JP4102432B2 - Allergenic proteins and peptides derived from cedar pollen - Google Patents

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発明の背景
遺伝的素因を有する個人（人口の約１０％に及ぶ）は、彼らがさらされる種々の環境起源の抗原に対して過剰感作（アレルギー性）となる。それらの即時型及び／又は遅延型の過敏症を誘発し得る抗原はアレルゲンとして知られている（King,T.P.,Adv.Immunol.23:77-105,（1976））。枯草熱、喘息及び発疹の症状を含むアナフィラキシー又はアトピーは、即時型アレルギーの一形態である。それは、草、木、雑草、動物の鱗屑、昆虫、食物、薬物及び化学物質等の種々のアトピー性アレルゲンによって引き起こされ得る。
アトピー性アレルギーに関係する抗体は、主として免疫グロブリンＩｇＥクラスに属する。ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基球と結合する。特定のアレルゲンと、マスト細胞又は好塩基球に結合したＩｇＥとの結合により、ＩｇＥは、その細胞上で架橋されてＩｇＥ−抗原相互作用の生理的効果を生じ得る。これらの生理的効果は、他の物質のうちで、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、エオシン好性白血球及び／又はロイコトリエンに対する走化性因子、Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の放出を含み、これらは、気管支平滑筋細胞の長期の収縮を引き起こす（Hood,L.E.等、Immunology（第２版）,The Benjamin/Cumming Publishing Co.,Inc.（1984））。これらの放出された物質は、ＩｇＥと特異的アレルゲンとの結合により引き起こされるアレルギー性症状を生じるメディエーターである。それらを介してアレルゲンの効果は現れる。かかる効果は、その性質が、抗原が体内に侵入した経路及びＩｇＥのマスト細胞又は好塩基球への付着パターンによって、全身性であり又は局所的である。局所的出現は、一般に、アレルゲンが体内に侵入した場所の上皮表面に起きる。全身性効果は、アナフィラキシー（アナフィラキシー性ショック）を含み、それは、循環（血管内）抗原に対するＩｇＥ−好塩基球の応答の結果である。
杉（スギ：Cryptomeria japonica）花粉症は、日本における最も重大なアレルギー性疾患の一つである。この病気を患っている患者数は増加中であり、幾つかの地域では人口の１０％より多くが影響を受けている。杉花粉抽出物を投与してアレルゲンに対して除感作することによる杉花粉症の治療が試みられてきた。しかしながら、杉花粉抽出物を用いる除感作は、高投与量で用いるならばそれがアナフィラキシーを誘出し得るという欠点を有しており、他方、低投与量を用いてアナフィラキシーを回避した場合には治療はその抽出物に対する寛容を確立するために数年間継続しなければならない。
杉花粉に由来する主要なアレルゲンは精製され、スギ塩基性蛋白質（ＳＢＰ）又はCryjIと呼ばれている。この蛋白質は、分子量４１〜５０ｋＤａでｐＩ８．８の塩基性蛋白質であることが報告されている。部分的に異なるグリコシレーションのために、このアレルゲンの多くのイソ型があるらしい（Yasueda等（1983）J.Allergy Clin.Immunol.71:77-86;及びTaniai等（1988）FEBS Letters239:329-332）。CryjIのＮ末端の最初の２０アミノ酸の配列及び１６アミノ酸の内部配列が決定された（Taniai、前出）。
分子量約３７ｋＤａを有しCryjIIとして知られる杉花粉の第２のアレルゲンも又報告された（Sakaguchi等、（1990）Allergy45:309-312）。このアレルゲンは、CryjIとの免疫交差反応性を有しないことが見出された。杉花粉症の殆どの患者は、CryjI及びCryjIIの両者に対するＩｇＥ抗体を有することが見出されたが、幾人かの患者からの血清はCryjI又はCryjIIのみと反応した。
低投与量の杉花粉抽出物を用いる杉花粉症患者の除感作に加えて、１９９０年７月３日にMatsuhashi等に発行された米国特許第４，９３９，２３９号は、杉花粉に過敏性の人の除感作用の杉花粉アレルゲンに共有結合した糖類を含む除感作剤を開示している。この除感作剤は、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の産生を促進するがアレルゲンに特異的であってアナフィラキシー及びアレルギーの原因であるＩｇＥ抗体の産生を減じることが報告されている。これらの除感作剤において用いられるアレルゲンは、好ましくは、ＮＨ2末端アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−、（ここにＸはＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ又はＨｉｓである）（SEQ ID NO（配列番号）：１８）を有する。更に、Usui等（1990）Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91:74-79は、アルツス反応を誘出するスギ塩基性蛋白質（即ち、CryjI）−プルラン結合体の能力が天然のスギ塩基性蛋白質のそれより約１０００倍近く顕著に感じたことを報告し、且つスギ塩基性蛋白質−プルラン結合体が杉花粉症に対する脱感作治療のための優れた候補であることを示唆した。
Cryptomeria japonica中に見出されるCryjIアレルゲンは又、Cupressus sempervirensを含む他の種の木からの花粉中のアレルゲンと交差反応性であることも見出されている。Panzani等（Annals of Allergy57:26-30（1986））は、皮膚試験（RAST及びRAST阻害）においてCupressus sempervirensとCryptomeria japonicaの花粉のアレルゲンの間で交差反応性が検出されたことを報告した。柏（Mountain Ceder）（Juniperus sabinoidesのこと。Juniperus asheiとしても知られる）から単離された５０ｋＤａのアレルゲンは、ＮＨ2末端配列ＡｓｐＡｓｎＰｒｏＩｌｅＡｓｐ（SEQ ID NO：２５）を有し（Gross等（1978）Scand.J.Immunol.8:437-441）、それはCryjIアレルゲンのＮＨ2末端の最初の５アミノ酸と同じ配列である。CryjIアレルゲンは又、アレルゲン的に、次の種の木々と交差反応性であることも見出された。Cupressus arizonica,Cupressus macrocarpa,Juniperus virginiana,Juniperus communis,Thuyaorientalis及びChamaecyparis obtusa。
杉花粉症アレルゲンに注意が払われたにもかかわらず、人々に悪影響を及ぼす原因であるアレルゲンの特定又は特性決定は非常に不完全である。現在の脱感作治療は、もし高投与量の花粉抽出物を投与するならば付随するアナフィラキシーの危険を伴う花粉抽出物を用いる治療、又は低投与量の花粉抽出物を投与する場合に長期の脱感作時間を要する治療を含んでいる。
発明の要約
本発明は、Cryptomeria japonica主要花粉アレルゲンCryjIをコードする核酸配列及びその断片を提供する。本発明は又、CryjIをコードする核酸配列又は少なくともその１断片でトランスフォームされた宿主細胞内で産生された単離されたCryjI又は少なくともその１断片及び合成により調製したCryjIの断片を提供する。
本発明は又、CryjIと免疫的に交差反応性のJunvI及びJunsI蛋白質アレルゲン並びにJunvI及びJunsIの断片（JunsI又はJunvIをそれぞれコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で産生されたもの）並びに合成により調製したJunsI及びJunvIの断片をも提供する。本発明は、更に、JunvI及びJunsIをコードする核酸配列並びにそれらの断片を提供する。ここで用いる場合、CryjI、JunsI又はJunvIの完全アミノ酸配列をコードする核酸配列の断片とは、CryjI、JunsI又はJunvI及び／又は成熟CryjI、JunsI又はJunvIの完全アミノ酸配列をコードする核酸配列よりも少ない塩基を有する核酸配列のことをいう。CryjI、JunsI又はJunvI及びこれらの断片は、杉花粉症並びに杉花粉アレルゲンと免疫的に交差反応性である他の種の木々からの花粉により引き起こされる花粉症を診断し、治療し及び予防するために有用である。
この発明の範囲内のペプチドは、好ましくは、CryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを、一層好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。この発明は、更に、少なくとも２つの領域（各領域は、杉花粉蛋白質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含むペプチドを提供する。この発明は又、対応する天然のアレルゲン又はその部分と同じ又は増大された治療特性を有するが減少した副作用を有する改変されたペプチド、並びに増大された溶解度及び安定性等の改善された特性を有する改変されたペプチドをも提供する。この発明のペプチドは、それらを投与した杉花粉に過敏性の個人又は杉花粉と交差反応性のアレルゲンに過敏性の個人において、杉花粉アレルゲン又は杉花粉と交差反応性のアレルゲン（例えば、JunsI又はJunvI）に対するその個人のアレルギー応答を調節することが出来る。個人における杉花粉又は交差反応性アレルゲンに対する感受性の治療又は診断方法及びこの発明の１つ以上のペプチドを含む治療用組成物も又提供する。この発明を、請求の範囲に一層詳細に記載し且つその好適具体例を以下の説明に記載する。
【図面の簡単な説明】
図１ａは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び０．１５ＭＮａＣｌで平衡化したSuperdex75（６０ｃｍにつき２．６）上でアフィニティー精製したCryjIのグラフ表示である。
図１ｂは、図１ａに示した主要ピークからの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）分析を示す。
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｍＡＢ ＣＢＦ２をプローブとした精製した天然のCryjI蛋白質のイソ型のウエスタンブロットを示す。
図３は、１５人のアレルギー患者のプールからの血漿を用いた、精製した天然CryjIの種々の精製画分のアレルギー性血清滴定のグラフ表示である。
図４ａ〜ｂは、CryjIをコードする２つの重複するクローンJC71.6及びpUC19JC91aからの複合核酸配列を示す。CryjIに対する完全なｃＤＮＡ配列は１３１２ヌクレオチドからなり、５’非翻訳配列の６６ヌクレオチド、１１２２ヌクレオチドの開始メチオニンに対するコドンで始まるオープンリーディングフレーム及び３’非翻訳領域を含む。図４ａ〜ｂは又、CryjIの演繹されたアミノ酸アミノ酸配列をも示している。
図５ａは、被覆抗原が杉花粉からの可溶性花粉抽出物（ＳＰＥ）であるＩｇＥ結合反応の結果のグラフ表示である。
図５ｂは、被覆抗原が精製した天然CryjIであるＩｇＥ結合反応の結果のグラフ表示である。
図６は、被覆抗原が杉花粉からの可溶性花粉抽出物（ＳＰＥ）である、１５人の患者からのプールしたヒト血漿（ＰＨＰ）を用いた競争ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図７は、被覆抗原が杉花粉からの可溶性花粉抽出物（ＳＰＥ）であり競争抗原が精製した天然CryjIである、個々の患者からの血漿（患者番号で示す）を用いた競争ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図８ａは、被覆抗原が杉花粉からの可溶性花粉抽出物（ＳＰＥ）である、７人の個々の患者からの血漿（患者番号で示す）を用いた直接結合ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図８ｂは、被覆抗原が還元剤ＤＴＴの存在下で煮沸させることにより変性させた変性した可溶性花粉抽出物である、７人の個々の患者からの血漿（患者番号で示す）を用いた直接結合ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図９は、ウェルを組換えCryjI（rCryjI）で被覆し且つＩｇＥ結合を個々の患者にてアッセイした、直接ＥＬＩＳＡのグラフ表示である。
図１０ａは、ウェルをＣＢＦ２（ＩｇＧ）ｍＡｂで被覆し、ＰＢＳを陰性抗原対照として用い且つ抗原が精製した組換えCryjIであった、１５人の患者からのプールしたヒト血漿を用いる捕獲ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図１０ｂは、ウェルを２０μｇ／ｍｌＣＢＦ２（ＩｇＧ）で被覆し、ＰＢＳを陰性抗原対照として用い且つ抗原が精製した組換えCryjIであった、ウサギ抗Amb a Ｉ及びＩＩを用いる捕獲ＥＬＩＳＡの結果のグラフ表示である。
図１１は、杉花粉からのＳＰＥ、精製した天然CryjI及び組換えCryjIを追加抗原として用いて杉花粉アレルギー患者について行なったヒスタミン放出アッセイのグラフ表示である。
図１２は、抗原が組換えCryjI蛋白質、精製した天然CryjI蛋白質又は選択したCryjIペプチド、組換えAmb a １．１である、９９９番の患者からの血液を用いるＴ細胞増殖アッセイの結果のグラフ表示である。
図１３は、CryjIから誘導された所望の長さの種々のペプチドを示す。
図１４は、精製した天然CryjIでイン・ビトロで誘発し且つ種々のCryjIペプチドに対する応答につき応答のパーセントにより分析した、２５人の患者からのＴ細胞系統の応答（陽性）を、少なくとも２のＳ．Ｉ（各棒の上に示す）、このペプチドに対する陽性応答の平均刺激インデックス（各棒の上に括弧内に示す）及びポジティビティーインデックス（Ｙ軸）で描写するグラフ表示である。
図１５は、あるCryjI蛋白質、精製した天然CryjI及びrCryjIに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフ表示である。
図１６は、JunsIのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:９４）を示す。この配列は２つの重複するｃＤＮＡクローンpUC19JS42e及びpUC19JS45a並びにJunsIをコードする完全長クローンJS53iibからの複合物である。JunsIに対する完全なｃＤＮＡは１１７０ヌクレオチドからなり、５’非翻訳配列の２５ヌクレオチド、１，１０１ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム及び３’非翻訳領域を含む。図１６は又、JunsIの演繹されたアミノ酸配列（SEQ ID NO:９５）をも示す。
図１７は、JunvIのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:９６）を示す。この配列はJunvIをコードする２つの重複するｃＤＮＡクローンpUC19JV46a及びpUC19JV49iiaからの複合物である。JunvIに対する完全なｃＤＮＡ配列は１２７８ヌクレオチドからなり、５’非翻訳配列の３５ヌクレオチド、１，１０１ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム及び３’非翻訳領域を含む。図１７は又、演繹されたJunvIのアミノ酸配列（SEQ ID NO:９７）をも示している。
図１８は、CryjIから導かれた所望の長さの種々のペプチドを示している。
図１９ａ及び１９ｂは、CryjI又はCryjI相同物をコードし得るｍＲＮＡの同定のためのCryjｃＤＮＡをプローブとした花粉誘導されたＲＮＡのノーザンブロットを示す。図１９ａは、CryjI ｃＤＮＡをプローブとして、C.japonica（米国及び日本国産）、J.sabinoides及びJ.virginianaからのＲＮＡを示す。図１９ｂは、同じｃＤＮＡをプローブとして、J.sabinoides及びC.arizonicaからのＲＮＡを示している。分子量標準の位置を図の各部に示す。
発明の詳細な説明
本発明は、CryjI（杉花粉に見出される主要アレルゲン）をコードする核酸配列並びにJunvI及びJunsIをコードする核酸配列を提供する。CryjIをコードする核酸配列は、好ましくは、図４ａ及び４ｂに示す配列（SEQ ID NO：１）を有する。図４ａ及び４ｂに示すCryjIをコードする核酸配列（SEQ ID NO：１）は、塩基６６から１２８までの２１アミノ酸リーダー配列を含む。このリーダー配列は、塩基１２９から１１８７によりコードされる成熟蛋白質から開裂される。CryjIの演繹されたアミノ酸配列も又図４ａ及び４ｂに示してある（SEQ ID NO：２）。この発明の核酸配列は、予想される分子量３８．５ｋＤａ、ｐＩ７．８及び潜在的なＮ結合グリコシレーション部位を有する蛋白質をコードする。これらのグリコシレーション部位の利用は、分子量を増加させ、成熟蛋白質のｐＩに影響する。この発明の核酸配列によりコードされる成熟蛋白質に対する演繹されたアミノ酸配列は、Taniai等（前出）により報告された公知のＮＨ2末端及び内部のアミノ酸配列と同じである。Taniai等（前出）により報告されたCryjIのＮＨ2末端はSEQ ID NO：１８に示した配列を有する。Taniai等（前出）により報告された内部配列は、配列ＧｌｕＡｌａＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＡｓｎＧｌｙＡｓｎＡｌａＴｈｒＰｒｏＧｌｎＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（SEQ ID NO：１９）を有する。この発明の核酸配列には配列多形が認められる。例えば、配列番号１のアミノ酸３８、５１及び７４をコードするコドンにおける１つの独立のヌクレオチドの置換（それぞれ、ＧＧＡ対ＧＡＡ、ＧＴＧ対ＧＣＧ、及びＧＧＧ対ＧＡＧ）は、これらの部位におけるアミノ酸多形（それぞれ、Ｇ対Ｅ、Ｖ対Ａ及びＧ対Ｅ）を生じ得る。更に、単一ヌクレオチド置換が、日本において採集されたCryptomeria japonica花粉から導かれた一つのｃＤＮＡクローンにおいて検出された。この配列番号１のアミノ酸６０に対するコドンにおける置換（ＴＡＴ対ＣＡＴ）は、この部位におけるアミノ酸多形（Ｙ対Ｈ）を生じ得る。更なるサイレントヌクレオチド置換が検出された。更なる配列多形が存在することが予想され、且つCryjIをコードする核酸配列中の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの１％まで）が、自然の対立遺伝子変化のために個々のCryptomeria japonica間で変化し得ることは当業者によって評価されよう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変化及びその結果のアミノ酸多形は、この発明の範囲内にある。更に、１つ以上のCryjIのファミリーメンバーが存在し得る。かかるファミリーメンバーは、機能及びアミノ酸配列においてCryjIと関連するが別個の遺伝子座によってコードされる蛋白質として定義される。
CryjI又は交差反応性アレルゲンの断片をコードする核酸配列の断片も又、この発明の範囲内にある。この発明の範囲内の断片は、CryjI又は交差反応性アレルゲン例えばJunvI若しくはJunsIの部分をコードするものを含み、これらは、哺乳動物好ましくはヒトにおいて免疫応答を誘発する（最小量のＩｇＥの刺激；ＩｇＥの結合；ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の産生の誘出；又は増殖及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギーの誘導等のＴ細胞応答の誘出等）。前述のCryjIの断片を、ここでは、抗原性断片という。この発明の範囲内の断片は、CryjIと交差反応性のアレルゲンを検出するスクリーニングプロトコールにおいて用いるために、他の植物種からの核酸とハイブリダイズし得るものをも含む。ここで用いる場合、CryjIをコードする核酸配列の断片とは、CryjI及び／又は成熟CryjIの完全アミノ酸配列をコードする核酸配列より少ない塩基を有する核酸配列をいう。一般に、CryjIの断片をコードする核酸配列を、成熟蛋白質をコードする塩基から選択するが、ある場合には、この発明の核酸配列のリーダー配列部分からの断片の全部又は一部を選択することが望ましい。この発明の核酸配列は又、CryjI又はその断片のクローニング、発現又は精製に有用なリンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位及びその他の配列をも含む。
CryjIをコードする核酸配列は、Cryptomeria japonica植物から得ることが出来る。しかしながら、出願人は、CryjIをコードするｍＲＮＡは市販のCryptomeria japonica花粉からは得られないことを見出した。この花粉からｍＲＮＡを得ることが出来ないのは市販の花粉の貯蔵又は輸送の問題のためであろう。出願人は、新鮮な花粉及び雄蘂を有する球果がCryjI ｍＲＮＡの良い源であることを見出した。Cryptomeria japonicaは杉の周知の種であり、植物材料は野生、耕作又は装飾用植物から得ることが出来る。CryjIをコードする核酸配列は、ここに開示する方法又は遺伝子の単離及びクローニングのための他の任意の適当な方法を用いて得ることが出来る。この発明の核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。
本発明は、この発明の核酸配列を発現するための発現ベクター及びトランスフォームした宿主細胞を提供する。CryjI、JunvI又はJunsIをコードする核酸配列又はそれらの少なくとも１断片をE.coli等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞中で発現させることが出来る。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素は、Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,ニューヨーク（1989）中に見出すことが出来る。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及び他の発現要素は、当業者には公知である。哺乳動物、酵母又は昆虫細胞内での発現は、組換え物質の部分的な又は完全なグリコシレーション及び鎖間又は鎖内ジスルフィド結合の形成へと導く。酵母内での発現のための適当なベクターは、YepSec1（Baldari等（1987）Embo J.6:229-234）;pMFa（Kurjan及びHerskowitz（1982）Cell30:933-943）;JRY88（Schultz等（1987）Gene54:113-123）及びpYES2（Invitrogen Corporationカリフォルニア、San Diego在）を含む。これらのベクターは自由に入手することが出来る。バキュロウイルス及び哺乳動物発現系も又入手可能である。例えば、バキュロウイルス系は、昆虫細胞中での発現用に市販されており（カリファオルニア、San Diego在、PharMingen）、他方、pMSGベクターは、哺乳動物細胞内での発現用に市販されている（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）。
E.coli内での発現のためには、適当な発現ベクターは、他のものの内で、pTRC（Amann等（1988）Gene69:301-315）;pGEX（オーストラリア、Melbourne在、Amrad Corp．）;pMAL（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）;pRIT5（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）;pET-11d（ウィスコンシン、Madison在、Novagen）Jameel等、（1990）J.Virol.64:3963-3966;及びpSEM（Knapp等（1990）BioTechniques8:280-281）を含む。例えば、pTRC及びpET-11dの利用は、未融合蛋白質の発現へと導く。pMAL、pRIT5、pSEM及びpGEXの利用は、マルトースＥ結合蛋白質（pMAL）、蛋白質Ａ（pRIT5）、切り詰めたβ−ガラクトシダーゼ（PSEM）又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（pGEX）に融合したアレルゲンの発現へと導くであろう。CryjI断片又はその断片が融合蛋白質として発現される場合には、キャリアー蛋白質とCryjI又はその断片との間の融合点に酵素開裂部位を導入することは特に有利である。次いで、CryjI又はその断片を融合蛋白質からその酵素部位における酵素開裂並びに蛋白質及びペプチド精製のための従来技術を用いる生化学的精製によって回収することが出来る。適当な酵素開裂部位は、血液凝固因子Ｘａ又はトロンビンに対するものを含み、それに対する適当な酵素は、例えば、ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Company及びマサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabsから入手することが出来る。種々のベクターは、構成的発現又は例えばＩＰＴＧ誘導（PRTCAmann等、（1988）前出;pET-11d,ウィスコンシン、Madison在、Novagen）若しくは温度誘導（pRIT5、ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）を用いる誘導可能な発現を可能にする種々のプロモーター領域を有する。組換えにより発現される蛋白質を分解する能力を変えた種々のE.coli宿主中で組換えCryjIを発現させることも適当であろう（例えば、米国特許第４，７５８，５１２号）。或は、E.coliにより優先的に利用されるコドンを用いるように核酸配列を変えることは有利であり得る（ここに、かかる核酸の変化は、発現されるアミノ酸配列に影響を与えないものである）。
宿主細胞は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は電気穿孔法等の従来技術を用いて、この発明の核酸配列を発現するようにトランスフォームすることが出来る。宿主細胞をトランスフォームするための適当な方法は、Sambrook等、前出及び他の実験室用テキスト中に見出され得る。
この発明の核酸配列は又、標準的技術を用いて合成することも出来る。
本発明は又、単離した杉花粉アレルゲンCryjI又は少なくともその１断片を製造する方法をも提供し、それは、杉花粉アレルゲンCryjI又は少なくともその１断片をコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞を適当な培地中で培養して該杉花粉アレルゲンCryjI若しくはその少なくとも１断片を含む細胞及び培地の混合物を生成し；そしてその混合物を精製して実質的に純粋な杉花粉アレルゲンCryjI又はその少なくとも１断片を生成する工程を含んでいる。CryjI又はその少なくとも１断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフォームした宿主細胞をその宿主細胞に適した培地中で培養する。CryjI蛋白質及びペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動及びCryjI若しくはその断片に特異的な抗体を用いる免疫精製を含むペプチド又は蛋白質を精製するための公知技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞又はその両者から精製することが出来る。単離した及び精製したという用語は、ここでは、交換可能であって、組換えＤＮＡ技術により生成したときに、実質的に細胞性物質若しくは培養培地を含まず、又は、化学合成する場合には、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないペプチド、蛋白質、蛋白質断片及び核酸配列のことをいう。
この発明の他の面は、杉花粉アレルゲンCryjI又はJunvI若しくはJunsI等の交差反応性アレルゲン又はこれらの少なくとも１断片（杉花粉アレルゲンCryjI又はかかる交差反応性アレルゲンをコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で合成されたもの、或は化学合成したもの）、及び単離した杉花粉アレルゲンCryjI蛋白質又はJunvI若しくはJunsI等の交差反応性アレルゲン又はこれらの少なくとも１つの抗原性断片（この発明の核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で生成したもの、或は化学合成したもの）を含む調製物を提供する。この発明の好適具体例において、CryjI蛋白質は、少なくとも成熟CryjI蛋白質をコードする核酸配列でトランスフォームした宿主細胞内で産生される。
ここで定義する抗原性断片は、免疫応答を誘発する任意の蛋白質断片又はペプチドをいう。ここで定義するユニークな抗原性断片とは、CryjIから誘導される任意の抗原性断片のことをいうが、図４ａ〜４ｂに示すアミノ酸１〜２０又は３２５〜３４０からなる断片は除く。杉花粉からのアレルゲン又はJunvI若しくはJunsI等の交差反応性アレルゲンの抗原性断片は、例えば、かかるペプチドをコードするこの発明の核酸配列の対応する断片から組換えにより生成された又は公知技術を用いて化学合成したペプチドをスクリーニングすることによって得ることが出来る。このアレルゲンを、ペプチドの重複を有しない所望の長さの断片に自由に分割することが出来るが、好ましくは、所望の長さの重複した断片に分割することが出来る。これらの断片を試験してそれらの抗原性（例えば、断片の免疫応答を誘発する能力）を測定する。もしCryjIの断片を治療目的に用いるならば、刺激等のＴ細胞応答（即ち、増殖又はリンホカイン分泌）を誘出することが出来及び／又はＴ細胞アネルギーを誘導することが出来るCryjIアレルゲンの断片は特に望ましく、又、最小ＩｇＥ刺激活性を有する杉花粉の断片も又望ましい。最小ＩｇＥ刺激活性とは、天然のCryjI蛋白質により刺激されたＩｇＥ産生の量より少ないＩｇＥ刺激活性のことをいう。更に、治療目的のためには、Ｔ細胞応答を誘出することが出来、杉花粉に特異的なＩｇＥと結合しないか又は精製した天然の杉花粉アレルゲンがかかるＩｇＥと結合するより実質的に低い程度でかかるＩｇＥと結合する単離した杉花粉アレルゲン例えばCryjI若しくはその断片を用いることは好ましい。もし単離した杉花粉アレルゲン又はその断片がＩｇＥと結合するならば、かかる結合がマスト細胞又は好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないことが望ましい。更に、もしJunvI若しくはJunsIを治療目的に用いるならば、Ｔ細胞応答を誘出することが出来、Juniperus種からの花粉に特異的なＩｇＥと結合しないか又は精製した天然のJuniperus花粉アレルゲンがかかるＩｇＥと結合するより実質的に低い程度でかかるＩｇＥと結合するJuniperusの花粉アレルゲン例えばJunvI若しくはJunsI又はそれらの断片を用いるのが望ましい。もし単離したJunvI若しくはJunsI又はそれらの断片がＩｇＥと結合するならば、かかる結合がマスト細胞又は好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないことが好ましい。
杉花粉から単離した蛋白質アレルゲン又はその好適な抗原性断片は、杉花粉感受性の個人又はJuniperus virginiana若しくはJuniperus sabinoides（前述）等の杉花粉アレルゲンと交差反応性のアレルゲンに対してアレルギーの個人に投与したときに、その個人の杉花粉若しくはかかる交差反応性アレルゲンに対するアレルギー応答を調節することが出来、好ましくは、その個人のそのアレルゲンに対するＢ細胞応答、Ｔ細胞応答又はＢ細胞及びＴ細胞の両方の応答を調節することが出来る。ここで用いる場合、杉花粉アレルゲン又は交差反応性アレルゲンに感受性の個人のアレルギー応答の調節は、標準臨床手順により測定したときに、アレルゲンに対する非応答性又は症状の減少として定義することが出来る（例えば、Varney等、British Medical Journal,302:265-269（1990）を参照されたい）（杉花粉誘発性の喘息症状の減少を含む）。ここでいう場合、症状の減少は、個人がこの発明のペプチド若しくは蛋白質を用いる治療管理を完了した後でのアレルゲンに対する任意のアレルギー応答の減少を含む。この減少は、主観的なものであって良い（即ち、患者がアレルゲンの存在下で一層快適に感じればよい）。症状の減少は又、公知の標準皮膚試験を用いて臨床的に測定することも出来る。
単離したCryjI蛋白質又はその断片を、好ましくは、Tamura等（1986）Microbiol.Immunol.30:883-896又は米国特許第４，９３９，２３９号に開示されたマウスモデル等の杉花粉の哺乳動物モデルにて、又はChiba等（1990）Int.Arch.Allergy Immunol.93:83-88に開示された霊長類モデルにて試験する。蛋白質又はその断片に対するＩｇＥ結合についての初期スクリーニングは、実験動物又はヒトのボランティアに対するスクラッチ試験又は皮内皮膚試験によって、又はＲＡＳＴ（放射アレルゲン吸着試験）、ＲＡＳＴ阻害、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はヒスタミン放出（実施例７及び８参照）にて行なうことが出来る。
Ｔ細胞刺激活性を有し、従って、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む本発明の抗原性断片は、特に望ましい。Ｔ細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状の原因と成る蛋白質アレルゲンに対する免疫応答の開始及び持続に関与すると考えられている。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適当なＨＬＡ分子に結合して関連Ｔ細胞サブポピュレーションを刺激することによりヘルパーＴ細胞のレベルで初期事象の引き金を引くと考えられる。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的炎症反応、追加の免疫細胞のその部位への補充及び抗体産生へ導くＢ細胞カスケードの活性化へと導く。これらの抗体の１つのイソ型であるＩｇＥは、アレルギー症状の発達に基本的に重要であり、その産生は事象のカスケードの初期に、ヘルパーＴ細胞のレベルで、分泌されたリンホカインの性質により影響を受ける。Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプターによる認識の基本要素又は最小単位であり、このエピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸を含んでいる。Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を真似るアミノ酸配列及び蛋白質アレルゲンに対するアレルギー応答を調節するアミノ酸配列は、この発明の範囲内にある。
杉花粉患者を、本発明の単離した蛋白質アレルゲン又は本発明の抗原性断片（少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、蛋白質アレルゲンから誘導される）にさらすと、適当なＴ細胞サブポピュレーションを寛容化し又は免疫性減少させて、それらを蛋白質アレルゲンに対して非応答性にし且つこのようにさらされても免疫応答の刺激に関与しないようにすることが出来る。更に、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むこの発明の蛋白質アレルゲン又は本発明の抗原性断片の投与は、天然の蛋白質アレルゲン又はその部分にさらすことと比較してリンホカイン分泌プロフィルを調節することが出来る（例えば、ＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加を生じる）。更に、かかる蛋白質アレルゲン又はかかる蛋白質アレルゲンの抗原性断片にさらすことは、通常そのアレルゲンに対する応答に関与するＴ細胞サブポピュレーションに影響を与えて、それらのＴ細胞が通常そのアレルゲンにさらされる部位（例えば、鼻粘膜、皮膚及び肺）から離れて治療用の断片又は蛋白質アレルゲンの投与部位に向かうようにすることが出来る。このＴ細胞サブポピュレーションの再分配は、アレルゲンに通常さらされる部位において通常の免疫応答を刺激する患者の免疫系の能力を改善し又は減少させ、アレルギー症状の減少を生じる。
単離したCryjI、JunvI又はJunsI蛋白質及びそれらから導かれる断片又は部分（ペプチド）を、杉花粉アレルゲン又は交差反応性蛋白質アレルゲンに対するアレルギー反応を診断し、治療し及び予防する方法において用いることが出来る。従って、本発明は、単離した杉花粉アレルゲンCryjI、JunvI若しくはJunsI又はそれらの少なくとも１断片（CryjI、JunvI若しくはJunsI又はそれらの少なくとも１断片を発現するようにトランスフォームした宿主細胞にて生成したもの）及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物を提供する。この発明の治療用組成物は又、合成により調製したCryjI、JunvI若しくはJunsI又はそれらの少なくとも１断片及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含んでもよい。脱感作されるべき個人への本発明の治療用組成物の投与は、公知技術を用いて行なうことが出来る。CryjI、JunvI若しくはJunsI蛋白質又はそれらの少なくとも１断片を例えば適当な希釈剤、キャリアー及び／又はアジュバントと組合せて個人に投与することが出来る。製薬上許容し得る希釈剤は塩溶液及び緩衝剤水溶液を含む。製薬上許容し得るキャリアーは、ポリエチレングリコール（Wie等（1981）Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.64:84-99）及びリポソーム（Strejan等（1984）J.Neuroimmunol 7:27）を含む。Ｔ細胞アネルギーを誘導する目的には、この治療用組成物を、好ましくは、非免疫原形態（例えば、アジュバントを含まない）で投与する。この発明の治療用組成物を、杉花粉感受性の個人又は杉花粉アレルゲン（即ち、Juniperus virginiana又はJuniperus sabinoides等）と免疫的に交差反応性のアレルゲンに感受性の個人に投与する。
脱感作されるべき個人への本発明の治療用組成物の投与は、その個人のアレルゲンに対する感受性を減じる（即ち、アレルギー応答を減じる）のに十分な投与量及び期間で、公知の手順を用いて行なうことが出来る。この治療用組成物の有効量は、その患者の杉花粉に対する感受性の程度、年齢、性別及び体重、並びにこの蛋白質又はその断片がその個人における抗原応答を誘出する能力等の因子によって変化する。
この活性化合物（即ち、蛋白質又はその断片）を、注射（皮下、静脈注射等）、経口投与、吸入、経皮的投与等の便利な方法で投与することが出来る。投与の経路によって、この活性化合物を、この化合物を不活性化し得る酵素、酸及び他の自然条件から保護するための物質で被覆することが出来る。
例えば、１投与量単位当り、好ましくは約１μｇ〜３ｍｇの、一層好ましくは約２０〜５００μｇの活性化合物（即ち、蛋白質又はその断片）を注射により投与することが出来る。投与量管理は、最適な治療応答を与えるように調節することが出来る。例えば、幾つかの分割した投与量を日々投与することが出来、或は投与量を治療状況の緊急性の指示に応じて減らすことが出来る。
蛋白質又はペプチドを非経口投与以外の投与法により投与するためには、この蛋白質をその不活性化を阻止する物質で被覆する（又はその物質と同時投与する）ことが必要であろう。例えば、蛋白質又はその断片をアジュバント中にて投与し、又は酵素阻害剤と共に又はリポソーム内にて同時投与することが出来る。酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）及びトラシロールを含む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソーム（Strejan等、（1984）J.Neuroimmunol.7:27）を含む。
この活性化合物は又、非経口投与或は腹膜内投与することも出来る。分散を、グリセロール、液体ポリエチリングリコール及びこれらの混合物中及び油中で調製することも出来る。通常の貯蔵及び使用の条件下において、これらの製剤は、微生物の成長を阻止する防腐剤を含むことが出来る。
注射用途に適した製薬組成物は、滅菌した水溶液（水溶性の場合）若しくは分散又は滅菌した分散の注射用溶液を即座に調製するための滅菌した粉末を含む。すべての場合に、この組成物は、無菌的でなければならず且つ容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及びカビ等の微生物の夾雑に対して保護されなければならない。キャリアーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物並びに植物油を含む溶剤又は分散媒質であってよい。適当な流動性を、例えばリシチン等の被覆の利用、分散の場合の必要な粒子寸法の維持及び界面活性剤の利用によって維持することが出来る。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤例えばパラベンス、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、サーメロサル等によって達成することが出来る。多くの場合に、等張剤例えば糖、ポリアルコール（マンニトール及びソルビトール等）又は塩化ナトリウムをこの組成物中に含むことは好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンをこの組成物に含ませることで引き起こし得る。
滅菌した注射用溶液は、活性化合物（即ち、蛋白質又はペプチド）を必要な量で適当な溶媒に必要ならば上記の成分の１つ又は組合せたものと共に取り込ませてから滅菌濾過することによって調製することが出来る。一般に、分散を、活性化合物、基本分散媒質及び上記のものから選ぶ必要な他の成分を含む滅菌したビヒクルに取り込ませることにより調製することが出来る。滅菌した注射用溶液の調製用の滅菌した粉末の場合には、調製の好適な方法は、前もって滅菌濾過した溶液からの任意の所望の追加の成分を加えた活性成分（即ち、蛋白質又はペプチド）の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
上記のように蛋白質又はそのペプチドが適当に保護されれば、その蛋白質は、例えば不活性な希釈剤又は同化可能な食べられるキャリアーと共に経口投与することが出来る。この蛋白質及び他の成分は、硬い又は軟らかい殻のゼラチンカプセルに封入し、錠剤に圧縮し、又は個人の食餌に直接取り込ませることも出来る。経口の治療用投与のために、この活性化合物に賦形剤を取り込ませて摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用することが出来る。かかる組成物及び製剤は、少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。勿論、この組成物及び製剤のパーセンテージは、変化することが出来、約５〜８０重量％単位が好都合である。かかる治療上有用な組成物における活性化合物の量は、適当な薬量が得られるようなものである。本発明による好適な組成物又は製剤は、経口投与量単位が約１０μｇ〜２００ｍｇの活性化合物を含むように調製する。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は、次のものをも含んでよい。ガムグラガカンス（gragacanth）、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸等の分散剤、マグネシウムステアレート等の潤滑剤、ショ糖、ラクトース又はサッカリン等の甘味剤、或は、ペパーミント、冬緑油又はサクランボ薬味等の薬味剤。投与量単位形態がカプセルである場合には、それは、上記の型の物質に加えて、液体キャリアーを含むことが出来る。種々の他の物質が、被覆として或は投与量単位の物理的形態を変えるように存在し得る。例えば、錠剤、ピル又はカプセルは、セラック、糖又は両者で被覆することが出来る。シロップ又はエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのショ糖、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベンス、色素及びサクランボ若しくはオレンジ風味等の薬味を含んでよい。勿論、任意の投薬量単位形態の調製に用いる任意の物質は、製薬上純粋であり、用いる量において実質的に非毒性であるべきである。更に、この活性化合物を、持続的放出用製剤及び配合物に取り込ませることが出来る。
ここで用いる場合、「製薬上許容し得るキャリアー」は、任意の及びすべての溶媒、分散媒質、被覆、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。製薬上活性な物質のためのかかる媒質及び薬剤の利用は、当業者には周知である。任意の従来の媒質又は薬剤が活性化合物と相容れないことがないかぎり、治療用組成物におけるその利用は企図される。補足的活性化合物をこの組成物に取り込ませることも出来る。
非経口組成物を投与量単位形態で配合することは、投与の容易さ及び均一な投与量に対して特に有利である。投与量単位は、ここで用いる場合、治療される哺乳動物患者に対する単位投与量に適した物理的に別個の単位をいう（各単位は、所望の治療効果を生じるように計算して予め決めた量の活性化合物を必要な製薬上のキャリアーと共に含む）。この発明の新しい投与量単位形態についての規格は、（ａ）活性化合物の独自の性質及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）かかる活性化合物を個人の感受性の治療用に混合する技術における本質的限界により指図され且つこれらに直接依存する。
CryjI ｃＤＮＡ（又は該ｃＤＮＡが転写されたｍＲＮＡ）又はその一部を用いて、任意の種類又は型の植物において類似の配列を同定することが出来、従って、CryjI ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はそれらの部分にハイブリダイズするだけ十分な相同性を有する配列（例えば、Juniperus virginiana,Juniperus sabinoides等のアレルゲンからのＤＮＡ）を低緊縮条件下で同定し又は「引き出す」ことが出来る。それらの十分な相同性（一般に４０％を超える）を有する配列を、ここに記載した方法を用いて、更なる評価のために選択することが出来る。或は、高緊縮条件を用いることが出来る。この方法では、本発明のＤＮＡを用いて、他の型の植物、好ましくは関連する科、属又は種（例えば、Juniperus又はCupressus）において、杉花粉アレルゲンCryjIのアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を同定することが出来、それ故、他の種におけるアレルゲンを同定することが出来る。従って、本発明は、CryjIを含むだけでなく、本発明のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる他のアレルゲンをも含む。この発明は、更に、単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片を含み、それらは、抗体交差反応（単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片はこの発明の蛋白質及びペプチドに特異的な抗体に結合することが出来る）により、又はＴ細胞交差反応（単離したアレルゲン性蛋白質又はそれらの断片はこの発明の蛋白質及びペプチドに特異的なＴ細胞を刺激することが出来る）等により、免疫的にCryjI又はその断片と関係している。
本発明のｃＤＮＡによりコードされる蛋白質又はペプチドを、例えば、「精製した」アレルゲンとして用いることが出来る。かかる精製したアレルゲンは、杉花粉症の診断及び治療のための鍵となる試薬であるアレルゲン抽出物の標準化において有用である。更に、CryjIの核酸配列に基づくペプチドを用いることにより、抗ペプチド抗体又はモノクローナル抗体を、標準的方法を用いて作成することが出来る。例えば、マウス又はウサギ等の動物を、単離したCryjI蛋白質の免疫原（例えば、CryjI蛋白質又は抗体応答を誘出することの出来る抗原性断片）で免疫化することが出来る。蛋白質又はペプチドサブユニットに免疫原性を与えるための技術は、キャリアーへの結合又は他の当業者に周知の技術を含む。CryjI蛋白質又はそのペプチドをアジュバントの存在下で投与することが出来る。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出により監視することが出来、抗体のレベルを評価するための抗原としてこの免疫原を用いて標準ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを利用することが出来る。
免疫化の後に、抗CryjI抗血清を得ることが出来、所望であれば、その血清からポリクローナル抗CryjI抗体を得ることが出来る。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫化した動物から採取し、ミエローマ細胞等の不滅化細胞を用いる標準的体細胞融合手順により融合させてハイブリドーマ細胞を生成することが出来る。ハイブリドーマ細胞を、CryjI蛋白質又はそのペプチドと反応性の抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることが出来る。これらの血清又はモノクローナル抗体を用いてアレルゲン抽出物を標準化することが出来る。
本発明のペプチド及び蛋白質の利用により、首尾一貫した、十分に規定された組成及び生物学的活性を有する製剤を作成して治療目的のために投与することが出来る（例えば、杉感受性の個人のかかる木々の花粉に対するアレルギー応答を調節する等）。かかるペプチド又は蛋白質の投与は、例えば、CryjIアレルゲンに対するＢ細胞応答、CryjIアレルゲンに対するＴ細胞応答又は両方の応答を調節することが出来る。単離したペプチドは又、Cryptomeria japonicaアレルギーの免疫療法の機構を研究し及び免疫療法において有用な改変した誘導体又はアナログをデザインするために用いることも出来る。
他の人々の仕事は、一般に、アレルゲンの高投与量が最良の結果（即ち、最大の症状軽快）を生じるということを示した。しかしながら、多くの人々は、アレルゲンに対するアレルギー反応のために、アレルゲンの大量投与に耐えられない。対応する天然のアレルゲンと同じかそれより増大された治療特性を有するが減少した副作用（特に、アナフィラキシー反応）を有する改変したペプチド又は改変したアレルゲンが生成されるような方法で、天然のアレルゲンの改変をデザインすることが出来る。これらは、例えば、本発明の蛋白質又はペプチド（例えば、CryjIのアミノ酸配列の全部又は一部を有するもの）、又は改変した蛋白質若しくはペプチド、又は蛋白質若しくはペプチドのアナログであってよい。
溶解度を増し、治療若しくは予防効果又は安定性（例えば、生体外での貯蔵寿命及びイン・ビボでの蛋白質分解に対する抵抗性）を増大させる等の目的で、この発明のペプチドの構造を改変することも可能である。免疫原性を改変し及び／又はアレルゲン性を減じるために、アミノ酸置換、欠失又は付加等によってアミノ酸配列が変化した、或は、同じ目的のために成分が加えられた、改変したペプチドを生成することが出来る。
例えば、ペプチドを、強い増殖応答の誘導能力を伴わないでＴ細胞アネルギーを誘導し及びＭＨＣ蛋白質に結合する能力、並びに免疫原形態での投与時の増殖応答を維持するように改変することが出来る。この場合には、Ｔ細胞レセプターに対する重大な結合残基を、公知の技術（例えば、各残基の置換及びＴ細胞反応性の存否の測定）を用いて決定することが出来る。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であることが示されたそれらの残基を、必須アミノ酸を他のもの好ましくはその存在がＴ細胞反応性を増大し、除去はしないが減少させ、或は該反応性に影響しない類似のアミノ酸残基で置換（保存的置換）することによって改変することが出来る。更に、Ｔ細胞レセプター相互作用に必須でないアミノ酸残基を、その取り込みがＴ細胞反応性を増大し、減少させ、又は該反応性に影響しないが関連ＭＨＣへの結合を除去しない他のアミノ酸により置換することによって改変することが出来る。
更に、この発明のペプチドを、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須であるべきことが示されたアミノ酸を他のもの好ましくはその存在がＴ細胞活性を増大し、除去はしないが減少させ又は該活性に影響しないことが示された類似のアミノ酸残基と置換（保存的置換）することによって改変することが出来る。更に、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須でないがＭＨＣ蛋白質複合体にやはり結合するアミノ酸残基を、その取り込みがＴ細胞反応性を増大し、影響せず又は除去はしないが減少させる他のアミノ酸で置換することによって改変することが出来る。非必須アミノ酸についての好適なアミノ酸置換は、アラニン、グルタミン酸又はメチルアミノ酸での置換を含む（但し、それらに限定はされない）。
安定性及び／又は反応性を増大するために、この発明の蛋白質又はペプチドを改変して、その蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列に、自然の対立遺伝子変化から生じる１つ以上の多形を取り込むことも出来る。更に、Ｄアミノ酸、非天然アミノ酸又は非アミノ酸アナログを代用とし又は加えて、この発明の範囲内の改変した蛋白質又はペプチドを生成することが出来る。更に、本発明の蛋白質又はペプチドを、A.Sehonと共同研究者（Wie等、前出）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて改変してＰＥＧと結合した蛋白質又はペプチドを生成することが出来る。更に、ＰＥＧを、この発明の蛋白質又はペプチドの化学合成中に加えることが出来る。蛋白質若しくはペプチド又はその部分の改変は又、還元／アルキル化（Tarr、Methods of Protein Microcharacter-ization,J.E.Silver編、Humana Press,Clifton,NJ,155-194頁（1986）中）；アシル化（Tarr、前出）；適当なキャリアーへの化学カップリング（Mishell及びShiigi編、Selected Methods in Cellular Immunology,WH Freeman,San Francisco,CA（1980）；米国特許第４，９３９，２３９号）；又は温和なホルマリン処理（Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology,41:199-215（1971））をも含むことが出来る。
この発明の蛋白質及びペプチドの精製を容易にし且つ溶解度を潜在的に増大させるために、そのペプチドの主鎖にレポーター基を加えることが出来る。例えば、ポリヒスチジンをペプチドに加えてそのペプチドを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーで精製することが出来る（Hochuli,E.等、Bio/Technology,6:1321-1325（1988））。更に、特異的なエンドプロテアーゼ開裂部位を、所望であれば、レポーター基とペプチドのアミノ酸配列との間に導入して無関係の配列を含まないペプチドの単離を促進することが出来る。蛋白質抗原に対して個人を上首尾に脱感作するためには、蛋白質若しくはペプチドの溶解度を、そのペプチドに官能基を付加することにより又は疎水性Ｔ細胞エピトープ若しくはこれらのペプチド中の疎水性エピトープを含む領域若しくはこの蛋白質若しくはペプチドの疎水性領域を含まないことによって、増大させることが必要であろう。
ペプチド内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に補助するために、それぞれ少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む領域間で、標準的プロテアーゼ感受性部位を組換えにより又は合成によって工作することが出来る。例えば、ＫＫ若しくはＲＲ等の荷電したアミノ酸の対を、ペプチドの組換え構築中にペプチド内の領域間に導入することが出来る。その結果のペプチドを、カテプシン及び／又は他のトリプシン様酵素開裂に対して感受性にして１つ以上のＴ細胞エピトープを含むペプチドの部分を生成することが出来る。更に、かかる荷電アミノ酸残基は、ペプチドの溶解度の増大を生じさせることが出来る。
この発明のペプチド若しくは蛋白質（例えば、CryjI又はその断片）をコードするＤＮＡの位置指定突然変異導入法を利用して、公知の方法によってこのペプチド若しくは蛋白質の構造を改変することが出来る。かかる方法は、その他の方法の内で、縮退したオリゴヌクレオチド（Ho等、Gene,77:51-59（1989））を用いるか又は全合成の突然変異遺伝子（Hostomsky,Z.等、Biochem.Biophys,Res.Comm.,161:1056-1063（1989））を用いるＰＣＲを含む。細菌での発現を促進するために、前述の方法を他の手順と共に用いて、この発明の蛋白質若しくはペプチドをコードするＤＮＡ構築物中の真核生物用コドンを、E.coli、酵母、哺乳動物細胞又は他の真核生物細胞中で優先的に利用されているものに変えることが出来る。
現在利用可能な構造的情報を用いて、杉花粉感受性の個人に十分量で投与したときにその個人の杉花粉に対するアレルギー応答を調節するCryjIペプチドをデザインすることが出来る。これは、例えば、CryjIの構造を調べ、杉花粉感受性の個人におけるＢ細胞及び／又はＴ細胞応答に影響を与える能力について試験すべきペプチドを（発現系により、合成により若しくはその他の方法により）生成し及びそれらの細胞により認識されるエピトープを含む適当なペプチドを選択することによって行なうことが出来る。エピトープというときは、そのエピトープはレセプター特に免疫グロブリン、組織適合性抗原及びＴ細胞レセプター（このエピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸を含む）による認識の基本要素であり又は単位である。これらのエピトープのアミノ酸配列を真似るアミノ酸配列及びCryjIに対するアレルギー応答を下方制御することの出来る配列を利用することも出来る。
杉花粉アレルゲンが杉花粉感受性の個人にアレルギー反応を誘発する能力をブロックし若しくは阻止することの出来る薬剤若しくは薬物をデザインすることも現在可能である。かかる薬剤は、例えば、それらが関連する抗CryjI ＩｇＥに結合し、それ故、ＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後のマスト細胞脱顆粒を阻止するような方法でデザインすることが出来る。或は、かかる薬剤は、免疫系の細胞性成分に結合することが出来、Cryptomeria japonica花粉アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制若しくは脱感作を生じる。これの非制限的な例は、杉花粉に対するアレルギー応答を抑制する本発明のｃＤＮＡ／蛋白質構造に基づく、適当なＢ及びＴ細胞エピトープペプチド又はそれらの改変物の利用である。これは、杉花粉感受性の個人からの血液成分を用いるイン・ビトロ研究においてＢ及びＴ細胞機能に影響を与えるＢ及びＴ細胞エピトープペプチドの構造を限定することにより行なうことが出来る。
本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体を、杉花粉症を検出し及び診断するために利用することも出来る。例えば、これは、杉花粉に対する感受性を評価すべき個人から得た血液若しくは血液生成物を、単離した抗原性ペプチド若しくはCryjIのペプチド、又は単離したCryjI蛋白質と、血液成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）とペプチド若しくは蛋白質との結合に適した条件下で合わせて、かかる結合が起きる程度を測定することによって行なうことが出来る。
本発明は又、CryjIのすべての若しくは少なくとも１つの断片をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を含む発現ベクターを含む宿主細胞をCryjI若しくは少なくともその１断片の発現に適した条件下で培養することを含むCryjI若しくはその断片を生成する方法をも提供する。次いで、発現された生成物を公知技術を用いて回収する。或は、CryjI若しくはその断片を、公知の機械的若しくは化学的技術を用いて合成することが出来る。
この発明の任意の具体例において用いたＤＮＡは、ここに記載したようにして得られたｃＤＮＡであるか、或は、ここに表示した配列の全部若しくは一部を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド配列又はそれらの機能的等価物であってよい。かかるオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知技術を用いて、化学的若しくは酵素的に生成することが出来る。オリゴヌクレオチド配列の機能的等価物は、１）配列番号１の配列（又は対応する配列部分）又はその断片がハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列、又は２）配列番号１に相補的な配列（又は対応する配列部分）及び／又は３）配列番号１の配列（又は対応する配列部分）によりコードされる生成物と同じ機能的特性を有する生成物（例えば、ポリペプチド又はペプチド）をコードする配列であるものである。機能的等価物が一方の基準を満たさなければならないか両方の基準を満たさなければならないかは、その利用に依る（例えば、もしそれがオリゴプローブとしてのみ用いられるならば、それは第１若しくは第２の基準を満たしさえすれば良く、もしそれがCryjIアレルゲンを生成するために用いられるならば、第３の基準さえ満たせば良い）。
本発明は又、杉花粉蛋白質から導かれた単離したペプチドをも提供する。ここで用いる場合、ペプチド若しくは蛋白質の断片とは、それが導かれた完全なアミノ酸配列より少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列のことをいう。この発明のペプチドは、アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むCryjIから導かれたペプチドを含む。
少なくとも２つの領域（各領域は、杉花粉の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含むペプチドも又この発明の範囲内にある。単離したペプチド又は単離したペプチドの領域（それぞれ、杉花粉アレルゲンの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む）は、増大された治療効果の故に、特に望ましい。本発明のペプチドと（例えば、抗体により又はＴ細胞交差反応性により）免疫的に関連するペプチドも又この発明の範囲内にある。
この発明の単離したペプチドは、かかるペプチドをコードする配列を有する核酸でトランスフォームした宿主細胞における組換えＤＮＡ技術により、上述のように生成することが出来る。この発明の単離したペプチドを化学合成によって生成することも出来る。単離したJunvI蛋白質若しくはペプチドに関して、かかる蛋白質若しくはペプチドは、公知の方法でJuniperus virginiana花粉から天然のJunvI蛋白質を生化学的に精製することによって生成することが出来る。ペプチドを組換え技術により生成するときには、そのペプチドをコードする配列を有する核酸又はその核酸配列の機能的等価物でトランスフォームした宿主細胞をその細胞に適した培地で培養し、そして、ペプチドを、細胞培養培地、宿主細胞又はその両者から、ペプチド及び蛋白質を生成するための当業者に公知の技術を用いて精製することが出来、該公知技術は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動又は、このペプチド、そのペプチドが導かれた蛋白質アレルゲン杉花粉又はその一部に特異的な抗体を用いる免疫精製を含む。この発明の単離したペプチドは、組換えＤＮＡ技術により生成したときに、実質的に細胞性物質又は培養培地を含まず、或は、化学合成したときに、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。
本発明の単離したペプチドを得るために、CryjIを実施例６で論じるように、重複しない所望の長さのペプチド又は重複する所望の長さのペプチドに分割する（組換えにより又は合成によって生成することが出来る）。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドは、Ｔ細胞増殖又はリンホカイン分泌等のＴ細胞応答を誘出することが出来及び／又はＴ細胞アネルギー（即ち、寛容）を誘導することが出来る。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを測定するために、単離したペプチドを、例えば、Ｔ細胞生物学技術によって試験してそれらのペプチドがＴ細胞応答を誘出し又はＴ細胞アネルギーを誘導するか否かを測定する。Ｔ細胞応答を誘出し又はＴ細胞アネルギーを誘導することが見出されたそれらのペプチドをＴ細胞刺激活性を有すると規定する。
実施例６で論じるように、ヒトＴ細胞刺激活性は、杉花粉アレルゲンに感受性の個人（即ち、杉花粉アレルゲンに対するＩｇＥ媒介の免疫応答を有する個人）から得られたＴ細胞を培養し、そして例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込みにより測定したときにそのペプチドに応答してＴ細胞の増殖が起きるか否かを測定することによって試験することが出来る。ペプチドに対するＴ細胞の応答についての刺激インデックスは、ペプチドに対する応答における最大ＣＰＭを対照のＣＰＭで除したものとして計算することが出来る。バックグラウンドレベルの２倍以上の刺激インデックス（Ｓ．Ｉ．）を「陽性」と見なす。陽性結果を用いて、試験した患者群についての各ペプチドに対する平均刺激インデックスを計算する。この発明の好適なペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み且つ２．０以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する。２．０以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するペプチドは、治療剤として有用であると考えられる。好適ペプチドは、少なくとも２．５の、もっと好ましくは少なくとも３．５の、一層好ましくは少なくとも４．０の、更に好ましくは少なくとも５の、更に一層好ましくは少なくとも７の、最も好ましくは少なくとも約９の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する。例えば、図１４に示した少なくとも５の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するこの発明のペプチドは、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−７（SEQ ID NO:３２）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）を含む。例えば、図１４に示した少なくとも７の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するこの発明のペプチドは、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）及びＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）を含む。
更に、好適ペプチドは、少なくとも約１００の、一層好ましくは少なくとも約２５０の、最も好ましくは少なくとも約３５０のポジティビティーインデックス（Ｐ．Ｉ．）を有する。あるペプチドのポジティビティーインデックスは、平均Ｔ細胞刺激インデックスに、杉花粉に感受性の個人の集団（例えば、好ましくは少なくとも１５人、一層好ましくは少なくとも３０人以上）内における少なくとも２．０のかかるペプチドに対するＴ細胞刺激インデックスを有する個人のパーセントを乗じることによって決定される。従って、ポジティビティーインデックスは、あるペプチドに対するＴ細胞応答の強度（Ｓ．Ｉ．）と杉花粉に感受性の個人の集団におけるあるペプチドに対するＴ細胞応答の頻度の両方を表す。例えば、図１４に示すように、ペプチドＣＪ１−２２は、試験した個人の群において、１４．５の平均Ｓ．Ｉ．及び６０％の陽性応答を有し、その結果、ポジティビティーインデックスは８７０．００となる。少なくとも約１００のポジティビティーインデックス及び少なくとも約４の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するCryjIのペプチドは、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）を含む。
正確なＴ細胞エピトープを、例えば、精密マッピング技術によって決定するためには、Ｔ細胞生物学技術により測定したときにＴ細胞刺激活性を有し従って少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを、そのペプチドのアミノ若しくはカルボキシ末端の何れかのアミノ酸残基の付加若しくは欠失によって改変し、その改変したペプチドに対するＴ細胞反応性の変化を測定する。もし天然の蛋白質配列内の重複領域を共有する２つ以上のペプチドが、Ｔ細胞生物学技術により測定したときに、ヒトＴ細胞刺激活性を有することが見出されるならば、かかるペプチドの全部若しくは一部を含む更なるペプチドを生成することが出来、それらの更なるペプチドを同様の手順により試験することが出来る。この技術の後に、ペプチドを、組換え若しくは合成によって選択し及び生成する。ペプチドを、そのペプチドに対するＴ細胞応答の強度（例えば、刺激インデックス）、杉花粉に感受性の個人の集団におけるそのペプチドに対するＴ細胞応答の頻度及びそのペプチドの前記の他の種の木々（例えば、Cupressus sempervirens,Cupressus arizonica,Juniperus virginiana,Juniperus sabinoides等）又はブタクサ（Amb a Ｉ．１）からの他のアレルゲンとの潜在的交差反応性を含む種々の因子に基づいて選択する。これらの選択されたペプチドの物理的及び化学的特性（例えば、溶解度、安定性）を試験してそれらのペプチドが治療用組成物中で用いるのに適当であるか否か或はそれらのペプチドがここに記載したように改変を必要とするか否かを決定する。これらの選択したペプチド又は選択した改変したペプチドがヒトＴ細胞を刺激する（例えば、増殖、リンホカイン分泌を誘導する）能力を測定する。
更に、この発明の好適なＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に結合しないか又はそのペプチドが導かれた蛋白質アレルゲンがＩｇＥに結合するよりも実質的に低い程度でＩｇＥに結合する。標準的な免疫療法の主要な合併症は、アナフィラキシー等のＩｇＥ媒介の応答である。免疫グロブリンＥは、マスト細胞若しくは好塩基球上のＩｇＥへの抗原の結合及び架橋並びにメディエーター（例えば、ヒスタミン、セロトニン、エオシン好性走化性因子）の放出から生じるアナフィラキシー反応のメディエーターである。従って、CryjIに感受性の個人の集団の相当のパーセンテージにおけるアナフィラキシーは、免疫療法において、CryjIアレルゲンに感受性の個人の集団の相当のパーセンテージ（例えば、少なくとも７５％）においてＩｇＥと結合せず、又は、ＩｇＥに結合してもかかる結合がマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーターの放出を生じないペプチドを利用することによって回避することが出来る。アナフィラキシーの危険は、免疫療法において、ＩｇＥ結合の減少したペプチドを利用することにより減じることが出来る。更に、最小ＩｇＥ刺激活性を有するペプチドは、治療効果に対して望ましい。最小ＩｇＥ刺激活性とは、天然のCryjI蛋白質アレルゲンにより刺激されたＩｇＥ産生及び／又はＩＬ−４産生の量より少ないＩｇＥ産生のことをいう。
この発明のＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、杉花粉感受性の個人に投与したとき、その個人のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節することが出来る。特に、CryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ又はCryjIから導かれる少なくとも２つの領域（それぞれ、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含むこの発明のペプチドは、杉花粉に感受性の個人に投与したときに、その個人のアレルゲンに対するＴ細胞応答を調節することが出来る。
この発明の好適な単離したペプチドは、杉花粉アレルゲンCryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、従って、そのペプチドは、少なくとも約７アミノ酸残基を含む。治療効果の目的のためには、この発明の好適な治療用組成物は、好ましくは、CryjIの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、従って、このペプチドは、少なくとも約８アミノ酸残基好ましくは少なくとも約１５アミノ酸残基を含む。更に、この発明の好適な単離したペプチドを含む治療用組成物は、好ましくは、杉花粉に感受性の個人にその組成物を投与する治療管理がその蛋白質アレルゲンに対して寛容化されたその個人のＴ細胞を生じるように、十分なパーセンテージの完全蛋白質アレルゲンのＴ細胞エピトープを含む。約４５アミノ酸残基長まで最も好ましくは約３０アミノ酸残基長までを含むこの発明の合成により生成したペプチドは、長さの増加はペプチド合成を困難にするので、特に望ましい。この発明のペプチドは又、上述のように組換えにより生成することも出来、４５アミノ酸以上のペプチドは組換えにより生成するのが好ましい。
好適ペプチドは、CryjI蛋白質アレルゲン内の主要Ｔ細胞反応性領域（ここでは、リージョン１、リージョン２、リージョン３、リージョン４及びリージョン５とよぶ）の全部又は一部を含む。Ｔ細胞活性の各主要領域を後述のように定義し、図４ａ〜ｂに示す。リージョン１は、CryjIのアミノ酸残基１〜５０（SEQ ID NO:６１）を含み；リージョン２は、CryjIのアミノ酸残基６１〜１２０（SEQ ID NO:６２）を含み；リージョン３は、CryjIのアミノ酸残基１３１〜１８０（SEQ ID NO:６３）を含み；リージョン４は、CryjIのアミノ酸残基１９１〜２８０（SEQ ID NO:６４）を含み；リージョン５は、CryjIのアミノ酸残基２９１〜３５３（SEQ ID NO:６５）を含む。図４ａ〜ｂに示すように、各リージョン内の好適な主要Ｔ細胞反応性領域は、アミノ酸残基１〜４０（SEQ ID NO:６６）；アミノ酸残基８１〜１１０（SEQ ID NO:６７）；アミノ酸残基１５１〜１８０（SEQ ID NO:６８）；アミノ酸残基１９１〜２６０（SEQ ID NO:６９）及びアミノ酸残基２９１〜３３０（SEQ ID NO:７０）を含む。
治療目的に用い得るCryjI蛋白質アレルゲンから導かれたペプチドは、次のペプチドの全部又は一部を含む：ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）、ＣＪ１−４（SEQ ID NO:２９）、ＣＪ１−７（SEQ ID NO:３２）、ＣＪ１−８（SEQ ID NO:３３）、ＣＪ１−９（SEQ ID NO:３４）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）、ＣＪ１−１１（SEQ ID NO:３６）、ＣＪ１−１２（SEQ ID NO:３７）、ＣＪ１−１４（SEQ ID NO:３９）、ＣＪ１−１５（SEQ ID NO:４０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−１８（SEQ ID NO:４３）、ＣＪ１−１９（SEQ ID NO:４４）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２１（SEQ ID NO:４６）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−２８（SEQ ID NO:５３）、ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）、ＣＪ１−３３（SEQ ID NO:５８）、ＣＪ１−３４（SEQ ID NO:５９）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）（ここに、このペプチドの部分は、好ましくは、図１４に示すように、それが導かれたペプチドの平均Ｔ細胞刺激インデックス以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する）。更に好ましくは、治療目的に用い得るCryjI蛋白質アレルゲンから導かれたペプチドは、図１４に示すように、次のペプチドの全部又は一部を含む：ＣＪ１−２、ＣＪ１−９、ＣＪ１−１０、ＣＪ１−１６、ＣＪ１−１７、ＣＪ１−２０、ＣＪ１−２２、ＣＪ１−２３、ＣＪ１−２４、ＣＪ１−２５、ＣＪ１−２６、ＣＪ１−２７、ＣＪ１−３０、ＣＪ１−３１、ＣＪ１−３２及びＣＪ１−３５。更に、CryjI蛋白質から導かれた他の好適ペプチドは、図１８に示すように、次のペプチドを含む：ＣＪ１−４１（SEQ ID NO:７１）、ＣＪ１−４１．１（SEQ ID NO:７２）、ＣＪ１−４１．２（SEQ ID NO:７３）、ＣＪ１−４１．３（SEQ ID NO:７４）、ＣＪ１−４２（SEQ ID NO:７５）、ＣＪ１−４２．１（SEQ ID NO:７６）、ＣＪ１−４２．２（SEQ ID NO:７７）、ＣＪ１−４３（SEQ ID NO:７８）、ＣＪ１−４３．１（SEQ ID NO:７９）、ＣＪ１−４３．６（SEQ ID NO:８０）、ＣＪ１−４３．７（SEQ ID NO:８１）、ＣＪ１−４３．８（SEQ ID NO:８２）、ＣＪ１−４３．９（SEQ ID NO:８３）、ＣＪ１−４３．１０（SEQ ID NO:８４）、ＣＪ１−４３．１１（SEQ ID NO:８５）、ＣＪ１−４３．１２（SEQ ID NO:８６）、ＣＪ１−４５（SEQ ID NO:８７）、ＣＪ１−４５．１（SEQ ID NO:８８）、ＣＪ１−４５．２（SEQ ID NO:８９）、ＣＪ１−４４（SEQ ID NO:９０）、ＣＪ１−４４．１（SEQ ID NO:９１）、ＣＪ１−４４．２（SEQ ID NO:９２）及びＣＪ１−４４．３（SEQ ID NO:９３）。この発明の他の好適な抗原性ペプチドは、１つより多くのリージョンを含んで良い（即ち、図４ａ〜ｂに示すCryjIのアミノ酸配列のアミノ酸１５１〜３５２の全部又は一部）。
本発明の１つの具体例は、この蛋白質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み且つ式Ｘn−Ｙ−Ｚmを有するCryjIのペプチド若しくはその部分を叙述する。この式により、Ｙは、ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）、ＣＪ１−４（SEQ ID NO:２９）、ＣＪ１−７（SEQ ID NO:３２）、ＣＪ１−８（SEQ ID NO:３３）、ＣＪ１−９（SEQ ID NO:３４）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）、ＣＪ１−１１（SEQ ID NO:３６）、ＣＪ１−１２（SEQ ID NO:３７）、ＣＪ１−１４（SEQ ID NO:３９）、ＣＪ１−１５（SEQ ID NO:４０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−１８（SEQ ID NO:４３）、ＣＪ１−１９（SEQ ID NO:４４）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２１（SEQ ID NO:４６）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−２８（SEQ ID NO:５３）、ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）、ＣＪ１−３３（SEQ ID NO:５８）、ＣＪ１−３４（SEQ ID NO:５９）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）よりなる群から選択するアミノ酸配列であり、好ましくは、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−９（SEQ ID NO:２９）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）よりなる群から選択するアミノ酸配列である。更に、Ｘnは、この蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列中のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸残基であり、Ｚmは、この蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸残基である。この式において、ｎは０〜３０であり、ｍは０〜３０である。好ましくは、このペプチド若しくはその部分は、図１４に示すように、Ｙの平均Ｔ細胞刺激インデックス以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する。
本発明の他の具体例は、少なくとも２つの領域（それぞれ、CryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、従って、各領域は少なくとも約７アミノ酸残基を含む）を含むペプチドを提供する。これらの少なくとも２つの領域を含むペプチドは、CryjIアレルゲンの所望するだけ多くのアミノ酸残基を含むことが出来、好ましくは少なくとも約１４、一層好ましくは約３０、最も好ましくは少なくとも約４０アミノ酸残基を含むことが出来る。所望であれば、これらの領域のアミノ酸配列を生成し、リンカーにより繋いで抗原提示細胞によるプロセッシングに対する感受性を増加させることが出来る。かかるリンカーは、任意の非エピトープアミノ酸配列又は他の適当な架橋若しくは結合剤であってよい。少なくとも２つの領域（それぞれ、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含む好適ペプチドを得るために、これらの領域を、アレルゲン中のこれらの領域の天然の構成と異なった構成で配置する。例えば、Ｔ細胞エピトープを含むこれらの領域を、非隣接的構成で配置することが出来、好ましくは同じ蛋白質アレルゲンから導かれ得る。非隣接的とは、Ｔ細胞エピトープを含む領域の配置であって、それらの領域が導かれた蛋白質アレルゲン中に存在するアミノ酸配列の配置と異なる配置として定義される。更に、Ｔ細胞エピトープを含む非隣接領域を非逐次的順序（例えば、Ｔ細胞エピトープを含む領域が誘導される天然の蛋白質アレルゲン（アミノ酸はアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている）のアミノ酸の順序と異なる順序で）で配置することが出来る。１つのペプチドは、少なくとも１５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％又は１００％までのCryjIのＴ細胞エピトープを含み得る。
個々のペプチド領域を生成し、試験をして、どの領域がCryjIに特異的な免疫グロブリンＥと結合するのか及びかかる領域のどれがマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出を引き起こすのかを決定することが出来る。試験したアレルギー性血清の約１０〜１５％より多くにおいて免疫グロブリンＥに結合し且つマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことが見出されたそれらのペプチドは、好ましくは、この発明の好適ペプチドを形成するために配置されるペプチド領域に含まれない。
更に、この発明のペプチドの領域は、好ましくは、上述のCryjI内の好適な主要Ｔ細胞反応性領域（即ち、リージョン１〜５）又は上述の各リージョン内の好適な主要Ｔ細胞反応性領域（即ち、残基１〜４０、８１〜１１０、１５１〜１８０、１９１〜２６０及び２９１〜３３０からのアミノ酸）の全部又は一部を含む。例えば、ある領域はリージョン１（アミノ酸残基１〜５１）の全部又は一部を含み、ある領域はリージョン２（アミノ酸残基６１〜１２０）の全部又は一部を含み得る。この発明のペプチドは、これらのリージョン（即ち、リージョン１〜５）の２つ以上の全部又は一部を含み得て、その結果の好適ペプチドはＩｇＥに結合せず且つマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こさない。CryjIから導かれた好適ペプチドは、リージョン３、リージョン４及びリージョン５を含み、適宜リージョン１及びリージョン２を含む。更に、もしこれらのリージョンの１つがＩｇＥと結合し且つマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことが見出されたならば、このペプチドは、かかるリージョンを含まずに、ＩｇＥに結合せず又はマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こさないようなリージョンから導かれた種々の領域を含むのが好ましい。
好適領域の例は、次を含む：ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）、ＣＪ１−４（SEQ ID NO:２９）、ＣＪ１−７（SEQ ID NO:３２）、ＣＪ１−８（SEQ ID NO:３３）、ＣＪ１−９（SEQ ID NO:３４）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）、ＣＪ１−１１（SEQ ID NO:３６）、ＣＪ１−１２（SEQ ID NO:３７）、ＣＪ１−１４（SEQ ID NO:３９）、ＣＪ１−１５（SEQ ID NO:４０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−１８（SEQ ID NO:４３）、ＣＪ１−１９（SEQ ID NO:４４）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２１（SEQ ID NO:４６）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−２８（SEQ ID NO:５３）、ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）、ＣＪ１−３３（SEQ ID NO:５８）、ＣＪ１−３４（SEQ ID NO:５９）、ＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）、ＣＪ１−４１（SEQ ID NO:７１）、ＣＪ１−４１．１（SEQ ID NO:７２）、ＣＪ１−４１．２（SEQ ID NO:７３）、ＣＪ１−４１．３（SEQ ID NO:７４）、ＣＪ１−４２（SEQ ID NO:７５）、ＣＪ１−４２．１（SEQ ID NO:７６）、ＣＪ１−４２．２（SEQ ID NO:７７）、ＣＪ１−４３（SEQ ID NO:７８）、ＣＪ１−４３．１（SEQ ID NO:７９）、ＣＪ１−４３．６（SEQ ID NO:８０）、ＣＪ１−４３．７（SEQ ID NO:８１）、ＣＪ１−４３．８（SEQ ID NO:８２）、ＣＪ１−４３．９（SEQ ID NO:８３）、ＣＪ１−４３．１０（SEQ ID NO:８４）、ＣＪ１−４３．１１（SEQ ID NO:８５）、ＣＪ１−４３．１２（SEQ ID NO:８６）、ＣＪ１−４５（SEQ ID NO:８７）、ＣＪ１−４５．１（SEQ ID NO:８８）、ＣＪ１−４５．２（SEQ ID NO:８９）、ＣＪ１−４４（SEQ ID NO:９０）、ＣＪ１−４４．１（SEQ ID NO:９１）、ＣＪ１−４４．２（SEQ ID NO:９２）及びＣＪ１−４４．３（SEQ ID NO:９３）（かかる領域のアミノ酸配列を図１３及び１８に示す）、又は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む該領域の部分。
好適ペプチドは、２つ以上の領域（各領域は、上述の好適な主要Ｔ細胞反応性領域の全部又は一部を含む）の種々の組合せを含む。好適ペプチドは、次を含む２つ以上の領域（各領域は、図１３に示すアミノ酸配列を有する）の組合せを含む：
ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）及びＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）；
ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）及びＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）；
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本発明の範囲内の単離したCryjI蛋白質又はCryjIのペプチドを、杉花粉に対するアレルギー反応を治療し及び予防する方法において用いることが出来る。従って、本発明の１つの面は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含むCryjIのペプチド及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む治療用組成物を提供する。他の面において、この治療用組成物は、製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤及び少なくとも２つの領域（各領域は、CryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含むペプチドを含む。
好適な治療用組成物は、杉花粉アレルゲンに感受性の個人へその組成物を投与する治療管理がその個人のＴ細胞をその蛋白質アレルゲンに対して寛容にするように、十分なパーセンテージのCryjIのＴ細胞エピトープを含む。更に好ましくは、この組成物は、CryjIのＴ細胞反応性の少なくとも約４０％、一層好ましくは少なくとも約６０％がこの組成物に含まれるように、十分なパーセンテージのＴ細胞エピトープを含む。かかる組成物を個人に投与して杉花粉又は杉花粉アレルゲンと免疫的に交差反応性のアレルゲンに対する感受性を治療し又は予防することが出来る。
本発明の更に別の面において、少なくとも２つのペプチド（それぞれ、CryjIの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を含む組成物（例えば、少なくとも２つのペプチドの物理的混合物）を提供する。かかる組成物を、製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を伴う治療用組成物の形態で投与することが出来る。治療上有効な量の１種以上のかかる組成物を、杉花粉に感受性の個人に同時に又は逐次的に投与することが出来る。
同時に又は逐次的に投与することの出来るペプチドの好適組成物及び好適組合せ（図１３に示すアミノ酸配列を有するペプチドを含む）は、次の組合せを含む：
ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）及びＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）；
ＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）及びＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）；
ＣＪ１−９（SEQ ID NO:３４）及びＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）；
ＣＪ１−１４（SEQ ID NO:３９）、ＣＪ１−１５（SEQ ID NO:４０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）及びＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）；
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ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）及びＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）；
ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）及びＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）；
ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）及びＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）；
ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）及びＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）；
ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）及びＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）；
ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）及びＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）；
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ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）及びＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）；
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ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）及びＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）。
この発明を、更に、下記の非制限的実施例により説明する。
実施例１
杉花粉アレルゲン（CryjI）の精製
以下は、天然形態の主要アレルゲンCryjIを生化学的に精製するためになされた仕事の説明である。この精製は、刊行された手順（Yasueda等、J.Allergy Clin.Immunol.71:77,1983）を改変したものである。
日本国から得た１００ｇの杉花粉（ワシントン、Spokane在、HollisterStir）を１Ｌのジエチルエーテル中で３回脱脂し、濾過後に花粉を集めてエーテルを真空中で乾燥させた。
脱脂した花粉を、５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤（２μｇ／ｍｌ（終濃度）大豆トリプシン阻害剤、１μｇ／ｍｌ（終濃度）ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ（終濃度）ペプスタチン及び０．１７ｍｇ／ｍｌ（終濃度）フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含む２Ｌの抽出用緩衝液中で４℃で一晩抽出した。不溶性物質を１．２Ｌの抽出用緩衝液で４℃で一晩再抽出し、両抽出物を合わせて、抽出用緩衝液で平衡化したWhatman DE-52 ＤＥＡＥセルロース（乾重量２００ｇ）を用いてバッチ式吸収により色素脱失した。
色素脱失した物質を、次いで、８０％飽和（４℃）の硫安沈澱により分画して、低分子量の物質の多くを除去した。その結果の部分精製したCryjIを、ＰＢＳ緩衝液にて透析してＴ細胞研究に用い（実施例６参照）又は下記のように更なる精製（生化学的又はモノクローナルアフィニティークロマトグラフィー）にかけた。
このCryjIに富む物質を、次いで、プロテアーゼ阻害剤を加えた５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を用いて、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（４℃でｐＨ５．０）に対して透析した。この試料を、次に、４℃でプロテアーゼ阻害剤を加えた５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥセルロースカラム（Whatman DE-52）に加えた。未結合物質（塩基性蛋白質）を、次いで、プロテアーゼ阻害剤を加えた４℃の１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した５０ｍｌのカチオン交換カラム（Whatman CM-52）に加えた。CryjIは、０．３Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配の初期画分に溶出された。このCryjI富化物質を凍結乾燥し、次いで、３００ｍｌのSuperdex75カラム（Pharmacia）上でのＦＰＬＣ（２５℃の１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、流量３０ｍｌ／時）により精製した。
精製したCryjIを、更に、０〜１Ｍ ＮａＣｌ（２５℃）の直線的勾配を用いたＦＰＬＣ S-Sepharose 16/10カラムクロマトグラフィー（Pharmacia）に加えた。主要ピークとして溶出したCryjIを第２のゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。ＦＰＬＣ Superdex 75カラム（６０ｃｍ当り２．６）（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）を、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の下降流（流量３０ｍｌ／時、２５℃）で溶出した。図１ａは、このゲル濾過クロマトグラフィーを示す。CryjIのみが検出された（図１ｂ、レーン２〜８）。CryjIは、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で３つのバンドに分画された（図１ｂ）。図１ｂに示すように、図１ａに示した主要ピークからの画分のＳＤＳＰＡＧＥ（１２．５％）分析を還元条件下で行なった。ゲルを、Bio-Radの銀染色キットを用いて銀染色した。これらの各レーン内の試料は、次のとおりであった：レーン１、オバルブミン（４３，０００ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９，０００ｋＤａ）及びα−ラクトグロブリン（１８，４００ｋＤａ）を含む予備染色した標準蛋白質（Gibco BRL）；レーン２、画分３６；レーン３ 画分３７；レーン４ 画分３８；レーン５ 画分３９；レーン６ 画分４１；レーン７ 画分４３及びレーン８ 画分４４。すべての画分を図１ａに示す。
これらの蛋白質を、マウスモノクローナル抗体ＣＢＦ２を用いるウエスタンブロットによっても分析した（図２）。図２に示すように、Superdex 75（図１）から精製した画分３６（レーン１）、画分３９（レーン２）及び画分４３（レーン３）のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上にエレクトロブロットし且つｍＡＢ ＣＢＦ２をプローブとして調べた。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇを第２抗体として用い、結合した抗体を125Ｉ−ストレプトアビジンにより示した。モノクローナルＣＢＦ２は、D.Klapper博士（ノースカロライナ、Hill在、Chapel）によりブタクサアレルゲンAmb a Ｉに対して高められた。Amb a ＩとCryjIの配列間の相同性の故に、Amb a Ｉに対して高められた抗体の幾つかをCryjIとの反応性について試験した。これらの結果は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにより検出されたように、ＣＢＦ２が変性したCryjIを認識することを示した。更に、ウエスタンブロットは又、ＣＢＦ２によっては、予想される分子量範囲にはCryjIを除いて、他のバンドは検出されないことをも示した。これらの結果は、蛋白質の配列決定から見出されたことと一致した。画分４４及び３９（図１ｂ）をＮ末端配列決定にかけたが、CryjIの配列しか検出されなかった。
要するに、花粉抽出物から分子量の異なる３つのCryjIイソ型が精製された。これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した分子量は、還元及び非還元条件の両方において４０〜３５ｋＤａにわたった。これらのイソ型の等電点は約９．５〜８．６であり、平均ｐＩ９．０である。Ｎ末端の２０アミノ酸配列は、これらの３つのバンドにおいて同じであり且つ以前に公表されたCryjIの配列（Taniai等、前出）と同一であった。これらの３つのイソ型は、すべて、１５人のアレルギー患者血漿を用いるCryjIの種々の精製したサブ画分のアレルギー血清滴定で示されるように、モノクローナル抗体ＣＢＦ２により認識される。それらは、すべてアレルギー患者のＩｇＥと結合する（図３）。これらのイソ型の分子量及び等電点の差異は、部分的に、翻訳後修飾例えばグリコシレーション、リン酸化又は脂質含量のためであろう。これらの異なるイソ型がプロテアーゼ分解のためであるという可能性は、抽出及び精製において４種の異なるプロテアーゼ阻害剤を用いたという事実によりありそうにもないが、現時点では排除することは出来ない。他の可能性は、ｃＤＮＡクローニング研究においてはCryjI蛋白質の唯一つの主要型しか検出されなかった（実施例４参照）が、遺伝子の多形又はｍＲＮＡの交替されたスプライシングのためということがあり得よう。
天然CryjI又は組換えCryjIを精製するために用い得る他のアプローチはイムノアフィニティークロマトグラフィーである。この技術は、モノクローナル抗体と抗原との間の相互作用の特性のために非常に選択的な蛋白質精製を与える。CryjI反応性モノクローナル抗体を生成する目的のために、雌のＢａｌｂ／ｃマウスをJackson Labsから入手した。各マウスを初めに完全フロイントアジュバントに乳化させた７０〜１００μｇの精製した天然CryjI（純度＞９９％、図１ｂに示す、下方のバンド）で腹膜内免疫化した。ＰＢＳ中の１０μｇの精製した天然CryjIの更なる静脈注射を、最初の注射後５４日目に行なった。３日後に脾臓を取り出して、ミエローマとの融合を、ミエローマ系統ＳＰ２．０を用いて、記載された（Current Protocols in Immunology,1991,Coligan等編）ようにしておこなった。これらの細胞を１０％ウシ胎児血清（Hybrimax）、ヒポキサンチン及びアザセリン中で培養し、ハイブリドーマ細胞のコロニーを含むウェルを、抗原結合ＥＬＩＳＡを用いて、抗体産生についてスクリーニングした。
陽性のウェルからの細胞を、３／１０の細胞／ウェルにて１０％ウシ胎児血清（Hybrimax）、ヒポキサンチン中でクローン化し、陽性クローンを再度ヒポキサンチン培地中でサブクローン化した。捕獲ＥＬＩＳＡ（実施例７参照）を、第２及び第３のスクリーニングに用いた。このアッセイは、天然蛋白質を認識するクローンが選択され、それ故、イムノアフィニティー精製に有用であり得るという利点を与える。例えば、２つのモノクローナル抗体（４Ｂ１１、８Ｂ１１）を生成した。これらの抗体を、製造者の手順に従って、Gammabind G.Sepharose（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）により生成し、Pharmaciaにより記載された手順に従ってシアノゲンブロミド活性化Sepharose 4B（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）に固定化した。CryjIを含む硫安調製物をこの樹脂に加え、未結合物質を多量のＰＢＳで洗った。CryjIを２カラム容積の０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．７）で溶出した。ＳＤＳＰＡＧＥにて泳動した溶出物画分の銀染色は、CryjIが殆ど均質に精製されたことを示した。これらの画分は、検出可能なレベルのCryjIIを含まない。ＭＡｂ８Ｂ１１を固定化する他の方法も又試験した。類似の結果が、ジメチルピメリミデートによりGammabind G Sepharoseに共有架橋結合された精製したＭＡｂ８Ｂ１１（Schneider C.等、J.Biol.Chem.（1982）257巻:10766-10769）を用いて得られた。しかしながら、Affi-gel １０（カリフォルニア、Richmond在、Biorad）に共有架橋結合された精製したＭＡｂ８Ｂ１１を用いた実験は、モノクローナル抗体の９０％より多くがAffi-gel 10に共有結合で結合されたにもかかわらず、その樹脂にて生成されたCryjIの収率は、シアノゲンブロミド活性化されたSepharose 4Bに架橋されたＭＡｂ８Ｂ１１から精製されたものより有意に低いということを示した（データは示さない）。それにもかかわらず、これらの種々の樹脂上に固定化されたモノクローナル抗体から精製したCryjIは、やはり無傷であり且つ捕獲ＥＬＩＳＡによりＭＡｂ８Ｂ１１及び４Ｂ１１によって認識され得る。従って、これらのＭＡｂは、花粉抽出物からのCryjIの精製に有用な道具を提供する。同様に、組換えCryjIに結合するモノクローナル抗体も又、イムノアフィニティークロマトグラフィーのために有用であり得る。更に、これらの生成されたモノクローナル抗体は、診断目的にも有用であり得る。CryjIのこれらの異なるイソ型に対する幾らかの特異性を示し、それ故、これらのイソ型を特性決定するための有用な道具を与えるであろう異なるＭＡｂを高めることも可能であろう。
実施例２
杉花粉からのＲＮＡの抽出の試み
市販の、脱脂してないCryptomeria japonica（杉）の花粉（ワシントン、Seattle在、Hollister Stier）からＲＮＡを得るために多くの試みが為された。最初、試料を４Ｍ グアニジン緩衝液中に懸濁させて溶解し、液体窒素下ですり潰して、５．７Ｍ 塩化セシウム中で超遠心分離によりペレット化するSambrook等、Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harborニューヨーク（1989）の方法を用いた。種々の量（３．５及び１０ｇ）の花粉を、グアニジン溶解緩衝液中でその量を変えて（１０及び２５ｍｌ）試みた。セシウム中での遠心分離は、管の底に粘性の物質を生じたが、それからＲＮＡペレットを回収することは出来なかった。脱脂したAmbrosia artemisiifolia（ブタクサ）花粉（ノースカロライナ、Lenior在、Greer Laboratories）から、このプロトコールを用いてＲＮＡを得ることは可能であるにもかかわらず、Cryptomeria japonica花粉をグアニジン抽出前にアセトンで脱脂しても、Ａ260の吸収で測定した限り何らのＲＮＡをも生成しなかった。
Sambrook等、前出の方法によるＲＮＡの酸フェノール抽出を、Cryptomeria japonica花粉から試みた。花粉を４．５Ｍ グアニジン溶液中ですり潰し且つ剪断し、２Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて酸性化し、そしてクロロホルムを加えた水飽和フェノールで抽出した。沈澱後、ペレットを４Ｍ 塩化リチウムで洗い、１０ｍＭ トリス／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ ＳＤＳに再溶解させ、クロロホルム抽出し、そしてＮａＣｌ及び無水エタノールで再沈澱させた。この手順を用いたのでは、Ambrosia artemisiifolia ＲＮＡを抽出することは出来たが、Cryoptomeria japonica ＲＮＡの抽出は出来なかった。
次に、４ｇのCryptomeria japonica花粉を１０ｍｌの抽出用緩衝液（５０ｍＭ トリス（ｐＨ９．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム及びジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）（０．１％にする））に懸濁し、ドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり潰し、１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンと共に遠心管に移してこの混合物を温フェノールで５回抽出した。最後の遠心分離の後に水相を回収して２．５倍容の無水エタノールを加え、この混合物を一晩４℃でインキュベートした。ペレットを遠心分離により回収し、６５℃に加熱することにより１ｍｌのｄＨ2Ｏに再懸濁し、そして０．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム及び２．０容のエタノールの添加により再沈澱させた。Ａ260の吸収及びゲル電気泳動により鑑定した限りにおいて、このペレットにおいては検出可能なＲＮＡは回収されなかった。
最後に、５００ｍｇのCryptomeria japonica花粉をドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり潰して０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳを加えた５ｍｌの５０ｍＭ トリス（ｐＨ９．０）（以前にFrankis及びMascarhenas（1980）Ann.Bot.45:595-599に記載されたように０．１％ ＤＥＰＣで一晩処理したもの）に懸濁させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１で混合）で５回抽出した後に、水相から物質を、０．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム及び２容のエタノールを用いて沈澱させた。そのペレットを、遠心分離で回収し、ｄＨ2Ｏに再懸濁させて６５℃まで加熱して沈澱物質を溶解させた。塩化リチウムを用いる更なる沈澱は行なわなかった。Ａ260の吸収及びゲル電気泳動により測定した限りにおいて、検出可能なＲＮＡはなかった。
要するに、市販の花粉からＲＮＡを回収することは不可能であった。ＲＮＡが貯蔵若しくは出荷の際に分解したのか、又はこの実施例で用いたプロトコールが実在するＲＮＡを回収出来ないのかは分からない。しかしながら、新鮮なCryptomeria japonica花粉及び雄蘂を有する球果試料からはＲＮＡが回収された（実施例３参照）。
実施例３
杉花粉及び雄蘂を有する球果からのＲＮＡの抽出及びCryjIのクローニング
Arnold Arboretum（マサチューセッツ、Boston）にある１本のCryptomeria japonica（杉）の木から採集した新鮮な花粉及び雄蘂を有する球果試料を直ちにドライアイス上で凍結した。ＲＮＡを５００ｍｇの各試料から、本質的にFrankis及びMascarhenas、前出により記載された様にして調製した。これらの試料をドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり潰し、０．１％ ＤＥＰＣで一晩処理した０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｌ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳを有する５ｍｌの５０ｍＭ トリス（ｐＨ９．０）に懸濁させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１で混合）で５回抽出した後に、ＲＮＡを水相から、０．１容の２Ｍ 酢酸ナトリウム及び２容のエタノールで沈殿させた。遠心分離によりペレットを回収し、ｄＨ2Ｏに再懸濁させ、６５℃に５分間加熱した。２ｍｌの４Ｍ 塩化リチウムをＲＮＡ沈澱に加えて、それらを一晩０℃でインキュベートした。遠心分離によりＲＮＡペレットを回収し、１ｍｌのｄＨ2Ｏに再懸濁させ、再び３Ｍ 酢酸ナトリウム及びエタノールで一晩沈澱させた。最後のペレットを１００μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁させて−８０℃に貯蔵した。
第１鎖ｃＤＮＡを、８μｇの頭状花序及び４μｇの花粉ＲＮＡから、市販のキット（ｃＤＮＡ合成システムキット、メリーランド、Gaithersburg在、BRL）を用いて、Gubler及びHoffman（1983）Gene25:263-269の方法に従ってオリゴｄＴプライミングで合成した。CryjIをコードするｃＤＮＡを、縮退オリゴヌクレオチドＣＰ−１（配列5’-GATAATCCGATAGATA-3’を有し、ここに、３位のＴはＣでもよく、６位のＴはＣでもよく、９位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、１２位のＡはＴ若しくはＣでもよく、１５位のＴはＣでもよく、１６位のＡはＴでもよく、１７位のＧはＣでもよい；SEQ ID NO：３）及びプライマーＥＤＴ及びＥＤを用いて増幅する試みを行なった。プライマーＥＤＴは、配列5’-GGAATTCTCTAGACTGCAGGTTTTTTTTTTTTTTT-3’（SEQ ID NO：２４）を有する。プライマーＥＤは、配列5’-GGAATTCTCTAGACTGCAGGT-3’（SEQ ID NO：２３）を有する。ＣＰ−１は、CryjIのアミノ末端の最初の６アミノ酸（ＡｓｐＡｓｎＰｒｏＩｌｅＡｓｐＳｅｒ、配列番号１のアミノ酸１〜６）をコードする縮退したオリゴヌクレオチド配列である。ＥＤＴは、この遺伝子のポリＡテールとハイブリダイズするであろう。すべてのオリゴヌクレオチドは、アラバマ、Huntsville在、Research Genetics,Inc.により合成された。ポリメラーゼ連鎖反応を、市販のキット（GeneAmp ＤＮア増幅キット、コネチカット、Norwalk在、PerkinElmer Cetus）を用いて行ない、ｄＮＴＰを含む１０μｌの１０×緩衝液を１μｇのＣＰ−１及び１μｇのＥＤ／ＥＤＴプライマー（ＥＤ：ＥＤＴのモル比３：１）、ｃＤＮＡ（２０μｌの第１鎖ｃＤＮＡ反応混合物の３〜５μｌ）、０．５μｌのAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ及び蒸留水（１００μｌにする）と混合した。
これらの試料を、プログラム可能な温度制御装置（マサチューセッツ、Cambridge在、MJ Research,Inc.）を用いて増幅した。増幅の最初の５回は、９４℃で１分間の変性、４５℃で１．５分間のプライマーのテンプレートへのアニーリング及び７０℃で２分間の鎖延長からなった。増幅の最後の２０回は、上記のとおりの変性、５５℃で１．５分間のアニーリング及び上記の通りの鎖延長からなった。次いで、この初期増幅の５パーセント（５μｌ）を、各１μｇのＣＰ−２（配列5’-GGGAATTCAATTGGGCGCAGAATGG-3’を有し、ここで１１位のＴはＣでもよく、１７位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２０位のＧはＡでもよく、２３位のＴはＣでもよく、２４位のＧはＣでもよい）（SEQ ID NO：４）、ネストしたプライマー及びＥＤを用いる第２の増幅で用いた。プライマーＣＰ−２中の配列5’-GGGAATTC-3’（配列番号４の塩基１〜８）は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ部位を表す。残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、CryjIのアミノ酸１３〜１８（ＡｓｎＴｒｐＡｌａＧｌｎＡｓｎＡｒｇ、配列番号１のアミノ酸１３〜１８）をコードする。多くのＤＮＡバンドが、１％ＧＴＧアガロースゲル（ME、Rockport在、FMC）上で分離されたが、それらの何れもが、Sambrook等、前出の方法に従って行なったサザーンブロットにおいて、32Ｐ末端標識したプローブＣＰ−３（SEQ ID NO：５）とハイブリダイズしなかった。従って、特定のCryjI ＤＮＡバンドを選択することは出来ず、このアプローチは中止した。ＣＰ−３は配列5’-CTGCAGCCATTTTCIACATTAAA-3’を有し、ここに、９位のＡはＧでもよく、１２位のＴはＣでもよく、１８位のＡはＧでもよく、２１位のＡはＧでもよい（SEQ ID NO：５）。１５位では、縮退を減じるためにＧ又はＡ又はＴ又はＣの代りにイノシン（Ｉ）を用いている（Knoth等（1988）Nucleic Acids Res.16:10932）。プライマーＣＰ−３中の配列5’-CTGCAG-3’（配列番号５の塩基１〜６）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ部位を表している。残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、CryjIの内部配列からのアミノ酸ＰｈｅＡｓｎＶａｌＧｌｕＡｓｎＧｌｙ（配列番号１のアミノ酸３２７〜３３２）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。
第１のＰＣＲも又、第１鎖ｃＤＮＡにて、上記のように、ＣＰ−１（SEQ ID NO：３）及びＣＰ−３（SEQ ID NO：５）を用いて行なった。第２のＰＣＲは、最初の反応の５％を用いて、ＣＰ−２（SEQ ID NO：４）及びＣＰ−３（SEQ ID NO：５）を用いて行なった。再び、多くのバンドが認められたが、それらの何れもが、サザーンブロットにおいて特異的にCryjIと同定され得ず、このアプローチも中止された。
次いで、二本鎖ｃＤＮＡを、約４μｇ（花粉）及び８μｇ（頭状花序）のＲＮＡから、市販のキット（ｃＤＮＡ合成システムキット、メリーランド、Gaithersburg在、BRL）を用いて合成した。フェノール抽出及びエタノール沈澱の後に、ｃＤＮＡを、Rafnar等（1991）J.Biol.Chem.266:1229-1236;Frohman等（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8998-9002;及びRoux等（1990）BioTech.8:48-57の方法に従って、改変アンカードＰＣＲ反応で用いるために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ウィスコンシン、Madison在、Promega）で鈍端化し、エタノール沈澱して自己アニールしたＡＴ（SEQ ID NO：２０）及びＡＬ（SEQ ID NO：２２）オリゴヌクレオチドに繋いだ。オリゴヌクレオチドＡＴは、配列5’-GGGTCTAGAGGTACCGTCCGATCGATCATT-3’（SEQ ID NO：２０）（Rafnar等、前出）を有する。オリゴヌクレオチドＡＬは、配列5’-AATGATCGATGCT-3’（SEQ ID NO：２２）（Rafnar等、前出）を有する。CryjIのアミノ末端を、結合したｃＤＮＡ（２０μｌの反応からの３μｌ）から、各１μｇのオリゴヌクレオチドＡＰ（SEQ ID NO：２１）及び縮退したCryjIプライマーＣＰ−７（配列5’-TTCATICGATTCTGGGCCCA-3’、８位のＧはＴでもよく、９位のＡはＧでもよく、１２位のＣはＴでもよく、１５位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよい）（SEQ ID NO：６）を用いて増幅した。縮退を減じるために、イノシン（Ｉ）を、６位で、Ｇ又はＡ又はＴ又はＣの代りに用いている（Knoth等、前出）。縮退したオリゴヌクレオチドＣＰ−７（SEQ ID NO：６）は、CryjIのアミノ末端（配列番号１のアミノ酸１４〜２０）からのアミノ酸１４〜２０（ＴｒｐＡｌａＧｌｎＡｓｎＡｒｇＭｅｔＬｙｓ）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。オリゴヌクレオチドＡＰは、配列5’-GGGTCTAGAGGTACCGTCCG-3’（SEQ ID NO：２１）を有する。
第１のＰＣＲ反応を、ここに記載したようにして、行なった。次いで、この初期増幅の５パーセント（５μｌ）を、各１μｇのＡＰ（SEQ ID NO：２１）及びCryjIプライマーＣＰ−８（SEQ ID NO：７）内部でネストしたCryjIオリゴヌクレオチドプライマーを用いる第２増幅において用いた。プライマーＣＰ−８は、配列5’-CCTGCAGCGATTCTGGGCCCAAATT-3’を有し、ここに、９位のＧはＴでもよく、１０位のＡはＧでもよく、１３位のＣはＴでもよく、１６位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２３位のＡはＧでもよい（SEQ ID NO：７）。ヌクレオチド5’-CCTGCAG-3’（配列番号７の塩基１〜７）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ部位を表す。残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、CryjIのアミノ末端からのCryjIのアミノ酸１３〜１８（ＡｓｎＴｒｐＡｌａＧｌｎＡｓｎＡｒｇ、配列番号１のアミノ酸１３〜１８）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。主な増幅生成物は、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）染色した３％アガロースゲル上で可視化したところ、約１９３塩基対のＤＮＡバンドであった。
増幅したＤＮＡを、逐次的なクロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出と、その後の０．５容の７．５酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールでの−２０℃での沈澱によって回収した。沈澱及び７０％エタノールでの洗浄の後に、このＤＮＡを、１５μｌの反応にてＸｂａＩとＰｓｔＩで同時に消化して調製用３％ＧＴＧ NuSieve低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドを、ＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出して、市販の配列決定用キット（Sequenase kit,オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等（1977）Proc.Natl Acad Sci.USA74:54463-5476）により配列決定するために、適当に消化したＭ１３ｍｐ１８中に繋いだ。最初は、ライゲーション可能な物質は、雄蘂を有する球果由来のＲＮＡからしか導けないと考えられた。しかしながら、引き続いての試験において、ライゲーション可能な物質が、花粉由来のＲＮＡ及び雄蘂を有する球果由来のＲＮＡから生成したＰＣＲ生成物から回収され得ることが示された。
ＪＣ７１．６とよばれるクローンは、CryjIの部分配列を含むことが見出された。これは、開示されたCryjIのＮＨ2末端配列（Taniai等、前出）に完全に同一である確実なCryjIのクローンであることが確認された。７位のアミノ酸は、米国特許打４，９３９，２３９号に開示された配列と一致して、システイン（Ｃｙｓ）であることが決定された。アミノ酸の番号付けは、成熟蛋白質の配列に基いており、アミノ酸１は、CryjIのＮＨ2末端として開示されたアスパラギン酸（Ａｓｐ）（Taniai等、前出）に対応する。開始メチオニンは、成熟蛋白質の第１アミノ酸に対してアミノ酸−２１であることが見出された。開始メチオニンの位置は、上流のインフレームの終止コドンの存在により及び周囲の配列と植物コンセンサス配列（Lutcke等（1987）EMBO J.6:43-48により報告されたように、開始メチオニンを含む）との７８％の相同性により支持された。
CryjI遺伝子の残りをコードしているｃＤＮＡを、第１のＰＣＲ反応で、結合したｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＣＰ−９（配列5’-ATGGATTCCCCTTGCTTA-3’）（SEQ ID NO：８）及びＡＰ（SEQ ID NO：２１）を用いてクローン化した。オリゴヌクレオチドＣＰ−９（SEQ ID NO：８）は、CryjIのリーダー配列に由来するCryjIのアミノ酸ＭｅｔＡｓｐＳｅｒＰｒｏＣｙｓＬｅｕ（配列番号１のアミノ酸−２１〜−１６）を含み、部分的CryjIクローンＪＣ７６．１について決定されたヌクレオチド配列に基いている。
第２のＰＣＲ反応を、最初の増幅混合物の５％について、各１μｇのＡＰ（SEQ ID NO：２１）及びＣＰ−１０（配列5’-GGGAATTCGATAATCCCATAGACAGC-3’を有する）（SEQ ID NO：９）ネストしたプライマーを用いて行なった。プライマーＣＰ−１０のヌクレオチド配列5’-GGGAATTC-3’（配列番号９の塩基１〜８）は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ部位を表す。残りのオリゴヌクレオチド配列は、CryjIのアミノ酸１〜６（ＡｓｐＡｓｎＰｒｏＩｌｅＡｓｐＳｅｒ）（配列番号１のアミノ酸１〜６）をコードし、部分的CryjIクローンＪＣ７６．１について決定されたヌクレオチド配列に基いている。この増幅したＤＮＡ生成物を、上記のように精製して沈殿させ、それから、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して調製用１％低融点ゲル中で電気泳動した。主なＤＮＡバンドを取り出して、配列決定のためにＭ１３ｍｐ１９及びｐＵＣ１９に繋いだ。再びライゲーション可能な物質を、花粉由来のＲＮＡ及び雄蘂を有する球果由来のＲＮＡから生成したｃＤＮＡから回収した。ｐＵＣ１９ＪＣ９１ａ及びｐＵＣ１９ＪＣ９１ｄとよばれる２つのクローンを、全長配列決定のために選択した。それらは、続いて、同一配列であることが見出された。
ＤＮＡを、市販のキット（オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等、前出）により、配列決定した。両鎖を、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）及び内部シーケンシングプライマーＣＰ−１３（SEQ ID NO：１０）、ＣＰ−１４（SEQ ID NO：１１）、ＣＰ−１５（SEQ ID NO：１２）、ＣＰ−１６（SEQ ID NO：１３）、ＣＰ１８（SEQ ID NO：１５）、ＣＰ−１９（SEQ ID NO：１６）及びＣＰ−２０（SEQ ID NO：１７）を用いて、完全に配列決定した。ＣＰ−１３は、配列5’-ATGCCTATGTACATTGC-3’（SEQ ID NO：１０）を有する。ＣＰ−１３（配列番号：１０）は、CryjIのアミノ酸８２〜８７（ＭｅｔＰｒｏＭｅｔＴｙｒＩｌｅＡｌａ、配列番号１のアミノ酸８２〜８７）をコードする。ＣＰ−１４は、配列5’-GCAATGTACATAGGCAT-3’（SEQ ID NO：１１）を有し、ＣＰ−１３（SEQ ID NO：１０）非コード鎖配列に対応する。ＣＰ−１５は、CryjIのアミノ酸１６９〜１７４（ＳｅｒＡｓｎＳｅｒＳｅｒＡｓｐＧｌｙ、配列番号１のアミノ酸１６９〜１７４）をコードする配列5’-TCCAATTCTTCTGATGGT-3’（SEQ ID NO：１２）を有する。ＣＰ−１６は、CryjIのアミノ酸３３５〜３４０（ＴｈｒＰｒｏＧｌｎＬｅｕＴｈｒＬｙｓ、配列番号１のアミノ酸３３５〜３４０）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である配列5’-TTTTGTCAATTGAGGAGT-3’（SEQ ID NO：１３）を有する。ＣＰ−１８は、CryjIのアミノ酸１８１〜１８６（ＴｈｒＳｅｒＴｈｒＧｌｙＶａｌＴｈｒ、配列番号１のアミノ酸１８１〜１８６）をコードするコード鎖配列に実質的に対応する非コード鎖配列である配列5’-TAGCAACTCCAGTCGAAGT-3’（SEQ ID NO：１５）を有する（但し、ＣＰ−１８（SEQ ID NO：１５）の第４ヌクレオチドは、正しいヌクレオチドＴではなくＣとして合成された）。配列5’-TAGCTCTCATTTGGTGC-3’（SEQ ID NO：１６）を有するＣＰ−１９は、CryjIのアミノ酸２７０〜２７５（ＡｌａＰｒｏＡｓｎＧｌｕＳｅｒＴｙｒ、配列番号１のアミノ酸２７０〜２７５）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列である。ＣＰ−２０は、CryjIのアミノ酸２５１〜２５６（ＴｙｒＡｌａＩｌｅＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、配列番号１のアミノ酸２５１〜２５６）に対するコード鎖である配列5’-TATGCAATTGGTGGGAGT-3’（SEQ ID NO：１７）を有する。この配列決定したＤＮＡは、図４ａ及び４ｂに示した配列（SEQ ID NO：１）を有することが見出された。これは、２つの重複するクローンＪＣ７１．６及びｐＵＣ１９Ｊ９１ａからの複合配列である。CryjIの完全ｃＤＮＡ配列は、１３１２ヌクレオチドからなり、６６ヌクレオチドの５’非翻訳配列、１１２２ヌクレオチドの開始メチオニンのコドンから始まるオープンリーディングフレーム及び３’非翻訳領域を含む。ポリＡテールの５’側２５ヌクレオチドの３’非翻訳領域にはコンセンサスポリアデニル化シグナル配列が存在する（図４及び配列番号１のヌクレオチド１２７９〜１２８３）。図４及び配列番号１のヌクレオチド１３１３〜１３３７は、ベクター配列を表す。開始メチオニンの位置は、インフレームの上流終止コドンの存在及び開始メチオニン（植物に共通の配列AACAAUGGC Lutcke等（1987）EMBO J.6:43-48に匹敵するCryjI中に見出されたAAAAAUGGA（配列番号１の塩基６２〜７０））を含む植物コンセンサス配列との７８％の相同性により確実とされる。このオープンリーディングフレームは、３７４アミノ酸の蛋白質をコードしており、その最初の２１アミノ酸は、成熟蛋白質からは開裂されるリーダー配列を含んでいる。この成熟蛋白質のアミノ末端は、公表されたＮＨ2末端配列（Taniai等（1988）、前出）及び精製したCryjI（実施例１）の直接アミノ酸分析により決定した配列との比較により同定された。成熟蛋白質の演繹されたアミノ酸配列（３５３アミノ酸からなる）は、公表されたCryjIの蛋白質配列（Taniai等、前出）と完全な配列同一性を有する（ＮＨ2末端の最初の２０アミノ酸及び１６の隣接内部アミノ酸配列を含む）。この成熟蛋白質は又、コンセンサス配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔに対応する５つの潜在的グリコシレーション部位を含む。
実施例４
日本で採集された杉花粉からのＲＮＡの抽出
日本でCryptomeria japonica（杉）の木のプールから採集した新鮮な花粉を直ちにドライアイス上で凍結した。この花粉５００ｍｇから、本質的にFrankis及びMascarenhas Ann.Bot.45:595-599に記載されたようにしてＲＮＡを調製した。試料をドライアイス上で乳鉢と乳棒ですり潰して、一晩０．１％ＤＥＰＣで処理した０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳを加えた５ｍｌの５０ｍＭ トリス（ｐＨ９．０）に懸濁させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１で混合）で５回抽出した後に、ＲＮＡを、０．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム及び２容のエタノールで水相から沈澱させた。ペレットを遠心分離で回収し、ｄＨ2Ｏに再懸濁させて６５℃に５分間加熱した。これらのＲＮＡ調製物に２ｍｌの４Ｍ 塩化リチウムを加えて、一晩９℃でインキュベートした。遠心分離によりＲＮＡペレットを回収して、１ｍｌのｄＨ2Ｏに再懸濁させ、再び３Ｍ 酢酸ナトリウム及びエタノールで一晩沈殿させた。最終的ペレットを１００μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁させて−８０℃で保存した。
二本鎖ｃＤＮＡを、８μｌ花粉ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成システムキット（BRL）を用いてGubler及びHoffman（1983）Gene25:263-269の方法に従ってオリゴｄＴプライミングで合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ｄＮＴＰを含む１０μｌの１０×緩衝液を各１００ｐモルのセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（４００μｌの二本鎖ｃＤＮＡ反応混合物の１０μｌ）、０．５μｌのAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ及び蒸留水（１００μｌにする）と混合して、GeneAmp ＤＮＡ増幅キット（Perkin Elmer Cetus）を用いて行なった。
これらの試料を、MJ Research,Inc.（マサチューセッツ、Cambridge在）プログラム可能な温度制御装置を用いて増幅した。最初の５回の増幅は、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のプライマーのテンプレートへのアニーリング及び７２℃で１分間の鎖延長からなった。最後の２０回の増幅は、上記の通りの変性、５５℃で１分間のアニーリング及び上記の通りの鎖延長からなった。
この二本鎖ｃＤＮＡを増幅するのに、次の７つの異なるCryjIプライマー対を用いた：ＣＰ−９（SEQ ID NO：８）及びＣＰ−１７（SEQ ID NO：１４）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１７（SEQ ID NO：１４）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１６（SEQ ID NO：１３）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１９（SEQ ID NO：１６）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１８（SEQ ID NO：１５）、ＣＰ−１３（SEQ ID NO：１０）及びＣＰ−１７（SEQ ID NO：１４）、並びにＣＰ−１３（SEQ ID NO：１０）及びＣＰ−１９（SEQ ID NO：１６）。ＣＰ−１７（SEQ ID NO：１４）は、配列5’-CCTGCAGAAGCTTCATCAACAACGTTTAGA-3’を有し、アミノ酸ＳＫＲＣ*（配列番号１の３５０〜３５３であり且つ終止コドン）をコードするコード鎖配列に対応する非コード鎖配列に対応する。ヌクレオチド配列5’-CCTGCAGAAGCTT-3’（配列番号１４の塩基１〜１３）は、クローニング目的のために加えられたＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を表す。ヌクレオチド配列5’-TCA-3’（配列番号１４の塩基１３〜１５）は、終止コドンの非コード鎖配列に対応している。すべての増幅は、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）染色したアガロースゲル上で見たところ、予想された寸法の生成物を生成した。これらのプライマー対の２つを増幅において使用し、その生成物を全長配列決定のためにｐＵＣ１９中にクローン化した。ＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１６（SEQ ID NO：１３）を用いる二本鎖ｃＤＮＡにおけるＰＣＲ反応は、約１．１ｋｂのバンドを生じ、ＪＣ１３０とよばれた。別個の第１鎖ｃＤＮＡ反応を８μｇの花粉ＲＮＡを用いて上記のように行い、オリゴヌクレオチドプライマーＣＰ−１０（SEQ ID NO：９）及びＣＰ−１７（SEQ ID NO：１４）を用いて増幅した。この増幅は、成熟蛋白質のアミノ末端から終止コドンまで、完全長のｃＤＮＡ（ＪＣ１３５という）を生成した。
増幅されたＤＮＡを、逐次的なクロロホルム、フェノール及びクロロホルム抽出と、その後の−２０℃での０．５容の７．５酢酸アンモニウム及び１．５容のイソプロパノールでの沈澱により回収した。沈澱及び７０％エタノールでの洗浄の後に、ＤＮＡを、１５μｌの反応にて、Ｔ４ポリメラーゼで鈍端化してからＥｃｏＲＩで消化し（ＪＣ１３０の場合）、又はＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで同時に消化し（ＪＣ１３５の場合）、調製用１％SeaPlaque低融点ゲル（FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドをＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出し、市販の配列決定用キット（オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いるジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5476）によるジデオキシＤＮＡ配列決定のために適当に消化したｐＵＣ１９中に繋いだ。
両鎖を、Ｍ１３順及び逆方向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）及び内部シーケンシングプライマーＣＰ−１３（SEQ ID NO：１０）、ＣＰ−１５（SEQ ID NO：１２）、ＣＰ−１６（SEQ ID NO：１３）、ＣＰ−１８（SEQ ID NO：１５）、ＣＰ−１９（SEQ ID NO：１６）及びＣＰ−２０（SEQ ID NO：１７）を用いて配列決定した。増幅ＪＣ１３０からの２つのクローン（ＪＣ１３０ａ及びＪＣ１３０ｂ）及び増幅ＪＣ１３５からの１つのクローン（ＪＣ１３５ｇ）は、配列からCryjIクローンであることが見出された。クローンＪＣ１３０ａ及びＪＣ１３５ｇのヌクレオチド配列及び演繹されたアミノ酸配列は、以前から公知のCryjI配列（SEQ ID NO：１）と同一であった。クローンＪＣ１３０ｂは、１つのヌクレオチドが以前から公知のCryjI配列（SEQ ID NO：１）と違うことが見出された。クローンＪＣ１３０ｂは、配列番号１の３０６位のヌクレオチドにＣを有した。このヌクレオチド変化は、成熟CryjI蛋白質のアミノ酸６０のＴｙｒからＨｉｓへの予想されるアミノ酸変化を生じる。この多形は、未だ独立して誘導されたＰＣＲにおいて又は直接アミノ酸配列決定によって確認されていない。しかしながら、かかる一次ヌクレオチド及びアミノ酸配列における多形は予想されることである。
実施例５
CryjIの発現
CryjIの発現を次のようにして行なった。１０μｇのｐＵＣ１９ＪＣ９１ａをＸｂａＩで消化し、沈殿させ、次いで、Ｔ４ポリメラーゼで鈍端化した。ＢａｍＨＩリンカー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）をｐＵＣ１９ＪＣ９１ａに一晩鈍端ライゲーションさせ、過剰のリンカーをNACSイオン交換ミニカラム（メリーランド、Gaithersburg在、BRL）を通す濾過により除去した。次いで、リンカー結合したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで同時に消化した。CryjI挿入物（成熟蛋白質のアミノ末端をコードするヌクレオチドから終止コドンを通って伸びる）を、１％SeaPlaque低融点アガロースゲル中でのこの消化物の電気泳動により単離した。次いで、この挿入物を適当に消化した、ユニークなＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位が後に続くＡＴＧ開始コドンの直ぐ３’側に６ヒスチジン（Ｈｉｓ６）をコードする配列を含むように改変した発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ウィスコンシン、Madison在、Novagen;Jameel等（1990）J.Virol.64:3963-3966）中にライゲーションした。ベクター中の第２のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位は、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位と共に、以前に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化、鈍端化及びリライゲーションによって除去した。このヒスチジン（Ｈｉｓ６）配列は、Ｎｉ2+キレーティングカラム（Hochuli等（1987）J.Chromatog.411:177-184;Hochuli等（1988）Bio/Tech.6:1321-1325）における組換え蛋白質（CryjI）のアフィニティー精製のために加えた。組換えクローンを用いて、Ｔ７ポリメラーゼをコードする遺伝子に先行するイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導可能なプロモーターを有するプラスミッドを含有する大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３株をトランスフォームした。ＩＰＴＧでの誘導は、高レベルのＴ７ポリメラーゼ発現へと導き、これは、Ｔ７プロモーターを有するｐＥＴ中の組換え蛋白質の発現に必要である。クローンｐＥＴ−１１ｄΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ９１ａ．ｄは、ＣＰ−１４（SEQ ID NO：１１）を用いるジデオキシ配列決定（Sanger等、前出）により、発現のための正しいリーディングフレーム内のCryjIクローンであることが確認された。
組換え蛋白質の発現を、初期小規模培養（５０ｍｌ）で確認した。クローンｐＥＴ−１１ｄΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ９１ａ．ｄの一晩培養を用いて、アンピシリンを含む５０ｍｌの培地（Brain Heart Infusion Media,Difco）に接種し、Ａ600＝１．０まで成育させ、次いで、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）で２時間誘導した。この細菌の１ｍｌのアリコートを誘導の前後で採取して、遠心分離によりペレット化し、そのペレットを５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、１０％ グリセロール、０．２５％ ブロモフェノールブルー中で５分間煮沸することにより粗細胞溶解物を調製した（Studier等、（1990）Methods in Enzymology 185:60-89）。組換え蛋白質発現を、Sambrook等、前出の方法に従って、予想される分子量約３８ｋＤａのクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドとして可視化した（ゲルには、４０μｌの粗溶解物を載せた）。陰性対照は、誘導してないCryjIのプラスミッドを含有する細菌からの粗溶解物及び誘導したプラスミッドを有しない細菌の溶解物からなった。
次いで、このｐＥＴ−１１ｄΔＨＲｈｉｓ６ＪＣ９１ａ．ｄクローンを組換え蛋白質の発現及び精製のために成育させた。組換えプラスミッドを含む培養細菌２ｍｌを８時間成育させ、次いで、固体培地（例えば、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（メリーランド、Gaithersburg在、Gibco-BRL）中の１．５％アガロースを含む６個のペトリ皿（１００×１５ｍｍ））上に線状にこすり付け、集密になるまで一晩成育させ、次いで、掻き取ってアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を含む９Ｌの液体培地（Brain Heart Infusion培地、Difco）に加えた。この培養を、Ａ600が１．０になるまで成育させ、ＩＰＴＧを加え（終濃度１ｍＭ）、更に２時間成育させた。
細菌を遠心分離（７，９３０×ｇ、１０分間）により回収して、９０ｍｌの６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）中で激しく震盪しながら１時間溶解させた。不溶性物質を遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分間、４℃）により除去した。溶解物のｐＨを８．０に調節し、６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）で平衡化した８０ｍｌのニッケルＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に加えた。そのカラムを、６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、次いで、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）で、最後に８Ｍ 尿素、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．３）で、逐次的に洗った。カラムを、各緩衝液で、通過した流れのＡ280が０．０５以下になるまで洗った。
組換え蛋白質CryjIは、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）で溶出され、１０ｍｌのアリコートで採集した。各画分の蛋白質濃度を、Ａ280の吸収により測定して、ピーク画分をプールした。採集した組換え蛋白質のアリコートを、Sambrook等、前出の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
最初の９Ｌの調製物（ＪＣｐＥＴ−１）は、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定（Shimadzu Flying Spot Scanner,マサチューセッツ、Braintree在、Shimadzu Scientific Instruments,Inc.）によると純度約７８％の３０ｍｇのCryjIを生成した。同様にして調製した第２の９Ｌ調製物（ＪＣｐＥＴ−２）は、純度約７７％の４１ｍｇのCryjIを生成した。
実施例６
CryjI（主要杉花粉アレルゲン）を用いた杉花粉アレルギー患者のＴ細胞の研究
重複するペプチドの合成
杉花粉CryjIの重複するペプチドを、標準的Ｆｍｏｃ／ｔＢｏｃ合成化学を用いて合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。図１３は、これらの研究で用いたCryjIペプチドを示す。ペプチドの名称は、一貫している。
杉花粉抗原ペプチドに対するＴ細胞応答
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、季節性鼻炎の臨床症状を示し且つ杉花粉に対するＭＡＳＴ及び／又は皮膚試験陽性の杉花粉アレルギー患者からの６０ｍｌのヘパリン化した血液のリンパ球分離培地（ＬＳＭ）遠心分離によって精製した。長期Ｔ細胞系統を、完全培地（熱で不活性化した５％ヒトＡＢ血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン、５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）のバルク培養における２×１０6ＰＢＬ／ｍｌの、保湿した５％ＣＯ2インキュベエター内での、２０μｇ／ｍｌの部分精製した天然CryjI（７５％の純度で、図２の３本のバンドと類似した３本のバンドを含む）での３７℃で７日間の刺激によって樹立し、CryjI反応性Ｔ細胞を選択した。この量のプライミング抗原は、殆どの杉花粉アレルギー患者からのＴ細胞の活性化に最適であることが測定された。生存細胞をＬＳＭ遠心分離により精製し、５単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２及び５単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４を補った完全培地中で、細胞がもはやリンホカインに応答せず且つ「休止した」と考えられるまで最長で３週間培養した。次いで、Ｔ細胞の、選択したペプチド、組換えCryjI（rCryjI）、精製した天然CryjI又は組換えAmb a Ｉ．１（rAmb aＩ．１）に対して増殖する能力を評価した。アッセイのために、２×１０4の休止細胞を、２×１０4のエプスタイ−バールウイルス（ＥＢＶ）トランスフォームした自家Ｂ細胞（後述のようにして調製した）（２５，０００ＲＡＤでガンマー照射したもの）の存在下で、丸底９６ウェルプレートの２若しくは３ウェル中の２００μｌの容積の完全培地中で、２〜５０μｇ／ｍｌのrCryjI、精製した天然CryjI又はAmb a Ｉ．１で２〜４日間刺激した。次いで、各ウェルに、１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６〜２０時間加えた。取り込まれたカウントをガラス繊維フィルターマット上に集め、液体シンチレーション計数処理した。図１２は、組換えCryjI、精製した天然CryjI及び組換えAmb a Ｉ．１並びに上記のようにして合成した幾つかの抗原性ペプチドを用いるアッセイにおいて抗原量を変えることの効果を示している。幾つかのペプチドは、これらのアッセイにおいて、高濃度では阻害的であることが見出された。滴定を用いて、これらのペプチドのＴ細胞アッセイにおける投与量を最適化した。各ペプチドの滴定における最大応答を、刺激インデックス（Ｓ．Ｉ．）として表す。このＳ．Ｉ．は、ペプチドへの応答において細胞により取り込まれたカウント／分（ＣＰＭ）を、培地のみの中で細胞により取り込まれたＣＰＭで除したものである。バックグラウンドの２倍以上のＳ．Ｉ．値は、「陽性」と考えられ、そのペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示す。これらの陽性結果は、試験した患者の群の各ペプチドの平均刺激インデックスの計算において使用した。図１２に示したこれらの結果は、９９９番の患者が、組換えCryjI及び精製した天然CryjI並びにペプチドＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、３（SEQ ID NO:２８）、２０（SEQ ID NO:４５）及び２２（SEQ ID NO:４７）に対してよく応答するが組換えAmb a Ｉ．１には応答しないことを示している。これは、CryjI Ｔ細胞エピトープがこの特定のアレルギー患者からのＴ細胞により認識されること、並びにrCryjI並びにペプチドＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、３（SEQ ID NO:２８）、２０（SEQ ID NO:４５）及び２２（SEQ ID NO:４７）がかかるＴ細胞エピトープを含むことを示す。更に、これらのエピトープは、しばしば、隣接する重複するペプチドで検出されず、従って、恐らく、反応性ペプチドの重複しない中央の残基に及ぶ。対照抗原でプライムされたＴ細胞又は他の抗原に対してCryjIプライムされたＴ細胞を用いるＴ細胞アッセイにおいて、有意の交差反応性は見出されなかった。
上記の手順を、他の数人の患者についても行なった。個々の患者の結果を、もし、その患者がCryjI蛋白質に２．０以上のＳ．Ｉ．で応答し且つCryjIから導かれた少なくとも１つのペプチドに２．０以上のＳ．Ｉ．で応答したならば、各ペプチドについての平均Ｓ．Ｉ．の計算に用いた。２５人の患者からの陽性の実験の概要を図１４に示す。棒は、ポジティビティーインデックスを表している。各棒の上にあるのは、試験した患者群におけるペプチド若しくは蛋白質に対する少なくとも２のＳ．Ｉ．を有する陽性応答のパーセントである。各棒の上の括弧内にあるのは、試験した患者群についての各ペプチド若しくは蛋白質に対する平均刺激インデックスである。すべての２５人のＴ細胞系統は精製した天然CryjIに応答し、これらのＴ細胞系統の６８．０％は、rCryjIに応答した。これらの２５のＴ細胞系統は又、有意に低いレベルで、rAmb aＩ．１にも応答し、これは、Amb a Ｉ．１アレルゲンがCryjIとある程度の相同性を共有していること及び「共有される」Ｔ細胞エピトープがCryjIとAmb a Ｉ．１との間に存在するであろうことを示している。この杉アレルギー患者のパネルは、ペプチドＣＪ１−１（SEQ ID NO:２６）、ＣＪ１−２（SEQ ID NO:２７）、ＣＪ１−３（SEQ ID NO:２８）、ＣＪ１−４（SEQ ID NO:２９）、ＣＪ１−７（SEQ ID NO:３２）、ＣＪ１−８（SEQ ID NO:３３）、ＣＪ１−９（SEQ ID NO:３４）、ＣＪ１−１０（SEQ ID NO:３５）、ＣＪ１−１１（SEQ ID NO:３６）、ＣＪ１−１２（SEQ ID NO:３７）、ＣＪ１−１４（SEQ ID NO:３９）、ＣＪ１−１５（SEQ ID NO:４０）、ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、ＣＪ１−１８（SEQ ID NO:４３）、ＣＪ１−１９（SEQ ID NO:４４）、ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、ＣＪ１−２１（SEQ ID NO:４６）、ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、ＣＪ１−２５（SEQ ID NO:５０）、ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、ＣＪ１−２８（SEQ ID NO:５３）、ＣＪ１−３０（SEQ ID NO:５５）、ＣＪ１−３１（SEQ ID NO:５６）、ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）、ＣＪ１−３３（SEQ ID NO:５８）、ＣＪ１−３４（SEQ ID NO:５９）及びＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）に応答し、これは、これらのペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示している。
抗原提示細胞としての利用のための（ＥＢＶ）トランスフォームしたＢ細胞の調製
自家ＥＢＶトランスフォームした細胞系統を、２５，０００ラドでガンマー照射して、第２増殖アッセイ及び第２バルク刺激において抗原提示細胞として用いた。これらの細胞系統を、免疫蛍光フローサイトメトリー分析においても対照として用いた。これらのＥＢＶトランスフォームした細胞系統を、５×１０6ＰＢＬを１ｍｌのＢ−５９／８マーモセット細胞系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２、メリーランド、Rockville在、American Type Culture Collection）調整培地と共に、１μｇ／ｍｌのフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下で、３７℃で６０分間、１２×７５ｍｍポリエチレン製丸底Falconスナップキャップチューブ（ニュージャージー、Lincoln Park在、Becton Dickinson Labware）中でインキュベートすることにより作成した。これらの細胞を、次いで、前述のようにＲＰＭＩ−１６４０にて１．２５×１０6細胞／ｍｌに希釈した（但し、熱で不活性化したウシ胎児血清１０％を補い、２００μｌのアリコートを平底培養プレートにて肉眼でコロニーが検出されるまで培養した）。次いで、それらを、細胞系統が樹立されるまで、より大きいウェルに移した。
実施例７
主要杉花粉アレルゲンとしてのCryjI
杉花粉の主要アレルゲンとして報告されたCryjIの重要性を試験するために、直接及び競争ＥＬＩＳＡの両アッセイを行なった。ウェルを杉花粉の可溶性花粉抽出物（ＳＰＥ）又はCryjI（蛋白質配列決定により純度９０％で検定）で被覆し、これらの抗原に対するヒトＩｇＥ抗体結合を分析した。杉花粉ＭＡＳＴで２．５以上の評点を有する１５人の患者からの等量の血漿からなるプールしたヒト血漿及び２人の個々の患者の血漿試料をこのアッセイにおいて比較した。図５は、これらの２種の抗原との結合反応性の結果を示している。結合の全体のパターンは、被覆抗原がＳＰＥであっても（図５ａ）又は精製された天然CryjIであっても（図５ｂ）非常に類似している。
競争アッセイにおいては、ＥＬＩＳＡのウェルを杉花粉ＳＰＥで被覆し、次いで、アレルギー患者のＩｇＥ結合を、溶液中で競争する精製された天然CryjIの存在下で測定した。これらのアッセイにおけるアレルギー性ＩｇＥの源は、１５人の患者からの血漿のプール（ＰＨＰで示す）又は杉花粉ＭＡＳＴで２．５以上の評点を有する患者からの７つの個々の血漿試料であった。このプールしたヒト血漿試料を用いる競争アッセイは、杉花粉ＳＰＥ及び無関係のアレルゲン源であるライグラスＳＰＥに対する精製した天然CryjIの競争結合能力を比較する。図６は、プールしたヒト血漿を用いた競争ＥＬＩＳＡのグラフ化した結果を示す。杉花粉ＳＰＥ中に存在する蛋白質の濃度は、各競争点において、精製した天然CryjIより約１７０倍大きい。この分析から、精製した天然CryjIが、ＩｇＥ結合に関して、杉花粉可溶性花粉抽出物中に存在するすべての範囲の蛋白質と非常によく競争することは明らかである。これは、抗CryjI ＩｇＥ反応性の殆どが天然CryjIに対して向けられていることを意味する。陰性対照は、溶液中の特異的な競争活性及び競争ＳＰＥが被覆されたウェルへの結合を完全に除去することは出来ないということを示す。このアッセイを、アレルギー集団内のＩｇＥ応答の範囲の尺度として、個々の患者について繰り返した。図７は、このＳＰＥへの結合の競争が精製した天然CryjIで行なわれたという結果を示している。これらの結果は、これらの患者が杉花粉ＳＰＥに対する異なる投与量応答を示すにもかかわらず、７人の患者の杉花粉ＳＰＥに対するＩｇＥ結合の各々は、精製した天然CryjIに匹敵し得るということを示す。これらのデータの含意することは、各患者について、CryjIに対して向けられたＩｇＥ反応性が優勢であるが、この反応性には患者間で変化があるということである。全体的結論は、これらのデータが、CryjIが杉花粉の主要アレルゲンであるという以前の発見（Yasueda等、（1988）、前出）を支持するということである。
杉花粉アレルギー患者からのＩｇＥのその花粉蛋白質に対する反応性は、これらの蛋白質を変性したときに、劇的に減少する。この性質を分析する１つの方法は、被覆抗原が杉花粉ＳＰＥ又は還元剤ＤＴＴの存在下で煮沸することにより変性した変性した杉花粉ＳＰＥである直接結合ＥＬＩＳＡによるものである。次いで、これをアレルギー患者の血漿を用いて、ＩｇＥ結合反応性について試験する。図８ａは、このＳＰＥに対する、７人の個々の血漿試料を用いる直接結合アッセイを示す。図８ｂでは、変性したＳＰＥを用いた結合結果は、この処理の後で、反応が顕著に減少したことを示している。ＥＬＩＳＡウェルへのCryjI結合の程度を調べるために、CryjIを、Amb a Ｉ及びＩＩ蛋白質ファミリーに対するウサギポリクローナル抗血清で検出した。これらのブタクサ蛋白質は、CryjIと高度の配列同一性（４６％）を有しており、この抗血清を交差反応性抗体検出システムとして用いることが出来る。結論として、これらのデータは、杉花粉ＳＰＥの変性後の顕著なＩｇＥ反応性の喪失を示している。
実施例８
ＩｇＥ反応性及びヒスタミン放出分析
細菌内で発現させ、次いで（実施例５に記載した様にして）精製した組換えCryjI蛋白質（rCryjI）を、ＩｇＥ反応性について試験した。この試験に適用した最初の方法は、ウェルを組換えCryjIで被覆して個々の患者についてＩｇＥ結合をアッセイした、直接ＥＬＩＳＡであった。このデータセットにおける唯一の陽性シグナルは、従来法で調製した２つの対照用抗血清ウサギポリクローナル抗Amb a Ｉ及びＩＩ（ウサギ抗Amb a Ｉ及びＩＩ）及びCryjIと交差反応するAmb a Ｉに対して高められたモノクローナル抗体ＣＢＦ２からのものである。この方法により、試験したすべての患者は、組換えCryjIとのＩｇＥ反応性を示さなかった。
組換えCryjIに対するＩｇＥ反応性の試験に適用された他の分析方法は、捕獲ＥＬＩＳＡであった。この分析は、抗原に結合し及び他のエピトープ部位への抗体の結合を与える限定された抗体（ここでは、ＣＢＦ２）の利用に依存している。この捕獲ＥＬＩＳＡの形式は、１）ＭＡｂ ＣＢＦ２でウェルを被覆し、２）抗原又はＰＢＳ（一種の陰性対照として）を加えて、被覆したＭＡｂとの特異的相互作用により捕獲させ、３）対照用抗体抗Amb a Ｉ及びＩＩ（図１０ｂ）又はヒトアレルギー性血漿（図１０ａ）の何れかを検出抗体として加え、そして４）抗体結合の検出をアッセイするというものである。ＩｇＥ分析のために、プールしたヒト血漿（ＰＨＰ）（１５患者）を用いた。これらの結果からの結論は、この分析方法によっては、ヒトアレルギー性ＩｇＥのrCryjIに対する特異的結合は示されないということである。しかしながら、rCryjIの捕獲は、図１０ｂに示した対照抗体結合曲線により証明されたように働く。大腸菌で発現されたrCryjIに対するＩｇＥ結合の欠如は、炭水化物又は他の何れかの翻訳後修飾の不在及び／又はＩｇＥの大多数が変性したCryjIと反応しえないためであろう。ＲＡＳＴ、競争ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングのデータも又、rCryjIに対する特異的ＩｇＥ結合を示さない（データは示さない）。
ヒスタミン放出アッセイを、杉花粉アレルギー患者について、杉花粉ＳＰＥ、精製した天然CryjI及びrCryjIを追加抗原として用いて行なった。このアッセイは、ヒト好塩基球メディエーター放出によるＩｇＥ反応性の測定である。図１１に示したこのアッセイの結果は、広範囲の濃度にわたる精製した天然CryjI及び杉花粉ＳＰＥによる強いヒスタミン放出を示している。CryjIによる何らかの測定可能なヒスタミン放出がある唯一の点は、最大濃度５０μｇ／ｍｌにおいてである。このrCryjIによる放出の２つの可能な説明は、１）CryjIの組換え型を認識し得る抗CryjI ＩｇＥの非常に低い割合との特異的な反応、又は２）最大抗原濃度でのみ認められた細菌夾雑物の低数度により引き起こされた非特異的放出である。今までのところ、この結果は、一人の患者において示されただけである。更に、この示されたデータは、各蛋白質濃度における１つのデータ点からのものである。
大腸菌で発現させた物質はＴ細胞反応性を有する（実施例６）が、Cryptomeria japonicaアトペス（atopes）からのＩｇＥに結合しないようであり、かかるアトペスのマスト細胞及び好塩基球からのイン・ビトロでのヒスタミン放出も引き起こさないので、この組換えにより発現されたCryjI蛋白質を免疫療法に用いることは可能であろう。ＩｇＥに結合し得るrCryjIの発現は、恐らく、酵母、昆虫（バキュロウイルス）又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ヒト及びマウス）中で達成出来るであろう。哺乳動物細胞での発現の特定の例は、組換えCryjIをＣＯＳ細胞中で発現するｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ哺乳動物発現ベクター（カリフォルニア、San Diego在、Invitrogen）の利用であってよい。活性にＩｇＥに結合し得るrCryjIは、診断目的のための組換え物質の利用のために重要であり得る。
選択したCryjIペプチドに対するＩｇＥ反応性を分析するために、直接ＥＬＩＳＡ形式を用いた。ＥＬＩＳＡ用のウェルを、CryjIから誘導した２５ペプチドで被覆してＩｇＥ結合についてアッセイした。図１５ａ及び１５ｂは、ＰＨＰ（１５患者）を杉花粉アレルギー性ＩｇＥ源として用いた、これらの結合結果のグラフである。この血漿のプールを、変性したＳＰＥ（直接ＥＬＩＳＡで測定したとき）に結合することが出来、それ故、これらのペプチドに対する反応性の機会を増大させることが出来るであろうＩｇＥの富化のために配合した。このアッセイにおいて、ペプチドＩｇＥ結合能力を、精製した天然CryjI及びrCryjIのそれと比較した。このアッセイで検出された唯一の特異的ＩｇＥは、精製した天然CryjIに対するものであり、これは、杉アレルギー患者のＩｇＥは組換えCryjI又は試験した組換えCryjIペプチドと結合しないという発見を支持している（図１５）。
この発明をその好適な具体例を参照して説明したが、他の具体例も同じ結果に到達することが出来る。本発明の変化及び改変は、当業者には自明であろうが、かかる改変及び等価物並びにこの発明の精神に従うものすべては、請求の範囲において保護されるべきものである。
実施例９
Juniperus sabinoides,Juniperus virginiana及びCupressus arizonica花粉からのＲＮＡの抽出並びに、CryjIの相同物JunsI及びJunvIのクローニング
新鮮な花粉を、Arnold Arboretum（マサチューセッツ、Boston）の一本のJuniperus virginianaの木から採集して直ちにドライアイス上で凍結した。Juniperussabinoides及びCupressus arizonicaの花粉をGreer Laboratories,Inc.（ノースカロライナ、Lenoir）から購入した。全ＲＮＡを、J.virginiana,J.sabinoides及びC.arizonicaの花粉から実施例３に記載したようにして調製した。一本鎖ｃＤＮＡを、５μｇのJ.virginianaからの全花粉ＲＮＡ及び５μｇのJ.sabinoidesからの全花粉ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成システムキット（メリーランド、Gaithersburg在、BRL）を用いて、実施例３に記載したようにして合成した。
２つの柏 種からのCryjI相同物をクローニングする最初の試みを、両柏 ｃＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅においてCryjI特異的なオリゴヌクレオチドの種々の対を用いて行なった。ＰＣＲを、実施例３に記載したようにして行なった。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、ＣＰ−９（SEQ ID NO:８）／ＣＰ−１７（SEQ ID NO:１４）、ＣＰ１０（SEQ ID NO:９）／ＣＰ−１７（SEQ ID NO:１４）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）／ＣＰ−１６（SEQ ID NO:１３）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）／ＣＰ−１９（SEQ ID NO:１６）、ＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）／ＣＰ−１８（SEQ ID NO:１５）、ＣＰ−１３（SEQ ID NO:１０）／ＣＰ−１７（SEQ ID NO:１４）及びＣＰ−１３（SEQ ID NO:１０）／ＣＰ−１９（SEQ ID NO:１６）であった。Gross等（1978）Scand.J.Immunol.8:437-441により、J.sabinoidesの最初の５アミノ酸はCryjIのそれらと同一であると報告されているので、大多数の反応において、ＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）を５’プライマーとして用いた。これらのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプライマー対は、実施例３に記載してある。
上記のプライマー対の何れも、ＥｔＢｒ染色した１％アガロース（メイン、Rockland在、FMC Bioproducts）ミニゲル上で見たときに、何れの柏 種に対するＰＣＲ生成物をも生じなかった。
J.sabinoides及びJ.virginianaからCryjI相同物をクローン化することを意図したＰＣＲ増幅の次のシリーズを、各種からのＲＮＡから合成した二本鎖のリンカー結合されたｃＤＮＡについて行なった。二本鎖ｃＤＮＡを、各５μｇのJ.virginiana及びJ.sabinoidesの花粉ＲＮＡから実施例３に記載したようにして合成した。この二本鎖ｃＤＮＡを、実施例３に記載した改変アンカードＰＣＲにおいて用いるために、エタノール沈殿して自己アニールしたＡＴ（SEQ ID NO:２０）及びＡＬ（SEQ ID NO:２２）オリゴヌクレオチドに対してライゲーションした。次いで、幾つかのCryjIプライマーを、CryjI相同物をこれらの２柏 種から単離する試みにおいて、ＡＰ（SEQ ID NO:２１）と組合せて用いた。ＡＴ（SEQ ID NO:２０）、ＡＬ（SEQ ID NO:２２）及びＡＰ（SEQ ID NO:２１）の配列は、実施例３で与えてある。最初に、第１のＰＣＲを、１００ｐモルの各オリゴヌクレオチドＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）及びＡＰ（SEQ ID NO:２１）を用いて行なった。次いで、この初期増殖の３パーセント（３μｌ）を、それぞれ１００ｐモルのＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）及びＡＰＡ（SEQ ID NO:９８）を用いる第２のＰＣＲにおいて用いた（ＡＰＡは、配列5’-GGGCTCGAGCTGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜１５は、クローニング目的のために追加されたＰｓｔＩ及びＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を表し、ヌクレオチド３３はＡ又はＣであってもよい）。第２のＰＣＲ反応の試験においては、ＥｔＢｒ染色したアガロースゲル上に、分離したバンドを有しないブロードなスメアが現れた。CryjI相同物をこれらのＰＣＲ生成物からクローニングする試みは、成功しなかった。このアプローチは、これらの遺伝子のカルボキシル部分をクローニングしたであろう。次いで、実施例３で記載した縮退したCryjIプライマーＣＰ−１（SEQ ID NO:３）、ＣＰ−４及びＣＰ−７（SEQ ID NO:６）をそれぞれ、二本鎖のリンカー結合したJ.virginiana及びJ.sabinoidesｃＤＮＡについての第１のＰＣＲにおいてＡＰ（SEQ ID NO:２１）と共に用いた。次の様な種々のプライマー対の組合せを第２のＰＣＲにおいて用いた：ＣＰ−２（SEQ ID NO:４）／ＡＰ及びＣＰ−４／ＡＰ（ＣＰ−１／ＡＰの第１ＰＣＲ増幅混合物に）、ＣＰ−２／ＡＰ及びＣＰ−５（SEQ ID NO:５）／ＡＰ（ＣＰ−４／ＡＰの第１ＰＣＲ増幅混合物に）、及びＣＰ−８（SEQ ID NO:７）／ＡＰ（ＣＰ−７／ＡＰ第１ＰＣＲ増幅混合物に）。最後の増幅（ＣＰ−８／ＡＰの第２ＰＣＲ増幅）のみが、試験において、ＥｔＢｒ染色したミニゲル上にバンドを生じた。その他は、ｐＵＣ１９中にクローン化し得ないスメアを与えた。実施例３に記載したＣＰ−８及びＡＰを用いたJ.virginiana及びJ.sabinoidesの第２ＰＣＲの両者（ＪＶ２１及びＪＳ１７という）は、それぞれ、約２００塩基対長の増幅された生成物を生じた。この増幅されたＤＮＡを、実施例３に記載したようにして回収して、５０μｌ反応中でＸｂａＩ及びＰｓｔＩで同時に消化し、沈殿させて容積を１０μｌまで減少させ、調製用２％ＧＴＧ NuSeive低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドをＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出して、市販の配列決定用キット（Sequenase kit,オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いるSanger等（前出）のジデオキシチェーンターミネーション法による配列決定のために適当に消化したｐＵＣ１９中にライゲーションした。２つのＪＳ１７クローン（ｐＵＣ１９ＪＳ１７ｄ及びｐＵＣ１９ＪＳ１７ｆ）及び１つのＪＶ２１クローン（ｐＵＣ１９ＪＶ２１ｇ）を配列決定してCryjIヌクレオチドに相同な配列を含むことを見出し且つアミノ酸配列を演繹した。このJ.sabinoides及びJ.virginianaＲＮＡから単離したCryjI相同物をそれぞれ、JunsI及びJunvIと呼んだ。
CryjIプライマーＣＰ−９（SEQ ID NO:８）及びＣＰ−１０（SEQ ID NO:９）は、第１及び第２ＰＣＲにおいて、それぞれ、ＡＰ（SEQ ID NO:２１）と共に働いて、JunsI及びJunvI ｃＤＮＡのカルボキシ部分を増幅させる。これらのプライマーの配列は、ＣＰ−９中の２ヌクレオチド（ＣＰ−９の５位のＡの代りのＴ、１２位のＡの代りのＣ）とＣＰ−１０中の１ヌクレオチド（JunsIについては１２位のＡの代りのＣのみ）を除いては、本質的に、JunsI Ｉ及びJunvIの配列と同じである。しかしながら、ＣＰ−９及びＡＰを用いる第１ＰＣＲ及びＣＰ−１０及びＡＰを用いる第２ＰＣＲは、ＥｔＢｒ染色したアガロースゲル上で見たときに、同定可能なJunsI生成物もJunvI生成物も生じなかった。
オリゴヌクレオチドＪ１（SEQ ID NO:９９）を合成した。Ｊ１及びすべての後のオリゴヌクレオチドを、ABI394ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（カリフォルニア、Foster City在、Applied Biosystems）にて合成した。第１ＰＣＲを、J.virginiana及びJ.sabinoidesｃＤＮＡと共にＡＰ及びＪ１を用いて行なった。Ｊ１は、JunsI（図１６）のヌクレオチド２０〜３７及びJunvI（図１７）のヌクレオチド３０〜４７に対応する配列5’-CATAAAAATGGCTTCCCCA-3’を有する。第２ＰＣＲ増幅を、J.sabinoidesｃＤＮＡの第１のＪ１／ＡＰ増幅に対して、プライマーＪ２（SEQ ID NO:１００）及びＡＰを用いて行なった。Ｊ２は、配列5’-CGGGAATTCTAGATGTGCAATTGTATCTTGTTA-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜１３は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩエンドヌクレアーゼ制限部位を表し、残りのヌクレオチドは、JunsI配列（図１６）中のヌクレオチド６５〜８４に対応する。J.virginianaｃＤＮＡからの第２の増殖を、ＡＰ及びＪ３（SEQ ID NO:１０１）を用いて行なった（Ｊ３は、配列5’-CGGGAATTCTAGATGTGCAATAGTATCTTGTTG-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜１３は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩエンドヌクレアーゼ制限部位を表し、残りのヌクレオチドは、JunvI配列（図１７）中のヌクレオチド７５〜９４に対応する）。何れの第２の反応においても、特異的な増幅生成物は認められなかった。ＥＤ（SEQ ID NO:１０２）及びＥＤＴ（SEQ ID NO:１０３）と呼ばれるプライマーを、下記のように、モル比３：１（ＥＤ：ＥＤＴ）で、プライマーＪ１（SEQ ID NO:９９）、Ｊ２（SEQ ID NO:１００）及びＪ３（SEQ ID NO:１０１）と共に用いた。ＥＤＴは、配列5’-GGAATTCTCTAGACTGCAGGTTTTTTTTTTTTTTT-3’を有する。ＥＤＴのヌクレオチド１〜２０をポリＴトラックに加えて、クローニング目的のためのＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ及びＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ制限部位を造った。ＥＤは、ＥＤＴのヌクレオチド１〜２１に対応する配列5’-GGAATTCTCTAGACTGCAGGT-3’を有する。これらのオリゴヌクレオチド及びそれらの利用は、以前に記載された（Morgenstern等（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9690-9694）。ＥＤ／ＥＤＴを、第１ＰＣＲにおいて、J.sabinoides及びJ.virginianaｃＤＮＡからの増幅のために、オリゴヌクレオチドＪ１と共に用い、それから、第２ＰＣＲを、オリゴヌクレオチドＪ２及びＡＰＡ（J.sabinoides用）又はＪ３及びＡＰＡ（J.virginiana用）を用いて行なった。これらの増幅からは、特異的な生成物は同定されなかった。Ｊ１、Ｊ２及びＪ３を用いる最後のＰＣＲセットを、オリゴヌクレオチドＡＰＡを用いて試みた。ＡＰＡを、第１ＰＣＲ反応において、J.sabinoides及びJ.virginiana用のＪ１と共に用い、それから、第２の増幅をＪ２（J.sabinoides用）又はＪ３（J.virginiana用）とＡＰＡとを用いて行なった。これらの増幅からは、特異的な生成物は同定されなかった。次いで、縮退したプライマーＣＰ−５７（SEQ ID NO:１０４）を合成した。ＣＰ−５７は、配列5’-GGCCTGCAGTTAACAGCGTTTGCAGAAGGTGCA-3’を有し、ここに、１０位のＴはＣでもよく、１１位のＴはＣでもよく、１３位のＡはＧでもよく、１６位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、１８位のＧはＴでもよく、１９位のＴはＣでもよく、２２位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２３位のＣはＧでもよく、２４位のＡはＣでもよく、２５位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２７位のＡはＧでもよく、２８位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２９位のＧはＣでもよく、３０位のＴはＡでもよく、そして、３１位のＧはＡでもよい。ＣＰ−５７のヌクレオチド１〜９を、クローニング目的のために加えてＰｓｔＩ部位を造ったが、ヌクレオチド１０〜１２は終止コドンに相補的であり、ヌクレオチド１３〜３３は、本質的にアミノ酸ＣｙｓＳｅｒＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｒｇＣｙｓ（図４ｂのアミノ酸３４７〜３５３（SEQ ID NO:２）；図４ｂのヌクレオチド１１６７〜１１８７（SEQ ID NO:１）に対応する）をコードするコード鎖配列に相補的である。これを、第１ＰＣＲにおいて、Ｊ１と共に、J.sabinoides及びJ.virginianaの二本鎖のリンカー結合されたｃＤＮＡに対して用い、それから、第２ＰＣＲを、J.sabinoidesについてはＣＰ−５７及びＪ２を、J.virginianaについてはＣＰ−５７及びＪ３を用いて行なった。３つの追加の縮退したCryjIオリゴヌクレオチドを合成した。ＣＰ−６２（（SEQ ID NO:１０５）は、配列5’-CCACTAAATATTATCCA-3’を有し、ここに、３位のＡはＧでもよく、６位のＡはＧでもよく、９位のＴはＡ若しくはＧでもよく、１２位のＴはＡ若しくはＧでもよい。この縮退したオリゴヌクレオチド配列は、本質的にアミノ酸ＴｒｐＩｌｅＰｈｅＳｅｒＧｌｙ（図４ａのアミノ酸６９〜７４（SEQ ID NO:２）；図４ａのヌクレオチド３３３〜３４９（SEQ ID NO:１）に対応する）をコードするコード鎖配列に相補的である。ＣＰ−６３（SEQ ID NO:１０６）は、配列5’-GCATCCCCATCTTGGGGATG-3’を有し、ここに、３位のＡはＧでもよく、９位のＡはＧでもよく、１２位のＴはＣでもよく、１５位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、１８位のＡはＧでもよい。この縮退したオリゴヌクレオチド配列は、アミノ酸ＨｉｓＰｒｏＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｌａ（図４ａのアミノ酸１４６〜１５２（SEQ ID NO:２）；図４ａのヌクレオチド５６４〜５８３（SEQ ID NO:１）に対応する）をコードし得る配列に相補的である。ＣＰ−６４（SEQ ID NO:１０７）は、配列5’-GTCCATGGATCATAATTATT-3’を有し、ここに、６位のＴはＣでもよく、９位のＡはＧでもよく、１２位のＡはＧでもよく、１５位のＡはＧでもよく、１８位のＡはＧでもよい。この縮退したオリゴヌクレオチド配列は、アミノ酸ＡｓｎＡｓｎＴｙｒＡｓｐＰｒｏＴｒｐＴｈｒ（図４ｂのアミノ酸２４３〜２４９；図４ｂのヌクレオチド８５５〜８７４（SEQ ID NO:２）に対応する）をコードし得るコード鎖配列に相補的である。ＡＰを、第１ＰＣＲ増幅において、ＣＰ−６２、ＣＰ−６３、ＣＰ−６４及びＣＰ−３（SEQ ID NO:５）（実施例３に記載）と共に、J.sabinoides及びJ.virginianaの二本鎖のリンカー結合した両ｃＤＮＡに対して用いた。診断用ＰＣＲを、各第１反応混合物について行なった。この診断用ＰＣＲにおいて、第１反応の３％を、上記のようにＡＰ及びＣＰ−８を用いて増幅した。J.sabinoides及びJ.virginianaの両者に対して、約２００塩基対の予想されるバンドが、ＡＰ及びＣＰ−６３を用いる第１ＰＣＲからの診断用ＰＣＲにおいて認められた。
次いで、縮退したプライマーＣＰ−６５（SEQ ID NO:１０８）を合成した。ＣＰ−６５は、配列5’-GCCCTGCAGTCCCCATCTTGGGGATGGAC-3’を有し、ここに、１５位のＡはＧでもよく、１８位のＴはＣでもよく、２１位のＧはＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣでもよく、２４位のＡはＧでもよく、２７位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよい。ＣＰ−６５のヌクレオチド１〜９を、クローニング目的のために加えてＰｓｔＩ制限部位を造ったが、残りの縮退したオリゴヌクレオチド配列は、本質的にアミノ酸ＶａｌＨｉｓＰｒｏＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｓｐ（図４ａのアミノ酸１４５〜１５１（SEQ ID NO:２）；図４ａのヌクレオチド５６１〜５８０（SEQ ID NO:１）に対応する）をコードし得るコード鎖配列に相補的である。ＡＰを、上記のJ.sabinoides及びJ.virginianaの第１のＡＰ／ＣＰ−６３増幅の第２ＰＣＲにおいて、ＣＰ−６５と共に用いた。これらの反応物を、ＪＳ４２（J.sabinoides）及びＪＶ４６（J.virginiana）と呼んだ。第２ＰＣＲは、両者とも、１％アガロースミニゲル上でＥｔＢｒ染色して調べたときに、約６００塩基対のバンドを与えた。ＪＳ４２及びＪＶ４６ＰＣＲからのＤＮＡを実施例３に記載したようにして回収し、１５μｌの反応中でＸｂａＩ及びＰｓｔＩで同時に消化し、次いで、調製用２％ＧＴＧSeaPlaque低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドを、ＥｔＢｒ染色で可視化し、取り出して、市販の配列決定用キット（Sequenase kit,オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いるジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等、前出）による配列決定のために、適当に消化したｐＵＣ１９中にライゲーションした。クローンを、Ｍ１３用の順及び逆方向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs)及び内部シーケンシングプライマーＪ４（SEQ ID NO:１０９）を用いて配列決定した。JunsI及びJunvIの両者について、Ｊ４は、配列5’-GCTCCACCATGGGAGGCA-3’（図１６のヌクレオチド１７７〜１９４及び図１７のヌクレオチド１８７〜２０４）を有し、それは、本質的にアミノ酸ＳｅｒＳｅｒＴｈｒＭｅｔＧｌｙＧｌｙ（図１６（SEQ ID NO:９５）及び１７（SEQ ID NO:９７）にそれぞれ示すJunsI及びJunvIのアミノ酸３０〜３５）をコードするコード鎖配列である。
このJunsIクローンの配列（ｐＵＣ１９ＪＳ４２ｅと呼ぶ）は、５’非翻訳領域において異なる長さを有しているにもかかわらず、クローンｐＵＣ１９ＪＳ１７ｄ及びｐＵＣ１９ＪＳ１７ｆの配列と、それらの重複領域において同一であることが見出された。クローンｐＵＣ１９ＪＳ１７ｄは、最長の５’非翻訳配列を有した。図１６のヌクレオチド１〜１４１は、クローンｐＵＣ１９ＪＳ１７ｄの配列に対応する。クローンｐＵＣ１９ＪＳ４２ｅは、図１６のヌクレオチド１〜５３８に対応する。
ｐＵＣ１９ＪＶ４６及びｐＵＣ１９ＪＶ４６ｂと呼ばれるJunvIクローンの配列は、クローンｐＵＣ１９ＪＶ２１ｇの配列と、それらの重複領域において同一であった（但し、図１７のヌクレオチド８３は、示されているＴではなく、クローンｐＵＣ１９ＪＶ２１ｇ中ではＡであった）。このヌクレオチドの差異は、予想されるアミノ酸変化を生じない。クローンｐＵＣ１９ＪＶ４６ａ、ｐＵＣ１９ＪＶ４６ｂ及びｐＵＣ１９ＪＶ２１ｇは、それぞれ、図１７のヌクレオチド１〜５４８、１〜５４８及び２〜１５１に対応する。
これらのJunsI及びJunvI遺伝子の残りをコードするｃＤＮＡを、それぞれリンカー結合されたｃＤＮＡから、縮退したオリゴヌクレオチドＣＰ−６６（SEQ ID NO:１１０）（ＣＰ−６６は、配列5’-CATCCGCAAGATGGGGATGC-3’を有し、ここに、３位のＴはＣでもよく、６位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、９位のＡはＧでもよく、１２位のＴはＣでもよく、１８位のＴはＣでもよい）及びＡＰを第１ＰＣＲで用いてクローン化した。ＣＰ−６６の配列は、ＣＰ−６３のそれと相補的である。第２ＰＣＲを、最初の増幅混合物の３％について、各１００ｐモルのＡＰ及びＣＰ−６７を用いて行なった。ＣＰ−６７（SEQ ID NO:１１１）は、配列5’-CGGGAATTCCCTCAAGATGGGGATGCGCT-3’を有し、ここに、１５位のＡはＧでもよく、１８位のＴはＣでもよく、２４位のＴはＣでもよく、２７位のＧはＡ、Ｔ若しくはＣでもよく、２８位のＣはＴでもよい。プライマーＣＰ−６７のヌクレオチド配列5’-CGGGAATTC-3’（塩基１〜９）を、クローニング目的のために加えてＥｃｏＲＩ制限部位を造った。残りのオリゴヌクレオチド配列は、本質的に、アミノ酸ＰｒｏＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｌａＬｅｕ（図４ａのアミノ酸１４７〜１５３（SEQ ID NO:２）；図４ａのヌクレオチド５６７〜５８６（SEQ ID NO:１）に対応する）をコードする。これらの、J.sabinoides増幅からのＤＮＡ生成物（ＪＳ４５と呼ぶ）及びJ.virginiana増幅からのＤＮＡ生成物（ＪＶ４９ｉｉと呼ぶ）を、実施例３に記載したようにして精製し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ（ＪＳ４５）又はＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８Ｉ（ＪＶ４９ｉｉ）で消化し、調製用１％低融点ゲル中で電気泳動した。約６５０ｂｐ長の主なＤＮＡバンドを取り出して、配列決定のためにｐＵＣ１９中にライゲーションした。ＤＮＡを、市販のキット（sequenase kit,オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等、前出）により配列決定した。
JunsI及びJunvIについてのｐＵＣ１９ＪＳ４５ａ及びｐＵＣ１９ＪＶ４９ｉｉａと呼ばれる２つのクローンを、それぞれ、Ｍ１３用の順及び逆方向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.BioLabs）及び内部シーケンシングプライマーＪ８（SEQ ID NO:１１２）、Ｊ９（SEQ ID NO:１１３）及びＪ１２（SEQ ID NO:１１４）（JunsI用）及びＪ６（SEQ ID NO:１１５）及びＪ１１（SEQ ID NO:１１６）（JunvI用）を用いて配列決定した。Ｊ８は、配列5’-TAGGACATGATGATACAT-3’（図１６のヌクレオチド６９０〜７０７）を有し、これは、本質的にJunsIのアミノ酸ＬｅｕＧｌｙＨｉｓＡｓｐＡｓｐＴｈｒ（図１６のアミノ酸２０１〜２０６）をコードするコード鎖配列である。Ｊ９は、配列5’-GAGATCTACACGAGATGC-3’（図１６のヌクレオチド９７６〜９９３）を有し、これは、本質的にJunvIのアミノ酸ＡｒｇＳｅｒＴｈｒＡｒｇＡｓｐＡｌａをコードするコード鎖配列である。Ｊ１２は、配列5’-AAAACTATTCCCTTCACT-3’を有し、ここに、１位のＡはＧでもよく、４位のＡはＴでもよい。これは、JunsIのアミノ酸ＳｅｒＧｌｕＧｌｙＡｓｎＳｅｒＰｈｅ（図１６のアミノ酸２６３〜２６８）をコードするコード鎖配列（図１６のヌクレオチド８７５〜８９２）に対応する非コード鎖配列である。Ｊ６は、配列5’-TAGGACATAGTGATTCAT-3’（図１７のヌクレオチド７００〜７１７）を有し、本質的にJunvIのアミノ酸ＬｅｕＧｌｙＨｉｓＳｅｒＡｓｐＳｅｒをコードするコード鎖配列である。Ｊ１１は、配列5’-CCGGGATCCTTACAAATAACACATTAT-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜９は、クローニング目的のためのＢａｍＨＩ制限部位をコードしており、ヌクレオチド１０〜２７は図１７のヌクレオチド１１６５〜１１８２（JunvIの３’非翻訳領域内）に相補的なコード鎖配列に対応する。クローンｐＵＣ１９ＪＳ４５ａの配列は、図１６のヌクレオチド５２７〜１１７０に対応する。クローンｐＵＣ２９ＪＶ４９ｉｉａの配列は、図１７のヌクレオチド５３７〜１２７８に対応する。
JunsIの完全長クローンをＰＣＲを用いて増幅した。オリゴヌクレオチドＪ７（SEQ ID NO:１１７）及びＪ１０（SEQ ID NO:１１８）を、ＰＣＲ反応において、上記のように、J.sabinoidesの二本鎖のリンカー結合されたｃＤＮＡと共に用いた。Ｊ７は、配列5’-CCCGAATTCATGGCTTCCCCATGCTTA-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜９は、クローニング目的のために加えられたＥｃｏＲＩ制限部位をコードし、ヌクレオチド１０〜２７（図１６のヌクレオチド２６〜４３に対応する）は、JunsIのアミノ酸ＭｅｔＡｌａＳｅｒＰｒｏＣｙｓＬｅｕ（図１６のアミノ酸−２１〜−１６）をコードするコード鎖配列である。Ｊ１０は、配列5’-CCGGGATCCCGTTTCATAAGCAAGATT-3’を有し、ここに、ヌクレオチド１〜９は、クローニング目的のために加えられたＢａｍＨＩ制限部位をコードし、ヌクレオチド１０〜２７は、JunsIの３’非翻訳領域からのヌクレオチド１１４０〜１１５７（図１６）に相補的な非コード鎖配列である。ＰＣＲ生成物（ＪＳ５３ｉｉと呼ぶ）は、１％アガロースミニゲル上でＥｔＢｒ染色して調べたときに、約１２００ｂｐのバンドを与えた。このＪＳ５３ｉｉＰＣＲからのＤＮＡを、実施例３に記載したようにして回収した。沈殿及び７０％ＥｔＯＨでの洗浄の後に、このＤＮＡを、１５μｌの反応中でＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで同時に消化し、調製用１％ＧＴＧ SeaPlaque低融点ゲル（メイン、Rockport在、FMC）中で電気泳動した。適当な寸法のＤＮＡバンドを、ＥｔＢｒ染色により可視化し、取り出し、市販の配列決定用キット（Sequenasekit,オハイオ、Cleveland在、U.S.Biochemicals）を用いるジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger等、前出）による配列決定のために、適当に消化したｐＵＣ１９中にライゲーションした。その結果生成したクローン、ｐＵＣ１９ＪＳ５３ｉｉｂを、Ｍ１３用の順及び逆方向プライマー（マサチューセッツ、Beverly在、N.E.Biolabs）及び内部シーケンシングプライマーＪ４を用いて部分的に配列決定した。このｐＵＣ１９ＪＳ５３ｉｉｂの配列を決定したが、それは、クローンｐＵＣ１９ＪＳ１７ｄ、ｐＵＣ１９ＪＳ４２ｅ及びｐＵＣ１９ＪＳ４５ａから得られたものと同一であった。このクローンｐＵＣ１９ＪＳ５３ｉｉｂのヌクレオチド配列は、図１６のヌクレオチド２６〜１１５７に対応する。
JunsIのヌクレオチド及び予想されるアミノ酸配列（SEQ ID NO:９４及び９５）を図１６に示す。JunsIは、図１６のヌクレオチド２６〜１１２６に対応する１１０１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する（３６７アミノ酸の蛋白質をコードし得る）。図１６のヌクレオチド１〜２５及び１１３０〜１１７０は、それぞれ、５’及び３’非翻訳領域である。図１６のヌクレオチド２６〜２８によりコードされる開始Ｍｅｔは、植物における開始Ｍｅｔを含むコンセンサス配列（AACAATGGC;Lutcke等、前出）と８９％の同一性を有する図１６のヌクレオチド２３〜３０（AAAAATGGC）中に同定された。この開始Ｍｅｔをコードするコドンの直５’側には、インフレームの終止コドンもある。図１６のアミノ酸−２１〜−１は、予想されるリーダー配列に対応する。JunsIの成熟型のアミノ末端は、精製したJunsIの直接蛋白質配列分析（Gross等、前出）により図１６のアミノ酸１として同定された。JunsIの成熟型は、図１６のアミノ酸１〜３４６に対応するが、予想される分子量３７．７ｋＤａを有する。JunsIは、共通配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有する、３つの潜在的なＮ結合グリコシレーション部位を有する。
JunvIの核酸及び予想されるアミノ酸配列（SEQ ID NO:９６及び９７）を図１７に示す。ヌクレオチド１〜３５及び１１３０〜１１７０は、それぞれ、５’及び３’非翻訳領域である。図１７のヌクレオチド３６〜３８によりコードされる開始ヌクレオチドは、植物における開始Ｍｅｔを含むコンセンサス配列（AACAATGGC;Lutcke等、前出）と８９％の同一性を有する図１７のヌクレオチド２３〜３０（AAAAATGGC）中に同定された。JunsI（図１６）及びJunvI（図１７）の核酸は、この開始Ｍｅｔの周りの領域において同一である。図１７の５’非翻訳領域には２つのインフレームの終止コドンもある。JunvIは、図１７のヌクレオチド３６〜１１４５に対応する１，１００ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有し、それは、３７０アミノ酸の蛋白質をコードし得る。図１７のヌクレオチド１１４６〜１１４８は終止コドンをコードしている。JunvIのアミノ酸−２１〜−１（図１７）は、予想されるリーダー配列に対応する。このJunvIの成熟型のアミノ末端は、CryjI（図４ａ）及びJunsI（図１６）の配列との比較により、図１７のアミノ酸１として同定された。図１７のアミノ酸１〜３４９に対応するJunvIの成熟型は、予想される分子量３８．０ｋＤａを有する。JunvIは、共通配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有する４つの潜在的Ｎ結合グリコシレーション部位を有する。
表Ｉに示すように、JunsIとJunvIの成熟型のアミノ酸配列は、互いに８０．９％相同（７５．４％同一であり、５．５％類似）である。JunsI及びCryjIの成熟型のアミノ酸配列は、８７％相同（８０．１％同一であり、６．９％類似）であり、JunvI及びCryjIの成熟型の配列は、８０．５％相同（７２．５％同一であり、８％類似）である。実施例６でＴ細胞エピトープを含むとして同定されたCryjIペプチド配列と対応するJunsI及びJunvI配列との間の相同性も又、非常に高い。例えば、CryjIのアミノ酸２１１〜２３０に対応するペプチドＣＪ１−２２（図１３）は、主要Ｔ細胞エピトープを含む（図１４）。ＣＪ１−２２は、JunsI及びJunvIそれぞれの対応する領域と９５％の同一性（１９／２０の同一アミノ酸）及び８５％の相同性（１６／２０の同一アミノ酸、１／２０の類似アミノ酸）を有する。この高い配列相同性は、CryjIにより引き起こされるアレルギー疾患の治療において有効な免疫療法は、CryjI相同物により引き起こされるアレルギー疾患の治療においても有効であり得るということを示唆する。すべての核酸及びアミノ酸分析は、PCGENE（カリフォルニア、Mountain View在、Intelligenetics）に含まれるソフトウェアを用いて行なった。

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実施例１０
Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊ．ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ及びＣ．ａｒｉｚｏｎｉｃａＲＮＡのノーザンブロット分析
Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、及びＪ．ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ花粉から分離したＲＮＡに関してノーザンブロット分析を行った。合衆国（例３）及び日本（例４）の両方で捕集したＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのＲＮＡを調べた。本質的に上記のＳａｍｂｒｏｏｋの方法を用いて、各々のＲＮＡ１５μｇを、ホルムアルデヒド３８％及び１Ｘ ＭＯＰＳ（２０Ｘ＝０．４Ｍ ＭＯＰＳ、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０）溶液を含有する１．２％アガロースゲル上で泳動した。ＲＮＡ試料（初めに酢酸ナトリウム１／１０容積、エタノール２容積で沈殿させて容積を減少させ、ｄＨ2Ｏ ５．５μｌに再懸濁させた）を、最終濃度ホルムアルデヒド１５．５％、ホルムアミド４２％、及び１．３Ｘ ＭＯＰＳ溶液を有するローディング色素を含有するホルムアルデヒド／ホルムアミド緩衝液１０μｌにより泳動した。試料を１０×ＳＳＣ（２０Ｘ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）におけるキャピラリートランスファーによりＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ、ボストン）に移した後に、膜を８０℃で２時間ベークし、３分間紫外線照射した。膜のプレハイブリダイゼーションは、４ｍＬの０．５Ｍ ＮａＰＯ4（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＢＳＡ、及び７％ＳＤＳ中６０℃において１時間であった。アンチセンスプローブを非対称性ＰＣＲ（ＭｃＣａｂｅ，Ｐ．Ｃ．、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ＡＧｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．等、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ボストン、（１９９０）、７６〜８３頁における）により低メルトアガロース（例３に記載する）においてＪＣ９１ａの増幅で合成した。この場合、２μｌのＤＮＡを２μｌのｄＮＴＰミックス（０．１６７ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１６７ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１６７ｍＭ ｄＧＴＰ０、及び０３３ｍＭ ｄＣＴＰ）、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１０μｌの32Ｐ−ｄＣＴＰ（１００μＣｉ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ、アーリントンハイツ）、１μｌ（１００ｐモル）のアンチセンスプライマーＣＰ−１７、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ、及びｄＨ2Ｏにより増幅して２０μｌにする。１０×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（コネチカット、ノアウオーク）からのものであった。増幅は９４℃において４５秒間３０回数変性し、プライマーを６０℃において４５秒間アニールしてテンプレートにしかつ７２℃において１分間鎖延長することからなるものであった。反応を、ＴＥ１００μｌを加えることによって停止させ、プローブを３ｃｃのＧ−５０スピンカラム（ＴＥで平衡にしたグラスウールを詰めた３ｃｃのシリンジ中の２ｍｌのＧ−５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スエーデン、アップサラ］）で回収し、１５００ ＴｒｉＣａｒｂ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋｅｒｄ、イリノイ、ダウナースグロウブ）でカウントした。プローブをプレハイブリダイジング緩衝液に１０6ｃｐｍ／ｍｌで加え、プレハイブリダイゼーションを６０℃において１６時間行った。ブロットを高緊縮条件：３×６５℃における０．２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳによる１５分、において行い、次いでプラスチックラップにラップして−８０℃のフィルムに暴露した。このノーザンブロットの７時間暴露は、Ｃ．Ｊａｐｏｎｉｃａ（合衆国）（図１９ａ、レーン１）、Ｃ．Ｊａｐｏｎｉｃａ（日本）（図１９ａ、レーン２）、Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ（図１９ａ、レーン３）及びＪ．ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ（図１９ａ、レーン４）ＲＮＡについておよそ１．２ｋｂにおいて単一の厚いバンドを示した。このバンドはｃＤＮＡのＰＣＲ分析によって予測される通りのＣｒｙｊＩ、ＪｕｎｓＩ及びＪｕｎｖＩについて予期されるサイズである。各々のレーンにおける異なるバンド強さはゲル上に負荷されたＤＮＡの量の相違を反映し得る。分子量基準１．６及び１．０ｋｂの位置を図１９ａ及び１９ｂに示す。
Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ及びＣ．ａｒｉｚｏｎｉｃａから分離したＲＮＡを別のノーザンブロットにおいて分析した。Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓからの全ＲＮＡ５μｇ及びＣ．ａｒｉｚｏｎｉｃａからの全ＲＮＡ５μｇを記載する通りにして精査した。このブロットにおいて、Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ（図１９ａ、レーン１）及びＣ．ａｒｉｚｏｎｉｃａ（図１９ｂ、レーン２）の両方について１．２ｋｂバンドが観測され、Ｃ．ａｒｉｚｏｎｉｃａがＣｒｙｊＩ相同体を有することを示す。他の関連するツリーもまた相同体を有するものと予想される。
本発明をその好適な実施態様に関連して説明したが、その他の実施態様は同じ結果を達成することができる。本発明への変更及び変更態様は当業者にとり自明であると思われかつ発明の真の精神及び範囲に従うかかる変更態様及び均等物をすべて添付する請求の範囲に含む意図である。
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Background of the Invention
Individuals with genetic predisposition (up to about 10% of the population) become over-sensitized (allergic) to antigens of various environmental sources to which they are exposed. Those antigens that can induce immediate and / or delayed hypersensitivity are known as allergens (King, T.P., Adv. Immunol. 23: 77-105, (1976)). Anaphylaxis or atopy, including symptoms of hay fever, asthma and rash, is a form of immediate allergy. It can be caused by various atopic allergens such as grasses, trees, weeds, animal dander, insects, food, drugs and chemicals.
Antibodies related to atopic allergy belong mainly to the immunoglobulin IgE class. IgE binds to mast cells and basophils. Due to the binding of specific allergens to IgE bound to mast cells or basophils, IgE can be cross-linked on the cells to produce the physiological effect of IgE-antigen interaction. These physiological effects include, among other substances, the release of chemotactic factors, C4, D4 and E4 to histamine, serotonin, heparin, eosin-loving leukocytes and / or leukotrienes, which are bronchial smooth muscle Causes long-term contraction of cells (Hood, LE et al., Immunology (2nd edition), The Benjamin / Cumming Publishing Co., Inc. (1984)). These released substances are mediators that produce allergic symptoms caused by the binding of IgE and specific allergens. The effect of allergen appears through them. Such effects are systemic or local in nature, depending on the route by which the antigen enters the body and the pattern of IgE attachment to mast cells or basophils. Local appearance generally occurs on the epithelial surface where allergens enter the body. Systemic effects include anaphylaxis (anaphylactic shock), which is the result of IgE-basophil response to circulating (intravascular) antigens.
Cedar (Cryptomeria japonica) hay fever is one of the most serious allergic diseases in Japan. The number of patients with this disease is increasing and in some areas more than 10% of the population is affected. Attempts have been made to treat cedar pollinosis by administering cedar pollen extract to desensitize allergens. However, desensitization using cedar pollen extract has the disadvantage that it can induce anaphylaxis if used at high doses, whereas if low doses are used to avoid anaphylaxis Treatment must continue for several years to establish tolerance to the extract.
A major allergen derived from cedar pollen has been purified and is called cedar basic protein (SBP) or CryjI. This protein is reported to be a basic protein having a molecular weight of 41 to 50 kDa and a pI of 8.8. There appear to be many isoforms of this allergen due to partially different glycosylation (Yasueda et al. (1983) J. Allergy Clin. Immunol. 71: 77-86; and Taniai et al. (1988) FEBS Letters 239: 329 -332). The sequence of the first 20 amino acids at the N-terminus of CryjI and the internal sequence of 16 amino acids were determined (Taniai, supra).
A second allergen of cedar pollen, known as CryjII, having a molecular weight of approximately 37 kDa has also been reported (Sakaguchi et al. (1990) Allergy 45: 309-312). This allergen was found to have no immune cross-reactivity with CryjI. Most patients with cedar pollinosis were found to have IgE antibodies against both CryjI and CryjII, but sera from some patients reacted with CryjI or CryjII only.
In addition to desensitization of cedar pollinosis patients using low-dose cedar pollen extracts, US Pat. No. 4,939,239 issued to Matsuhashi et al. On July 3, 1990 is sensitive to cedar pollen. A desensitizing agent comprising a saccharide covalently bound to a cedar pollen allergen for desensitization of sex persons is disclosed. This desensitizer has been reported to promote the production of IgG and IgM antibodies but reduce the production of IgE antibodies that are specific for allergens and cause anaphylaxis and allergies. The allergen used in these desensitizers is preferably NH2Terminal amino acid sequence Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-X-Trp-Arg-Gly-Asp-Ser-Asn-Trp-Ala-Gln-Asn-Arg-Met-Lys-, where X is Ser , Cys, Thr or His) (SEQ ID NO: 18). Furthermore, Usui et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 74-79 is a cedar basic protein (ie, CryjI) -pullulan conjugate that induces the Arthus reaction. It was reported that it felt about 1000 times more prominent than that of the protein, and suggested that the cedar basic protein-pullulan conjugate is an excellent candidate for the desensitization treatment for cedar pollinosis.
The CryjI allergen found in Cryptomeria japonica has also been found to be cross-reactive with allergens in pollen from trees of other species including Cupressus sempervirens. Panzani etc. (Annals of Allergy57: 26-30 (1986)) reported that cross-reactivity was detected between pollen allergens of Cupressus sempervirens and Cryptomeria japonica in a skin test (RAST and RAST inhibition). The 50 kDa allergen isolated from Mountain Ceder (Juniperus sabinoides, also known as Juniperus ashei) is NH2It has the terminal sequence AspAsnProIleAsp (SEQ ID NO: 25) (Gross et al. (1978) Scand. J. Immunol.8: 437-441), the CryjI allergen NH2The same sequence as the first 5 amino acids at the end. The CryjI allergen was also found to be allergenic and cross-reactive with the following species of trees. Cupressus arizonica, Cupressus macrocarpa, Juniperus virginiana, Juniperus communis, Thuyaorientalis and Chamaecyparis obtusa.
Despite attention paid to cedar pollinosis allergens, the identification or characterization of allergens that cause adverse effects on people is very incomplete. Current desensitization treatments are long-term treatments with high-dose pollen extracts, if used with a pollen extract with the associated risk of anaphylaxis, or with low-dose pollen extracts. Includes treatments that require desensitization time.
Summary of invention
The present invention provides a nucleic acid sequence encoding Cryptomeria japonica major pollen allergen CryjI and fragments thereof. The present invention also provides isolated CryjI or at least one fragment thereof produced in a host cell transformed with a nucleic acid sequence encoding CryjI or at least one fragment thereof and a fragment of CryjI prepared synthetically.
The present invention also includes JunvI and JunsI protein allergens immunologically cross-reactive with CryjI and fragments of JunvI and JunsI (produced in host cells transformed with a nucleic acid sequence encoding JunsI or JunvI, respectively) and synthesis. Also provided are JunsI and JunvI fragments prepared by The present invention further provides nucleic acid sequences encoding JunvI and JunsI and fragments thereof. As used herein, a fragment of a nucleic acid sequence encoding the complete amino acid sequence of CryjI, JunsI or JunvI is less than a nucleic acid sequence encoding the complete amino acid sequence of CryjI, JunsI or JunvI and / or mature CryjI, JunsI or JunvI A nucleic acid sequence having a base. CryjI, JunsI or JunvI and fragments thereof to diagnose, treat and prevent hay fever caused by cedar pollinosis and pollen from trees of other species that are immunologically cross-reactive with cedar pollen allergens Useful for.
Peptides within the scope of this invention preferably comprise at least one T cell epitope of CryjI, more preferably at least two T cell epitopes. The invention further provides a peptide comprising at least two regions, each region comprising at least one T cell epitope of a cedar pollen protein allergen. The invention also has modified peptides that have the same or increased therapeutic properties as the corresponding natural allergens or portions thereof, but have reduced side effects, and improved properties such as increased solubility and stability. Modified peptides are also provided. The peptides of this invention can be used in individuals who are hypersensitive to cedar pollen or individuals who are hypersensitive to cedar pollen and cross-reactive allergens (eg, JunsI or allergen). Can regulate the individual's allergic response to JunvI). Also provided are methods of treating or diagnosing susceptibility to cedar pollen or cross-reactive allergens in an individual and therapeutic compositions comprising one or more peptides of this invention. The invention is described in more detail in the claims and preferred embodiments thereof are described in the following description.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1a is a graphical representation of CryjI affinity purified on Superdex 75 (2.6 per 60 cm) equilibrated with 10 mM sodium acetate (pH 5.0) and 0.15 M NaCl.
FIG. 1b shows an SDS-PAGE (12.5%) analysis of the fractions from the main peak shown in FIG. 1a.
FIG. 2 shows a Western blot of an isoform of a natural CryjI protein separated by SDS-PAGE and purified using mAB CBF2 as a probe.
FIG. 3 is a graphical representation of allergic serum titration of various purified fractions of purified native CryjI using plasma from a pool of 15 allergic patients.
Figures 4a-b show composite nucleic acid sequences from two overlapping clones JC71.6 and pUC19JC91a encoding CryjI. The complete cDNA sequence for CryjI consists of 1312 nucleotides, including an open reading frame beginning with the codon for 66 nucleotides, 1122 nucleotide starting methionine of the 5 'untranslated sequence and a 3' untranslated region. Figures 4a-b also show the deduced amino acid amino acid sequence of CryjI.
FIG. 5a is a graphical representation of the results of an IgE binding reaction in which the coated antigen is a soluble pollen extract (SPE) from cedar pollen.
FIG. 5b is a graphical representation of the results of an IgE binding reaction in which the coated antigen is native CryjI purified.
FIG. 6 is a graphical representation of the results of a competitive ELISA using pooled human plasma (PHP) from 15 patients whose coated antigen is soluble pollen extract (SPE) from cedar pollen.
FIG. 7 shows the results of a competitive ELISA using plasma from individual patients (indicated by patient number) where the coated antigen is soluble pollen extract (SPE) from cedar pollen and the competitive antigen is purified natural CryjI. It is a graph display.
FIG. 8a is a graphical representation of the results of a direct binding ELISA using plasma from 7 individual patients (indicated by patient number) where the coated antigen is soluble pollen extract (SPE) from cedar pollen.
FIG. 8b shows direct binding with plasma from 7 individual patients (denoted by patient number), a denatured soluble pollen extract whose coating antigen has been denatured by boiling in the presence of the reducing agent DTT. It is a graph display of the result of ELISA.
FIG. 9 is a graphic representation of a direct ELISA where wells were coated with recombinant CryjI (rCryjI) and IgE binding was assayed in individual patients.
FIG. 10a shows the results of a capture ELISA using pooled human plasma from 15 patients, where the wells were coated with CBF2 (IgG) mAb, PBS was used as a negative antigen control and the antigen was purified CryjI. It is a graph display.
FIG. 10b is a graph of the results of a capture ELISA using rabbit anti-Amb a I and II, where the wells were coated with 20 μg / ml CBF2 (IgG), PBS was used as a negative antigen control, and the antigen was purified CryjI. It is a display.
FIG. 11 is a graphical representation of a histamine release assay performed on cedar pollen allergic patients using SPE from cedar pollen, purified natural CryjI and recombinant CryjI as additional antigens.
FIG. 12 is a graphical representation of the results of a T cell proliferation assay using blood from a 999 patient whose antigen is recombinant CryjI protein, purified natural CryjI protein or selected CryjI peptide, recombinant Amb a 1.1. It is.
FIG. 13 shows various peptides of the desired length derived from CryjI.
FIG. 14 shows T cell line responses (positive) from 25 patients, induced in vitro with purified native CryjI and analyzed by percent response for responses to various CryjI peptides. . Graphic representation depicting I (shown above each bar), mean stimulus index of positive responses to this peptide (shown in parentheses above each bar) and positiveness index (Y axis).
FIG. 15 is a graphical representation of the results of an IgE direct binding assay for a CryjI protein, purified native CryjI and rCryjI.
FIG. 16 shows the nucleotide sequence of JunsI (SEQ ID NO: 94). This sequence is a composite from two overlapping cDNA clones pUC19JS42e and pUC19JS45a and a full-length clone JS53iib encoding JunsI. The complete cDNA for JunsI consists of 1170 nucleotides, including 25 nucleotides of 5 'untranslated sequence, 1,101 nucleotides open reading frame and 3' untranslated region. FIG. 16 also shows the deduced amino acid sequence of JunsI (SEQ ID NO: 95).
FIG. 17 shows the nucleotide sequence of JunvI (SEQ ID NO: 96). This sequence is a composite from two overlapping cDNA clones pUC19JV46a and pUC19JV49iia encoding JunvI. The complete cDNA sequence for JunvI consists of 1278 nucleotides, including 35 nucleotides of 5 'untranslated sequence, 1,101 nucleotide open reading frame and 3' untranslated region. FIG. 17 also shows the deduced amino acid sequence of JunvI (SEQ ID NO: 97).
FIG. 18 shows various peptides of the desired length derived from CryjI.
Figures 19a and 19b show Northern blots of pollen-derived RNA probed with Cryj cDNA for identification of mRNAs that can encode CryjI or CryjI homologues. FIG. 19a shows RNA from C. japonica (USA and Japan), J. sabinoides and J. virginiana using CryjI cDNA as a probe. FIG. 19b shows RNA from J. sabinoides and C. arizonica using the same cDNA as a probe. The position of the molecular weight standard is shown in each part of the figure.
Detailed Description of the Invention
The present invention provides a nucleic acid sequence encoding CryjI (a major allergen found in cedar pollen) and a nucleic acid sequence encoding JunvI and JunsI. The nucleic acid sequence encoding CryjI preferably has the sequence shown in FIGS. 4a and 4b (SEQ ID NO: 1). The nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoding CryjI shown in FIGS. 4a and 4b contains a 21 amino acid leader sequence from base 66 to 128. This leader sequence is cleaved from the mature protein encoded by bases 129 to 1187. The deduced amino acid sequence of CryjI is also shown in FIGS. 4a and 4b (SEQ ID NO: 2). The nucleic acid sequence of this invention encodes a protein with the expected molecular weight of 38.5 kDa, pI7.8 and a potential N-linked glycosylation site. Utilization of these glycosylation sites increases the molecular weight and affects the pi of the mature protein. The deduced amino acid sequence for the mature protein encoded by the nucleic acid sequence of this invention is the known NH sequence reported by Taniai et al. (Supra).2It is the same as the terminal and internal amino acid sequences. CryjI's NH reported by Taniai et al.2The end has the sequence shown in SEQ ID NO: 18. The internal sequence reported by Taniai et al. (Supra) has the sequence GluAlaPheAsnValGluAsnGlyAsnAlaThrProGlnLeuThrLys (SEQ ID NO: 19). Sequence polymorphisms are observed in the nucleic acid sequences of this invention. For example, substitution of one independent nucleotide in the codons encoding amino acids 38, 51 and 74 of SEQ ID NO: 1 (GGA vs. GAA, GTG vs. GCG, and GGG vs. GAG, respectively) are amino acid polymorphisms at these sites ( G vs E, V vs A and G vs E), respectively. Furthermore, a single nucleotide substitution was detected in one cDNA clone derived from Cryptomeria japonica pollen collected in Japan. This substitution at the codon for amino acid 60 of SEQ ID NO: 1 (TAT vs. CAT) can result in an amino acid polymorphism (Y vs. H) at this site. Additional silent nucleotide substitutions were detected. It is expected that additional sequence polymorphisms will exist and one or more nucleotides (up to 1% of the nucleotides) in the nucleic acid sequence encoding CryjI may vary between individual Cryptomeria japonicas due to natural allelic changes. It will be appreciated by those skilled in the art that it can vary. Any and all such nucleotide changes and resulting amino acid polymorphisms are within the scope of this invention. In addition, there may be one or more CryjI family members. Such family members are defined as proteins that are related to CryjI in function and amino acid sequence but encoded by distinct loci.
Fragments of nucleic acid sequences that encode fragments of CryjI or a cross-reactive allergen are also within the scope of this invention. Fragments within the scope of the present invention include CryjI or cross-reactive allergens such as those encoding portions of JunvI or JunsI that elicit an immune response in mammals, preferably humans (stimulation of minimal amounts of IgE; IgE binding; induction of IgG and IgM antibody production; or induction of T cell responses such as proliferation and / or lymphokine secretion and / or induction of T cell anergy, etc.). The aforementioned CryjI fragment is referred to herein as an antigenic fragment. Fragments within the scope of this invention also include those that can hybridize with nucleic acids from other plant species for use in screening protocols that detect allergens that are cross-reactive with CryjI. As used herein, a fragment of a nucleic acid sequence encoding CryjI refers to a nucleic acid sequence having fewer bases than the nucleic acid sequence encoding the complete amino acid sequence of CryjI and / or mature CryjI. In general, the nucleic acid sequence encoding the fragment of CryjI is selected from the bases encoding the mature protein. In some cases, all or part of the fragment from the leader sequence portion of the nucleic acid sequence of the present invention may be selected. desirable. The nucleic acid sequences of this invention also include linker sequences, modified restriction endonuclease sites and other sequences useful for cloning, expression or purification of CryjI or fragments thereof.
Nucleic acid sequences encoding CryjI can be obtained from Cryptomeria japonica plants. However, Applicants have found that mRNA encoding CryjI cannot be obtained from commercially available Cryptomeria japonica pollen. The inability to obtain mRNA from this pollen may be due to problems with storage or transportation of commercial pollen. Applicants have found that cones with fresh pollen and stamens are a good source of CryjI mRNA. Cryptomeria japonica is a well-known species of cedar and plant material can be obtained from wild, cultivated or ornamental plants. The nucleic acid sequence encoding CryjI can be obtained using the methods disclosed herein or any other suitable method for gene isolation and cloning. The nucleic acid sequence of this invention may be DNA or RNA.
The present invention provides expression vectors and transformed host cells for expressing the nucleic acid sequences of this invention. Expression of a nucleic acid sequence encoding CryjI, JunvI or JunsI or at least one fragment thereof in bacterial cells such as E. coli, insect cells (baculovirus), yeast, or mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) It can be made. Suitable expression vectors, promoters, enhancers and other expression control elements can be found in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). . Other suitable expression vectors, promoters, enhancers and other expression elements are known to those skilled in the art. Expression in mammalian, yeast or insect cells leads to partial or complete glycosylation of the recombinant material and formation of interchain or intrachain disulfide bonds. Suitable vectors for expression in yeast are YepSec1 (Baldari et al. (1987) Embo J.6: 229-234); pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell30: 933-943); JRY88 (Schultz et al. (1987) Gene54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation California, San Diego). These vectors are freely available. Baculovirus and mammalian expression systems are also available. For example, the baculovirus system is commercially available for expression in insect cells (California, San Diego, PharMingen), while the pMSG vector is commercially available for expression in mammalian cells. (New Jersey, Piscataway, Pharmacia).
For expression in E. coli, suitable expression vectors include pTRC (Amann et al. (1988) Gene, among others.69: 301-315); pGEX (Amrad Corp., Australia); pMAL (Massachusetts, Beverly, NEBiolabs); pRIT5 (New Jersey, Piscataway, Pharmacia); pET-11d (Wisconsin, Madison, Novagen) Jameel et al. (1990) J. Virol. 64: 3963-3966; and pSEM (Knapp et al. (1990) BioTechniques8: 280-281). For example, the use of pTRC and pET-11d leads to the expression of unfused proteins. Use of pMAL, pRIT5, pSEM and pGEX leads to the expression of allergens fused to maltose E binding protein (pMAL), protein A (pRIT5), truncated β-galactosidase (PSEM) or glutathione S-transferase (pGEX). Will. When the CryjI fragment or a fragment thereof is expressed as a fusion protein, it is particularly advantageous to introduce an enzyme cleavage site at the fusion point between the carrier protein and CryjI or a fragment thereof. CryjI or a fragment thereof can then be recovered from the fusion protein by enzymatic cleavage at the enzyme site and biochemical purification using conventional techniques for protein and peptide purification. Suitable enzyme cleavage sites include those for blood clotting factor Xa or thrombin, suitable enzymes for which can be obtained from, for example, Missouri, St. Louis, Sigma Chemical Company and Massachusetts, Beverly, NEBiolabs. I can do it. Various vectors are inducible using constitutive expression or eg IPTG induction (PRTCAmann et al. (1988) supra; pET-11d, Wisconsin, Madison, Novagen) or temperature induction (pRIT5, New Jersey, Piscataway, Pharmacia) It has various promoter regions that allow proper expression. It may also be appropriate to express recombinant CryjI in a variety of E. coli hosts that have altered ability to degrade recombinantly expressed proteins (eg, US Pat. No. 4,758,512). Alternatively, it may be advantageous to alter the nucleic acid sequence to use codons preferentially utilized by E. coli (wherein such nucleic acid changes do not affect the expressed amino acid sequence). is there).
Host cells can be transformed to express the nucleic acid sequences of the invention using conventional techniques such as calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran mediated transfection, or electroporation. Suitable methods for transforming host cells can be found in Sambrook et al., Supra and other laboratory texts.
The nucleic acid sequences of this invention can also be synthesized using standard techniques.
The present invention also provides a method for producing an isolated cedar pollen allergen CryjI or at least one fragment thereof, which comprises suitable host cells transformed with a nucleic acid sequence encoding the cedar pollen allergen CryjI or at least one fragment thereof. Producing a mixture of cells and medium containing said cedar pollen allergen CryjI or at least one fragment thereof; and purifying the mixture to obtain substantially pure cedar pollen allergen CryjI or at least one fragment thereof. A step of generating. A host cell transformed with an expression vector containing DNA encoding CryjI or at least one fragment thereof is cultured in a medium suitable for the host cell. CryjI proteins and peptides use known techniques for purifying peptides or proteins, including ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ultrafiltration, electrophoresis and immunopurification using antibodies specific for CryjI or fragments thereof. And purified from cell culture media, host cells, or both. The terms isolated and purified herein are interchangeable and are substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology, or when chemically synthesized. Refers to peptides, proteins, protein fragments and nucleic acid sequences that are substantially free of chemical precursors or other chemicals.
Another aspect of the present invention is a host cell transformed with a cedar pollen allergen CryjI or a cross-reactive allergen such as JunvI or JunsI or at least one fragment thereof (cedar pollen allergen CryjI or a nucleic acid sequence encoding such a cross-reactive allergen Synthesized or chemically synthesized) and isolated cedar pollen allergen CryjI protein or cross-reactive allergen such as JunvI or JunsI or at least one antigenic fragment thereof (in the nucleic acid sequence of the present invention) Preparations containing those produced in transformed host cells or chemically synthesized) are provided. In a preferred embodiment of this invention, the CryjI protein is produced in a host cell transformed with at least a nucleic acid sequence encoding a mature CryjI protein.
An antigenic fragment as defined herein refers to any protein fragment or peptide that elicits an immune response. The unique antigenic fragment defined here refers to any antigenic fragment derived from CryjI, but excludes the fragment consisting of amino acids 1-20 or 325-340 shown in FIGS. An allergen from cedar pollen or an antigenic fragment of a cross-reactive allergen such as JunvI or JunsI is produced, for example, recombinantly from the corresponding fragment of the nucleic acid sequence of this invention encoding such a peptide or using known techniques It can be obtained by screening chemically synthesized peptides. The allergen can be freely divided into fragments of a desired length that do not have overlapping peptides, but preferably can be divided into overlapping fragments of a desired length. These fragments are tested to determine their antigenicity (eg, the ability of the fragments to elicit an immune response). If a fragment of CryjI is used for therapeutic purposes, a fragment of CryjI allergen that can elicit a T cell response (ie, proliferation or lymphokine secretion) such as a stimulus and / or induce T cell anergy is Particularly desirable is also a piece of cedar pollen that has minimal IgE stimulating activity. Minimal IgE stimulating activity refers to IgE stimulating activity that is less than the amount of IgE production stimulated by the natural CryjI protein. Furthermore, for therapeutic purposes, a T cell response can be elicited and does not bind to cedar pollen-specific IgE or is substantially less than purified natural cedar pollen allergens bind to such IgE. It is preferred to use an isolated cedar pollen allergen such as CryjI or a fragment thereof that binds to such IgE to some extent. If the isolated cedar pollen allergen or fragment thereof binds to IgE, it is desirable that such binding does not result in the release of mediators (eg, histamine) from mast cells or basophils. Furthermore, if JunvI or JunsI is used for therapeutic purposes, it can elicit a T cell response and does not bind to pollen-specific IgE from Juniperus species or such purified Iguniperus pollen allergen. It is desirable to use a Juniperus pollen allergen, such as JunvI or JunsI, or fragments thereof, that binds to such IgE to a substantially lower extent than it binds. If the isolated JunvI or JunsI or a fragment thereof binds IgE, it is preferred that such binding does not result in the release of mediators (eg histamine) from mast cells or basophils.
A protein allergen isolated from cedar pollen, or a suitable antigenic fragment thereof, is administered to individuals who are allergic to cedar pollen-sensitive individuals or allergic to cedar pollen allergens such as Juniperus virginiana or Juniperus sabinoides (described above) The allergic response to the individual's cedar pollen or such a cross-reactive allergen, preferably the individual's B cell response, T cell response or both B cells and T cells to that allergen. The response can be adjusted. As used herein, modulation of an individual's allergic response that is susceptible to cedar pollen or cross-reactive allergens can be defined as non-responsiveness or reduced symptoms to allergens as measured by standard clinical procedures (e.g. , Varney et al., British Medical Journal,302: 265-269 (1990)) (including reduction of cedar pollen-induced asthma symptoms). As used herein, a reduction in symptoms includes a reduction in any allergic response to an allergen after an individual has completed treatment management with a peptide or protein of the invention. This reduction can be subjective (ie, the patient only needs to feel more comfortable in the presence of the allergen). Symptom reduction can also be measured clinically using known standard skin tests.
The isolated CryjI protein or fragment thereof, preferably, Tamura et al. (1986) Microbiol. Immunol.30In mammalian models of cedar pollen, such as the mouse model disclosed in U.S. Pat. No. 4,883-896 or U.S. Pat. No. 4,939,239, or Chiba et al. (1990) Int. Arch. Allergy Immunol.93Tested in the primate model disclosed in: 83-88. Initial screening for IgE binding to proteins or fragments thereof can be by scratch or intradermal skin tests on laboratory animals or human volunteers or by RAST (Radioallergen Adsorption Test), RAST inhibition, ELISA assay, radioimmunoassay (RIA) Alternatively, histamine release (see Examples 7 and 8) can be used.
Antigenic fragments of the present invention that have T cell stimulating activity and thus contain at least one T cell epitope are particularly desirable. T cell epitopes are thought to be involved in the initiation and persistence of immune responses to protein allergens that cause clinical symptoms of allergies. These T cell epitopes are thought to trigger early events at the level of helper T cells by binding to appropriate HLA molecules on the surface of antigen presenting cells and stimulating relevant T cell subpopulations. These events lead to activation of the B cell cascade leading to T cell proliferation, lymphokine secretion, local inflammatory response, recruitment of additional immune cells to that site and antibody production. One isoform of these antibodies, IgE, is fundamentally important in the development of allergic symptoms, and its production is influenced by the nature of the secreted lymphokine at the level of helper T cells, early in the cascade of events. Receive. A T cell epitope is a basic element or the smallest unit of recognition by a T cell receptor, and this epitope contains amino acids essential for receptor recognition. Amino acid sequences that mimic the amino acid sequence of T cell epitopes and amino acid sequences that regulate allergic responses to protein allergens are within the scope of this invention.
Exposure of cedar pollen patients to an isolated protein allergen of the present invention or an antigenic fragment of the present invention (containing at least one T cell epitope and derived from a protein allergen) tolerates appropriate T cell subpopulations Or reduced in immunity, making them unresponsive to protein allergens and not exposed to stimulation of the immune response when exposed in this way. Furthermore, administration of a protein allergen of this invention or antigenic fragment of this invention comprising at least one T cell epitope can modulate the lymphokine secretion profile as compared to exposure to a native protein allergen or portion thereof ( For example, it results in a decrease in IL-4 and / or an increase in IL-2). Furthermore, exposure to such protein allergens or antigenic fragments of such protein allergens affects T cell subpopulations that are normally involved in the response to that allergen, such that the sites where these T cells are normally exposed to that allergen ( For example, it can be directed away from the nasal mucosa, skin, and lungs) toward the therapeutic fragment or protein allergen administration site. This redistribution of T cell subpopulations improves or reduces the patient's immune system's ability to stimulate a normal immune response at sites normally exposed to allergens, resulting in a reduction in allergic symptoms.
The isolated CryjI, JunvI or JunsI protein and fragments or portions (peptides) derived therefrom can be used in methods for diagnosing, treating and preventing allergic reactions to cedar pollen allergens or cross-reactive protein allergens. Accordingly, the present invention is an isolated cedar pollen allergen CryjI, JunvI or JunsI or at least one fragment thereof (produced in a host cell transformed to express CryjI, JunvI or JunsI or at least one fragment thereof) And a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The therapeutic composition of the present invention may also comprise synthetically prepared CryjI, JunvI or JunsI or at least one fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Administration of the therapeutic composition of the present invention to the individual to be desensitized can be performed using known techniques. CryjI, JunvI or JunsI proteins or at least one fragment thereof can be administered to an individual in combination with, for example, a suitable diluent, carrier and / or adjuvant. Pharmaceutically acceptable diluents include salt solutions and aqueous buffer solutions. Pharmaceutically acceptable carriers are polyethylene glycol (Wie et al. (1981) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.64: 84-99) and liposomes (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol7: 27). For purposes of inducing T cell anergy, the therapeutic composition is preferably administered in a non-immunogenic form (eg, without an adjuvant). The therapeutic composition of this invention is administered to individuals sensitive to cedar pollen or individuals sensitive to allergens immunologically cross-reactive with cedar pollen allergens (ie, Juniperus virginiana or Juniperus sabinoides).
Administration of the therapeutic composition of the present invention to an individual to be desensitized follows known procedures at a dosage and for a period sufficient to reduce the individual's sensitivity to allergens (ie, reduce the allergic response). Can be used. The effective amount of the therapeutic composition will vary depending on factors such as the degree of sensitivity of the patient to cedar pollen, age, sex and weight, and the ability of the protein or fragment thereof to elicit an antigenic response in the individual.
This active compound (ie, protein or fragment thereof) can be administered by a convenient method such as injection (subcutaneous, intravenous injection, etc.), oral administration, inhalation, transdermal administration and the like. Depending on the route of administration, the active compound can be coated with substances to protect it from enzymes, acids and other natural conditions that can inactivate the compound.
For example, preferably about 1 μg to 3 mg, more preferably about 20 to 500 μg of active compound (ie protein or fragment thereof) can be administered by injection per dosage unit. Dosage management can be adjusted to provide the optimum therapeutic response. For example, several divided doses can be administered daily, or the dose can be reduced in response to an urgent indication of the treatment situation.
In order to administer a protein or peptide by a method other than parenteral administration, it may be necessary to coat (or co-administer with) the protein with a substance that prevents its inactivation. For example, the protein or fragment thereof can be administered in an adjuvant, or co-administered with an enzyme inhibitor or in a liposome. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropyl fluorophosphate (DEP) and trasilol. Liposomes include water-in-oil-in-water CGF emulsions as well as conventional liposomes (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol.7: 27).
The active compound can also be administered parenterally or intraperitoneally. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycol and mixtures thereof and in oils. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations can contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
Pharmaceutical compositions suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions or sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile dispersed injectable solutions. In all cases, the composition must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contamination of microorganisms such as bacteria and mold. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lysine, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thermolase, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol and sorbitol, or sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compound (ie, protein or peptide) in the required amount in the appropriate solvent with one or a combination of the above ingredients if necessary and then sterile filtered. I can do it. Generally, dispersions can be prepared by incorporating them into a sterile vehicle that contains the active compound, a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of a sterile powder for the preparation of a sterile injectable solution, the preferred method of preparation is the active ingredient (ie protein or peptide) plus any desired additional ingredients from a previously sterile filtered solution Vacuum drying and lyophilization to produce a powder.
If the protein or peptide thereof is appropriately protected as described above, the protein can be orally administered, for example, with an inert diluent or an assimilable edible carrier. The protein and other ingredients can also be enclosed in hard or soft shell gelatin capsules, compressed into tablets, or incorporated directly into the individual's diet. For oral therapeutic administration, the active compound can be used in the form of tablets, mouth tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. that can be ingested with excipients incorporated . Such compositions and preparations should contain at least 1% by weight of active compound. Of course, the percentages of the composition and formulation can vary, with about 5 to 80 wt% units being convenient. The amount of active compound in such therapeutically useful compositions is such that a suitable dosage will be obtained. Preferred compositions or preparations according to the present invention are prepared so that an oral dosage unit contains between about 10 μg and 200 mg of active compound.
Tablets, troches, pills, capsules and the like may also include: Binders such as gum gragacanth, acacia, corn starch or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, dispersants such as corn starch, potato starch, alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sucrose, lactose or saccharin Sweeteners such as peppermint, winter green oil or cherries. Where the dosage unit form is a capsule, it can contain, in addition to a substance of the above type, a liquid carrier. Various other materials may be present as coatings or to change the physical form of the dosage unit. For instance, tablets, pills, or capsules can be coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a dye and a flavor such as cherry or orange flavor. Of course, any material used in preparing any dosage unit form should be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compound can be incorporated into sustained-release preparations and formulations.
As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known to those skilled in the art. As long as any conventional medium or agent is not incompatible with the active compound, its use in therapeutic compositions is contemplated. Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.
It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit, as used herein, refers to a physically distinct unit appropriate for the unit dosage for the mammalian patient being treated (each unit being calculated and predetermined to produce the desired therapeutic effect). Amount of active compound together with the required pharmaceutical carrier). The specifications for the new dosage unit form of this invention are in (a) the unique nature of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved, and (b) the technology for mixing such active compounds for the treatment of individual sensitivity. Directed by and inherently dependent on intrinsic limitations.
CryjI cDNA (or the mRNA from which it was transcribed) or a portion thereof can be used to identify similar sequences in any kind or type of plant and thus hybridize to CryjI cDNA or mRNA or parts thereof. Sequences with sufficient homology to soy (eg, DNA from allergens such as Juniperus virginiana, Juniperus sabinoides, etc.) can be identified or “drawn” under low stringency conditions. Sequences with sufficient homology thereof (generally greater than 40%) can be selected for further evaluation using the methods described herein. Alternatively, high stringency conditions can be used. In this method, the DNA of the present invention is used to have an amino acid sequence similar to the amino acid sequence of the cedar pollen allergen CryjI in other types of plants, preferably related families, genera or species (eg, Juniperus or Cupressus) The sequence encoding the polypeptide can be identified and therefore allergens in other species can be identified. Thus, the present invention not only includes CryjI, but also includes other allergens encoded by DNA that hybridizes to the DNA of the present invention. The present invention further includes isolated allergenic proteins or fragments thereof, which are antibody cross-reactive (isolated allergenic proteins or fragments thereof bind to antibodies specific for the proteins and peptides of this invention. CryjI immunologically by T cell cross-reaction (isolated allergenic proteins or fragments thereof can stimulate T cells specific for the proteins and peptides of this invention), etc. Or is associated with a fragment thereof.
The protein or peptide encoded by the cDNA of the present invention can be used, for example, as a “purified” allergen. Such purified allergens are useful in standardizing allergen extracts, which are key reagents for the diagnosis and treatment of cedar pollinosis. Furthermore, by using peptides based on the CryjI nucleic acid sequence, anti-peptide antibodies or monoclonal antibodies can be made using standard methods. For example, animals such as mice or rabbits can be immunized with an isolated CryjI protein immunogen (eg, an antigenic fragment capable of eliciting a CryjI protein or antibody response). Techniques for conferring immunogenicity on a protein or peptide subunit include binding to a carrier or other techniques well known to those skilled in the art. CryjI protein or a peptide thereof can be administered in the presence of an adjuvant. The progress of immunization can be monitored by detection of antibody titers in plasma or serum, and using a standard ELISA or other immunoassay using this immunogen as an antigen to assess antibody levels. I can do it.
After immunization, an anti-CryjI antiserum can be obtained and, if desired, a polyclonal anti-CryjI antibody can be obtained from the serum. To produce monoclonal antibodies, antibody-producing cells (lymphocytes) are collected from the immunized animal and fused by standard somatic cell fusion procedures using immortalized cells such as myeloma cells to produce hybridoma cells. I can do it. Hybridoma cells can be screened immunochemically for the production of antibodies reactive with the CryjI protein or peptide thereof. These sera or monoclonal antibodies can be used to standardize allergen extracts.
By utilizing the peptides and proteins of the present invention, a consistent, well-defined composition and formulation with biological activity can be made and administered for therapeutic purposes (eg, for cedar sensitive individuals Such as regulating the allergic response to pollen of such trees). Administration of such peptides or proteins can modulate, for example, a B cell response to the CryjI allergen, a T cell response to the CryjI allergen, or both responses. The isolated peptides can also be used to study the mechanism of immunotherapy of Cryptomeria japonica allergy and to design modified derivatives or analogs useful in immunotherapy.
Other people's work has generally shown that high doses of allergens produce the best results (ie, maximum symptom relief). However, many people cannot tolerate large doses of allergens due to allergic reactions to allergens. Modification of a natural allergen in such a way that a modified peptide or modified allergen having the same or increased therapeutic properties as the corresponding natural allergen but with reduced side effects (especially an anaphylactic reaction) is produced. Can be designed. These may be, for example, the protein or peptide of the present invention (for example, having all or part of the amino acid sequence of CryjI), a modified protein or peptide, or an analog of the protein or peptide.
Increase solubility, therapeutic or prophylactic effects or stability (eg in vitro shelf life andIn vivoIt is also possible to modify the structure of the peptide of the present invention for the purpose of increasing the resistance to proteolysis in the present invention. Generate modified peptides with altered amino acid sequence by amino acid substitutions, deletions or additions, or added components for the same purpose to alter immunogenicity and / or reduce allergenicity I can do it.
For example, peptides can be modified to maintain the ability to induce T cell anergy and bind to MHC proteins without the ability to induce a strong proliferative response, and the proliferative response when administered in immunogenic form. . In this case, critical binding residues for the T cell receptor can be determined using known techniques (eg, substitution of each residue and measurement of the presence or absence of T cell reactivity). Those residues that have been shown to be essential for interaction with the T cell receptor, reduce the essential amino acids, preferably their presence, increase T cell reactivity, but not remove them, or It can be modified by substitution (conservative substitution) with a similar amino acid residue that does not affect the reactivity. In addition, amino acid residues that are not essential for T cell receptor interaction are replaced by other amino acids whose uptake increases, decreases or does not affect the reactivity but remove the binding to the associated MHC. Can be modified.
In addition, the peptides of this invention may reduce other but preferably the presence of amino acids that have been shown to be essential for interaction with the MHC protein complex, but their presence increases T cell activity, but does not eliminate them, or Modifications can be made by substitution (conservative substitution) with similar amino acid residues that have been shown not to affect the activity. In addition, amino acid residues that are not essential for interaction with the MHC protein complex, but still bind to the MHC protein complex, uptake increases T cell reactivity and does not affect or eliminate but reduce other amino acid residues. It can be modified by substitution with an amino acid. Suitable amino acid substitutions for non-essential amino acids include, but are not limited to, substitution with alanine, glutamic acid or methyl amino acid.
To increase stability and / or reactivity, the protein or peptide of this invention can be modified to incorporate one or more polymorphisms resulting from natural allelic changes into the amino acid sequence of the protein allergen. . Furthermore, D amino acids, unnatural amino acids or non-amino acid analogs can be substituted or added to produce modified proteins or peptides within the scope of this invention. Furthermore, the protein or peptide of the present invention can be modified using the polyethylene glycol (PEG) method of A. Sehon and collaborators (Wie et al., Supra) to produce a protein or peptide bound to PEG. . Furthermore, PEG can be added during chemical synthesis of the protein or peptide of the invention. Modification of proteins or peptides or portions thereof is also reduced / alkylated (in Tarr, Methods of Protein Microcharacterization, edited by JESilver, Humana Press, Clifton, NJ, pages 155-194 (1986)); acylation (Tarr Chemical coupling to an appropriate carrier (Edited by Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980); US Pat. No. 4,939,239); Formalin treatment (Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology,41: 199-215 (1971)).
In order to facilitate the purification of the proteins and peptides of this invention and potentially increase solubility, reporter groups can be added to the backbone of the peptides. For example, polyhistidine can be added to a peptide and the peptide can be purified by immobilized metal ion affinity chromatography (Hochuli, E. et al., Bio / Technology, 6: 1321-1325 (1988)). In addition, a specific endoprotease cleavage site can be introduced between the reporter group and the amino acid sequence of the peptide, if desired, to facilitate isolation of the peptide without irrelevant sequences. In order to successfully desensitize an individual to a protein antigen, the solubility of the protein or peptide can be determined by adding functional groups to the peptide or by hydrophobic T cell epitopes or hydrophobic epitopes in these peptides. It may be necessary to increase by not including the region containing or the hydrophobic region of this protein or peptide.
Standard protease sensitive sites can be engineered either recombinantly or synthetically between regions each containing at least one T cell epitope to potentially assist in proper antigen processing of T cell epitopes within the peptide. . For example, charged amino acid pairs such as KK or RR can be introduced between regions within a peptide during recombinant construction of the peptide. The resulting peptide can be made sensitive to cathepsin and / or other trypsin-like enzyme cleavage to produce portions of the peptide that contain one or more T cell epitopes. Furthermore, such charged amino acid residues can cause an increase in peptide solubility.
The structure of the peptide or protein can be modified by a known method using a site-directed mutagenesis method for DNA encoding the peptide or protein (for example, CryjI or a fragment thereof) of the present invention. Such methods include, among other methods, degenerate oligonucleotides (Ho et al., Gene,77: 51-59 (1989)) or a fully synthetic mutant gene (Hostomsky, Z. et al., Biochem. Biophys, Res. Comm.,161: 1056-1063 (1989)). In order to promote the expression in bacteria, the above-mentioned method is used together with other procedures to change the eukaryotic codon in the DNA construct encoding the protein or peptide of the present invention into E. coli, yeast, mammalian cells. Or it can be changed to those preferentially used in other eukaryotic cells.
Using the structural information currently available, it is possible to design CryjI peptides that modulate the individual's allergic response to cedar pollen when administered in sufficient amounts to individuals susceptible to cedar pollen. This can be done, for example, by examining the structure of CryjI and generating peptides (by expression systems, synthetically or otherwise) to be tested for their ability to affect B cell and / or T cell responses in individuals susceptible to cedar pollen. And by selecting an appropriate peptide containing an epitope recognized by those cells. When referring to an epitope, the epitope is the basic element or unit of recognition by receptors, particularly immunoglobulins, histocompatibility antigens, and T cell receptors, which include amino acids essential for receptor recognition. Amino acid sequences that mimic the amino acid sequences of these epitopes and sequences that can down regulate the allergic response to CryjI can also be utilized.
It is now possible to design drugs or drugs that can block or block the ability of cedar pollen allergens to induce allergic reactions in individuals susceptible to cedar pollen. Such agents can be designed, for example, in such a way as to bind to their associated anti-CryjI IgE and thus prevent IgE-allergen binding and subsequent mast cell degranulation. Alternatively, such agents can bind to cellular components of the immune system, resulting in suppression or desensitization of the allergic response to Cryptomeria japonica pollen allergen. A non-limiting example of this is the use of appropriate B and T cell epitope peptides or their modifications based on the cDNA / protein structures of the present invention that suppress allergic responses to cedar pollen. This can be done by limiting the structure of B and T cell epitope peptides that affect B and T cell function in in vitro studies using blood components from individuals susceptible to cedar pollen.
The protein, peptide or antibody of the present invention can also be used to detect and diagnose cedar pollinosis. For example, this may involve blood or blood products obtained from an individual to be assessed for susceptibility to cedar pollen, an isolated antigenic peptide or CryjI peptide, or an isolated CryjI protein and a blood component (eg, antibody, T cells and B cells) can be combined under conditions suitable for the binding of the peptide or protein, and the degree of such binding can be measured.
The present invention also includes culturing a host cell comprising an expression vector comprising a nucleic acid sequence (eg, DNA) encoding all or at least one fragment of CryjI under conditions suitable for expression of CryjI or at least one fragment thereof. Also provided is a method of generating CryjI or a fragment thereof comprising The expressed product is then recovered using known techniques. Alternatively, CryjI or a fragment thereof can be synthesized using known mechanical or chemical techniques.
The DNA used in any embodiment of this invention is a cDNA obtained as described herein, or any oligodeoxynucleotide sequence having all or part of the sequence indicated herein, or They may be their functional equivalents. Such oligodeoxynucleotide sequences can be generated chemically or enzymatically using known techniques. A functional equivalent of an oligonucleotide sequence is 1) a sequence that can hybridize to a complementary oligonucleotide to which the sequence of SEQ ID NO: 1 (or corresponding sequence portion) or a fragment thereof hybridizes, or 2) complementary to SEQ ID NO: 1. A sequence (or corresponding sequence portion) and / or 3) a product (eg, a polypeptide or peptide) having the same functional properties as the product encoded by the sequence of SEQ ID NO: 1 (or the corresponding sequence portion) Is a sequence encoding Whether a functional equivalent must meet one or both criteria depends on its use (eg, if it is used only as an oligo probe, it is either first or second And if it is used to generate the CryjI allergen, then only the third criterion is met).
The present invention also provides an isolated peptide derived from cedar pollen protein. As used herein, a peptide or protein fragment refers to an amino acid sequence having fewer amino acid residues than the complete amino acid sequence from which it was derived. The peptides of this invention include peptides derived from CryjI that contain at least one T cell epitope of an allergen.
Also within the scope of the invention are peptides comprising at least two regions, each region containing at least one T cell epitope of cedar pollen. Isolated peptides or regions of isolated peptides, each containing at least two T cell epitopes of the cedar pollen allergen, are particularly desirable because of the increased therapeutic effect. Peptides that are immunologically related to the peptides of the invention (eg, by antibodies or by T cell cross-reactivity) are also within the scope of the invention.
Isolated peptides of this invention can be produced as described above by recombinant DNA techniques in a host cell transformed with a nucleic acid having a sequence encoding such a peptide. Isolated peptides of this invention can also be produced by chemical synthesis. With respect to an isolated JunvI protein or peptide, such protein or peptide can be produced by biochemical purification of the natural JunvI protein from Juniperus virginiana pollen by known methods. When a peptide is produced recombinantly, a host cell transformed with a nucleic acid having a sequence encoding the peptide or a functional equivalent of the nucleic acid sequence is cultured in a medium suitable for the cell, and the peptide is It can be purified from cell culture media, host cells or both using techniques known to those skilled in the art for producing peptides and proteins, including ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, It includes external filtration, electrophoresis, or immunopurification using an antibody specific for this peptide, the protein allergen cedar pollen from which the peptide is derived, or a part thereof. The isolated peptides of this invention are substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology, or are chemically precursors or other chemicals when chemically synthesized. Is substantially not included.
To obtain an isolated peptide of the present invention, CryjI is split into non-overlapping desired length peptides or overlapping desired length peptides (recombinantly or synthetically generated as discussed in Example 6). Can do). A peptide comprising at least one T cell epitope can elicit a T cell response such as T cell proliferation or lymphokine secretion and / or induce T cell anergy (ie tolerance). In order to determine peptides containing at least one T cell epitope, the isolated peptides are tested, for example, by T cell biology techniques to determine whether they induce a T cell response or induce T cell anergy. Measure whether or not. Those peptides found to elicit T cell responses or induce T cell anergy are defined as having T cell stimulating activity.
As discussed in Example 6, human T cell stimulating activity is achieved by culturing T cells obtained from individuals susceptible to cedar pollen allergens (ie, individuals having an IgE-mediated immune response to cedar pollen allergens) and, for example, It can be tested by measuring whether T cell proliferation occurs in response to the peptide as measured by incorporation of tritiated thymidine into the cell. The stimulation index for the T cell response to the peptide can be calculated as the maximum CPM in response to the peptide divided by the control CPM. A stimulation index (SI) that is more than twice the background level is considered “positive”. Positive results are used to calculate the average stimulation index for each peptide for the group of patients tested. Preferred peptides of this invention contain at least one T cell epitope and have an average T cell stimulation index of 2.0 or greater. Peptides having an average T cell stimulation index of 2.0 or greater are considered useful as therapeutic agents. Preferred peptides are at least 2.5, more preferably at least 3.5, more preferably at least 4.0, more preferably at least 5, even more preferably at least 7, most preferably at least about 9. Has an average T cell stimulation index. For example, the peptides of this invention having an average T cell stimulation index of at least 5 shown in FIG. 14 are CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1-7 (SEQ ID NO: 32), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), CJ1-32 (SEQ ID NO: 56) NO: 57) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60). For example, the peptides of this invention having an average T cell stimulation index of at least 7 shown in FIG. 14 are CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57).
Furthermore, preferred peptides have a positive index (PI) of at least about 100, more preferably at least about 250, and most preferably at least about 350. The positive index of a peptide is the mean T cell stimulation index, relative to at least 2.0 such peptides in a population of individuals susceptible to cedar pollen (eg, preferably at least 15, more preferably at least 30 or more). Determined by multiplying the percentage of individuals with a T cell stimulation index. Thus, the positive index represents both the strength of the T cell response (SI) to a peptide and the frequency of the T cell response to a peptide in a population of individuals susceptible to cedar pollen. For example, as shown in FIG. 14, peptide CJ1-22 has an average S.D. of 14.5 in the group of individuals tested. I. And a positive response of 60%, resulting in a positive index of 870.00. CryjI peptides having a positive index of at least about 100 and an average T cell stimulation index of at least about 4 are CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-20 ( SEQ ID NO: 45), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-26 (SEQ ID NO: 51) , CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-32 (SEQ ID NO: 57) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60).
In order to determine the exact T cell epitope, for example by means of a precision mapping technique, a peptide having T cell stimulating activity as measured by T cell biology techniques and thus containing at least one T cell epitope can be obtained from the peptide Are modified by addition or deletion of either amino acid or carboxy terminal amino acid residues, and the change in T cell reactivity to the modified peptide is measured. If two or more peptides sharing an overlapping region within the native protein sequence are found to have human T cell stimulating activity as measured by T cell biology techniques, all or one of such peptides Additional peptides can be generated that contain parts, and those additional peptides can be tested by similar procedures. After this technique, peptides are selected and produced by recombination or synthesis. The peptide can be expressed as the strength of the T cell response to the peptide (eg, stimulation index), the frequency of the T cell response to the peptide in a population of individuals susceptible to cedar pollen, and trees of the other species of the peptide (eg, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica, Juniperus virginiana, Juniperus sabinoides, etc.) or ragweed (Amb a I.1), based on a variety of factors including potential cross-reactivity with other allergens. The physical and chemical properties (eg, solubility, stability) of these selected peptides are tested to determine whether they are suitable for use in therapeutic compositions or whether they are Determine if modification is required as described herein. The ability of these selected peptides or selected modified peptides to stimulate human T cells (eg, induce proliferation, lymphokine secretion) is measured.
Furthermore, preferred T cell epitope-containing peptides of this invention do not bind to immunoglobulin E (IgE) or bind IgE to a substantially lower extent than the protein allergen from which the peptide was derived binds to IgE. . The main complication of standard immunotherapy is an IgE-mediated response such as anaphylaxis. Immunoglobulin E is a mediator of the anaphylactic reaction resulting from antigen binding and crosslinking to IgE on mast cells or basophils and the release of mediators (eg, histamine, serotonin, eosin chemotactic factors). Thus, anaphylaxis in a substantial percentage of the population of individuals susceptible to CryjI does not bind IgE in a substantial percentage (eg, at least 75%) of the population of individuals sensitive to CryjI allergen in immunotherapy, or IgE Such binding can be avoided by using a peptide that does not cause release of mediators from mast cells or basophils. The risk of anaphylaxis can be reduced by utilizing peptides with reduced IgE binding in immunotherapy. Furthermore, peptides with minimal IgE stimulating activity are desirable for therapeutic effects. Minimal IgE stimulating activity refers to IgE production less than the amount of IgE production and / or IL-4 production stimulated by the natural CryjI protein allergen.
When administered to an individual who is susceptible to cedar pollen, the T cell epitope-containing peptide of the present invention can regulate the allergic response to the individual's allergen. In particular, the peptides of this invention comprising at least one T cell epitope of CryjI or at least two regions derived from CryjI, each comprising at least one T cell epitope, when administered to an individual susceptible to cedar pollen The T cell response to the individual's allergen can be modulated.
Preferred isolated peptides of this invention comprise at least one T cell epitope of the cedar pollen allergen CryjI, and thus the peptide comprises at least about 7 amino acid residues. For therapeutic effect purposes, preferred therapeutic compositions of this invention preferably comprise at least two T cell epitopes of CryjI, and thus the peptide comprises at least about 8 amino acid residues, preferably at least about Contains 15 amino acid residues. Furthermore, a therapeutic composition comprising a suitable isolated peptide of the present invention is preferably that individual whose therapeutic administration to administer the composition to an individual susceptible to cedar pollen has been tolerized to the protein allergen. A sufficient percentage of the T protein epitope of the complete protein allergen so as to yield T cells. Peptides produced by the synthesis of this invention containing up to about 45 amino acid residues in length, most preferably up to about 30 amino acid residues in length, are particularly desirable because increased length makes peptide synthesis difficult. The peptides of this invention can also be produced recombinantly as described above, and peptides of 45 amino acids or more are preferably produced recombinantly.
Preferred peptides include all or part of the major T cell responsive region within the CryjI protein allergen (herein referred to as region 1, region 2, region 3, region 4 and region 5). Each major region of T cell activity is defined as described below and is shown in FIGS. Region 1 contains amino acid residues 1-50 of CryjI (SEQ ID NO: 61); Region 2 contains amino acid residues 61-120 of CryjI (SEQ ID NO: 62); Region 3 contains CryjI Region 4 contains amino acid residues 191 to 280 of CryjI (SEQ ID NO: 64); region 5 contains amino acid residues 291 to 353 of CryjI (SEQ ID NO: 65). As shown in FIGS. 4a-b, preferred major T cell responsive regions within each region are amino acid residues 1-40 (SEQ ID NO: 66); amino acid residues 81-110 (SEQ ID NO: 67). Amino acid residues 151-180 (SEQ ID NO: 68); amino acid residues 191-260 (SEQ ID NO: 69) and amino acid residues 291-330 (SEQ ID NO: 70).
Peptides derived from the CryjI protein allergen that can be used for therapeutic purposes include all or part of the following peptides: CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1- 3 (SEQ ID NO: 28), CJ1-4 (SEQ ID NO: 29), CJ1-7 (SEQ ID NO: 32), CJ1-8 (SEQ ID NO: 33), CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35), CJ1-11 (SEQ ID NO: 36), CJ1-12 (SEQ ID NO: 37), CJ1-14 (SEQ ID NO: 39), CJ1-15 (SEQ ID NO: 40), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-18 (SEQ ID NO: 43), CJ1-19 (SEQ ID NO: 44) ), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-21 (SEQ ID NO: 46), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-25 (SEQ ID NO: 50), CJ1-26 (SEQ ID NO: 51), CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-28 (SEQ ID NO: 53) ), CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), CJ1-32 (SEQ ID NO: 57), CJ1-33 (SEQ ID NO: 58), CJ1-34 ( SEQ ID NO: 59) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60) (wherein the portion of this peptide is preferably greater than or equal to the average T cell stimulation index of the peptide from which it was derived, as shown in FIG. 14) Average T cell stimulation index). More preferably, the peptide derived from the CryjI protein allergen that can be used for therapeutic purposes includes all or part of the following peptides as shown in FIG. 14: CJ1-2, CJ1-9, CJ1-10, CJ1 -16, CJ1-17, CJ1-20, CJ1-22, CJ1-23, CJ1-24, CJ1-25, CJ1-26, CJ1-27, CJ1-30, CJ1-31, CJ1-32 and CJ1-35 . Furthermore, other suitable peptides derived from the CryjI protein include the following peptides, as shown in FIG. 18: CJ1-41 (SEQ ID NO: 71), CJ1-41.1 (SEQ ID NO: 72) CJ1-41.2 (SEQ ID NO: 73), CJ1-41.3 (SEQ ID NO: 74), CJ1-42 (SEQ ID NO: 75), CJ1-42.1 (SEQ ID NO: 76) CJ1-42.2 (SEQ ID NO: 77), CJ1-43 (SEQ ID NO: 78), CJ1-43.1 (SEQ ID NO: 79), CJ1-43.6 (SEQ ID NO: 80) , CJ1-43.7 (SEQ ID NO: 81), CJ1-43.8 (SEQ ID NO: 82), CJ1-43.9 (SEQ ID NO: 83), CJ1-43.9 (SEQ ID NO: 84), CJ1-43.11 (SEQ ID NO: 85), CJ1-43.12 (SEQ ID NO: 86), CJ1-45 (SEQ ID NO: 87), CJ1-45.1 (SEQ ID NO: 88), J1-45.2 (SEQ ID NO: 89), CJ1-44 (SEQ ID NO: 90), CJ1-44.1 (SEQ ID NO: 91), CJ1-44.2 (SEQ ID NO: 92) and CJ1-44.3 (SEQ ID NO: 93). Other suitable antigenic peptides of this invention may comprise more than one region (ie, all or part of amino acids 151-352 of the amino acid sequence of CryjI shown in FIGS. 4a-b).
One embodiment of the present invention comprises at least one T cell epitope of this protein allergen and has the formula Xn-Y-ZmDescribes a peptide of CryjI or a portion thereof. According to this formula, Y represents CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1-3 (SEQ ID NO: 28), CJ1-4 (SEQ ID NO: 29) CJ1-7 (SEQ ID NO: 32), CJ1-8 (SEQ ID NO: 33), CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35), CJ1-11 (SEQ ID NO: 36), CJ1-12 (SEQ ID NO: 37), CJ1-14 (SEQ ID NO: 39), CJ1-15 (SEQ ID NO: 40), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-18 (SEQ ID NO: 43), CJ1-19 (SEQ ID NO: 44), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-21 (SEQ ID NO: 46), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-25 (SEQ ID NO: 50), CJ1 -26 (SEQ ID NO: 51), J1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-28 (SEQ ID NO: 53), CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), CJ1-32 (SEQ ID NO: 56) NO: 57), CJ1-33 (SEQ ID NO: 58), CJ1-34 (SEQ ID NO: 59) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60), preferably an amino acid sequence selected from the group consisting of CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1-9 (SEQ ID NO: 29), CJ1-10 (SEQ ID NO: 30), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-25 (SEQ ID NO: 50), CJ1-26 (SEQ ID NO: 51), CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), an amino acid sequence selected from the group consisting of CJ1-32 (SEQ ID NO: 57) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60). In addition, XnIs an amino acid residue adjacent to the amino terminus of Y in the amino acid sequence of this protein allergen,mIs an amino acid residue adjacent to the carboxy terminus of Y in the amino acid sequence of this protein allergen. In this formula, n is 0-30 and m is 0-30. Preferably, the peptide or portion thereof has an average T cell stimulation index equal to or greater than the Y average T cell stimulation index, as shown in FIG.
Another embodiment of the invention provides a peptide comprising at least two regions, each comprising at least one T cell epitope of CryjI, and thus each region comprising at least about 7 amino acid residues. Peptides comprising these at least two regions can contain as many amino acid residues as desired of the CryjI allergen, preferably at least about 14, more preferably about 30, and most preferably at least about 40 amino acid residues. Can be included. If desired, the amino acid sequences of these regions can be generated and linked by a linker to increase sensitivity to processing by antigen presenting cells. Such a linker may be any non-epitope amino acid sequence or other suitable cross-linking or binding agent. In order to obtain a suitable peptide comprising at least two regions, each containing at least one T cell epitope, these regions are arranged in a configuration different from the natural configuration of these regions in the allergen. For example, these regions containing T cell epitopes can be arranged in a non-adjacent configuration, preferably derived from the same protein allergen. Non-contiguous is defined as an arrangement of regions containing T cell epitopes that is different from the arrangement of amino acid sequences present in the protein allergen from which these regions were derived. Further, the non-adjacent region containing the T cell epitope is in non-sequential order (eg, the amino acid order of the natural protein allergen from which the region containing the T cell epitope is derived (amino acids are located from the amino terminus to the carboxy terminus)). In a different order). One peptide may comprise at least 15%, at least 30%, at least 50% or up to 100% of CryjI T cell epitopes.
Individual peptide regions are generated and tested to determine which regions bind to immunoglobulin E specific for CryjI and which such regions release mediators (eg histamine) from mast cells or basophils. Can be determined. Those peptides found to bind to immunoglobulin E and cause the release of mediators from mast cells or basophils in more than about 10-15% of allergic sera tested are preferably It is not included in the peptide region that is arranged to form a preferred peptide.
Furthermore, the region of the peptide of the invention is preferably a suitable major T cell responsive region within CryjI described above (ie, regions 1-5) or a suitable major T cell responsive region within each region described above ( That is, it includes all or part of residues 1 to 40, 81 to 110, 151 to 180, 191 to 260, and 291 to 330). For example, a region may include all or part of region 1 (amino acid residues 1 to 51), and a region may include all or part of region 2 (amino acid residues 61 to 120). The peptides of this invention may comprise all or part of two or more of these regions (ie, regions 1-5) so that the preferred peptide does not bind to IgE and from mast cells or basophils Does not cause the release of mediators. Preferred peptides derived from CryjI include Region 3, Region 4 and Region 5, and suitably include Region 1 and Region 2. In addition, if one of these regions is found to bind IgE and cause mediator release from mast cells or basophils, the peptide binds to IgE without including such a region. It is preferable to include various regions derived from regions that do not cause or cause mediator release from mast cells or basophils.
Examples of suitable regions include: CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1-3 (SEQ ID NO: 28), CJ1-4 (SEQ ID NO: 28) : 29), CJ1-7 (SEQ ID NO: 32), CJ1-8 (SEQ ID NO: 33), CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35), CJ1- 11 (SEQ ID NO: 36), CJ1-12 (SEQ ID NO: 37), CJ1-14 (SEQ ID NO: 39), CJ1-15 (SEQ ID NO: 40), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-18 (SEQ ID NO: 43), CJ1-19 (SEQ ID NO: 44), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-21 (SEQ ID NO: 46), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-25 (SEQ ID NO: 50) ), CJ1-26 (SEQ ID NO: 5) ), CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-28 (SEQ ID NO: 53), CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), CJ1-32 ( SEQ ID NO: 57), CJ1-33 (SEQ ID NO: 58), CJ1-34 (SEQ ID NO: 59), CJ1-35 (SEQ ID NO: 60), CJ1-41 (SEQ ID NO: 71) CJ1-41.1 (SEQ ID NO: 72), CJ1-41.2 (SEQ ID NO: 73), CJ1-41.3 (SEQ ID NO: 74), CJ1-42 (SEQ ID NO: 75) CJ1-42.1 (SEQ ID NO: 76), CJ1-42.2 (SEQ ID NO: 77), CJ1-43 (SEQ ID NO: 78), CJ1-43.1 (SEQ ID NO: 79) CJ1-43.6 (SEQ ID NO: 80), CJ1-43.7 (SEQ ID NO: 81), CJ1-43.8 (SEQ ID NO: 82), CJ1-43.9 (SEQ ID NO: 83), CJ1-43.10 ( SEQ ID NO: 84), CJ1-43.11 (SEQ ID NO: 85), CJ1-43.12 (SEQ ID NO: 86), CJ1-45 (SEQ ID NO: 87), CJ1-45.1 ( SEQ ID NO: 88), CJ1-45.2 (SEQ ID NO: 89), CJ1-44 (SEQ ID NO: 90), CJ1-44.1 (SEQ ID NO: 91), CJ1-44.2 ( SEQ ID NO: 92) and CJ1-44.3 (SEQ ID NO: 93) (the amino acid sequence of such a region is shown in FIGS. 13 and 18), or a portion of that region comprising at least one T cell epitope.
Preferred peptides comprise various combinations of two or more regions, each region containing all or part of the preferred major T cell responsive region described above. Preferred peptides include a combination of two or more regions (each region having the amino acid sequence shown in FIG. 13) including:
CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27) and CJ1-3 (SEQ ID NO: 28);
CJ1-1 (SEQ ID NO: 26) and CJ1-2 (SEQ ID NO: 27);
CJ1-9 (SEQ ID NO: 34) and CJ1-10 (SEQ ID NO: 35);
CJ1-14 (SEQ ID NO: 39), CJ1-15 (SEQ ID NO: 40), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41) and CJ1-17 (SEQ ID NO: 42);
CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-21 (SEQ ID NO: 46), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48);
CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47) and CJ1-23 (SEQ ID NO: 48);
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47) and CJ1-23 (SEQ ID NO: 48);
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48) and CJ1-24 (SEQ ID NO: 49);
CJ1-24 (SEQ ID NO: 49) and CJ1-25 (SEQ ID NO: 50);
CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57);
CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57);
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41) and CJ1-17 (SEQ ID NO: 42);
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ-32 (SEQ ID NO: 57);
CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57);
CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35) and CJ1-16 (SEQ ID NO: 41);
CJ1-16 (SEQ ID NO: 41) and CJ1-17 (SEQ ID NO: 42);
CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47) and CJ1-23 (SEQ ID NO: 48);
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Isolated CryjI proteins or CryjI peptides within the scope of the present invention can be used in methods of treating and preventing allergic reactions to cedar pollen. Accordingly, one aspect of the invention provides a therapeutic composition comprising a peptide of CryjI comprising at least one T cell epitope, preferably at least two T cell epitopes, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. In another aspect, the therapeutic composition comprises a peptide comprising a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and at least two regions, each region comprising at least one T cell epitope of CryjI.
A preferred therapeutic composition is a sufficient percentage of CryjI T so that therapeutic administration of the composition to an individual susceptible to cedar pollen allergens tolerates the individual's T cells to the protein allergen. Contains cellular epitopes. More preferably, the composition comprises a sufficient percentage of T cell epitopes such that at least about 40%, more preferably at least about 60%, of CryjI T cell reactivity is included in the composition. Such compositions can be administered to individuals to treat or prevent susceptibility to cedar pollen or allergens that are immunoreactive with cedar pollen allergens.
In yet another aspect of the invention, a composition (eg, a physical mixture of at least two peptides) comprising at least two peptides (each comprising at least one T cell epitope of CryjI) is provided. Such compositions can be administered in the form of a therapeutic composition with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. A therapeutically effective amount of one or more such compositions can be administered simultaneously or sequentially to an individual susceptible to cedar pollen.
Preferred compositions and preferred combinations of peptides that can be administered simultaneously or sequentially (including peptides having the amino acid sequence shown in FIG. 13) include the following combinations:
CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27) and CJ1-3 (SEQ ID NO: 28);
CJ1-1 (SEQ ID NO: 26) and CJ1-2 (SEQ ID NO: 27);
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CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO. NO: 35), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57); and
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 48) NO: 57).
The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.
Example 1
Purification of cedar pollen allergen (CryjI)
The following is a description of the work done to biochemically purify the major form of the allergen CryjI in natural form. This purification can be performed using published procedures (Yasueda et al., J. Allergy Clin. Immunol.71: 77,1983).
100 g of cedar pollen (HollisterStir, Washington, Spokane) obtained from Japan was defatted three times in 1 L of diethyl ether. After filtration, the pollen was collected and the ether was dried in vacuum.
The defatted pollen was mixed with 50 mM Tris HCl (pH 7.8), 0.2 M NaCl, and protease inhibitor (2 μg / ml (final concentration) soybean trypsin inhibitor, 1 μg / ml (final concentration) leupeptin, 1 μg / ml (final concentration). ) Extracted overnight at 4 ° C. in 2 L of extraction buffer containing pepstatin and 0.17 mg / ml (final concentration) phenylmethylsulfonyl fluoride). Insoluble material was re-extracted with 1.2 L of extraction buffer at 4 ° C. overnight, and both extracts were combined and used with Whatman DE-52 DEAE cellulose (dry weight 200 g) equilibrated with extraction buffer. Depigmented by batch absorption.
The depigmented material was then fractionated by 80% saturation (4 ° C.) ammonium sulfate precipitation to remove much of the low molecular weight material. The resulting partially purified CryjI was dialyzed against PBS buffer and used for T cell studies (see Example 6) or subjected to further purification (biochemical or monoclonal affinity chromatography) as described below.
This CryjI-rich material was then dialyzed against 50 mM sodium acetate (pH 5.0 at 4 ° C.) using 50 mM sodium acetate (pH 5.0) plus protease inhibitors. This sample was then applied to a 100 ml DEAE cellulose column (Whatman DE-52) equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH 5.0) with protease inhibitors at 4 ° C. Unbound material (basic protein) was then added to a 50 ml cation exchange column (Whatman CM-52) equilibrated with 10 mM sodium acetate (pH 5.0) at 4 ° C. with added protease inhibitors. CryjI eluted in the initial fraction of a linear gradient of 0.3M NaCl. The CryjI enriched material was lyophilized and then purified by FPLC (25 mM 10 mM sodium acetate pH 5.0, flow rate 30 ml / hr) on a 300 ml Superdex 75 column (Pharmacia).
Purified CryjI was further added to FPLC S-Sepharose 16/10 column chromatography (Pharmacia) using a linear gradient of 0-1 M NaCl (25 ° C.). CryjI eluted as the main peak was subjected to a second gel filtration chromatography. A FPLC Superdex 75 column (2.6 per 60 cm) (New Jersey, Piscataway, Pharmacia) was eluted with a descending flow of 10 mM sodium acetate (pH 5.0) (flow rate 30 ml / hr, 25 ° C.). FIG. 1a shows this gel filtration chromatography. Only CryjI was detected (FIG. 1b, lanes 2-8). CryjI was fractionated into three bands by SDS-PAGE analysis using silver staining (FIG. 1b). As shown in FIG. 1b, SDSPAGE (12.5%) analysis of the fraction from the main peak shown in FIG. 1a was performed under reducing conditions. The gel was silver stained using a Bio-Rad silver staining kit. Samples in each of these lanes were as follows: Lane 1, prestained with ovalbumin (43,000 kDa), carbonic anhydrase (29,000 kDa) and α-lactoglobulin (18,400 kDa). Standard protein (Gibco BRL); lane 2, fraction 36; lane 3 fraction 37; lane 4 fraction 38; lane 5 fraction 39; lane 6 fraction 41; lane 7 fraction 43 and lane 8 fraction 44. All fractions are shown in FIG.
These proteins were also analyzed by Western blot using the mouse monoclonal antibody CBF2 (FIG. 2). As shown in FIG. 2, aliquots of fraction 36 (lane 1), fraction 39 (lane 2) and fraction 43 (lane 3) purified from Superdex 75 (FIG. 1) were separated by SDS-PAGE, and nitro Electroblotted on cellulose and probed with mAB CBF2. Using biotinylated goat anti-mouse Ig as the second antibody, the bound antibody125Indicated by I-streptavidin. Monoclonal CBF2 was raised against ragweed allergen Amb a I by Dr. D. Klapper (Chapel, Hill, North Carolina). Because of the homology between Amb a I and Cryj I sequences, some of the antibodies raised against Amb a I were tested for reactivity with Cryj I. These results indicated that CBF2 recognizes denatured CryjI as detected by ELISA and Western blot. In addition, Western blots also showed that no other bands were detected by CBF2, with the exception of CryjI in the expected molecular weight range. These results were consistent with what was found from protein sequencing. Fractions 44 and 39 (FIG. 1b) were subjected to N-terminal sequencing, but only the sequence of CryjI was detected.
In short, three CryjI isoforms with different molecular weights were purified from pollen extracts. The molecular weight evaluated by these SDS-PAGE ranged from 40 to 35 kDa in both reducing and non-reducing conditions. These isoforms have an isoelectric point of about 9.5 to 8.6 with an average pI of 9.0. The N-terminal 20 amino acid sequence was the same in these three bands and was identical to the previously published sequence of CryjI (Taniai et al., Supra). All three of these isoforms are recognized by monoclonal antibody CBF2, as shown by allergic serum titration of various purified sub-fractions of CryjI using 15 allergic patient plasma. They all bind to IgE from allergic patients (Figure 3). Differences in the molecular weight and isoelectric point of these isoforms may be due in part to post-translational modifications such as glycosylation, phosphorylation or lipid content. The possibility that these different isoforms are due to protease degradation is unlikely due to the fact that four different protease inhibitors were used in extraction and purification, but cannot be ruled out at this time. Another possibility could be that only one major form of the CryjI protein was detected in cDNA cloning studies (see Example 4), but due to genetic polymorphism or alternatively spliced mRNA. .
Another approach that can be used to purify native CryjI or recombinant CryjI is immunoaffinity chromatography. This technique provides highly selective protein purification due to the nature of the interaction between the monoclonal antibody and the antigen. Female Balb / c mice were obtained from Jackson Labs for the purpose of generating CryjI reactive monoclonal antibodies. Each mouse was immunized intraperitoneally with 70-100 μg of purified native CryjI (purity> 99%, lower band shown in FIG. 1b), first emulsified in complete Freund's adjuvant. An additional intravenous injection of 10 μg of purified native CryjI in PBS was made 54 days after the first injection. Three days later, the spleen was removed and fusion with myeloma was performed using the myeloma line SP2.0 as described (Current Protocols in Immunology, 1991, Coligan et al.). These cells were cultured in 10% fetal bovine serum (Hybrimax), hypoxanthine and azaserine, and wells containing colonies of hybridoma cells were screened for antibody production using an antigen-binding ELISA.
Cells from positive wells were cloned in 10% fetal bovine serum (Hybrimax), hypoxanthine at 3/10 cells / well, and positive clones were subcloned again in hypoxanthine medium. A capture ELISA (see Example 7) was used for the second and third screening. This assay provides the advantage that clones that recognize the native protein are selected and can therefore be useful for immunoaffinity purification. For example, two monoclonal antibodies (4B11, 8B11) were generated. These antibodies were generated by Gammabind G. Sepharose (New Jersey, Piscataway, Pharmacia) according to the manufacturer's procedure and conjugated to cyanogen bromide activated Sepharose 4B (New Jersey, Piscataway, Pharmacia) according to the procedure described by Pharmacia. Immobilized. An ammonium sulfate preparation containing CryjI was added to the resin and unbound material was washed with a large volume of PBS. CryjI was eluted with 2 column volumes of 0.1 M glycine (pH 2.7). Silver staining of the eluate fraction run on SDSPAGE showed that CryjI was almost homogeneously purified. These fractions do not contain detectable levels of CryjII. Other methods of immobilizing MAb8B11 were also tested. Similar results were obtained using purified MAb8B11 (Schneider C. et al., J. Biol. Chem. (1982) 257: 10766-10769) covalently cross-linked to Gammabind G Sepharose by dimethylpimelimidate. It was. However, experiments with purified MAb8B11 covalently cross-linked to Affi-gel 10 (Richmond, Calif., Biorad) showed that more than 90% of the monoclonal antibodies were covalently bound to Affi-gel 10. Regardless, the yield of CryjI produced with the resin was shown to be significantly lower than that purified from MAb8B11 cross-linked to cyanogen bromide activated Sepharose 4B (data not shown). . Nevertheless, CryjI purified from monoclonal antibodies immobilized on these various resins is still intact and can be recognized by MAbs 8B11 and 4B11 by capture ELISA. Thus, these MAbs provide a useful tool for the purification of CryjI from pollen extracts. Similarly, monoclonal antibodies that bind to recombinant CryjI may also be useful for immunoaffinity chromatography. In addition, these generated monoclonal antibodies may be useful for diagnostic purposes. It would also be possible to enhance different MAbs that show some specificity for these different isoforms of CryjI and therefore provide a useful tool for characterizing these isoforms.
Example 2
Trial of RNA extraction from cedar pollen
Many attempts have been made to obtain RNA from commercial, non-defatted Cryptomeria japonica pollen (Hollister Stier, Washington, Seattle). First, the sample is suspended in 4M guanidine buffer, dissolved, ground in liquid nitrogen and pelleted by ultracentrifugation in 5.7M cesium chloride, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring. The method of Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (1989) was used. Various amounts (3.5 and 10 g) of pollen were tried in varying amounts (10 and 25 ml) in guanidine lysis buffer. Centrifugation in cesium produced a viscous material at the bottom of the tube, from which no RNA pellet could be recovered. Although it is possible to obtain RNA from defatted Ambrosia artemisiifolia pollen (North Carolina, Lenior, Greer Laboratories) using this protocol, Cryptomeria japonica pollen is defatted with acetone before guanidine extraction. A260No RNA was produced as measured by absorption of.
Sambrook et al. Attempted to extract acid phenol from RNA using Cryptomeria japonica pollen by the method described above. Pollen was ground and sheared in 4.5M guanidine solution, acidified with 2M sodium acetate, and extracted with water saturated phenol with chloroform. After precipitation, the pellet was washed with 4M lithium chloride, redissolved in 10 mM Tris / 5 mM EDTA / 1% SDS, extracted with chloroform, and reprecipitated with NaCl and absolute ethanol. Using this procedure, Ambrosia artemisiifolia RNA could be extracted, but Cryoptomeria japonica RNA could not be extracted.
Next, 4 g of Cryptomeria japonica pollen was suspended in 10 ml of extraction buffer (50 mM Tris (pH 9.0), 0.2 M NaCl, 10 mM magnesium acetate and diethyl pyrocarbonate (DEPC) (to 0.1%)). It became cloudy, ground with mortar and pestle on dry ice, transferred to a centrifuge tube with 1% SDS, 10 mM EDTA and 0.5% N-lauroyl sarcosine and the mixture was extracted 5 times with warm phenol. After the last centrifugation, the aqueous phase was collected and 2.5 volumes of absolute ethanol was added and the mixture was incubated overnight at 4 ° C. The pellet is recovered by centrifugation and heated to 65 ° C. to give 1 ml of dH2Resuspended in O and reprecipitated by the addition of 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2.0 volumes of ethanol. A260No detectable RNA was recovered in this pellet, as determined by absorbance and gel electrophoresis.
Finally, 500 mg of Cryptomeria japonica pollen is ground on dry ice with a mortar and pestle and added with 0.2 ml NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 5 ml 50 mM Tris (pH 9.0) (previously Frankis and Mascarhenas (1980 ) Ann.Bot.45: Treated with 0.1% DEPC overnight as described in 595-599). After extraction five times with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (mixed at 25: 24: 1), the material was precipitated from the aqueous phase with 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol. The pellet is recovered by centrifugation and dH2Resuspended in O and heated to 65 ° C. to dissolve the precipitated material. No further precipitation with lithium chloride was performed. A260There was no detectable RNA as measured by absorbance and gel electrophoresis.
In short, it was impossible to recover RNA from commercial pollen. It is not known whether the RNA was degraded during storage or shipment, or whether the actual RNA used in this example could not be recovered. However, RNA was recovered from cone samples with fresh Cryptomeria japonica pollen and stamens (see Example 3).
Example 3
Extraction of RNA from cones with cedar pollen and stamen and cloning of CryjI
A cone sample with fresh pollen and stamen collected from a single Cryptomeria japonica tree in Arnold Arboretum (Boston, Mass.) Was immediately frozen on dry ice. RNA was prepared from 500 mg of each sample essentially as described by Frankis and Mascarhenas, supra. These samples are crushed with mortar and pestle on dry ice and suspended in 5 ml 50 mM Tris (pH 9.0) with 0.2 M NaCl, 1 ml EDTA, 1% SDS treated overnight with 0.1% DEPC. It was. After 5 extractions with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (mixed 25: 24: 1), RNA was precipitated from the aqueous phase with 0.1 volume of 2M sodium acetate and 2 volumes of ethanol. The pellet is recovered by centrifugation and dH2Resuspended in O and heated to 65 ° C. for 5 minutes. 2 ml of 4M lithium chloride was added to the RNA precipitate and they were incubated overnight at 0 ° C. The RNA pellet is recovered by centrifugation and 1 ml of dH2Resuspended in O and precipitated again with 3M sodium acetate and ethanol overnight. The final pellet is 100 μl dH2Resuspended in O and stored at -80 ° C.
First strand cDNA was obtained from 8 μg of head inflorescence and 4 μg of pollen RNA using commercially available kits (cDNA synthesis system kit, Gaithersburg, BRL) using Gubler and Hoffman (1983) Gene.twenty five: Synthesized by oligo dT priming according to the method of 263-269. The cDNA encoding CryjI has a degenerate oligonucleotide CP-1 (sequence 5′-GATAATCCGATAGATA-3 ′, where T at position 3 may be C, T at position 6 may be C, and position 9 G may be A, T or C, A at position 12 may be T or C, T at position 15 may be C, A at position 16 may be T, and G at position 17 may be C; SEQ ID An attempt was made to amplify using NO: 3) and primers EDT and ED. Primer EDT has the sequence 5'-GGAATTCTCTAGACTGCAGGTTTTTTTTTTTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 24). Primer ED has the sequence 5'-GGAATTCTCTAGACTGCAGGT-3 '(SEQ ID NO: 23). CP-1 is a degenerate oligonucleotide sequence that encodes the first 6 amino acids at the amino terminus of CryjI (AspAsnProIleAspSer, amino acids 1-6 of SEQ ID NO: 1). EDT will hybridize to the poly A tail of this gene. All oligonucleotides were synthesized by Research Genetics, Inc., Alabama, Huntsville. Polymerase chain reaction was performed using a commercially available kit (GeneAmp DNa amplification kit, Connecticut, Norwalk, PerkinElmer Cetus), 10 μl of 10 × buffer containing dNTP, 1 μg of CP-1 and 1 μg of ED / EDT primer. (ED: EDT molar ratio 3: 1), cDNA (3-5 μl of 20 μl first strand cDNA reaction mixture), 0.5 μl Amplitaq DNA polymerase and distilled water (to 100 μl).
These samples were amplified using a programmable temperature controller (Massachusetts, Cambridge, MJ Research, Inc.). The first five rounds of amplification consisted of denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing of the primer to template at 45 ° C. for 1.5 minutes and strand extension at 70 ° C. for 2 minutes. The last 20 amplifications consisted of denaturation as described above, annealing at 55 ° C. for 1.5 minutes and strand extension as described above. Then, 5 percent (5 μl) of this initial amplification was used for each 1 μg of CP-2 (with the sequence 5′-GGGAATTCAATTGGGCGCAGAATGG-3 ′ where T at position 11 may be C and G at position 17 is A, T or C may be used, G at position 20 may be A, T at position 23 may be C, and G at position 24 may be C) (SEQ ID NO: 4), a second using a nested primer and ED Used for amplification. The sequence 5'-GGGAATTC-3 '(bases 1-8 of SEQ ID NO: 4) in primer CP-2 represents an EcoRI site added for cloning purposes. The remaining degenerate oligonucleotide sequence encodes CryjI amino acids 13-18 (AsnTrpAlaGlnAsnArg, amino acids 13-18 of SEQ ID NO: 1). Many DNA bands were separated on a 1% GTG agarose gel (ME, Rockport, FMC), all of which were in Southern blots performed according to Sambrook et al., Supra.32It did not hybridize with the P-end labeled probe CP-3 (SEQ ID NO: 5). Therefore, it was not possible to select a specific CryjI DNA band and this approach was discontinued. CP-3 has the sequence 5′-CTGCAGCCATTTTCIACATTAAA-3 ′, where A at position 9 may be G, T at position 12 may be C, A at position 18 may be G, and A at position 21 May be G (SEQ ID NO: 5). In position 15, inosine (I) is used in place of G or A or T or C to reduce degeneracy (Knoth et al. (1988) Nucleic Acids Res.16: 10932). The sequence 5'-CTGCAG-3 '(bases 1-6 of SEQ ID NO: 5) in primer CP-3 represents the PstI site added for cloning purposes. The remaining degenerate oligonucleotide sequence is a non-coding strand sequence corresponding to the coding strand sequence encoding amino acids PheAsnValGluAsnGly (amino acids 327 to 332 of SEQ ID NO: 1) from the internal sequence of CryjI.
The first PCR was also performed on the first strand cDNA using CP-1 (SEQ ID NO: 3) and CP-3 (SEQ ID NO: 5) as described above. The second PCR was performed with CP-2 (SEQ ID NO: 4) and CP-3 (SEQ ID NO: 5) using 5% of the first reaction. Again, many bands were observed, none of which could be specifically identified as CryjI in the Southern blot, and this approach was discontinued.
Double stranded cDNA was then synthesized from about 4 μg (pollen) and 8 μg (headed inflorescence) of RNA using a commercially available kit (cDNA synthesis system kit, Gaithersburg, BRL). After phenol extraction and ethanol precipitation, the cDNA was analyzed using Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem.266: 1229-1236; Frohman et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 8998-9002; and Roux et al. (1990) BioTech.8AT-SEQ (SEQ ID NO: 20) and AL blunted with T4 DNA polymerase (Wisconsin, Madison, Promega), ethanol precipitated and self-annealed for use in the modified Uncard PCR reaction according to the method of 48-57 (SEQ ID NO: 22) linked to oligonucleotide. Oligonucleotide AT has the sequence 5'-GGGTCTAGAGGTACCGTCCGATCGATCATT-3 '(SEQ ID NO: 20) (Rafnar et al., Supra). Oligonucleotide AL has the sequence 5'-AATGATCGATGCT-3 '(SEQ ID NO: 22) (Rafnar et al., Supra). From the ligated cDNA (3 μl from a 20 μl reaction), the CryjI amino terminus was reconstituted with 1 μg each of oligonucleotide AP (SEQ ID NO: 21) and the degenerated CryjI primer CP-7 (sequence 5′-TTCATICGATTCTGGGCCCA-3 ′, G at the 8th position may be T, A at the 9th position may be G, C at the 12th position may be T, and G at the 15th position may be A, T or C) (SEQ ID NO: 6) Amplified. Inosine (I) is used in place of G or A or T or C at position 6 (Knoth et al., Supra) to reduce degeneracy. The degenerate oligonucleotide CP-7 (SEQ ID NO: 6) is non-coding corresponding to the coding strand sequence encoding amino acids 14-20 (TrpAlaGlnAsnArgMetLys) from the amino terminus of CryjI (amino acids 14-20 of SEQ ID NO: 1). Strand sequence. The oligonucleotide AP has the sequence 5'-GGGTCTAGAGGTACCGTCCG-3 '(SEQ ID NO: 21).
The first PCR reaction was performed as described herein. 5 percent (5 μl) of this initial amplification is then used for the second amplification using 1 μg of each AP (SEQ ID NO: 21) and CryjI oligonucleotide primer nested within CryjI primer CP-8 (SEQ ID NO: 7). Used in. Primer CP-8 has the sequence 5′-CCTGCAGCGATTCTGGGCCCAAATT-3 ′, where G at position 9 may be T, A at position 10 may be G, C at position 13 may be T, and position 16 G may be A, T or C, and A at position 23 may be G (SEQ ID NO: 7). Nucleotide 5'-CCTGCAG-3 '(bases 1-7 of SEQ ID NO: 7) represents the PstI site added for cloning purposes. The remaining degenerate oligonucleotide sequence is a non-coding strand sequence corresponding to the coding strand sequence encoding CryjI amino acids 13-18 (AsnTrpAlaGlnAsnArg, amino acids 13-18 of SEQ ID NO: 1) from the amino terminus of CryjI. The main amplification product was a DNA band of about 193 base pairs when visualized on an ethidium bromide (EtBr) stained 3% agarose gel.
Amplified DNA was recovered by sequential chloroform, phenol and chloroform extractions followed by precipitation at −20 ° C. with 0.5 volumes of 7.5 ammonium acetate and 1.5 volumes of isopropanol. After precipitation and washing with 70% ethanol, the DNA was electrophoresed in a preparative 3% GTG NuSieve low melting gel (Main, Rockport, FMC) digested simultaneously with XbaI and PstI in a 15 μl reaction. . Appropriately sized DNA bands were visualized by EtBr staining, removed, and the dideoxy chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc using a commercially available sequencing kit (Sequenase kit, Ohio, Cleveland, USBiochemicals). .Natl Acad Sci. USA 74: 54463-5476) and was ligated into appropriately digested M13mp18. Initially, it was thought that ligable material could only be derived from RNA from cones with stamens. However, in subsequent studies, it was shown that ligable material could be recovered from PCR products generated from pollen-derived RNA and cone-derived RNA with stamens.
A clone called JC71.6 was found to contain a partial sequence of CryjI. This is because the disclosed CryjI NH2It was confirmed to be a reliable CryjI clone completely identical to the terminal sequence (Taniai et al., Supra). The amino acid at position 7 was determined to be cysteine (Cys), consistent with the sequence disclosed in US Pat. No. 4,939,239. Amino acid numbering is based on the sequence of the mature protein, and amino acid 1 is the NH of CryjI.2Corresponds to aspartic acid (Asp) disclosed as terminal (Taniai et al., Supra). The starting methionine was found to be amino acid-21 relative to the first amino acid of the mature protein. The position of the initiating methionine is due to the presence of an upstream in-frame stop codon and surrounding and plant consensus sequences (including the initiating methionine as reported by Lutcke et al. (1987) EMBO J.6: 43-48) Supported by 78% homology with.
The cDNA encoding the rest of the CryjI gene was extracted from the ligated cDNA in the first PCR reaction with oligonucleotides CP-9 (sequence 5′-ATGGATTCCCCTTGCTTA-3 ′) (SEQ ID NO: 8) and AP (SEQ It was cloned using ID NO: 21). Oligonucleotide CP-9 (SEQ ID NO: 8) contains CryjI amino acids MetAspSerProCysLeu (amino acids -21 to -16 of SEQ ID NO: 1) derived from the leader sequence of CryjI and was determined for partial CryjI clone JC76.1. It is based on the nucleotide sequence.
The second PCR reaction was performed on 5% of the initial amplification mixture, 1 μg each of AP (SEQ ID NO: 21) and CP-10 (having the sequence 5′-GGGAATTCGATAATCCCATAGACAGC-3 ′) (SEQ ID NO: 9) This was done using nested primers. The nucleotide sequence 5'-GGGAATTC-3 '(bases 1-8 of SEQ ID NO: 9) of primer CP-10 represents an EcoRI site added for cloning purposes. The remaining oligonucleotide sequence encodes CryjI amino acids 1-6 (AspAsnProIleAspSer) (amino acids 1-6 of SEQ ID NO: 1) and is based on the partial nucleotide sequence determined for CryjI clone JC76.1. The amplified DNA product was purified and precipitated as described above, then digested with EcoRI and XbaI and electrophoresed in a preparative 1% low melting gel. The main DNA band was removed and ligated to M13mp19 and pUC19 for sequencing. The religatable material was recovered from cDNA generated from pollen-derived RNA and cone-derived RNA with stamens. Two clones called pUC19JC91a and pUC19JC91d were selected for full length sequencing. They were subsequently found to be identical sequences.
DNA was sequenced by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., Supra) using a commercially available kit (Ohio, Cleveland, U.S. Biochemicals). Both strands were combined with M13 forward and reverse primers (Massachusetts, Beverly, NE Biolabs) and internal sequencing primers CP-13 (SEQ ID NO: 10), CP-14 (SEQ ID NO: 11), CP-15. (SEQ ID NO: 12), CP-16 (SEQ ID NO: 13), CP18 (SEQ ID NO: 15), CP-19 (SEQ ID NO: 16) and CP-20 (SEQ ID NO: 17). Used to complete sequencing. CP-13 has the sequence 5'-ATGCCTATGTACATTGC-3 '(SEQ ID NO: 10). CP-13 (SEQ ID NO: 10) encodes amino acids 82-87 of CryjI (MetProMetTyrIleAla, amino acids 82-87 of SEQ ID NO: 1). CP-14 has the sequence 5'-GCAATGTACATAGGCAT-3 '(SEQ ID NO: 11) and corresponds to the CP-13 (SEQ ID NO: 10) non-coding strand sequence. CP-15 has the sequence 5'-TCCAATTCTTCTGATGGT-3 '(SEQ ID NO: 12) which encodes CryjI amino acids 169-174 (SerAsnSerSerAspGly, amino acids 169-174 of SEQ ID NO: 1). CP-16 is a sequence 5′-TTTTGTCAATTGAGGAGT-3 ′ (SEQ ID NO. NO.) Which is a non-coding chain sequence corresponding to the coding chain sequence encoding amino acids 335 to 340 of CryjI (ThrProGlnLeuThrLys; 13). CP-18 is a sequence 5′-TAGCAACTCCAGTCGAAGT-3 ′ (non-coding chain sequence substantially corresponding to the coding chain sequence encoding amino acids 181 to 186 of CryjI (ThrSerThrGlyValThr, amino acids 181 to 186 of SEQ ID NO: 1). (However, the fourth nucleotide of CP-18 (SEQ ID NO: 15) was synthesized as C rather than the correct nucleotide T). CP-19 having the sequence 5′-TAGCTCTCATTTGGTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 16) is non-corresponding to the coding chain sequence encoding CryjI amino acids 270-275 (AlaProAsnGluSerTyr, amino acids 270-275 of SEQ ID NO: 1). The coding strand sequence. CP-20 has the sequence 5'-TATGCAATTGGTGGGAGT-3 '(SEQ ID NO: 17) which is the coding strand for amino acids 251 to 256 of CryjI (TyrAlaIleGlyGlySer, amino acids 251 to 256 of SEQ ID NO: 1). This sequenced DNA was found to have the sequence shown in FIGS. 4a and 4b (SEQ ID NO: 1). This is a composite sequence from two overlapping clones JC71.6 and pUC19J91a. The complete cDNA sequence of CryjI consists of 1312 nucleotides, including a 66 nucleotide 5 'untranslated sequence, an open reading frame starting from the codon of the 1122 nucleotide start methionine and a 3' untranslated region. There is a consensus polyadenylation signal sequence in the 3 'untranslated region 5 nucleotides 5' of the poly A tail (nucleotides 1279-1283 of Figure 4 and SEQ ID NO: 1). Nucleotides 1313 to 1337 of FIG. 4 and SEQ ID NO: 1 represent the vector sequence. The position of the initiating methionine depends on the presence of an in-frame upstream stop codon and the initiating methionine (the sequence ACACA common to plants).AUGGC Lutcke et al. (1987) EMBO J.6: AAAA found in CryjI comparable to 43-48AUGConfirmed by 78% homology with plant consensus sequences including GA (bases 62-70 of SEQ ID NO: 1)). This open reading frame encodes a protein of 374 amino acids, the first 21 amino acids of which contain a leader sequence that is cleaved from the mature protein. The amino terminus of this mature protein is the published NH2It was identified by comparison of the terminal sequence (Taniai et al. (1988), supra) and the sequence determined by direct amino acid analysis of purified CryjI (Example 1). The deduced amino acid sequence of the mature protein (consisting of 353 amino acids) has complete sequence identity with the published protein sequence of CryjI (Taniai et al., Supra) (NH2Including the terminal first 20 amino acids and 16 adjacent internal amino acid sequences). This mature protein also contains five potential glycosylation sites corresponding to the consensus sequence NXS / T.
Example 4
Extraction of RNA from Japanese cedar pollen collected in Japan
Fresh pollen collected from a pool of Cryptomeria japonica trees in Japan was immediately frozen on dry ice. From 500 mg of this pollen, essentially Frankis and Mascarenhas Ann. Bot.45: RNA was prepared as described in: 595-599. Samples are ground on dry ice with a mortar and pestle and suspended in 5 ml of 50 mM Tris (pH 9.0) containing 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS treated with 0.1% DEPC overnight. It was. After extraction 5 times with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (mixed at 25: 24: 1), RNA was precipitated from the aqueous phase with 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol. The pellet is recovered by centrifugation and dH2Resuspended in O and heated to 65 ° C. for 5 minutes. 2 ml of 4M lithium chloride was added to these RNA preparations and incubated overnight at 9 ° C. The RNA pellet is recovered by centrifugation and 1 ml of dH2Resuspended in O and precipitated again with 3M sodium acetate and ethanol overnight. The final pellet is 100 μl dH2Resuspended in O and stored at -80 ° C.
Double stranded cDNA was synthesized from 8 μl pollen RNA by oligo dT priming using the cDNA synthesis system kit (BRL) according to the method of Gubler and Hoffman (1983) Gene 25: 263-269. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using 10 μl of 10 × buffer containing dNTPs, each 100 pmoles of sense and antisense oligonucleotides (10 μl of 400 μl of double-stranded cDNA reaction mixture), 0.5 μl of Amplitaq DNA polymerase and Mixing with distilled water (to 100 μl) was performed using GeneAmp DNA amplification kit (Perkin Elmer Cetus).
These samples were amplified using a programmable temperature controller, MJ Research, Inc. (Cambridge, Mass.). The first five amplifications consisted of denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing of the primer to the template at 45 ° C for 1 minute and strand extension at 72 ° C for 1 minute. The last 20 amplifications consisted of denaturation as described above, annealing at 55 ° C. for 1 minute and chain extension as described above.
Seven different CryjI primer pairs were used to amplify this double stranded cDNA: CP-9 (SEQ ID NO: 8) and CP-17 (SEQ ID NO: 14), CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-17 (SEQ ID NO: 14), CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-16 (SEQ ID NO: 13), CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-19 (SEQ ID NO: 16), CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-18 (SEQ ID NO: 15), CP-13 (SEQ ID NO: 10) and CP-17 (SEQ ID NO: 16) NO: 14), and CP-13 (SEQ ID NO: 10) and CP-19 (SEQ ID NO: 16). CP-17 (SEQ ID NO: 14) has the sequence 5'-CCTGCAGAAGCTTCATCAACAACGTTTAGA-3 'and the amino acid SKRC.*This corresponds to the non-coding strand sequence corresponding to the coding strand sequence encoding 350-353 and the stop codon of SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence 5'-CCTGCAGAAGCTT-3 '(bases 1-13 of SEQ ID NO: 14) represents PstI and HindIII restriction sites added for cloning purposes. The nucleotide sequence 5'-TCA-3 '(bases 13-15 of SEQ ID NO: 14) corresponds to the non-coding strand sequence of the stop codon. All amplifications produced products of the expected dimensions when viewed on ethidium bromide (EtBr) stained agarose gels. Two of these primer pairs were used in amplification and the product was cloned into pUC19 for full-length sequencing. A PCR reaction on double stranded cDNA using CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-16 (SEQ ID NO: 13) produced a band of approximately 1.1 kb and was called JC130. A separate first strand cDNA reaction was performed as described above with 8 μg of pollen RNA and amplified with oligonucleotide primers CP-10 (SEQ ID NO: 9) and CP-17 (SEQ ID NO: 14). . This amplification produced a full-length cDNA (referred to as JC135) from the amino terminus of the mature protein to the stop codon.
Amplified DNA was recovered by sequential chloroform, phenol and chloroform extractions followed by precipitation with 0.5 volumes of 7.5 ammonium acetate and 1.5 volumes of isopropanol at -20 ° C. After precipitation and washing with 70% ethanol, the DNA is blunted with T4 polymerase and digested with EcoRI (JC130) in a 15 μl reaction, or digested with EcoRI and PstI (JC135). ), Electrophoresis in a preparative 1% SeaPlaque low melting point gel (FMC). Appropriately sized DNA bands were visualized by EtBr staining, removed and the dideoxy chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. Using a commercially available sequencing kit (Ohio, Cleveland, USBiochemicals). USA74: 5463-5476) was ligated into appropriately digested pUC19 for dideoxy DNA sequencing.
Both strands were combined with M13 forward and reverse primers (Massachusetts, Beverly, NE Biolabs) and internal sequencing primers CP-13 (SEQ ID NO: 10), CP-15 (SEQ ID NO: 12), CP-16 ( Sequencing was performed using SEQ ID NO: 13), CP-18 (SEQ ID NO: 15), CP-19 (SEQ ID NO: 16) and CP-20 (SEQ ID NO: 17). Two clones from amplified JC130 (JC130a and JC130b) and one clone from amplified JC135 (JC135g) were found to be CryjI clones from the sequence. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of clones JC130a and JC135g were identical to the previously known CryjI sequence (SEQ ID NO: 1). Clone JC130b was found to differ from the previously known CryjI sequence (SEQ ID NO: 1) by one nucleotide. Clone JC130b had C at nucleotide 306 of SEQ ID NO: 1. This nucleotide change results in the expected amino acid change from Tyr to His at amino acid 60 of the mature CryjI protein. This polymorphism has not yet been confirmed in independently derived PCR or by direct amino acid sequencing. However, polymorphisms in such primary nucleotide and amino acid sequences are to be expected.
Example 5
Expression of CryjI
CryjI was expressed as follows. 10 μg of pUC19JC91a was digested with XbaI, precipitated, and then blunted with T4 polymerase. BamHI linker (Massachusetts, Beverly, N.E. Biolabs) was blunted overnight in pUC19JC91a and excess linker was removed by filtration through a NACS ion exchange minicolumn (Maryland, Gaithersburg, BRL). The linker-linked cDNA was then digested simultaneously with EcoRI and BamHI. The CryjI insert (extending from the nucleotide encoding the amino terminus of the mature protein through the stop codon) was isolated by electrophoresis of this digest in a 1% SeaPlaque low melting point agarose gel. This insert was then digested appropriately and the expression vector pET-11d modified to contain a sequence encoding 6 histidine (His6) immediately 3 'to the ATG start codon followed by a unique EcoRI endonuclease restriction site. (Wisconsin, Madison, Novagen; Jameel et al. (1990) J. Virol.64: 3963-3966). The second EcoRI endonuclease restriction site in the vector, together with the ClaI and HindIII endonuclease restriction sites, was previously removed by digestion, blunting and religation with EcoRI and HindIII. This histidine (His6) sequence is Ni2+Chelating column (Hochuli et al. (1987) J. Chromatog.411: 177-184; Hochuli et al. (1988) Bio / Tech.6: 1321-1325) for affinity purification of the recombinant protein (CryjI). A recombinant clone was used to transform E. coli strain BL21-DE3 containing a plasmid with an isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible promoter preceding the gene encoding T7 polymerase. . Induction with IPTG leads to high levels of T7 polymerase expression, which is required for expression of recombinant proteins in pET with the T7 promoter. Clone pET-11dΔHRhis6JC91a. d was confirmed to be a CryjI clone in the correct reading frame for expression by dideoxy sequencing (Sanger et al., supra) using CP-14 (SEQ ID NO: 11).
Recombinant protein expression was confirmed in early small scale cultures (50 ml). Clone pET-11dΔHRhis6JC91a. d Use an overnight culture to inoculate 50 ml of medium containing ampicillin (Brain Heart Infusion Media, Difco)600= 1.0 and then induced with IPTG (final concentration 1 mM) for 2 hours. A 1 ml aliquot of this bacterium is taken before and after induction, pelleted by centrifugation, and the pellet is 50 mM Tris HCl (pH 6.8) 2 mM EDTA, 1% SDS, β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0. Crude cell lysates were prepared by boiling in 25% bromophenol blue for 5 minutes (Studier et al. (1990) Methods in Enzymology185: 60-89). Recombinant protein expression was visualized as a band on an expected Coomassie blue stained SDS-PAGE gel of approximately 38 kDa, according to the method of Sambrook et al., Supra (40 μl of crude lysate was loaded on the gel) ). Negative controls consisted of crude lysates from bacteria containing uninduced CryjI plasmid and lysates of bacteria without induced plasmid.
Then, this pET-11dΔHRhis6JC91a. d clones were grown for expression and purification of the recombinant protein. 2 ml of cultured bacteria containing the recombinant plasmid are grown for 8 hours and then 1.5% agarose in solid medium (eg LB medium containing 200 μg / ml ampicillin (Gibco-BRL, Maryland, Gibco-BRL)). Scraped linearly on 6 containing Petri dishes (100 x 15 mm), grown overnight until confluent, then scraped to 9 L of liquid medium (Brain Heart containing ampicillin (200 μg / ml)) Infusion medium, Difco). This culture is called A600Was grown to 1.0, IPTG was added (final concentration 1 mM), and further grown for 2 hours.
Bacteria were recovered by centrifugation (7,930 × g, 10 minutes) and 90 ml of 6M guanidine-HCl, 0.1M Na2HPOFourDissolve in (pH 8.0) with vigorous shaking for 1 hour. Insoluble material was removed by centrifugation (11,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.). The pH of the lysate is adjusted to 8.0, 6M guanidine HCl, 100 mM Na.2HPOFourIt was applied to an 80 ml nickel NTA agarose column (Qiagen) equilibrated with (pH 8.0). The column was loaded with 6M guanidine HCl, 100 mM Na.2HPOFour10 mM Tris-HCl (pH 8.0), then 8 M urea, 100 mM Na2HPOFour(PH 8.0), and finally washed with 8M urea, 100 mM sodium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 6.3) sequentially. The column was passed through each buffer with A280Was washed until 0.05 or less.
Recombinant protein CryjI was eluted with 8M urea, 100 mM sodium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 4.5) and collected in 10 ml aliquots. The protein concentration of each fraction is expressed as A280Peak fractions were pooled as measured by absorbance of Aliquots of the collected recombinant proteins were analyzed by SDS-PAGE according to Sambrook et al., Supra.
The first 9L preparation (JCpET-1) is approximately 78% pure according to coomassie blue stained SDS-PAGE gel concentration measurements (Shimadzu Flying Spot Scanner, Massachusetts, Braintree, Shimadzu Scientific Instruments, Inc.). 30 mg of CryjI was produced. A second 9L preparation (JCpET-2) prepared in a similar manner produced 41 mg of CryjI with a purity of about 77%.
Example 6
Study of T cells in cedar pollen allergic patients using CryjI
Synthesis of overlapping peptides
The overlapping peptide of cedar pollen CryjI was synthesized using standard Fmoc / tBoc synthetic chemistry and purified by reverse phase HPLC. FIG. 13 shows the CryjI peptide used in these studies. Peptide names are consistent.
T cell response to cedar pollen antigen peptide
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), 60 ml of heparinized blood lymphocyte isolation medium (LSM) from patients with cedar pollen allergy who showed clinical symptoms of seasonal rhinitis and positive for cedar pollen Purified by centrifugation. Long-term T cell lines were prepared in complete medium (RPMI-1640 supplemented with 5% human AB serum inactivated with heat, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 5 × 10 5-Five2 × 10 in bulk culture of M2-mercaptoethanol and 10 mM HEPES)6PBL / ml moisturized 5% CO2Established in an incubator by stimulation for 7 days at 37 ° C. with partially purified natural CryjI (75% purity, including 3 bands similar to the 3 bands in FIG. 2) at 20 μg / ml CryjI reactive T cells were selected. This amount of priming antigen was determined to be optimal for activation of T cells from most cedar pollen allergic patients. Surviving cells were purified by LSM centrifugation, and the cells no longer responded to lymphokines in complete medium supplemented with 5 units / ml recombinant human IL-2 and 5 units / ml recombinant human IL-4 and The cells were cultured for a maximum of 3 weeks until it was considered “rested”. The T cell is then subjected to selected peptides, recombinant CryjI (rCryjI), purified native CryjI or recombinant Amb a I. The ability to grow against 1 (rAmb aI.1) was evaluated. 2 × 10 for assayFourOf resting cells 2 × 10FourOf Epstein-Barr virus (EBV) transformed autologous B cells (prepared as described below) in 2 or 3 wells of a round bottom 96 well plate in the presence of 25,000 RAD gamma irradiated 2-50 μg / ml rCryjI, purified native CryjI or Amb a I.I in a complete medium in a volume of 200 μl. 1 for 2-4 days. 1 μCi of tritiated thymidine was then added to each well for 16-20 hours. The incorporated counts were collected on a glass fiber filter mat and processed for liquid scintillation counting. FIG. 12 shows recombinant CryjI, purified natural CryjI and recombinant Amb a I.I. 1 and the effect of changing the amount of antigen in an assay using several antigenic peptides synthesized as described above. Some peptides were found to be inhibitory at these concentrations in these assays. Titration was used to optimize the dosage of these peptides in the T cell assay. The maximum response in titration of each peptide is expressed as the stimulation index (SI). This S.I. I. Is the count / min (CPM) taken up by the cells in response to the peptide divided by the CPM taken up by the cells in the medium alone. S. more than twice the background. I. The value is considered “positive” and indicates that the peptide contains a T cell epitope. These positive results were used in calculating the average stimulation index for each peptide in the group of patients tested. These results, shown in FIG. 12, show that patient 999 had recombinant CryjI and purified native CryjI and peptides CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), 3 (SEQ ID NO: 28), 20 (SEQ ID NO: 45) and 22 (SEQ ID NO: 47) respond well to recombinant Amb a I.a. 1 indicates no response. This is because CryjI T cell epitopes are recognized by T cells from this particular allergic patient and that rCryjI and peptides CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), 3 (SEQ ID NO: 28), 20 (SEQ ID NO: 45) and 22 (SEQ ID NO: 47) are shown to contain such T cell epitopes. Furthermore, these epitopes are often not detected in adjacent overlapping peptides, and thus probably span the non-overlapping central residues of reactive peptides. No significant cross-reactivity was found in T cell assays using T cells primed with control antigen or CryjI primed T cells against other antigens.
The above procedure was performed for several other patients. An individual patient's results show that if the patient has a CryjI protein of 2.0 or higher S.C. I. And at least one peptide derived from CryjI has a S.E. I. The average S.D. for each peptide. I. Used for calculation. A summary of positive experiments from 25 patients is shown in FIG. The bar represents the positive index. Above each bar is at least two S.D.s for peptides or proteins in the group of patients tested. I. The percentage of positive responses with In parentheses above each bar is the average stimulation index for each peptide or protein for the group of patients tested. All 25 T cell lines responded to purified native CryjI and 68.0% of these T cell lines responded to rCryjI. These 25 T cell lines also have significantly lower levels of rAmb aI. Also responds to Amb a I.1. That one allergen shares some homology with CryjI and that the “shared” T cell epitope is CryjI and Amb a I.I. This means that it will exist between 1 and 1. This panel of cedar allergy patients consists of peptides CJ1-1 (SEQ ID NO: 26), CJ1-2 (SEQ ID NO: 27), CJ1-3 (SEQ ID NO: 28), CJ1-4 (SEQ ID NO: 29), CJ1-7 (SEQ ID NO: 32), CJ1-8 (SEQ ID NO: 33), CJ1-9 (SEQ ID NO: 34), CJ1-10 (SEQ ID NO: 35), CJ1-11 (SEQ ID NO: 36), CJ1-12 (SEQ ID NO: 37), CJ1-14 (SEQ ID NO: 39), CJ1-15 (SEQ ID NO: 40), CJ1-16 (SEQ ID NO: 41) ), CJ1-17 (SEQ ID NO: 42), CJ1-18 (SEQ ID NO: 43), CJ1-19 (SEQ ID NO: 44), CJ1-20 (SEQ ID NO: 45), CJ1-21 ( SEQ ID NO: 46), CJ1-22 (SEQ ID NO: 47), CJ1-23 (SEQ ID NO: 48), CJ1-24 (SEQ ID NO: 49), CJ1-25 (SEQ ID NO: 50) , CJ1-2 6 (SEQ ID NO: 51), CJ1-27 (SEQ ID NO: 52), CJ1-28 (SEQ ID NO: 53), CJ1-30 (SEQ ID NO: 55), CJ1-31 (SEQ ID NO: 56), CJ1-32 (SEQ ID NO: 57), CJ1-33 (SEQ ID NO: 58), CJ1-34 (SEQ ID NO: 59) and CJ1-35 (SEQ ID NO: 60), This indicates that these peptides contain T cell epitopes.
Preparation of (EBV) transformed B cells for use as antigen presenting cells
Autologous EBV transformed cell lines were gamma irradiated at 25,000 rads and used as antigen presenting cells in the second proliferation assay and second bulk stimulation. These cell lines were also used as controls in immunofluorescent flow cytometry analysis. These EBV transformed cell lines are6PBL in the presence of 1 μg / ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) with 1 ml B-59 / 8 marmoset cell line (ATCC CRL1612, Maryland, Rockville, American Type Culture Collection) conditioned medium At 60 ° C. for 60 minutes in a 12 × 75 mm polyethylene round bottom Falcon snap cap tube (New Jersey, Lincoln Park, Becton Dickinson Labware). These cells were then 1.25 × 10 6 in RPMI-1640 as described above.6Diluted to cells / ml (provided with 10% fetal calf serum inactivated by heat and cultured in 200 μl aliquots on flat bottom culture plates until colonies were detected visually). They were then transferred to larger wells until a cell line was established.
Example 7
CryjI as a major cedar pollen allergen
To test the importance of CryjI reported as the major allergen of cedar pollen, both direct and competitive ELISA assays were performed. Wells were coated with soluble pollen extract of cedar pollen (SPE) or CryjI (tested at 90% purity by protein sequencing) and analyzed for human IgE antibody binding to these antigens. Pooled human plasma consisting of equal amounts of plasma from 15 patients with a cedar pollen MAST score of 2.5 or higher and plasma samples from two individual patients were compared in this assay. FIG. 5 shows the results of binding reactivity with these two antigens. The overall pattern of binding is very similar whether the coated antigen is SPE (Figure 5a) or purified native CryjI (Figure 5b).
In a competitive assay, ELISA wells were coated with cedar pollen SPE and then IgE binding of allergic patients was measured in the presence of purified native CryjI competing in solution. The source of allergic IgE in these assays was a pool of plasma (shown as PHP) from 15 patients or 7 individual plasma samples from patients with a cedar pollen MAST score of 2.5 or higher. . This competitive assay using pooled human plasma samples compares the competitive binding ability of purified natural CryjI to cedar pollen SPE and an unrelated allergen source, ryegrass SPE. FIG. 6 shows the graphical results of a competitive ELISA using pooled human plasma. The concentration of protein present in the cedar pollen SPE is about 170 times greater than the purified natural CryjI at each competition point. From this analysis it is clear that purified native CryjI competes very well with the full range of proteins present in cedar pollen soluble pollen extracts for IgE binding. This means that most of the anti-CryjI IgE reactivity is directed against natural CryjI. Negative controls indicate that specific competitive activity in solution and binding to competitive SPE cannot be completely removed. This assay was repeated for individual patients as a measure of the extent of IgE response within the allergic population. FIG. 7 shows the result that this competition for binding to SPE was performed with purified native CryjI. These results indicate that despite these patients showing different dose responses to cedar pollen SPE, each of the 7 patients' IgE binding to cedar pollen SPE can be comparable to purified native CryjI. Show. The implication of these data is that for each patient, the IgE reactivity directed against CryjI predominates, but this reactivity varies between patients. The overall conclusion is that these data support previous findings that CryjI is the major allergen of cedar pollen (Yasueda et al. (1988), supra).
The reactivity of IgE from cedar pollen allergic patients to its pollen proteins is dramatically reduced when these proteins are denatured. One way to analyze this property is by direct binding ELISA, where the coated antigen is a modified cedar pollen SPE modified by boiling in the presence of cedar pollen SPE or reducing agent DTT. This is then tested for IgE binding reactivity using plasma from allergic patients. FIG. 8a shows a direct binding assay with 7 individual plasma samples for this SPE. In FIG. 8b, the binding results using the modified SPE show that the reaction was significantly reduced after this treatment. To examine the extent of CryjI binding to ELISA wells, CryjI was detected with rabbit polyclonal antisera against the Amb a I and II protein families. These ragweed proteins have a high degree of sequence identity (46%) with CryjI, and this antiserum can be used as a cross-reactive antibody detection system. In conclusion, these data indicate a significant loss of IgE reactivity after denaturation of cedar pollen SPE.
Example 8
IgE reactivity and histamine release assay
The recombinant CryjI protein (rCryjI) expressed in bacteria and then purified (as described in Example 5) was tested for IgE reactivity. The first method applied to this study was a direct ELISA where wells were coated with recombinant CryjI and IgE binding was assayed for individual patients. The only positive signals in this data set are for two control antisera rabbit polyclonal anti-Amb a I and II (rabbit anti-Amb a I and II) and Amb a I that cross-react with CryjI prepared in the conventional manner. From the raised monoclonal antibody CBF2. By this method, all patients tested showed no IgE reactivity with recombinant CryjI.
Another analytical method applied to testing IgE reactivity against recombinant CryjI was a capture ELISA. This analysis relies on the use of a limited antibody (here CBF2) that binds to the antigen and provides binding of the antibody to other epitope sites. The format of this capture ELISA is 1) coating the wells with MAb CBF2, 2) adding antigen or PBS (as a kind of negative control) and capturing by specific interaction with the coated MAb, 3) for control Either antibody anti-Amb a I and II (FIG. 10b) or human allergic plasma (FIG. 10a) is added as a detection antibody, and 4) the detection of antibody binding is assayed. Pooled human plasma (PHP) (15 patients) was used for IgE analysis. The conclusion from these results is that this analytical method does not show specific binding of human allergic IgE to rCryjI. However, rCryjI capture works as evidenced by the control antibody binding curve shown in FIG. 10b. The lack of IgE binding to rCryjI expressed in E. coli may be due to the absence of carbohydrate or any other post-translational modification and / or the majority of IgE cannot react with denatured CryjI. RAST, competition ELISA and western blotting data also do not show specific IgE binding to rCryjI (data not shown).
A histamine release assay was performed on cedar pollen allergic patients using cedar pollen SPE, purified natural CryjI and rCryjI as additional antigens. This assay is a measure of IgE reactivity by human basophil mediator release. The results of this assay shown in FIG. 11 show strong histamine release by purified native CryjI and cedar pollen SPE over a wide range of concentrations. The only point where there is any measurable histamine release by CryjI is at a maximum concentration of 50 μg / ml. Two possible explanations for this release by rCryjI are 1) a specific reaction with a very low proportion of anti-CryjI IgE capable of recognizing the recombinant form of CryjI, or 2) bacteria observed only at the highest antigen concentration Non-specific release caused by a low number of contaminants. So far this result has only been shown in one patient. Furthermore, the data shown is from one data point at each protein concentration.
The substance expressed in E. coli has T cell reactivity (Example 6), but does not appear to bind to IgE from Cryptomeria japonica atopes, and in vitro from mast cells and basophils of such atopes. It would also be possible to use this recombinantly expressed CryjI protein for immunotherapy because it also does not cause histamine release in Expression of rCryjI that can bind to IgE is probably achievable in yeast, insect (baculovirus) or mammalian cells (eg CHO, human and mouse). A specific example of expression in mammalian cells may be the use of a pcDNAI / Amp mammalian expression vector (Invitrogen, San Diego, Calif.) That expresses recombinant CryjI in COS cells. RCryjI, which can bind IgE to activity, may be important for the use of recombinant materials for diagnostic purposes.
A direct ELISA format was used to analyze IgE reactivity against selected CryjI peptides. ELISA wells were coated with 25 peptides derived from CryjI and assayed for IgE binding. Figures 15a and 15b are graphs of these binding results using PHP (15 patients) as a cedar pollen allergic IgE source. This plasma pool can be bound to denatured SPE (as measured by direct ELISA) and therefore enriched for IgE which could increase the chance of reactivity to these peptides. Blended into In this assay, peptide IgE binding ability was compared to that of purified native CryjI and rCryjI. The only specific IgE detected in this assay is against purified native CryjI, in support of the finding that cedar allergic IgE does not bind to recombinant CryjI or the tested recombinant CryjI peptide. (FIG. 15).
Although the invention has been described with reference to preferred embodiments thereof, other embodiments can achieve the same results. Variations and modifications of the present invention will be obvious to those skilled in the art, but all such modifications and equivalents, and in accordance with the spirit of the present invention, are to be protected in the claims.
Example 9
Extraction of RNA from Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana and Cupressus arizonica pollen and cloning of CryjI homologs JunsI and JunvI
Fresh pollen was collected from a single Juniperus virginiana tree from Arnold Arboretum (Boston, Mass.) And immediately frozen on dry ice. Juniperussabinoides and Cupressus arizonica pollen were purchased from Greer Laboratories, Inc. (Lenoir, North Carolina). Total RNA was prepared as described in Example 3 from pollen of J. virginiana, J. sabinoides and C. arizonica. Single-stranded cDNA was obtained from Example 5 using 5 μg total pollen RNA from J. virginiana and 5 μg total pollen RNA from J. sabinoides using a cDNA synthesis system kit (BRL, Maryland, BRL). Synthesized as described.
Initial attempts to clone CryjI homologues from two species were performed using various pairs of CryjI specific oligonucleotides in PCR amplification on both cDNAs. PCR was performed as described in Example 3. The oligonucleotide primer pairs used were CP-9 (SEQ ID NO: 8) / CP-17 (SEQ ID NO: 14), CP10 (SEQ ID NO: 9) / CP-17 (SEQ ID NO: 14), CP-10 (SEQ ID NO: 9) / CP-16 (SEQ ID NO: 13), CP-10 (SEQ ID NO: 9) / CP-19 (SEQ ID NO: 16), CP-10 (SEQ ID NO: 16) NO: 9) / CP-18 (SEQ ID NO: 15), CP-13 (SEQ ID NO: 10) / CP-17 (SEQ ID NO: 14) and CP-13 (SEQ ID NO: 10) / CP -19 (SEQ ID NO: 16). Gross et al. (1978)Scand.J.Immunol.8: 437-441 reports that the first 5 amino acids of J. sabinoides are identical to those of CryjI, so in most reactions CP-10 (SEQ ID NO: 9) is the 5 'primer. Used as. These oligonucleotides and oligonucleotide primer pairs are described in Example 3.
None of the above primer pairs produced PCR products for any of the species when viewed on EtBr stained 1% agarose (Main, Rockland, FMC Bioproducts) minigels.
The next series of PCR amplification intended to clone CryjI homologues from J. sabinoides and J. virginiana was performed on double-stranded linker-linked cDNA synthesized from RNA from various sources. Double stranded cDNA was synthesized as described in Example 3 from 5 μg each of pollen RNA of J. virginiana and J. sabinoides. This double stranded cDNA was used for the AT (SEQ ID NO: 20) and AL (SEQ ID NO: 22) oligonucleotides that had been ethanol precipitated and self-annealed for use in the modified uncarded PCR described in Example 3. Ligated. Several CryjI primers were then used in combination with AP (SEQ ID NO: 21) in an attempt to isolate CryjI homologues from these two species. The sequences of AT (SEQ ID NO: 20), AL (SEQ ID NO: 22) and AP (SEQ ID NO: 21) are given in Example 3. Initially, a first PCR was performed using 100 pmoles of each oligonucleotide CP-10 (SEQ ID NO: 9) and AP (SEQ ID NO: 21). Three percent (3 μl) of this initial growth was then used in a second PCR with 100 pmoles of CP-10 (SEQ ID NO: 9) and APA (SEQ ID NO: 98), respectively (APA is the sequence 5′-GGGCTCGAGCTGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 ′, wherein nucleotides 1-15 represent PstI and XhoI endonuclease restriction sites added for cloning purposes, nucleotide 33 may be A or C) . In the second PCR reaction test, a broad smear having no separated band appeared on the EtBr-stained agarose gel. Attempts to clone CryjI homologues from these PCR products were unsuccessful. This approach would have cloned the carboxyl portion of these genes. The degenerate CryjI primers CP-1 (SEQ ID NO: 3), CP-4 and CP-7 (SEQ ID NO: 6) described in Example 3 were then respectively combined with double-stranded linker-bound J. virginiana. And in the first PCR for J. sabinoides cDNA with AP (SEQ ID NO: 21). Various primer pair combinations were used in the second PCR as follows: CP-2 (SEQ ID NO: 4) / AP and CP-4 / AP (in the first PCR amplification mixture of CP-1 / AP). CP-2 / AP and CP-5 (SEQ ID NO: 5) / AP (in the first PCR amplification mixture of CP-4 / AP) and CP-8 (SEQ ID NO: 7) / AP (CP-7) / AP to the first PCR amplification mixture). Only the last amplification (second PCR amplification of CP-8 / AP) produced a band on the EtBr stained minigel in the test. Others gave a smear that could not be cloned into pUC19. Both the J. virginiana and J. sabinoides second PCRs (referred to as JV21 and JS17) using CP-8 and AP as described in Example 3 resulted in amplified products of approximately 200 base pairs in length, respectively. . This amplified DNA is recovered as described in Example 3 and digested simultaneously with XbaI and PstI in a 50 μl reaction and precipitated to reduce the volume to 10 μl, preparative 2% GTG NuSeive low melting point Electrophoresis was performed in a gel (Main, Rockport, FMC). Appropriately sized DNA bands were visualized by EtBr staining, removed and sequenced by the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (Supra) using a commercially available sequencing kit (Sequenase kit, Cleveland, Ohio, USBiochemicals). For ligation into appropriately digested pUC19. Two JS17 clones (pUC19JS17d and pUC19JS17f) and one JV21 clone (pUC19JV21g) were sequenced to find that they contained sequences homologous to the CryjI nucleotide and deduced the amino acid sequence. The CryjI homologues isolated from this J. sabinoides and J. virginiana RNA were called JunsI and JunvI, respectively.
CryjI primers CP-9 (SEQ ID NO: 8) and CP-10 (SEQ ID NO: 9) work together with AP (SEQ ID NO: 21) in the first and second PCR, respectively, to produce JunsI and JunvI cDNAs. Is amplified. The sequences of these primers are 2 nucleotides in CP-9 (T instead of A at position 5 in CP-9, C instead of A in position 12) and 1 nucleotide in CP-10 (12 for JunsI). The sequence is essentially the same as that of JunsI I and JunvI, except for C in place of A). However, the first PCR using CP-9 and AP and the second PCR using CP-10 and AP produced no identifiable JunsI or JunvI product when viewed on an EtBr-stained agarose gel.
Oligonucleotide J1 (SEQ ID NO: 99) was synthesized. J1 and all subsequent oligonucleotides were synthesized on an ABI394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). The first PCR was performed using AP and J1 with J.virginiana and J.sabinoides cDNA. J1 has the sequence 5'-CATAAAAATGGCTTCCCCA-3 'corresponding to nucleotides 20-37 of JunsI (Figure 16) and nucleotides 30-47 of JunvI (Figure 17). A second PCR amplification was performed for the first J1 / AP amplification of J. sabinoides cDNA using primer J2 (SEQ ID NO: 100) and AP. J2 has the sequence 5′-CGGGAATTCTAGATGTGCAATTGTATCTTGTTA-3 ′, where nucleotides 1-13 represent EcoRI and XbaI endonuclease restriction sites added for cloning purposes, and the remaining nucleotides are JunsI sequences ( This corresponds to nucleotides 65 to 84 in FIG. A second propagation from J. virginiana cDNA was performed using AP and J3 (SEQ ID NO: 101) (J3 has the sequence 5'-CGGGAATTCTAGATGTGCAATAGTATCTTGTTG-3 ', where nucleotides 1-13 are , Representing EcoRI and XbaI endonuclease restriction sites added for cloning purposes, the remaining nucleotides corresponding to nucleotides 75-94 in the JunvI sequence (FIG. 17)). No specific amplification product was observed in any of the second reactions. Primers referred to as ED (SEQ ID NO: 102) and EDT (SEQ ID NO: 103) were added in primers J1 (SEQ ID NO: 99), J2 at a molar ratio of 3: 1 (ED: EDT) as follows: Used with (SEQ ID NO: 100) and J3 (SEQ ID NO: 101). EDT has the sequence 5'-GGAATTCTCTAGACTGCAGGTTTTTTTTTTTTTTT-3 '. Nucleotides 1-20 of EDT were added to the poly T track to create EcoRI, XbaI and PstI endonuclease restriction sites for cloning purposes. The ED has the sequence 5'-GGAATTCTCTAGACTGCAGGT-3 'corresponding to nucleotides 1 to 21 of EDT. These oligonucleotides and their use have been described previously (Morgenstern et al. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88: 9690-9694). ED / EDT is used in the first PCR with oligonucleotide J1 for amplification from J. sabinoides and J. virginiana cDNA, and then the second PCR is used for oligonucleotide J2 and APA (for J. sabinoides) or J3 and APA. (For J. virginiana). No specific product was identified from these amplifications. The final PCR set using J1, J2 and J3 was attempted using oligonucleotide APA. APA is used in the first PCR reaction with J1 for J. sabinoides and J. virginiana, and then a second amplification is performed using J2 (for J. sabinoides) or J3 (for J. virginiana) and APA. It was. No specific product was identified from these amplifications. Subsequently, degenerated primer CP-57 (SEQ ID NO: 104) was synthesized. CP-57 has the sequence 5'-GGCCTGCAGTTAACAGCGTTTGCAGAAGGTGCA-3 'where T at position 10 may be C, T at position 11 may be C, A at position 13 may be G, G may be A, T or C, G at the 18th position may be T, T at the 19th position may be C, G at the 22nd position may be A, T or C, and C at the 23rd position may be G; A at position 24 may be C, G at position 25 may be A, T or C, A at position 27 may be G, G at position 28 may be A, T or C, and G at position 29 is C However, T in the 30th position may be A, and G in the 31st position may be A. Nucleotides 1-9 of CP-57 were added for cloning purposes to create a PstI site, but nucleotides 10-12 were complementary to the stop codon and nucleotides 13-33 were essentially amino acids CysSerLeuSerLysArgCys (Figure It is complementary to the coding strand sequence encoding amino acids 347-353 (SEQ ID NO: 2) of 4b; corresponding to nucleotides 1167-1187 (SEQ ID NO: 1) of FIG. 4b). This was used in the first PCR for J. sabinoides and J. virginiana double-stranded linker-linked cDNAs along with J1, and then for the second PCR, CP-57 and J2 for J. sabinoides. For J. virginiana, CP-57 and J3 were used. Three additional degenerate CryjI oligonucleotides were synthesized. CP-62 ((SEQ ID NO: 105) has the sequence 5′-CCACTAAATATTATCCA-3 ′, where A at position 3 may be G, A at position 6 may be G, and T at position 9 May be A or G, and T at position 12 may be A or G. This degenerate oligonucleotide sequence consists essentially of amino acids TrpIlePheSerGly (amino acids 69-74 of FIG. 4a (SEQ ID NO: 2); Complementary to the coding strand sequence encoding nucleotides 333 to 349 (corresponding to SEQ ID NO: 1) CP-63 (SEQ ID NO: 106) has the sequence 5'-GCATCCCCATCTTGGGGATG-3 ' Here, A in the 3rd position may be G, A in the 9th position may be G, T in the 12th position may be C, G in the 15th position may be A, T or C, and A in the 18th position is G. This degenerate oligonucleotide sequence contains the amino acid HisProG. Complementary to a sequence capable of encoding lnAspGlyAspAla (corresponding to amino acids 146-152 (SEQ ID NO: 2) in Figure 4a; nucleotides 564-583 (SEQ ID NO: 1) in Figure 4a) CP-64 ( SEQ ID NO: 107) has the sequence 5′-GTCCATGGATCATAATTATT-3 ′, where T at position 6 may be C, A at position 9 may be G, and A at position 12 may be G. A at position 15 may be G and A at position 18 may be G. This degenerate oligonucleotide sequence comprises amino acids AsnAsnTyrAspProTrpThr (amino acids 243 to 249 of FIG. 4b; nucleotides 855 to 874 of FIG. 4b (SEQ ID NO: 2 In the first PCR amplification, the AP is complementary to CP-62, CP-63, CP-64 and CP-3 (SEQ ID NO: 5). (As described in Example 3) and used for both double-stranded linker-linked cDNAs of J. sabinoides and J. virginiana A diagnostic PCR was performed on each first reaction mixture. 3% of the first reaction was amplified using AP and CP-8 as described above, with an expected band of approximately 200 base pairs for both J. sabinoides and J. virginiana. And in the diagnostic PCR from the first PCR using CP-63.
Next, a degenerated primer CP-65 (SEQ ID NO: 108) was synthesized. CP-65 has the sequence 5'-GCCCTGCAGTCCCCATCTTGGGGATGGAC-3 ', where A at position 15 may be G, T at position 18 may be C, and G at position 21 may be G, A, T or C. Alternatively, A at position 24 may be G, and G at position 27 may be A, T, or C. Although nucleotides 1-9 of CP-65 were added for cloning purposes to create a PstI restriction site, the remaining degenerate oligonucleotide sequence essentially consists of amino acids ValHisProGlnAspGlyAsp (amino acids 145-151 of FIG. 4a (SEQ ID NO: 2); complementary to the coding strand sequence that can encode nucleotides 561-580 (corresponding to SEQ ID NO: 1) in FIG. 4a). AP was used with CP-65 in the second PCR of the first AP / CP-63 amplification of J. sabinoides and J. virginiana described above. These reactants were called JS42 (J. sabinoides) and JV46 (J. virginiana). The second PCR gave a band of approximately 600 base pairs when both were examined by EtBr staining on a 1% agarose minigel. DNA from JS42 and JV46 PCR was recovered as described in Example 3, digested simultaneously with XbaI and PstI in a 15 μl reaction, then a preparative 2% GTGSeaPlaque low melting gel (Main, Rockport, FMC) Electrophoresed in. Appropriately sized DNA bands are visualized by EtBr staining, removed, and sequenced by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., Supra) using a commercially available sequencing kit (Sequenase kit, Ohio, Cleveland, USBiochemicals). For determination, it was ligated into appropriately digested pUC19. Clones were sequenced using forward and reverse primers for M13 (Massachusetts, Beverly, N.E. Biolabs) and internal sequencing primer J4 (SEQ ID NO: 109). For both JunsI and JunvI, J4 has the sequence 5′-GCTCCACCATGGGAGGCA-3 ′ (nucleotides 177-194 in FIG. 16 and nucleotides 187-204 in FIG. 17), which essentially consists of the amino acid SerSerThrMetGlyGly (FIG. 16 ( SEQ ID NO: 95) and coding strand sequences encoding JunsI and JunvI amino acids 30-35) shown in SEQ ID NO: 97), respectively.
Although the sequence of this JunsI clone (referred to as pUC19JS42e) has a different length in the 5 ′ untranslated region, it is found to be identical to the sequences of clones pUC19JS17d and pUC19JS17f in their overlapping regions. It was issued. Clone pUC19JS17d had the longest 5 'untranslated sequence. Nucleotides 1-141 in FIG. 16 correspond to the sequence of clone pUC19JS17d. Clone pUC19JS42e corresponds to nucleotides 1-538 in FIG.
The sequences of the JunvI clones, called pUC19JV46 and pUC19JV46b, were identical in their overlapping regions to the sequence of clone pUC19JV21g (however, nucleotide 83 in FIG. there were). This nucleotide difference does not result in the expected amino acid change. Clones pUC19JV46a, pUC19JV46b and pUC19JV21g correspond to nucleotides 1-548, 1-548 and 2-151 of FIG. 17, respectively.
CDNAs encoding the remainder of these JunsI and JunvI genes were deduced from linker-linked cDNAs, respectively, by degenerate oligonucleotide CP-66 (SEQ ID NO: 110) (CP-66 has the sequence 5′-CATCCGCAAGATGGGGATGC-3 ′. Where T at the 3rd position may be C, G at the 6th position may be A, T or C, A at the 9th position may be G, T at the 12th position may be C, and 18th position T may be C) and AP was cloned in the first PCR. The sequence of CP-66 is complementary to that of CP-63. A second PCR was performed with 3% of the initial amplification mixture using 100 pmoles of AP and CP-67 each. CP-67 (SEQ ID NO: 111) has the sequence 5′-CGGGAATTCCCTCAAGATGGGGATGCGCT-3 ′, where A at position 15 may be G, T at position 18 may be C, and T at position 24 is C may be sufficient, G at the 27th position may be A, T or C, and C at the 28th position may be T. The nucleotide sequence 5'-CGGGAATTC-3 '(bases 1-9) of primer CP-67 was added for cloning purposes to create an EcoRI restriction site. The remaining oligonucleotide sequence essentially encodes the amino acid ProGlnAspGlyAlaLeu (corresponding to amino acids 147-153 (SEQ ID NO: 2) in FIG. 4a; nucleotides 567-586 (SEQ ID NO: 1) in FIG. 4a). . These DNA products from J. sabinoides amplification (referred to as JS45) and DNA products from J. virginiana amplification (referred to as JV49ii) were purified as described in Example 3, and EcoRI and XbaI ( JS45) or EcoRI and Asp718I (JV49ii) and electrophoresed in a preparative 1% low melting gel. A major DNA band approximately 650 bp long was removed and ligated into pUC19 for sequencing. DNA was sequenced by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., Supra) using a commercially available kit (sequenase kit, Ohio, Cleveland, U.S. Biochemicals).
Two clones, called pUC19JS45a and pUC19JV49ia for JunsI and JunvI, were transferred to forward and reverse primers for M13 (Massachusetts, Beverly, NEBioLabs) and internal sequencing primers J8 (SEQ ID NO: 112), J9 ( SEQ ID NO: 113) and J12 (SEQ ID NO: 114) (for JunsI) and J6 (SEQ ID NO: 115) and J11 (SEQ ID NO: 116) (for JunvI) were sequenced. J8 has the sequence 5′-TAGGACATGATGATACAT-3 ′ (nucleotides 690-707 in FIG. 16), which is essentially the coding strand sequence that encodes JunsI amino acids LeuGlyHisAspAspThr (amino acids 201-206 in FIG. 16). is there. J9 has the sequence 5'-GAGATCTACACGAGATGC-3 '(nucleotides 976-993 in FIG. 16), which is the coding strand sequence that essentially encodes JunvI amino acids ArgSerThrArgAspAla. J12 has the sequence 5'-AAAACTATTCCCTTCACT-3 'where A at position 1 may be G and A at position 4 may be T. This is a non-coding strand sequence corresponding to the coding strand sequence (nucleotides 875 to 892 in FIG. 16) encoding JunsI amino acids SerGluGlyAsnSerPhe (amino acids 263 to 268 in FIG. 16). J6 is the coding strand sequence having the sequence 5'-TAGGACATAGTGATTCAT-3 '(nucleotides 700-717 in FIG. 17) and essentially encoding the JunvI amino acid LeuGlyHisSerAspSer. J11 has the sequence 5′-CCGGGATCCTTACAAATAACACATTAT-3 ′, where nucleotides 1-9 encode a BamHI restriction site for cloning purposes, nucleotides 10-27 are nucleotides 1165-1182 of FIG. Corresponds to the complementary coding strand sequence (within the JunvI 3 ′ untranslated region). The sequence of clone pUC19JS45a corresponds to nucleotides 527 to 1170 in FIG. The sequence of clone pUC29JV49ia corresponds to nucleotides 537 to 1278 in FIG.
JunsI full-length clones were amplified using PCR. Oligonucleotides J7 (SEQ ID NO: 117) and J10 (SEQ ID NO: 118) were used in a PCR reaction with J. sabinoides double-stranded linker-linked cDNA as described above. J7 has the sequence 5′-CCCGAATTCATGGCTTCCCCATGCTTA-3 ′, where nucleotides 1-9 encode an EcoRI restriction site added for cloning purposes, nucleotides 10-27 (nucleotides 26- (Corresponding to 43) is the coding chain sequence encoding the JunsI amino acids MetAlaSerProCysLeu (amino acids -21 to -16 in FIG. 16). J10 has the sequence 5′-CCGGGATCCCGTTTCATAAGCAAGATT-3 ′, where nucleotides 1-9 encode a BamHI restriction site added for cloning purposes, and nucleotides 10-27 are JunsI 3 ′ non- Non-coding strand sequence complementary to nucleotides 1140 to 1157 (FIG. 16) from the translation region. The PCR product (referred to as JS53ii) gave a band of approximately 1200 bp when examined by EtBr staining on a 1% agarose minigel. DNA from this JS53ii PCR was recovered as described in Example 3. After precipitation and washing with 70% EtOH, the DNA was digested simultaneously with EcoRI and BamHI in a 15 μl reaction and electrophoresed in a preparative 1% GTG SeaPlaque low melting gel (Main, Rockport, FMC). . Appropriately sized DNA bands were visualized by EtBr staining, removed and sequenced by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., Supra) using a commercially available sequencing kit (Sequenasekit, Ohio, Cleveland, USBiochemicals). For this purpose, it was ligated into appropriately digested pUC19. The resulting clone, pUC19JS53iib, was partially sequenced using forward and reverse primers for M13 (Massachusetts, Beverly, N.E. Biolabs) and internal sequencing primer J4. The sequence of this pUC19JS53iib was determined and was identical to that obtained from clones pUC19JS17d, pUC19JS42e and pUC19JS45a. The nucleotide sequence of this clone pUC19JS53iib corresponds to nucleotides 26 to 1157 in FIG.
The nucleotide and predicted amino acid sequence of JunsI (SEQ ID NOs: 94 and 95) is shown in FIG. JunsI has a 1101 nucleotide open reading frame corresponding to nucleotides 26 to 1126 in FIG. 16 (which may encode a 367 amino acid protein). Nucleotides 1-25 and 1130-1170 in FIG. 16 are 5 'and 3' untranslated regions, respectively. The initiating Met encoded by nucleotides 26-28 in FIG. 16 is a nucleotide consensus sequence (AACAATGGC; Lutcke et al., Supra) containing the initiating Met in plants with nucleotides 23-30 in FIG. 16 (AAAAATGGC). Identified. There is also an in-frame stop codon immediately 5 'to the codon encoding this start Met. Amino acids-21 to -1 in FIG. 16 correspond to the predicted leader sequence. The mature amino terminus of JunsI was identified as amino acid 1 in FIG. 16 by purified protein sequence analysis of purified JunsI (Gross et al., Supra). The mature form of JunsI corresponds to amino acids 1 to 346 in FIG. 16, but has the expected molecular weight of 37.7 kDa. JunsI has three potential N-linked glycosylation sites with the consensus sequence Asn-Xxx-Ser / Thr.
The JunvI nucleic acid and predicted amino acid sequence (SEQ ID NO: 96 and 97) is shown in FIG. Nucleotides 1-35 and 1130-1170 are 5 'and 3' untranslated regions, respectively. The starting nucleotide encoded by nucleotides 36-38 of FIG. 17 is nucleotides 23-30 of FIG. 17 (AAAAATGGC) with 89% identity to the consensus sequence containing the starting Met in plants (AACAATGGC; Lutcke et al., Supra). Identified. JunsI (FIG. 16) and JunvI (FIG. 17) nucleic acids are identical in the region around this initiating Met. There are also two in-frame stop codons in the 5 'untranslated region of FIG. JunvI has an open reading frame of 1,100 nucleotides corresponding to nucleotides 36 to 1145 of FIG. 17, which can encode a 370 amino acid protein. Nucleotides 1146 to 1148 in FIG. 17 encode a stop codon. JunvI amino acids-21 to -1 (Figure 17) correspond to the predicted leader sequence. The mature amino terminus of JunvI was identified as amino acid 1 in FIG. 17 by comparison with the sequence of CryjI (FIG. 4a) and JunsI (FIG. 16). The mature form of JunvI corresponding to amino acids 1 to 349 in FIG. 17 has the expected molecular weight of 38.0 kDa. JunvI has four potential N-linked glycosylation sites with the consensus sequence Asn-Xxx-Ser / Thr.
As shown in Table I, JunsI and JunvI mature amino acid sequences are 80.9% homologous to each other (75.4% identical and 5.5% similar). JunsI and CryjI mature amino acid sequences are 87% homologous (80.1% identical and 6.9% similar), and JunvI and CryjI mature amino acid sequences are 80.5% homologous (72. 5% identical and 8% similar). The homology between the CryjI peptide sequence identified as containing T cell epitopes in Example 6 and the corresponding JunsI and JunvI sequences is also very high. For example, peptide CJ1-22 (FIG. 13) corresponding to amino acids 211-230 of CryjI contains the major T cell epitope (FIG. 14). CJ1-22 has 95% identity (19/20 identical amino acids) and 85% homology (16/20 identical amino acids, 1/20 similar amino acids) with the corresponding regions of JunsI and JunvI, respectively. . This high sequence homology suggests that immunotherapy effective in the treatment of allergic diseases caused by CryjI may also be effective in the treatment of allergic diseases caused by CryjI homologues. All nucleic acid and amino acid analyzes were performed using software included in PCGENE (Intelligents, California, Mountain View).
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Example 10
C. japonica, J. et al. sabinoides, J. et al. virginiana and C.I. Northern blot analysis of arizonica RNA
C. japonica, J. et al. sabinoides, and J.H. Northern blot analysis was performed on RNA isolated from virginiana pollen. C. collected in both the United States (Example 3) and Japan (Example 4). RNA from japonica pollen was examined. Essentially using the Sambrook method described above, 15 μg of each RNA is 1% containing formaldehyde 38% and 1X MOPS (20X = 0.4 M MOPS, 0.02 M EDTA, 0.1 M NaOAc, pH 7.0) solution. Run on a 2% agarose gel. RNA sample (initially precipitated with 1/10 volume of sodium acetate, 2 volumes of ethanol to reduce volume, dH2O resuspended in 5.5 μl) was run with 10 μl formaldehyde / formamide buffer containing loading dye with a final concentration of 15.5% formaldehyde, 42% formamide, and 1.3X MOPS solution. After transferring the sample to Genescreen Plus (NEN Research Products, Massachusetts, Boston) by capillary transfer in 10 × SSC (20 × = 3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate), the membrane was baked at 80 ° C. for 2 hours and 3 minutes. Irradiated with ultraviolet rays. Membrane prehybridization was performed with 4 mL of 0.5 M NaPO.Four(PH 7.2) 1 hour at 60 ° C. in 1 mM EDTA, 1% BSA, and 7% SDS. Antisense probes were low melted by asymmetric PCR (McCabe, PC, PCR Protocols. AGide to Methods and Applications, Innis, M. et al., Editing, Academic Press, Boston, (1990), pages 76-83). Synthesized by amplification of JC91a in agarose (described in Example 3). In this case, 2 μl of DNA was added to 2 μl of dNTP mix (0.167 mM dATP, 0.167 mM dTTP, 0.167 mM dGTP0, and 033 mM dCTP), 2 μl of 10 × PCR buffer, 10 μl32P-dCTP (100 μCi; Amersham, Illinois, Arlington Heights), 1 μl (100 pmol) antisense primer CP-17, 0.5 μl Taq polymerase, and dH2Amplify with O to 20 μl. 10 × PCR buffer, dNTPs and Taq polymerase were from Perkin Elmer Cetus (Connecticut, Noau Oak). Amplification consisted of denaturing 30 times for 45 seconds at 94 ° C., annealing the primer for 45 seconds at 60 ° C. to a template and extending the chain for 1 minute at 72 ° C. The reaction was stopped by adding 100 μl TE and the probe was placed in a 3 cc G-50 spin column (2 ml G-50 Sephadex [Pharmacia, Sweden, Upsala] in a 3 cc syringe packed with glass wool equilibrated with TE) And counted with a 1500 TriCarb Liquid Scintillation Counter (Packard, Illinois, Downers Globe). Probe in prehybridizing buffer 106Added at cpm / ml and prehybridization was performed at 60 ° C. for 16 hours. Blots were performed at high stringency conditions: 15 min with 0.2 × SSC / 1% SDS at 3 × 65 ° C., then wrapped in plastic wrap and exposed to −80 ° C. film. This Northern blot exposure for 7 hours Japan (United States) (FIG. 19a, lane 1), C.I. Japana (Japan) (FIG. 19a, lane 2), J. sabinoides (Figure 19a, lane 3) and J. virginiana (FIG. 19a, lane 4) showed a single thick band at approximately 1.2 kb for RNA. This band is the expected size for CryjI, JunsI and JunvI as predicted by PCR analysis of cDNA. The different band intensities in each lane can reflect differences in the amount of DNA loaded on the gel. The positions of molecular weight standards 1.6 and 1.0 kb are shown in FIGS. 19a and 19b.
J. et al. sabinoides and C.I. RNA isolated from arizonica was analyzed in another Northern blot. J. et al. 5 μg of total RNA from Sabinoides and C.I. 5 μg of total RNA from arizonica was probed as described. In this blot, J. et al. sabinoides (Figure 19a, lane 1) and C.I. A 1.2 kb band was observed for both arizonica (FIG. 19b, lane 2) and C.I. 2 shows that arizonica has a CryjI homologue. Other related trees are also expected to have homologues.
Although the invention has been described with reference to preferred embodiments thereof, other embodiments can achieve the same results. Changes and modifications to the present invention will be apparent to those skilled in the art and are intended to include all such modifications and equivalents in accordance with the true spirit and scope of the appended claims.
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Claims (5)

杉花粉蛋白質アレルゲンＣｒｙｊＩの単離されたペプチドであって、該ペプチドは、該蛋白質アレルゲンに感受性の個人群において求めて平均Ｔ細胞刺激インデックス（ＳＩ）少なくとも３．５及びポジティビティーインデックス（ＰＩ）少なくとも１００を有し且つ当該ペプチドは、
ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、
ＣＪ１−１７（SEQ ID NO:４２）、
ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、
ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、
ＣＪ１−２３（SEQ ID NO:４８）、
ＣＪ１−２４（SEQ ID NO:４９）、
ＣＪ１−２６（SEQ ID NO:５１）、
ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）、
ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）及び
ＣＪ１−３５（SEQ ID NO:６０）並びにこれらの組合せ
からなる群より選ばれる、上記の単離されたペプチド。An isolated peptide of the cedar pollen protein allergen CryjI, said peptide comprising an average T cell stimulation index (SI) of at least 3.5 and a positive index (PI) of at least as determined in a population sensitive to said protein allergen 100 and the peptide is
CJ1-16 (SEQ ID NO: 41),
CJ1-17 (SEQ ID NO: 42),
CJ1-20 (SEQ ID NO: 45),
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47),
CJ1-23 (SEQ ID NO: 48),
CJ1-24 (SEQ ID NO: 49),
CJ1-26 (SEQ ID NO: 51),
CJ1-27 (SEQ ID NO: 52),
CJ1-32 (SEQ ID NO: 57) and
CJ1-35 (SEQ ID NO: 60) and combinations thereof
The above-mentioned isolated peptide selected from the group consisting of: ペプチドが、少なくとも７．０のＳＩを有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。Peptide, as well as at least 7. Having a 0 of SI, isolated peptide of claim 1. ペプチドを、
ＣＪ１−１６（SEQ ID NO:４１）、
ＣＪ１−２０（SEQ ID NO:４５）、
ＣＪ１−２２（SEQ ID NO:４７）、
ＣＪ１−２７（SEQ ID NO:５２）及び
ＣＪ１−３２（SEQ ID NO:５７）
からなる群より選ぶ、請求項２に記載の単離されたペプチド。Peptides,
CJ1-16 (SEQ ID NO: 41),
CJ1-20 (SEQ ID NO: 45),
CJ1-22 (SEQ ID NO: 47),
CJ1-27 (SEQ ID NO: 52) and CJ1-32 (SEQ ID NO: 57)
The isolated peptide of claim 2 , selected from the group consisting of: 杉花粉蛋白質アレルゲンＣｒｙｊＩの単離されたペプチドであって、該ペプチドは、請求項１で規定したペプチドの少なくとも２つを含む、上記の単離されたペプチド。Cedar An isolated peptide of pollen proteins allergen CryjI, the peptide comprises at least two peptides as defined in claim 1, said isolated peptide. 請求項１〜４の何れか一つに記載の単離されたペプチドをコードする単離された核酸分子。An isolated nucleic acid molecule encoding the isolated peptide of any one of claims 1-4 .
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