JP4117646B2

JP4117646B2 - An ester bond-containing plastic-degrading microorganism, a plastic-degrading enzyme, and a polynucleotide encoding the enzyme.

Info

Publication number: JP4117646B2
Application number: JP2003055409A
Authority: JP
Inventors: 敏明神戸; ゆき枝茂野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2023-03-03
Also published as: JP2004261102A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエステル結合含有プラスチック分解微生物、該プラスチック分解酵素および該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに該微生物、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではない。
【０００３】
プラスチックを分解することのできる微生物に関する報告は限られている。ポリウレタンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによって分解が進む。ポリオール部分のエステル結合はカビや細菌によって切断されるという報告が数例ある。Ｄａｒｂｙ（ＤａｒｂｙＲ．Ｔ．ａｎｄＫａｐｌａｎＡ．Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８））らはカビによる種々のポリウレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリウレタンの方が分解を受け易いことや、イソシアネートやポリオールの種類によって分解特性が異なることを報告している。Ｋａｙ（Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．：Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）．）らはエステル系ポリウレタン分解菌として１５種類の菌を単離し、分解力の強かったＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌について分解特性を検討した結果について報告している。
【０００４】
【非特許文献１】
ＤａｒｂｙＲ．Ｔ．ａｎｄＫａｐｌａｎＡ．Ｍ．著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）
【非特許文献２】
Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．著、Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）
ポリエステルの微生物分解に関しては、生分解性プラスチックとして知られているポリエステル樹脂を中心に数多くの報告がある。しかし、ウレタンの合成原料として一般的に使用されている液状のポリエステルの分解に関する報告は少ない。常盤らは各種の液状ポリエステルを分解するカビを報告しているが（Ｔｏｋｉｗａ，Ｙ．ａｎｄＳｕｚｕｋｉ，Ｔ．（１９７７）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｄｉｐａｔｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．ｓｔｒａｉｎ１４−３．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４１，２６５−２７４）、これらを分解資化する細菌についてはほとんど知られていない。
【非特許文献３】
Ｔｏｋｉｗａ，Ｙ．ａｎｄＳｕｚｕｋｉ，Ｔ．（１９７７）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｄｉｐａｔｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．ｓｔｒａｉｎ１４−３．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４１，２６５−２７４
更に、プラスチックを分解することのできる酵素に関する報告は、アシドボラックスデラフィルディ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）由来のポリブチレンサクシネート分解酵素（ＵｃｈｉｄａＨ，Ｎａｋａｊｉｍａ−ＫａｍｂｅＴ，Ｓｈｉｇｅｎｏ−ＡｋｕｔｓｕＹ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＮａｋａｈａｒａＴ（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＡｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉｓｔｒａｉｎＢＳ−３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７）、コマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）由来のポリウレタン分解酵素、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属菌（ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｓｕｃｈｉｉＡ，ＴｏｋｉｗａＹ（２００１）Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１：２５〜２９，ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＡｂｅＮ，ＫａｍｉｏＹ（２００１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍａｓｏｉｌｉｓｏｌａｔｅ，Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＫ１０４−１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３）およびバチラススミッチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｈｉｉ）由来（ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ（２００１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８〜３００）のポリ乳酸分解酵素に限られている。
【非特許文献４】
ＵｃｈｉｄａＨ，Ｎａｋａｊｉｍａ−ＫａｍｂｅＴ，Ｓｈｉｇｅｎｏ−ＡｋｕｔｓｕＹ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＮａｋａｈａｒａＴ著、Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＡｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉｓｔｒａｉｎＢＳ−３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７、２００２年
【非特許文献５】
ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｓｕｃｈｉｉＡ，ＴｏｋｉｗａＹ著、Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１：２５〜２９、２００１年
【非特許文献６】
ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＡｂｅＮ，ＫａｍｉｏＹ著、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍａｓｏｉｌｉｓｏｌａｔｅ，Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＫ１０４−１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３、２００１年
【非特許文献７】
ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ著、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８〜３００、２００１年
また、酵素を用いた液状ポリエステルの分解については、動物やカビ、細菌由来のリパーゼ、エステラーゼによるものが多く知られているが（例えば、ＴｏｋｉｗａＹ，ＳｕｚｕｋｉＴ（１９７７）Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓｂｙｌｉｐａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ２７０：７６−７８）、これらの酵素は液状ポリエステルを本来の基質とするものではないため、環境中での分解とは無関係である。
【非特許文献８】
ＴｏｋｉｗａＹ，ＳｕｚｕｋｉＴ（１９７７）Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓｂｙｌｉｐａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ２７０：７６−７８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なエステル結合含有プラスチック分解微生物、該プラスチック分解酵素および該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに該微生物、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する、平成１５年２月２６日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し拒否された、バークホルデリアセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ）ＴＢ−６２株、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリアセパシアＴＢ−６５株、および該微生物が生産するエステル結合含有プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチドである。また本発明は、該ポリヌクレオチドを組み込んだ微生物にエステル結合含有プラスチック分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。尚、バークホルデリア属に属する微生物がエステル結合含有プラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。
【０００７】
更に本発明は、該微生物、酵素もしくは該酵素を発現する微生物を用いるエステル結合含有プラスチックの分解方法である。
本発明の酵素は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する。より具体的には、本発明の酵素は、バークホルデリアセパシアに由来する、新規なプラスチック分解酵素であり、エステラーゼ活性を有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
微生物
バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、エステル系ポリウレタンを一定期間地面に埋設した後取り出し、該ポリウレタン小片を生理食塩水に加え、ボルテックスで微生物を抽出したものを適宜希釈して、ニュートリエント平板培地にエマルジョン化したポリエステル（例えばポリエチレンアジペート）寒天溶液５ｍｌを重層した平板に塗布する。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンを生成したコロニーを取得することにより行うことができる。
【０００９】
本発明の微生物は、エステル結合含有プラスチックを分解する能力を有するバークホルデリア属菌であればよい。具体的には、代表例として、平成１５年２月２６日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し拒否された、バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリアセパシアＴＢ−６５株が挙げられる。尚、これらの菌株は自己寄託とし、申請により分譲を認めることとする。バークホルデリア属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’ＳＭＡＮＵＡＬＯＦＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第１巻１９８４年、第２巻１９８６年、第３巻１９８９年、第４巻１９８９年）に記載されている。
【００１０】
更に本発明の微生物は、エステル結合含有プラスチックを分解する能力を有するバークホルデリア属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００１１】
バークホルデリア属に属する微生物の培養に用いる培地としては、バークホルデリア属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１２】
本微生物が分解できるエステル結合含有プラスチックは、分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００１３】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１４】
本発明の微生物または酵素により分解されるエステル結合含有プラスチックの数平均分子量は、特に制限はない。ポリエチレンアジペート分子量約２０００、ポリブチレンアジペート分子量約２０００、ポリエチレンブチレンアジペート分子量約２０００、ポリジエチレンアジペート分子量約２５００の分解については実施例に示している。
【００１５】
酵素
本発明の酵素は３０６のアミノ酸から構成され、分子量３２１２１、３２１９３、３２１４５のポリペプチドであり、配列番号１〜３のアミノ酸番号１−３０６で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４〜６に記載されている塩基配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１６】
尚、配列番号１〜３のアミノ酸配列はシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号１〜３のアミノ酸番号１９番目とアミノ酸番号２０番目の間であると推定される。このことから成熟型酵素は２８７のアミノ酸からなるそれぞれ分子量３０４５４、３０５３６、３０４８８のポリペプチドである。これらの酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェニルアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）に対しても分解活性が認められることから、エステラーゼの一種であると考えられる。
【００１７】
本発明のアミノ酸配列には、配列番号１、２または３に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の微生物に由来する対応するアミノ酸相同配列も本発明に包含される。また、配列番号１、２または３のヌクレオチド配列がコードするいかなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
配列番号１、２または３に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号１、２または３に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、その様なポリペプチドと配列番号１、２または３に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリペプチドも、エステル結合含有プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本酵素が分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００２０】
遺伝子
次に本発明の酵素をコードする遺伝子は、配列番号４、５または６のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば配列表の配列番号４、５または６に示す、塩基番号１−９１８で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明のプラスチック分解酵素をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。
【００２２】
本発明には、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５ＭＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．編，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎＷｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，１９８９，前掲）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行う事により、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号４、５または６に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリヌクレオチドも、プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果、配列番号４に記載されている塩基配列はラルストニアソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のリゾホスホリパーゼをはじめとするいくつかの遺伝子と相同性が認められる（図２）。しかし、その相同性は４０％以下と低く、また相同性を持つ遺伝子はすべてゲノムプロジェクトからもたらされた推定遺伝子で、タンパク質として翻訳されていることが証明されているものはない。また、配列番号５および６に記載されている塩基配列は、配列番号４に記載されている塩基配列と高い相同性を有する。
【００２５】
酵素の生産方法
本発明の酵素は、バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより、あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。
【００２６】
バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物は、公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。具体的には、代表例として、バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリアセパシアＴＢ−６５株が挙げられる。
【００２７】
バークホルデリア属に属する微生物の培養に用いる培地としては、バークホルデリア属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無核酸類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。ペニバチルス属に属する微生物の培養は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養により行うことができる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２８】
本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え微生物を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、バークホルデリア属菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。
【００２９】
バークホルデリア属に属しエステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物、あるいは本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによる酵素の生産では、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３０】
プラスチック分解方法
更に、本発明は、本酵素により、もしくは該酵素を発現する微生物を利用した、エステル結合含有プラスチックを分解する方法を提供する。つまり、本発明のエステル結合含有プラスチックを分解する方法は、酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用するもの、該酵素を発現する微生物の増殖過程でエステル結合含有プラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは該酵素を発現する微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
【００３１】
あるいは、本発明の酵素を発現する微生物菌体を常法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、該酵素を発現する微生物菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００３２】
本発明の酵素を、該酵素を含有する錠剤等として利用に供することもできる。酵素の粗酵素液、粗酵素粉末、または精製酵素の他に、通常酵素錠剤等に用いられる他の成分、例えば安定化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、増量剤、結合剤等を適宜配合してもよい。また、剤型も特に限定されず、用途に応じて散財、顆粒剤、錠剤等の剤型を選択すればよい。
【００３３】
本発明の方法に用いる酵素は、バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリアセパシアＴＢ−６５株から調製される酵素に限定されるわけではなく、組換えＤＮＡ技術によって創製された微生物、例えば発現ベクターに接続された該酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主、例えば大腸菌、バークホルデリア属菌、枯草菌、酵母等により生産された酵素を使用することも可能である。
【００３４】
組換えＤＮＡ技術による微生物の創製は、当該分野において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、エステル結合含有プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系の構築は、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴシステムを用いて構築することができる。
【００３５】
本発明の方法で使用する酵素は、必ずしも十分に精製する必要はないが、酵素の精製が望まれるときは、通常蛋白質の精製に用いられる方法、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。一例を示せば、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出する。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３６】
本発明のエステル結合含有プラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００３７】
分解に共されるエステル結合含有プラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは液状、粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するエステル結合含有プラスチックの投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する酵素あるいは微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してエステル結合含有プラスチックに対して湿重量として、酵素の場合は０．００１重量％以上、微生物の場合は０．１重量％以上が好ましい。また、分解に供するエステル結合含有プラスチックは、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００３８】
精製酵素あるいは粗精製酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用する態様では、エステル結合含有プラスチックの分解に際し、緩衝液にエステル結合含有プラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３９】
本発明の酵素を発現する微生物の増殖過程でエステル結合含有プラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、エステル結合含有プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、用いる微生物に適した培地であれば特に制限はないが、炭素源としては、グルコース等、及び該微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無機塩を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００４０】
微生物の有する酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、エステル結合含有プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にエステル結合含有プラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００４１】
本発明において、酵素を発現する増殖中の微生物をエステル結合含有プラスチックの分解に利用する場合は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばエステル結合含有プラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００４２】
エステル結合含有プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００４３】
培地中のエステル結合含有プラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００４４】
ポリエステルの生分解性評価方法
さらに本発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物、請求項９、１１または１２に記載の酵素、または請求項９、１１あるいは１２記載の酵素を発現する遺伝子組換え細胞を用いる、ポリエステルの生分解性評価方法である。
【００４５】
上記微生物、酵素および細胞は、天然より分離された微生物および酵素を含有するため、分解試験に供するポリエステルが自然界において分解されるのかの評価に用いることができる。
【００４６】
例えば、請求項９、１１または１２に記載の酵素をリン酸緩衝液に適量入れ、そこに評価サンプルとしてポリエステルを投入し、数日間３０℃にて培養し、ポリエステルの分解を測定することにより、該評価サンプルの生分解性を評価することができる。
【００４７】
本発明のポリエステルの生分解性評価方法は、生分解性を有する新規ポリエステルの設計にも有用である。
【００４８】
【実施例】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１エステル結合含有プラスチック分解菌のスクリーニング
実験材料
平均分子量の異なる数種類のポリジエチレンアジペート（ＭＷ＝５５４、９３５、２，５００、２，６９０）とトリレン−２，４−ジイソシアネート（２，４−ＴＤＩ）をＯＨ基とイソシアネート基の比が１：１になるように無水状態で混合し、エステル系ポリウレタンを合成した。これら各種ポリウレタンを一定期間地面に埋設した後取り出し、微生物の分離源とした。
【００４９】
検索方法
ニュートリエント平板培地（肉エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ）にエマルジョン化した各種ポリエステル（ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、ポリジエチレンアジペート）寒天溶液５ｍｌを重層した。分離源のポリウレタン小片を生理食塩水に加え、ボルテックスで微生物を抽出したものを適宜希釈して平板に塗布した。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンを生成したコロニーをポリエステル分解菌とした。
【００５０】
スクリーニング結果
７０種類の土壌埋設ポリウレタン小片から、高いポリエステル分解活性を持った細菌を３株取得した。これらをそれぞれＴＢ−６２、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５とし、−８０℃にて凍結保存した。
【００５１】
分離微生物の同定
生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定にはＢｅｒｇｅｙ'ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：ＷＩＬＬＩＡＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳＣｏ．，（１９８４）を参考にした。また、米国ＢＩＯＬＯＧ社製の微生物同定システム（Ｍｉｃｒｏｌｏｇ３）も使用した。１６ｓｒＤＮＡの配列決定と解析はダイレクトＰＣＲ法を用い、プライマーには真正細菌１６ＳｒＤＮＡのほぼ全長を増幅することのできる２７Ｆおよび１４９２Ｒのプライマーセットを使用した。
【００５２】
ＴＢ−６２、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５について生理試験を行った結果、すべてグラム陰性の桿菌であり、運動性を有していた。また、ＢＩＯＬＯＧの結果より、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５の２株がバークホルデリア属、ＴＢ−６２株がバークホルデリアセパシアに近縁との結果を得た。
【００５３】
【表１】

【００５４】
【表２】

【００５５】
【表３】

【００５６】
さらに、コロニーダイレクトＰＣＲによって本菌株の１６ＳｒＤＮＡのほぼ全長を増幅し、そのうちの上流領域と下流領域それぞれ約５００ｂｐの塩基配列を決定した。３菌株の上流領域４７５ｂｐの配列を配列表に示す（それぞれ配列番号７、８、９）。この配列に基づいてＢＬＡＳＴにより相同性検索を行ったところ、３株すべてがバークホルデリアセパシアであると同定された。
【００５７】
実施例２得られた微生物によるポリエステルの分解試験
実施例１のスクリーニングの場合と同様に、ニュートリエント平板培地にエマルジョン化した各種ポリエステル（ポリエチレンアジペート分子量約２０００、ポリブチレンアジペート分子量約２０００、ポリエチレンブチレンアジペート分子量約２０００、ポリジエチレンアジペート分子量約２５００）寒天溶液５ｍｌを重層したものを用いた。ここに供試菌を塗布した。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンの大きさにより、分解力を判定した。
【００５８】
実験結果を表４に示した。分解力はＴＢ−６２株が最も強く、また、ＴＢ−６３株の基質特異性は他の２株と異なっていた。
【００５９】
【表４】

【００６０】
実施例３バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株由来エステル結合分解酵素遺伝子のクローニング
方法
エステル結合分解酵素遺伝子の取得を目的として、バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株の遺伝子ライブラリー作成を行った。定法によりゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素Ｓａｕ３Ａ１による部分分解を行った。これをアガロースゲル電気泳動に供し、約４〜６ｋｂｐの大きさの断片を回収した。この回収されたｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニングサイト上ＢａｍＨ１サイトに連結した。これをＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポレーションで導入し、得られた形質転換体を遺伝子ライブラリーとした。
【００６１】
これを、乳化させた０．５％ポリエチレンブチレンアジペートを重層したＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）平板培地にて、３７℃、１〜３日間培養した。コロニー周辺にクリアゾーンが確認された形質転換体をピックアップし、候補株として保存した。
【００６２】
結果
約２万のコロニーを検索した結果、１株の候補クローンを取得した。プラスミド抽出して解析した結果、約２．５ｋｂｐのインサートを確認した。この２．５ｋｂｐの断片をシークエンスした結果、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認められ（図１）、そのうちの１つ（ｅｂａＡ１）が細菌由来のリパーゼと３０〜３５％の相同性が認められた。本ＯＲＦ部分のみをＰＣＲによって増幅し、再度大腸菌に導入した結果、ポリエチレンブチレンアジペートを重層寒天平板上でクリアゾーンの形成が認めたれたことから、本ＯＲＦがポリエステル分解酵素本体であると断定した。本遺伝子の全塩基配列を配列番号４に示した。本酵素は３０６アミノ酸からなり、Ｎ末端から１９アミノ酸がシグナル配列であると推定された（配列番号１）。分子量は前駆体で３２，１２１Ｄａ、シグナルを除いた成熟（ｍａｔｕｒｅ）型で３０，４５４Ｄａと計算された。ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果、本遺伝子はラルストニアソラナセラム由来のリゾホスホリパーゼをはじめとするいくつかの遺伝子と相同性が認められた（図２）。しかし、その相同性は４０％以下と低く、また相同性を持つ遺伝子はすべてゲノムプロジェクトからもたらされた推定遺伝子で、タンパク質として翻訳されていることが証明されているものはなかった。
【００６３】
実施例４発現ベクターを用いた配列番号４のヌクレオチド配列（ｅｂａＡ）の高発現
方法
高発現ベクターへの配列番号４のヌクレオチド配列の組み込み
配列番号４のヌクレオチド配列の開始コドンから停止コドンまでをＰＣＲで増幅し、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入、ｐＥＢＡ−ＰＥＴを作成した。これをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、ＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）培地へ植菌、３２℃、４時間培養後、ＩＰＴＧを添加（終濃度０．１ｍＭ）し、３時間酵素の発現を誘導した。これを集菌、超音波にて破砕、遠心して得た上清を、粗酵素液とした。
【００６４】
活性測定法
エステラーゼ活性の測定は、基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートを用い、酵素反応によって生じたｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生じさせる酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００６５】
ポリエステル分解活性は基質としてポリエチレンブチレンアジペートをエマルジョン化したものを用いた。１００ｍｌの蒸留水（２００ｐｐｍのＰｌｙｓｕｒｆＡ２１０Ｇを含む）に、ジクロロメタンに溶解した０．５ｇのポリエチレンブチレンアジペートを添加し、１０，０００ｒｐｍ、５分間ホモジナイザーで撹拌した。８０℃で１〜２時間加温し、溶液中のジクロロメタンを除去した。これをエマルジョン溶液とした。１．８ｍｌのエマルジョン溶液に、０．２ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍｌの酵素溶液を添加し、３０℃で１時間反応を行った。反応終了後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の減少量を、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性とした。
【００６６】
結果
常法によりペリプラズム画分を回収し、酵素活性を測定したところ、エステラーゼ活性（１３．６Ｕ／ｍｌ）が認められた。また、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性は、１時間で９８％のＯＤ減少率が認められた。また、本画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約３３，０００の位置に太いバンドが観察され、これは配列番号４の配列に基づく推定分子量とほぼ一致した。
【００６７】
一方、コントロール系（配列番号４のヌクレオチド配列を含まない空のプラスミド）において、エステラーゼ活性はほとんど見られず、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性は全く観察されなかった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても、強く発現したバンドは認められなかった。
【００６８】
実施例５バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株およびＴＢ−６５株由来エステル結合分解酵素遺伝子のクローニング
方法
バークホルデリアセパシアＴＢ−６２株由来の配列番号４記載のヌクレオチド配列を基にして、遺伝子の全体を増幅可能なプライマーを作成し、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株およびＴＢ−６５の全染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。得られたバンドを、前述と同様の方法で発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）に挿入した。これをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、乳化ポリエチレンブチレンアジペートを重層したＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭＩＰＴＧを含む）平板培地へ植菌した。
【００６９】
結果
ＰＣＲを行ったところ、両方の菌株において特定なバンドの増幅が認められた。そこで、これらのＰＣＲ産物を発現ベクターに組み込み、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性を調べた。その結果、どちらのＰＣＲ産物からも、ポリエチレンブチレンアジペート分解酵素活性が認められた。そこで、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株由来のエステル結合分解酵素遺伝子を配列番号５、バークホルデリアセパシアＴＢ−６５株由来のエステル結合分解酵素遺伝子を配列番号６とし、それぞれシーケンスを行った。その結果、これらの遺伝子はバークホルデリアセパシアＴＢ−６２株由来のエステル結合分解酵素遺伝子である配列番号４記載の配列と同一ではなかったが、高い相同性を持っていた（図３）。
【００７０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、候補クローンのプラスミド抽出して解析して得た約２．５ｋｂｐのインサート中の、シークエンス結果に基づく遺伝子地図を示す。３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認められた。
【図２】図２は、ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果を示す。ホモロジーの認められた遺伝子は、全てゲノムプロジェクトから得られた推定タンパク質（リパーゼまたはリゾホスホリパーゼ）である。図ではその遺伝子を持つ菌株名で示してある。
【図３】図３は、配列番号１、配列番号２、配列番号３記載の配列を比較した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel ester-decomposing plastic-degrading microorganism, a plastic-degrading enzyme and a polynucleotide encoding the enzyme, and a method for decomposing plastic using the microorganism, the enzyme or a microorganism expressing the enzyme.
[0002]
[Prior art]
In recent years, disposal of plastic waste has become a problem. Incineration and landfill are the main methods for treating plastic waste, but incineration has problems such as promotion of global warming and landfill has a decrease in landfill. For example, polyurethane consumes about 6 million tons annually worldwide and about 550,000 tons domestically. Among these, since the foam cushion is excellent in heat insulation, it is used in large quantities as a heat insulating material for refrigerators and the like. At present, this polyurethane waste is often landfilled as incombustible waste, but there are insufficient disposal sites and environmental pollution problems. On the other hand, biodegradation methods using microorganisms are preferable from the viewpoint of the natural environment, but plastics are generally not biodegradable.
[0003]
There are limited reports of microorganisms that can degrade plastics. Polyurethane contains a urethane bond and an ester bond or an ether bond in the molecule, and the decomposition proceeds by breaking these bonds. There are several reports that the ester bond of the polyol part is cleaved by mold and bacteria. Darby (Darby RT and Kaplan AM: Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968)) et al. Conducted various polyurethane degradation tests with fungi, and ester polyurethanes were better than ether polyurethanes. It has been reported that it is susceptible to decomposition and that the decomposition characteristics differ depending on the type of isocyanate or polyol. Kay (Kay, MJ, McCabe, RW, Morton, L. H. G .: Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991).) Et al. We report the results of isolating 15 types of bacteria and examining the degradation characteristics of Corynebacterium spp.
[0004]
[Non-Patent Document 1]
Darby R.D. T.A. and Kaplan A. M.M. Author, Appl. Microbiol. 16,900-905 (1968)
[Non-Patent Document 2]
Kay, M .; J. et al. McCabe, R .; W. Morton, L .; H. G. By Int. Biodeterio. Biodegrad. , 31, 209-225 (1991)
Regarding the microbial degradation of polyester, there are many reports centering on polyester resins known as biodegradable plastics. However, there are few reports on the decomposition of liquid polyester that is generally used as a raw material for urethane synthesis. Tokiwa et al. Have reported fungi that decompose various liquid polyesters (Tokiwa, Y. and Suzuki, T. (1977) Purification and some properties of polypropylene 3). Agric. Biol. Chem. 41, 265-274), little is known about the bacteria that degrade and assimilate them.
[Non-Patent Document 3]
Tokyo, Y. et al. and Suzuki, T .; (1977) Purification and some properties of polyethylenate-degrading enzyme produced by Penicillium sp. strain 14-3. Agric. Biol. Chem. 41,265-274
Furthermore, a report on an enzyme capable of degrading plastics is polybutylene succinate degrading enzyme (Uchida H, Nakajima-Kambe T, Shigeno-Akutsu Y, Nomura Kur, derived from Acidovorax delafieldi) Y, Nakahara T (2002) Cloning and sequence analysis of poly (tetramethylene succinate) depolymerase acidoidorax delafieldi strain BS-3. Bio J. Bio. dovorans-derived polyurethane-degrading enzyme, Amycolatopsis genus (Planamuda H, Tsuchii A, Tokyo Y (2001) Poly (L-lactide) -degrading enzyme prod. 29, Nakamura K, Tomita T, Abe N, Kamio Y (2001) Purification and charac- terization of an extracellular disorder, L-lactide acid, polysoil tropisolisole soil tropois tropois tropois tropois tropisolis lysole lysole lysole sto tropis ol i s? n K104-1.Appl.Environ.Microbiol.67: 345-353) and from Bacillus smithi (Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura I, Nakamura I, Nakamura I, Nakamura I, Nakamura I. -L-lactide degrading bacteria from compost and it's enzymatic characteristics. J. et al. Biosci. Bioeng. 92: 298-300).
[Non-Patent Document 4]
Uchida H, Nakajima-Kambe T, Shigeno-Akutsu Y, Nomura N, Tokiwa Y, Nakahara T. J. et al. Biosci. Bioeng. 93: 245-247, 2002
[Non-Patent Document 5]
Pranumuda H, Tsuchii A, Tokyo Y, Poly (L-lactide) -degrading enzyme produced by Amycolatopsis sp. Macromol. Biosci. 1: 25-29, 2001
[Non-Patent Document 6]
Nakamura K, Tomita T, Abe N, Kamio Y, Purification and charac- terization of an extracellular poly (L-lactide acid) depolymerase fossil aspiros fro lysm ole fosi mel azo fro lysmo fro lys fos m oleo fossil lys fos m oleo fossil s? strain K104-1. Appl. Environ. Microbiol. 67: 345-353, 2001
[Non-Patent Document 7]
Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M, Isolation of aerhomophilic poly-L-lactide degrading bacteria and commodities. J. et al. Biosci. Bioeng. 92: 298-300, 2001
As for the degradation of liquid polyester using an enzyme, many are known to use lipases derived from animals, molds, bacteria, and esterases (for example, Tokyo Y, Suzuki T (1977) Hydrolysis of polymerases by Natures. 270: 76-78), since these enzymes are not based on liquid polyesters, they are unrelated to degradation in the environment.
[Non-Patent Document 8]
Tokyo Y, Suzuki T (1977) Hydrosisofylesters by liposomes. Nature 270: 76-78
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel ester-decomposing plastic-degrading microorganism, a plastic-degrading enzyme and a polynucleotide encoding the enzyme, and a method for decomposing plastic using the microorganism, the enzyme or a microorganism expressing the enzyme. The purpose is to do.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has the capability of decomposing plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure, and rejected the application from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on February 26, 2003. A Burkholderia cepacia TB-62 strain, a Burkholderia cepacia TB-63 strain, or a Burkholderia cepacia TB-65 strain, and an enzyme having an ester bond-containing plastic resolution produced by the microorganism, A polynucleotide encoding the enzyme. The present invention also relates to a method for purifying and obtaining an enzyme having an ester bond-containing plastic ability in a microorganism incorporating the polynucleotide. Heretofore, it has not been known that microorganisms belonging to the genus Burkholderia have the resolution of plastics containing ester bonds.
[0007]
Furthermore, the present invention is a method for decomposing an ester bond-containing plastic using the microorganism, the enzyme, or a microorganism that expresses the enzyme.
The enzyme of the present invention has the ability to degrade plastics, particularly plastics having ester bonds in the molecular structure. More specifically, the enzyme of the present invention is a novel plastic degrading enzyme derived from Burkholderia cepacia and has esterase activity.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Microbe
Microorganisms belonging to the genus Burkholderia and having a resolution of plastics containing ester bonds may be known microorganisms or newly screened microorganisms. One example of screening for microorganisms is to embed ester polyurethane in the ground for a certain period of time and take it out. Add the polyurethane pieces to physiological saline, vortex-extracted microorganisms, and dilute them appropriately into a nutrient plate medium. Emulsified polyester (eg, polyethylene adipate) is applied to a flat plate overlaid with 5 ml of agar solution. This can be performed by culturing at 30 ° C. for 3 days, and obtaining colonies that have produced a clear zone generated by polyester degradation around the colonies.
[0009]
The microorganism of the present invention may be a Burkholderia genus having an ability to degrade an ester bond-containing plastic. Specifically, as a representative example, on February 26, 2003, the Berkhorderia Sepasia TB-62 strain, which was rejected after applying for deposit at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center, Examples include Deria Sepiacia TB-63 strain, or Burkholderia Sepiacia TB-65 strain. These strains are self-deposited and can be distributed upon application. The bacteriological properties of the genus Burkholderia are as follows: BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology (Volume 1, 1984, Vol. 2, 1986, Vol. 3, 1989, 4 (1989).
[0010]
Furthermore, the microorganism of the present invention may be a wild strain or a mutant strain as long as it is a Burkholderia genus having an ability to degrade an ester bond-containing plastic.
Mutant strains can be obtained without mutation treatment with ethyl methanesulfonic acid, a commonly used mutation agent, other chemical treatments such as nitrosoguanidine, methylmethanesulfonic acid, ultraviolet irradiation, or treatment with a mutation agent. It can also be obtained by so-called spontaneous mutation.
[0011]
As a medium used for culture of microorganisms belonging to the genus Burkholderia, any medium can be used as long as it can grow microorganisms belonging to the genus Burkholderia. For example, LB medium (1% tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl), but not limited thereto. The medium used for the growth of the microorganism of the present invention specifically contains a carbon source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. May contain an organic nitrogen source, such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steeple liquor, etc., and an inorganic nitrogen source, such as ammonium sulfate, ammonium chloride and the like. Further, if desired, a salt composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion or magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chlorine ion or phosphate ion may be contained. Furthermore, trace elements such as vitamins and nucleic acids can also be contained. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source is, for example, about 0.01 to 5%, depending on the type. Moreover, the density | concentration of inorganic salt is about 0.001-1%, for example.
[0012]
The ester bond-containing plastic that can be decomposed by the microorganism is only required to have an ester bond in the molecular structure. Non-limiting examples include polyurethane, polybutylene adipate, polyethylene adipate, and polyethylene butylene adipate.
[0013]
Polyurethane is a general term for polymer compounds having a urethane bond (—NHCOO—) in the molecule, and is obtained by reaction of a polyfunctional isocyanate and a hydroxyl group-containing compound, and groups such as ester, ether, amide, urea, carbamate, etc. It is a polymer having A wide variety of branched or cross-linked polymers can be prepared by varying the functional number of the hydroxyl or isocyanate groups. Depending on the type of polyol used, it can be roughly divided into ester and ether types. Polyurethanes have a wide range of applications such as elastic bodies, foams, adhesives, paints, fibers, and synthetic leather due to excellent properties such as easy processability, rot resistance, alteration resistance, and low specific gravity. Are also widely used. The number average molecular weight of the polyurethane resin that can be applied in the decomposition method of the present invention is not particularly limited.
[0014]
The number average molecular weight of the ester bond-containing plastic that is degraded by the microorganism or enzyme of the present invention is not particularly limited. The decomposition of polyethylene adipate molecular weight about 2000, polybutylene adipate molecular weight about 2000, polyethylene butylene adipate molecular weight about 2000, polydiethylene adipate molecular weight about 2500 is shown in the examples.
[0015]
enzyme
The enzyme of the present invention is composed of 306 amino acids, is a polypeptide having a molecular weight of 32121, 32193, and 32145, and is specified by the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 306 of SEQ ID NOs: 1 to 3. This amino acid sequence is an amino acid sequence of a polypeptide encoded by an open reading frame (reading frame) portion of the base sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively.
[0016]
In addition, the amino acid sequence of sequence number 1-3 has a signal peptide part, The cut | disconnecting point is presumed to be between the 19th amino acid number and 20th amino acid number of sequence number 1-3. Therefore, the mature enzyme is a polypeptide consisting of 287 amino acids and having molecular weights 30454, 30536, and 30488, respectively. These enzymes are considered to be a kind of esterase because they have a degrading activity with respect to para-nitrophenyl acetate (p-nitrophenyl acetate) which is a substrate for measuring the activity of esterase in addition to plastic.
[0017]
The amino acid sequence of the present invention includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3, and analogs and derivatives thereof. Furthermore, corresponding amino acid homologous sequences derived from other microorganisms are also encompassed by the present invention. Also, any polypeptide encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is within the scope of the present invention.
[0018]
A polypeptide in which a part of the amino acids of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is deleted, substituted, inserted or added, for example, 20 or less in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3, preferably Polypeptides with 10 or fewer amino acids, more preferably 5 or fewer amino acids substituted, may exhibit the same enzyme activity. Therefore, as long as it has the same enzyme activity, those peptides are also included in the enzyme of the present invention. Further, such a polypeptide and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 have a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (homology calculation is For example, it can be performed by using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search.) Such a polypeptide is also included in the scope of the present invention as long as it has a feature of catalyzing an ester bond-containing plastic degradation reaction.
[0019]
The plastic that can be decomposed by the enzyme may be any plastic that has an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polyurethane, polybutylene adipate, polyethylene adipate, and polyethylene butylene adipate.
[0020]
gene
Next, the gene encoding the enzyme of the present invention is a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoded by the open reading frame of SEQ ID NO: 4, 5 or 6. For example, it is a polynucleotide comprising the base sequence represented by base numbers 1-918 shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6 in the sequence listing.
[0021]
The polynucleotide of the present invention can include its degeneracy. Degeneracy refers to a phenomenon in which one amino acid can be encoded by different nucleotide codons. Thus, the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule encoding the plastic degrading enzyme of the present invention can be altered by degeneracy.
[0022]
The present invention includes a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6 or a complementary sequence of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6 under conditions highly stringent [eg, 0.5M NaHPO_Four, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), hybridized to filter-bound DNA in 1 mM EDTA at 65 ° C. and washed at 68 ° C. in 0.1 × SSC / 0.1% SDS (Ausubel, FM et al. al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, and John Willy & Sons, New York, p. 2.10.3)] The protein encoded by the hybridizing nucleotide sequence is the same. It may show enzyme activity. Therefore, as long as they have the same enzyme activity, their nucleotide sequences are also included in the scope of the present invention. Further, under conditions moderately stringent to the complementary sequence of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6, [for example, washed at 42 ° C. in 0.2 × SSC / 0.1% SDS (Ausubel, et al. al., 1989, supra)], depending on the nucleotide sequence to hybridize, the encoded protein may also exhibit the same enzymatic activity. Therefore, as long as they have the same enzyme activity, their nucleotide sequences are also included in the scope of the present invention.
[0023]
According to the genetic recombination technique, it is possible to artificially mutate a specific site of the basic DNA without changing the basic characteristics of the DNA or so as to improve the characteristics. Similarly, a polynucleotide having a natural base sequence provided by the present invention or a polynucleotide having a base sequence different from that of the natural one is artificially inserted, deleted, substituted, or added, It is possible to have the same or improved properties as the polynucleotide of the present invention, and the present invention includes such a mutant polynucleotide. That is, the polynucleotide in which a part of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6 in the sequence listing is inserted, deleted, substituted or added is 20 or less in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably A polynucleotide in which 10 or less, more preferably 5 or less bases are substituted. Further, such a polynucleotide and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 have a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (homology calculation is performed by, for example, BLAST (Basic (Local Alignment Search Tool) search can be used.) Such polynucleotides are also within the scope of the present invention so long as they encode a polypeptide having the characteristic of having the ability to degrade plastics.
[0024]
As a result of homology search by BLAST, the base sequence described in SEQ ID NO: 4 has homology with several genes including lysophospholipase derived from Ralstonia solanaceram (FIG. 2). However, the homology is as low as 40% or less, and all the homologous genes are putative genes derived from the genome project, and none have been proven to be translated as proteins. Further, the base sequences described in SEQ ID NOs: 5 and 6 have high homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 4.
[0025]
Enzyme production method
The enzyme of the present invention belongs to the genus Burkholderia, and cultivates a microorganism having an ester bond-containing plastic ability and isolates and purifies the enzyme in the microorganism, or a host in which the polynucleotide sequence of the present invention is incorporated. It can be produced by culturing cells and separating and purifying the enzyme from the host.
[0026]
A microorganism belonging to the genus Burkholderia and having an ester bond-containing plastic ability may be a known microorganism or a newly screened microorganism. Specifically, the Burkholderia cepacia TB-62 strain, the Burkholderia cepacia TB-63 strain, or the Burkholderia cepacia TB-65 strain can be mentioned as a representative example.
[0027]
As a medium used for culture of microorganisms belonging to the genus Burkholderia, any medium can be used as long as it can grow microorganisms belonging to the genus Burkholderia. For example, LB medium (1% tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl), but not limited thereto. The medium used for the growth of the microorganism of the present invention specifically contains a carbon source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. May contain an organic nitrogen source, such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steeple liquor, etc., and an inorganic nitrogen source, such as ammonium sulfate, ammonium chloride and the like. Furthermore, if desired, a unique species comprising a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chlorine ion and phosphate ion may be included. Furthermore, trace elements such as vitamins and nucleic acids can also be contained. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source is, for example, about 0.01 to 5%, depending on the type. Moreover, the concentration of the nucleic acid-free is, for example, about 0.001 to 1%. Culture of microorganisms belonging to the genus Penibacillus can be performed under aerobic conditions by stationary culture, shaking culture or aeration culture. Preferably, rotary shaking culture is good, and the number of rotations is in the range of 30 to 250 rotations / minute. The culture temperature is preferably 10 to 50 ° C, particularly around 30 ° C. The pH of the medium is in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0028]
A method for producing the enzyme of the present invention using a recombinant cell is as follows. First, a polynucleotide molecule is inserted into a host cell and inserted into any vector capable of forming a recombinant microorganism. Vectors can be either RNA or DNA, either prokaryotic or eukaryotic, but are typically viruses or plasmids. The vector can be expressed as an extrachromosomal element (eg, a plasmid) or it can be integrated into the chromosome. The integrated polynucleotide molecule can be under the control of a chromosomal promoter, under the control of a natural or plasmid promoter, or under a combination of several promoters. Single or multiple copies of the polynucleotide molecule can be integrated into the chromosome. The vector is then transfected into a host cell to form a recombinant cell. Suitable host cells for transfection include any bacterial, fungal (eg yeast), insect, plant or animal cell that can be transfected. Preferred host cells for use in the present invention include, but are not limited to, any microbial cell suitable for expression of the enzyme of the present invention including, for example, E. coli, Burkholderia, Bacillus subtilis, yeast, and the like. Including. Furthermore, a genetically modified cell containing the enzyme of the present invention can be obtained by culturing the host under culture conditions suitable for the host. Suitable culture conditions for the host are well-known to those of skill in the art.
[0029]
Separation / purification of the enzyme of the present invention from a microorganism belonging to the genus Burkholderia and having an ester bond-containing plastic ability or a host cell incorporating the polynucleotide sequence of the present invention is usually used for the separation / purification of proteins from cells. Can be carried out by using the following method. Specifically, it can be carried out by using commonly used separation and purification means after disrupting the cells. Non-limiting examples of cell destruction include sonication, high-pressure homogenizer treatment, and osmotic shock method. Separation and purification means may be used by appropriately combining methods such as salting out, gel filtration, and ion exchange chromatography. Furthermore, in the production of the enzyme by genetic recombination, the recombinant enzyme is produced so that it has a His-tag at the C-terminus, the cultured cells are collected by centrifugation, and the periplasm fraction is extracted by the osmotic shock method. Since the recombinant enzyme has a His-tag at the C-terminus, it can be easily purified by a column chelated with nickel.
[0030]
Plastic disassembly method
Furthermore, the present invention provides a method for decomposing an ester bond-containing plastic using the present enzyme or using a microorganism that expresses the enzyme. In other words, the method for decomposing an ester bond-containing plastic of the present invention uses an enzyme's action of decomposing the ester bond-containing plastic, and the ester bond-containing plastic is decomposed during the growth of microorganisms expressing the enzyme as a nutrient source. Utilizing consumption, or utilizing microbial cells that express the enzyme, such as resting cells.
[0031]
Alternatively, a powder obtained by freeze-drying the microbial cells expressing the enzyme of the present invention by a conventional method, tableting with the powder, various vitamins and minerals, and necessary nutrients such as yeast extract, casamino acid, peptone, etc. It may also be provided for the processing of plastics as a solid form preparation such as tablets. Moreover, the microorganism strain which expresses this enzyme can also be utilized as a component of activated sludge and compost.
[0032]
The enzyme of the present invention can also be used as a tablet containing the enzyme. In addition to the enzyme crude enzyme solution, crude enzyme powder, or purified enzyme, other ingredients commonly used in enzyme tablets, such as stabilizers, excipients, pH adjusters, extenders, binders, etc. May be. Also, the dosage form is not particularly limited, and a dosage form such as a powdered product, a granule, or a tablet may be selected according to the use.
[0033]
The enzyme used in the method of the present invention is not limited to enzymes prepared from Burkholderia cepacia TB-62 strain, Burkholderia cepacia TB-63 strain, or Burkholderia cepacia TB-65 strain. Use of microorganisms created by recombinant DNA technology, for example, enzymes produced by a host introduced with a polynucleotide encoding the enzyme connected to an expression vector, such as E. coli, Burkholderia, Bacillus subtilis, yeast, etc. It is also possible to do.
[0034]
The creation of microorganisms by recombinant DNA technology can be carried out by methods commonly used in the art. For example, a high-efficiency expression system for an ester bond-containing plastic degrading enzyme gene can be constructed using the pET system, which is one of the most efficient host-vector systems for expressing polypeptides at present.
[0035]
The enzyme used in the method of the present invention does not necessarily need to be sufficiently purified, but when purification of the enzyme is desired, a method usually used for protein purification such as salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, etc. These methods may be used in appropriate combination. For example, the recombinant enzyme is produced so as to have a His-tag at the C-terminus of the recombinant enzyme, the cultured cells are collected by centrifugation, and the periplasmic fraction is extracted by the osmotic shock method. Since the recombinant enzyme has a His-tag at the C-terminus, it can be easily purified by a column chelated with nickel.
[0036]
As described above, the plastic that can be decomposed by the method for decomposing an ester bond-containing plastic according to the present invention may be one having an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polyurethane, polybutylene adipate, polyethylene adipate, and polyethylene butylene adipate.
[0037]
The ester bond-containing plastic used in the decomposition may be added, for example, as an emulsion in a liquid medium, in the form of a liquid or powder, or as a lump such as a film or a pellet. The input amount of the ester bond-containing plastic to the medium is preferably 0.01 to 10% by weight. The amount of enzyme or microorganism to be added may be extremely small, but considering the degradation efficiency, the wet weight with respect to the ester bond-containing plastic is 0.001% by weight or more in the case of an enzyme, and 0. 1% by weight or more is preferable. Further, the ester bond-containing plastic to be decomposed may be one kind or plural kinds.
[0038]
In the embodiment using the action of decomposing the ester bond-containing plastic of the purified enzyme or the crude purified enzyme, the medium containing the ester bond-containing plastic in the buffer solution may be used when decomposing the ester bond-containing plastic. Nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and the like may be added. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution.
[0039]
In an embodiment using the fact that the ester bond-containing plastic is decomposed and consumed as a nutrient source in the growth process of the microorganism expressing the enzyme of the present invention, the ester bond-containing plastic can be provided as a single carbon source, It can also be given with a source. The medium that can be used is not particularly limited as long as it is a medium that is suitable for the microorganism to be used. However, the carbon source contains glucose and the like and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism, and the nitrogen source is an organic nitrogen source. For example, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and the like, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium chloride. Furthermore, if desired, an inorganic salt composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion or magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chlorine ion or phosphate ion may be contained. Furthermore, trace elements such as vitamins and nucleic acids can also be contained. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source is, for example, about 0.01 to 5%, depending on the type. Moreover, the density | concentration of inorganic salt is about 0.001-1%, for example.
[0040]
In an embodiment using the action of decomposing an ester bond-containing plastic of an enzyme possessed by a microorganism, that is, in an embodiment using a microbial cell after growth, for example, a resting cell, the growth of the microorganism is carried out when the ester bond-containing plastic is decomposed. Since it does not accompany, it may be a medium in which an ester bond-containing plastic is added to a buffer solution, or a nitrogen source, an inorganic salt, a vitamin, or the like may be added. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution.
[0041]
In the present invention, when a growing microorganism that expresses an enzyme is used for degradation of an ester bond-containing plastic, if the stationary culture, shaking culture, or aeration culture is performed under aerobic conditions, the degradation of the ester bond-containing plastic is observed. It is done. Preferably, rotary shaking culture is good, and the number of rotations is in the range of 30 to 250 rotations / minute. As culture conditions, the culture temperature is preferably 10 to 50 ° C., particularly around 30 ° C. The pH of the medium is in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0042]
The time required for the degradation of the ester bond-containing plastic can vary depending on the type, composition, shape and amount of plastic to be decomposed, the type of microorganism used and the relative amount to the resin, and other various culture conditions.
[0043]
Confirmation of the degradation of the ester bond-containing plastic in the medium can be carried out, for example, by measuring the weight reduction of the plastic subjected to degradation, or by forming a clear zone due to the degradation of the plastic when used as an emulsion.
[0044]
Evaluation method of biodegradability of polyester
Furthermore, the present invention uses the microorganism according to any one of claims 1 to 3, the enzyme according to claim 9, 11 or 12, or a genetically modified cell that expresses the enzyme according to claim 9, 11 or 12. This is a method for evaluating biodegradability of polyester.
[0045]
Since the microorganisms, enzymes and cells contain microorganisms and enzymes isolated from nature, they can be used to evaluate whether the polyester used for the degradation test is degraded in nature.
[0046]
For example, by putting an appropriate amount of the enzyme according to claim 9, 11 or 12 in a phosphate buffer, adding polyester as an evaluation sample therein, culturing at 30 ° C. for several days, and measuring degradation of the polyester, The biodegradability of the evaluation sample can be evaluated.
[0047]
The polyester biodegradability evaluation method of the present invention is also useful for designing a novel polyester having biodegradability.
[0048]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Screening of ester-degrading plastic-degrading bacteria
Experimental material
Several types of polydiethylene adipate (MW = 554, 935, 2500, 2,690) having different average molecular weights and tolylene-2,4-diisocyanate (2,4-TDI) were mixed at a ratio of OH group to isocyanate group of 1: An ester polyurethane was synthesized by mixing in an anhydrous state so as to be 1. These various polyurethanes were buried in the ground for a certain period and then taken out, and used as a microorganism separation source.
[0049]
retrieval method
Various polyester (polyethylene adipate, polybutylene adipate, polyethylene butylene adipate, polydiethylene adipate) agar solutions (5 ml) were layered on a nutrient plate medium (meat extract 3 g / l, peptone 5 g / l, agar 20 g / l). A polyurethane piece as a separation source was added to physiological saline, and a microorganism extracted with vortex was appropriately diluted and applied to a flat plate. This was cultured at 30 ° C. for 3 days, and a colony in which a clear zone produced by the degradation of the polyester around the colony was defined as a polyester-degrading bacterium.
[0050]
Screening result
Three strains of bacteria having high polyester degrading activity were obtained from 70 types of soil-embedded polyurethane pieces. These were designated as TB-62, TB-63, and TB-65, respectively, and stored frozen at -80 ° C.
[0051]
Identification of isolated microorganisms
Physiological tests were performed according to general methods. For identification, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore: WILLIAMS & WILKINS Co. , (1984). In addition, a microorganism identification system (Microlog 3) manufactured by BIOLOG USA was also used. For sequencing and analysis of 16s rDNA, the direct PCR method was used, and as primers, 27F and 1492R primer sets capable of amplifying almost the full length of eubacterial 16S rDNA were used.
[0052]
As a result of physiological tests on TB-62, TB-63, and TB-65, all were gram-negative bacilli and had motility. From the results of BIOLOG, two strains, TB-63 and TB-65, were closely related to the genus Burkholderia, and the TB-62 strain was closely related to Burkholderia cepacia.
[0053]
[Table 1]

[0054]
[Table 2]

[0055]
[Table 3]

[0056]
Furthermore, almost the entire length of 16S rDNA of this strain was amplified by colony direct PCR, and a base sequence of about 500 bp in each of the upstream region and the downstream region was determined. Sequences of the upstream region 475 bp of the three strains are shown in the sequence listing (SEQ ID NOs: 7, 8, and 9 respectively). When homology search was performed by BLAST based on this sequence, all three strains were identified as Burkholderia cepacia.
[0057]
Example 2 Degradation test of polyester by the obtained microorganism
As in the screening of Example 1, various polyesters emulsified in a neutral plate medium (polyethylene adipate molecular weight about 2000, polybutylene adipate molecular weight about 2000, polyethylene butylene adipate molecular weight about 2000, polydiethylene adipate molecular weight about 2500) agar A solution layered with 5 ml of solution was used. The test bacteria were applied here. This was cultured at 30 ° C. for 3 days, and the degrading power was determined by the size of the clear zone generated by the degradation of the polyester around the colony.
[0058]
The experimental results are shown in Table 4. The resolution of the TB-62 strain was the strongest, and the substrate specificity of the TB-63 strain was different from the other two strains.
[0059]
[Table 4]

[0060]
Example 3 Cloning of an ester bond degrading enzyme gene derived from Burkholderia cepacia TB-62
Method
A gene library of Burkholderia cepacia TB-62 was prepared for the purpose of obtaining an ester bond degrading enzyme gene. Genomic DNA was prepared by a conventional method, and partial digestion with restriction enzyme Sau3A1 was performed. This was subjected to agarose gel electrophoresis, and fragments having a size of about 4 to 6 kbp were recovered. The recovered pUC18 vector was ligated to the BamH1 site on the multicloning site. This is E. The resulting transformant was introduced into E. coli DH10B strain by electroporation and used as a gene library.
[0061]
This was cultured at 37 ° C. for 1 to 3 days in an LB (containing 10 μg / ml ampicillin) flat plate layered with emulsified 0.5% polyethylene butylene adipate. A transformant in which a clear zone was confirmed around the colony was picked up and stored as a candidate strain.
[0062]
result
As a result of searching about 20,000 colonies, one candidate clone was obtained. As a result of plasmid extraction and analysis, an insert of about 2.5 kbp was confirmed. As a result of sequencing this 2.5 kbp fragment, three open reading frames (ORF) were observed (FIG. 1), and one of them (ebaA1) had 30-35% homology with bacterial lipase. It was. As a result of amplifying only this ORF portion by PCR and re-introducing it into Escherichia coli, it was determined that this ORF was the main body of the polyester-degrading enzyme because the formation of clear zones was observed on the multi-layered agar plate. The entire base sequence of this gene is shown in SEQ ID NO: 4. This enzyme consists of 306 amino acids, and it was estimated that 19 amino acids from the N-terminal were the signal sequence (SEQ ID NO: 1). The molecular weight was calculated to be 32,121 Da for the precursor and 30,454 Da for the mature type excluding the signal. As a result of homology search by BLAST, this gene was found to be homologous to several genes including lysophospholipase derived from Ralstonia solanaceram (FIG. 2). However, the homology was as low as 40% or less, and all the homologous genes were putative genes derived from the genome project, and none were proved to be translated as proteins.
[0063]
Example 4 High Expression of Nucleotide Sequence (ebaA) of SEQ ID NO: 4 Using Expression Vector
Method
Incorporation of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 into a high expression vector
The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 was amplified by PCR from the start codon to the stop codon and inserted into the NheI / XhoI site of the expression vector pET21a (+) (Novagen, USA) to prepare pEBA-PET. This is E. E. coli BL21 (DE3) strain, inoculated into LB (containing 10 μg / ml ampicillin) medium, cultured at 32 ° C. for 4 hours, and then added with IPTG (final concentration 0.1 mM) to express the enzyme for 3 hours. Induced. The supernatant obtained by collecting and pulverizing and centrifuging this with ultrasonic waves was used as a crude enzyme solution.
[0064]
Activity measurement method
For the measurement of esterase activity, p-nitrophenyl acetate was used as a substrate, and the amount of p-nitrophenol produced by the enzyme reaction was quantified by measuring the absorbance at 405 nm. The amount of enzyme that produced 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 unit.
[0065]
Polyester degradation activity was obtained by emulsifying polyethylene butylene adipate as a substrate. To 100 ml of distilled water (containing 200 ppm of Plysurf A210G), 0.5 g of polyethylene butylene adipate dissolved in dichloromethane was added, and the mixture was stirred with a homogenizer at 10,000 rpm for 5 minutes. Heated at 80 ° C. for 1-2 hours to remove dichloromethane in the solution. This was used as an emulsion solution. To 1.8 ml of the emulsion solution, 0.2 ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.1 ml of enzyme solution were added, and the reaction was performed at 30 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, absorbance at 580 nm was measured. The amount of decrease in absorbance was defined as polyethylene butylene adipate decomposition activity.
[0066]
result
When the periplasmic fraction was collected by a conventional method and enzyme activity was measured, esterase activity (13.6 U / ml) was observed. The polyethylene butylene adipate decomposition activity was found to have a 98% OD reduction rate in 1 hour. Further, when this fraction was subjected to SDS-PAGE, a thick band was observed at a molecular weight of about 33,000, which almost coincided with the estimated molecular weight based on the sequence of SEQ ID NO: 4.
[0067]
On the other hand, in the control system (empty plasmid containing no nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4), almost no esterase activity was observed, and no polyethylene butylene adipate degradation activity was observed. Also, a strongly expressed band was not observed in SDS-PAGE.
[0068]
Example 5 Cloning of ester bond degrading enzyme genes derived from Burkholderia cepacia TB-63 and TB-65
Method
Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 derived from Burkholderia cepacia TB-62, a primer capable of amplifying the entire gene was prepared, and whole chromosomal DNA of Burkholderia cepacia TB-63 and TB-65 PCR was performed on. The obtained band was inserted into the expression vector pET21a (+) in the same manner as described above. This is E.I. E. coli BL21 (DE3) strain was transformed and inoculated into LB (containing 10 μg / ml ampicillin and 0.1 mM IPTG) plate medium overlaid with emulsified polyethylene butylene adipate.
[0069]
result
When PCR was performed, amplification of a specific band was observed in both strains. Therefore, these PCR products were incorporated into an expression vector, and the polyethylene butylene adipate degradation activity was examined. As a result, polyethylene butylene adipate-degrading enzyme activity was recognized from both PCR products. Thus, the ester bond-degrading enzyme gene derived from the Burkholderia cepacia TB-63 strain was set as SEQ ID NO: 5, and the ester bond-degrading enzyme gene derived from the Burkholderia cepacia TB-65 strain was set as SEQ ID NO: 6, respectively. As a result, these genes were not identical to the sequence described in SEQ ID NO: 4 which is an ester bond degrading enzyme gene derived from Burkholderia cepacia TB-62 strain, but had high homology (FIG. 3).
[0070]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a gene map based on sequence results in an insert of about 2.5 kbp obtained by extracting and analyzing a plasmid of a candidate clone. Three open reading frames (ORF) were observed.
FIG. 2 shows the result of homology search by BLAST. The homologous genes are all putative proteins (lipase or lysophospholipase) obtained from the genome project. In the figure, the name of the strain having the gene is shown.
FIG. 3 is a diagram comparing the sequences described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.

Claims

A microorganism belonging to the genus Burkholderia and having an ester bond-containing plastic ability , or a mutant thereof having an ester bond-containing plastic ability .

The microorganism according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Burkholderia is Burkholderia cepacia.

The microorganism according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Burkholderia is Burkholderia cepacia TB-62 strain, Burkholderia cepacia TB-63 strain, or Burkholderia cepacia TB-65 strain.

The microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

A method for decomposing an ester bond-containing plastic comprising the step of bringing the microorganism according to any one of claims 1 to 3 into contact with an ester bond-containing plastic.

The decomposition method according to claim 6, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The decomposition method according to claim 6, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

A method for producing an ester bond-containing plastic degrading enzyme derived from a microorganism of the genus Burkholderia,
Step of culturing Burkholderia microorganism:
Separating and purifying the enzyme from the culture:
A method for producing the enzyme, comprising:

A peptide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, or a peptide sequence having a deletion, substitution, insertion or addition of 1 to several amino acids in the peptide sequence, wherein the ester bond-containing plastic degrading enzyme activity is An ester bond-containing plastic degrading enzyme comprising a maintained peptide sequence.

The esterase-containing plastic degrading enzyme according to claim 10, wherein the peptide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 has a peptide sequence in which the first to 19th amino acids are deleted, or 1 in the peptide sequence. An ester bond-containing plastic degrading enzyme comprising a peptide sequence having deletions, substitutions, insertions or additions of several amino acids and maintaining the ester bond-containing plastic degrading enzyme activity.

The enzyme according to claim 10 or 11, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The enzyme according to claim 10 or 11, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

A polynucleotide comprising the base sequence shown in (a), (b), or (c):
(A) a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, or an amino acid sequence from which the first amino acid to the 19th amino acid are deleted, or a polynucleotide comprising a complementary sequence thereof ;
(B) a polynucleotide encoding a polypeptide having polyester-degrading activity and comprising a sequence in which a part of the base sequence of (a) is deleted, substituted, inserted or added, or a complementary sequence thereof;
(C) a polynucleotide that encodes a polypeptide having polyester-degrading activity and hybridizes to the base sequence (a) or (b) under stringent conditions.

A polynucleotide having the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4 to 6.

The polynucleotide according to claim 14 or 15, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The polynucleotide according to claim 14 or 15, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

A method for decomposing an ester bond-containing plastic comprising the step of contacting the enzyme according to claim 10 or 11 with an ester bond-containing plastic.

19. The method of claim 18, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The method according to claim 18, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

12. Degradation of an ester bond-containing plastic comprising the steps of culturing a genetically modified cell expressing the enzyme according to claim 10 or 11 , pulverizing the cell, and contacting the cell lysate with an ester bond-containing plastic. Method.

The method for decomposing an ester bond-containing plastic according to claim 21, wherein the cell is Escherichia coli.

The method according to claim 21 or 22, wherein the ester bond-containing plastic is polybutylene adipate, polyethylene adipate, polyethylene butylene adipate, or polydiethylene adipate.

The method according to claim 21 or 22, wherein the ester bond-containing plastic is polyurethane.

A method for producing a recombinant enzyme comprising:
(I) a step of culturing a host cell containing a vector comprising a polynucleotide sequence encoding the enzyme according to claim 10 or 11 under conditions suitable for the growth of the host cell;
(J) separating and purifying the enzyme from the culture;
A method for producing a recombinant enzyme, comprising:

The polyester whose biodegradability is to be evaluated is selected from those of the microorganism according to any one of claims 1 to 3, the enzyme according to claim 10 or 11, or a genetically modified cell expressing the enzyme according to claim 10 or 11 . A method of evaluating the biodegradability of polyester by contacting with a crushing liquid and the degree of degradation of the polyester.