍｏｃｋ細胞）の培養液についても、並行して、その活性を測定した。その結果、形質転換体の培養液であるｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）およびｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）にはＭＭＤＦ活性が認められたが、Ｍｏｃｋ細胞の培養上清にはＭＭＤＦ活性は認められなかった。
【００４５】
実施例９ 各種臓器及び細胞株におけるＭＭＤＦ遺伝子の発現
ヒトの各種臓器から抽出したｍＲＮＡを各２μｇずつ、予めナイロンメンブランに固定してあるＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（クロンテック社）のＨｕｍａｎ，ＨｕｍａｎIIを５×ＳＳＰＥ，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳおよび超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で、４２℃で３時間保温した後、実施例６で示したものと同じ標識プロ−ブを含むプレハイブリダイゼ−ション溶液と同組成のハイブリダイゼ−ション溶液中で、４２℃で１８時間保温した。その後、メンブランを０．１％ＳＤＳ含有の１×ＳＳＣに浸し６５℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルムと増感スクリ−ンをあてて、−８０℃で７２時間露光後、現像した。
以上のようにして、ＭＭＤＦ遺伝子の発現分布をノ−ザンブロッティングで調べた。その結果、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および結腸にＭＭＤＦ遺伝子の発現を示す約３．０ｋｂと約２．１ｋｂのバンドが認められたが、末梢血由来白血球にはその存在は認められなかった。
【００４６】
次に、ヒト由来細胞株であるＡ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２９）、ＫＡＴＯ−III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）、ＴＣＯ−１（ＪＣＲＢ０２３９）の細胞より調製したｍＲＮＡ各３μｇを、５０％ホルムアミド、７．２％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 酢酸ナトリウム、エチジウムブロマイド２０μｇ／ｍｌからなる溶液２０μｌに溶解し、６５℃で１０分間保温した。その後、１．２％アガロ−ス、６．６％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 酢酸ナトリウムからなるアガロ−スゲルに付し、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ 酢酸ナトリウムからなる泳動用溶液中で電気泳動を行った。
【００４７】
電気泳動後、ゲルを水に５分間浸した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ中で３０分、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分処理し、ゲル中のｍＲＮＡを、１０×ＳＳＣを用いたキャピラリ−法でナイロンメンブランに移した。そのメンブランを２×ＳＳＣでリンスした後、風乾し、８０℃で２時間ベーキングしてＲＮＡを固定した。次に、メンブランを０．１％ＳＤＳ含有の４×ＳＳＣに浸し、５０℃で１０分間保温した後、６×ＳＳＰＥ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド及び超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で４５℃で２時間保温した。そして、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌおよび上記と同様に実施例６で示したものと同じ標識プロ−ブからなるハイブリダイゼ−ション溶液中で４５℃で１８時間保温した。その後、メンブランを上記と同様に洗浄、乾燥、露光の操作を実施した結果、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及び、ＴＣＯ−１にＭＭＤＦ遺伝子の発現を認めた。
【００４８】
実施例１０ 白血病細胞株（Ｕ９３７）に対するＭＭＤＦの作用
白血病細胞株（Ｕ９３７）を１０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地に浮遊させ、２×１０５個／ｍｌに調製後、９６穴マイクロタイタープレート（コースター社）に５０μｌ／穴を播種した。その後、粗精製したＭＭＤＦを総蛋白質濃度で０．１μｇ／ｍｌ添加し、組換え型ＭＭＤＦについては、実施例７で示したように、得られた組換え体の培養液（ｒＭＭＤＦ）並びに、Ｍｏｃｋ細胞の培養液を各１０％添加して３日間培養を行った。ＭＴＴ法で細胞数をカウントした結果、Ｍｏｃｋ細胞の培養液添加群では細胞にまったく影響はなかったが、粗精製ＭＭＤＦ添加群では約４０％の増殖抑制が認められ、ｒＭＭＤＦ添加群では約３０％の増殖抑制が認められた。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、外来刺激の認識、貪食、消化、生理活性物質の分泌、抗原提示などの様々な機能により、生体防御に関与し、抗菌作用および抗腫瘍作用などを有する細胞である単球或いはマクロファージに対し長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用をもつＭＭＤＦが得られた。その結果、抗癌剤、免疫賦活剤、感染症治療剤として医薬への応用が可能になった。また本発明により、ＭＭＤＦのｃＤＮＡがクローン化され、組換え型ＭＭＤＦの活性も確認されたことから、遺伝子操作技術の方法を用い、ＭＭＤＦの大量生産も可能になった。
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト末梢血由来の単球を使い、ＭＭＤＦの活性をＭＴＴ法で測定した結果を示す図である。
【図２】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−による、ＭＭＤＦの精製結果を示す図である。
【図３】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−により精製されたＭＭＤＦのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
Claims (13)
- 液体培養において、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列中少なくとも２５番目〜１７７番目のアミノ酸配列を含む蛋白質を含有する、単球の成熟分化剤。
- 液体培養において、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有し、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸のうち、１つが削除または置換されたアミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に１つのアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸配列
を有する蛋白質を含有する、単球の成熟分化剤。 - 単球またはマクロファージがヒト細胞由来のものである、請求項１または２に記載の単球の成熟分化剤。
- 蛋白質がヒト細胞由来である、請求項１または２記載の単球の成熟分化剤。
- ヒト細胞が血液由来の白血球を除くヒト癌組織またはヒト正常組織より樹立された細胞株である、請求項４記載の単球の成熟分化剤。
- 蛋白質が、血液由来の白血球を除くヒト癌組織またはヒト正常組織より樹立された細胞株であるヒト細胞の培養液から精製された、請求項１または２に記載の単球の成熟分化剤。
- 液体培養における血清濃度が１％以下で、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用を有する、請求項１または２に記載の単球の成熟分化剤。
- 液体培養における長期生存維持を、１４日以上継続させる、請求項１または２に記載の単球の成熟分化剤。
- 蛋白質が、遺伝子組換え技術により生産されたものである、請求項１または２に記載の単球の成熟分化剤。
- 蛋白質が、以下の工程を包含する方法により生産されたものである、請求項９記載の単球の成熟分化剤。
（１）液体培養において、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有し、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列中少なくとも２５番目〜１７７番目のアミノ酸配列、ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸のうち、１つが削除または置換されたアミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に１つのアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸配列
を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程。
（２）培養物からＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を採取する工程。 - 形質転換体が、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される請求項１０記載の単球の成熟分化剤。
- 液体培養において、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列中少なくとも２５番目〜１７７番目のアミノ酸配列を含む蛋白質を含有する、免疫賦活剤。
- 液体培養において、単球またはマクロファージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有し、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸のうち、１つが削除または置換されたア ミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に１つのアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸配列
を有する蛋白質を含有する、免疫賦活剤。
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