JP4098841B2 - Method for producing fermented food and drink - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵飲食品の製造方法及び新規酵母に関し、詳しくは、調味用ソース等の発酵飲食品をβ−フェネチルアルコール含量の高い香味のよい製品として製造する方法及びアルコール発酵に用いた際に高いβ−フェネチルアルコール生産能を示す新規酵母に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母を用いた発酵飲食品の製造においては、酵母の酵素反応によるアルコール発酵の過程でエタノールとともにエタノール以外のアルコール類やエステル類、アルデヒド類のような様々の香味成分が生成されていることが知られている。発酵飲食品においては、この様なアルコール発酵の過程で生成される香味成分が製品中で重要な要素を占めている。このため、酵母を用いたアルコール発酵において香味成分を効率よく生産させようとする研究が数多くなされている。例えば、イソアミルアルコール、イソブチルアルコール、β−フェネチルアルコールあるいは２−メチル−１−ブタノール等の生産能がそれぞれ高い酵母を用いた発酵飲食品の製造方法等が提案されている。
【０００３】
これらの中でも、芳香族アルコールのひとつで薔薇様の香りを有するβ−フェネチルアルコールを生産する能力が高い酵母については、これまでにサッカロマイセス属に属するフルオロフェニルアラニン耐性の酵母からサッカロマイセス セレビジェＦ４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０２５）等が得られており、これが日本酒等の製造に用いられた例（特開平２−９２２６５号公報）が知られている。
【０００４】
しかし、この様なβ−フェネチルアルコールを生産する能力が高い酵母を調味用ソースの製造に用いた例はこれまでに知られていない。つまり、調味用ソースの製造方法においては、アルコール発酵により得られる各種香味成分を含有する香味の高い調味用ソースを得ることを目的として、アルコール発酵が関与した製造方法、例えば、野菜処理物、果実処理物、あるいは糖類等をアルコール発酵した発酵液とその他原料成分とを混合する方法が提案されてきた（特公昭５７−２８５３８号、特公昭５７−４２３０２号、特開昭５６−１６９５６３号、特開昭５８−５１６４号、特開昭５８−５１６５号、特開昭６３−１１６６７５号、特開平４−１７３０７１号）が、これらの方法では酵母として、香味成分、特にβ−フェネチルアルコールの生産能の高い酵母を用いているわけではなかった。そのため、アルコール発酵により生産される香味成分が十分でなく、したがって得られる調味用ソースの香味を十分に改善していないという問題があった。
【０００５】
さらに、上記の様なこれまでに知られているβ−フェネチルアルコール高生産性の酵母においても、それが有するβ−フェネチルアルコールの生産能は、発酵飲食品に香味を付与するという点でまだ満足のいくものではなかった。
【０００６】
そこで、β−フェネチルアルコールによる香味を十分に有する香味の高い発酵飲食品、特に、調味用ソースの製造方法や、それに用いるアルコール発酵時のβ−フェネチルアルコール生産能が十分に高い新規な酵母についての研究、開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、調味用ソース等の発酵飲食品をβ−フェネチルアルコール含量の高い香味のよい製品として製造する方法及びそれに用いるアルコール発酵に際して高いβ−フェネチルアルコール生産能を示す酵母を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、調味用ソースの製造の際に、β−フェネチルアルコール生産能を有する酵母を用いてアルコール発酵を行い得られる発酵液を用いることにより、香味のよい調味用ソースが得られることを見出し、さらに、調味用ソースを含むより香味のよい発酵飲食品を得るために高いβ−フェネチルアルコール生産能を有する酵母を求めて鋭意研究を重ねた結果、サッカロマイセス属に属する酵母の突然変異株より上記性質を示す新規酵母を取得することに成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、β−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母を、調味用ソースの発酵原料に作用させてアルコール発酵を行い、得られる発酵液を配合することを特徴とする調味用ソースの製造方法である。
【００１０】
また、本発明はサッカロマイセス属に属し、フルオロフェニルアラニン耐性を有し、且つβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母を、発酵飲食品の発酵原料に作用させアルコール発酵させる工程を含む発酵飲食品の製造方法において、前記酵母として、サッカロマイセス セレビジェ（Saccharomyces cerevisiae）ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３から選ばれる酵母を用いることを特徴とする発酵飲食品の製造方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明はフルオロフェニルアラニン耐性を有し、且つβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有するサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３を新規菌株として提供するものである。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の調味用ソースの製造方法
本発明の調味用ソースの製造方法に用いる酵母は、β−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母であれば特に制限されない。酵母としては、サッカロマイセス属やチゴサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。サッカロマイセス属に属する酵母として、具体的には、後述するサッカロマイセス セレビジェの各菌株が、また、チゴサッカロマイセス属に属する酵母として、具体的には、チゴサッカロマイセス ルーキシ、より具体的には、チゴサッカロマイセスルーキシ ＦＰＡ６９（アグリカルチャル アンド バイオロジカル ケミストリー, 54巻, 273〜274頁に記載）等が挙げられる。
【００１３】
本発明の調味用ソースの製造方法に用いるβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母として、好ましくは、サッカロマイセス属に属し、フルオロフェニルアラニン耐性を有する酵母から、β−フェネチルアルコール生産能を指標として選択された酵母等を挙げることができる。さらに、これらの酵母のうちでもより好ましくは、後述の様にして得られたサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３等のβ−フェネチルアルコール生産能の高い酵母を挙げることができる。
【００１４】
これらの酵母は、従来知られているサッカロマイセス属に属し、フルオロフェニルアラニン耐性を有し、且つβ−フェネチルアルコール生産能を有する酵母、例えば、サッカロマイセス セレビジェ Ｆ４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０２５）等に比べて、特に調味用ソースの製造に用いた場合に、高いβ−フェネチルアルコール生産能を示す酵母である。
【００１５】
なお、調味用ソースの製造において、香味の改善を目的としてβ−フェネチルアルコール生産能を有する酵母を用いた例はないが、上記の公知の酵母であっても、これを調味用ソースの製造に用いることにより、調味用ソースの香味の改善を行うことが可能である。
【００１６】
また、上記サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１等の菌株は、高いβ−フェネチルアルコール生産能を有する菌株を得るために、サッカロマイセス セレビジェに属する酵母をフルオロフェニルアラニン耐性を指標としてスクリーニングして得られた菌株であるが、本発明の調味用ソースの製造方法に用いる酵母は、必ずしもフルオロフェニルアラニン耐性を有している必要はなく、上述の様にβ−フェネチルアルコール生産能を有していればよい。そのようなサッカロマイセス セレビジェとして、具体的には、サッカロマイセス セレビジェ Ｋ９０１−Ｔ１２（日本醸造学会誌, 86巻, 616〜618頁に記載）等が挙げられる。
【００１７】
本発明の調味用ソース、具体的には、ウスターソース、とんかつソース、中濃ソース、こいくちソース等の製造方法においては、まず、上記酵母の少なくとも１種を調味用ソースの発酵原料に作用させる。調味用ソースの発酵原料としては、前記ソースの種類に関係なく、通常アルコール発酵による発酵液を含有する調味用ソースの製造の際に発酵原料として用いられる発酵原料、具体的には、野菜処理物、果実処理物、糖類、アミノ酸液等から適宜選択される１種又は２種以上を挙げることができる。また、発酵原料には発酵原料以外の調味用ソースの原料成分、例えば、食塩、食酢、香辛料、カラメル、糊料等を発酵に阻害を与えない程度の分量で添加しておくことも可能である。アルコール発酵は、通常調味用ソースに配合される発酵液を得る場合と同様に、１０〜４０℃程度、好ましくは１０〜３０℃程度の温度で、発酵液中のエタノール濃度が約１〜３％になるまで行われる。得られる発酵液は必要に応じて除菌された後、通常のアルコール発酵による発酵液を含有する調味用ソースと同様に、発酵液以外の各種原料成分と混合されて調味用ソースとなる。
【００１８】
（２）本発明の発酵飲食品の製造方法
本発明の発酵飲食品の製造方法においては、酵母としてサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３から選ばれる酵母を用いるが、これら酵母と同様にアルコール発酵を行う際に上記３菌株と同程度にβ−フェネチルアルコールを生産する能力が高い酵母であれば、上記３菌株と同様に本発明の発酵飲食品の製造方法に用いることが可能である。
【００１９】
上記の様なβ−フェネチルアルコールを生産する能力が高いサッカロマイセスセレビジェの菌株を得るには、まず、サッカロマイセス セレビジェを常法に従って突然変異処理する。用いる親株としてはサッカロマイセス セレビジェであれば特に制限されないが、例えば、サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２（ＩＦＯ ２２６０）、サッカロマイセス セレビジェ ＩＦＯ ０２５１、サッカロマイセス セレビジェ 日本醸造協会９０１号酵母等を挙げることができる。突然変異の方法としては、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルフォネート等の変異剤を作用させる方法や紫外線照射による方法、遺伝子組換え手法による部位特異的変異法等を挙げることができる。
【００２０】
この様にして得られる突然変異株のそれぞれについてｏ−フルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性を調べる。これらのフルオロフェニルアラニンのいずれかに耐性を示す菌株全てについて、さらに、これを適当な原料に作用させアルコール発酵を行い、この際、生成されるβ−フェネチルアルコールの量を測定する。このβ−フェネチルアルコール生成量が、親株のサッカロマイセス セレビジェを用いて同様にアルコール発酵を行ったときに生成されるβ−フェネチルアルコールの量より多い菌株が、本発明の発酵飲食品の製造方法に用いることが可能な菌株である。
【００２１】
サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３は、上記スクリーニング法に従い後述の実施例で取得された新規菌株であるが、このうちサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１は、ｏ−フルオロフェニルアラニン耐性菌から選択された菌株であり、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２は、ｍ−フルオロフェニルアラニン耐性菌から選択された菌株であり、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３は、ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性菌から選択された菌株である。これらは、平成８年２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、サッカロマイセス セレビジェＫＧＭ−９６００１、ＫＧＭ−９６００２、ＫＧＭ−９６００３の順にそれぞれ微生物受託番号第ＦＥＲＭ Ｐ−１５４６１、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４６２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４６３として寄託されている。
【００２２】
本発明の製造方法が適用される発酵飲食品としては、酵母によるアルコール発酵が関与する発酵飲食品であれば特に制限されない。この様な発酵飲食品としては、パン、アルコール飲料、調味料等が挙げられるが、本発明の製造方法は、調味用ソースに用いたときにより高い香味の改善効果が得られる。
【００２３】
本発明の発酵飲食品の製造方法においては、発酵飲食品の発酵原料に酵母を作用させアルコール発酵させる工程で、酵母として上記サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３等から選ばれる酵母を用いる以外は、通常の発酵飲食品の製造方法と同様の製造方法を取ることが可能である。
【００２４】
例えば、調味用ソースについては上述の様に製造されるが、その他の発酵飲食品に関しても、それぞれの発酵飲食品に用いる原料成分と同様の原料成分を用い、その発酵飲食品を製造する時と同様のアルコール発酵条件やその他製造条件をとる等により製造することが可能である。
【００２５】
本発明の調味用ソースの製造方法によれば、香味成分の１種であるβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母を用いてアルコール発酵を行い得られる発酵液を配合することにより、従来の調味用ソースに比べて香味のよい調味用ソースが得られる。さらに、アルコール発酵の際に高いβ−フェネチルアルコール生産能を示す新規酵母、すなわち、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３等を用いてアルコール発酵を行うことにより、香味成分であるβ−フェネチルアルコール含有量の多い香味の高い調味用ソース等の発酵飲食品が得られる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を説明する。
（１）本発明の調味用ソースの製造方法
まず、本発明の調味用ソースの製造方法の実施の形態を以下に説明する。
【００２７】
本発明の調味用ソースの製造方法においては、これに配合する発酵液を得るために、上述の様なβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母、好ましくは、サッカロマイセス属に属し、フルオロフェニルアラニン耐性を有し、且つβ−フェネチルアルコールを生産する能力を有する酵母の少なくとも１種を調味用ソースの発酵原料に作用させてアルコール発酵を行う。調味用ソースの発酵原料としては、野菜処理物、果実処理物、糖類、アミノ酸液等から適宜選択される１種又は２種以上を挙げることができる。また、発酵原料には発酵原料以外の調味用ソースの原料成分、例えば、食塩、食酢、香辛料、カラメル、糊料等を発酵に阻害を与えない程度の分量で添加しておくことも可能である。
【００２８】
上記野菜処理物、果実処理物として具体的には、トマト、タマネギ、ニンジン、セロリ、レタス、キャベツ等の野菜やリンゴ、ミカン、ブドウ等の果実の搾汁液等が挙げられる。また、糖類として具体的には、ショ糖、ブドウ糖等の精製糖の他に、液糖、異性化液糖、ブドウ糖シラップ等のシラップ類、糖蜜等が挙げられる。アミノ酸として具体的には、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、フェニルアラニン等の精製アミノ酸や大豆蛋白加水分解物等が挙げられる。香辛料として具体的には、ケイヒ、ニクズク、セージ、タイム、クロコショウ等が挙げられる。さらに、糊料として具体的には、キサンタンガム、タマリンド等を挙げることが可能である。
【００２９】
アルコール発酵による発酵液を配合して調味用ソースを製造する際のアルコール発酵の方法等に関しては、従来公知の方法、例えば、野菜処理物や果実処理物をアルコール発酵させ、得られる発酵液に他の原料成分を添加混合する方法（特開昭５６−１６９５６３号公報、特開昭５８−５１６５号公報等を参照）、糖類のみをアルコール発酵させ、得られた発酵液を他の成分に添加混合する方法（特開平４−１７３０７１号公報を参照）、また、食酢を除く全原料成分を用いてアルコール発酵を行いその後食酢を添加する方法（特開平６−１６９７３２号公報を参照）等に従えばよい。
【００３０】
具体的には、アルコール発酵を行う際には、発酵原料を適当な濃度、例えば、可溶性固形分については２０〜５０重量％濃度程度、食塩を含有する場合の食塩については１重量％濃度程度の水性液とし、これを必要に応じて公知の中和剤でｐＨ５．０〜７．０程度に調製し、さらに９０〜１３０℃達温程度で加熱殺菌し冷却して得られる発酵原液を用いる。アルコール発酵の形態は、静置又は振盪によるバッチ発酵、あるいはバイオリアクターを用いた連続発酵の何れでもよいが、バイオリアクターを用いた連続発酵が作業性及び生産性からいって好ましい。
【００３１】
バッチで発酵を行う場合は、上記のように調製した発酵原液に、上記酵母の１種を予め馴養しておいたものを１０2〜１０6個／ｍｌ程度となるように加えて発酵を行う。バイオリアクターを用いて連続発酵を行う場合には、上記酵母の１種を予め馴養化し、固定化しておいたバイオリアクター中に上記のように調製した発酵原液を送液することで発酵が行われる。なお、何れの場合もアルコール発酵中は雑菌による汚染を防止する措置を取ることが好ましい。また、アルコール発酵を行う際の温度は、１０〜４０℃程度であることが好ましく、さらに好ましくは１０〜３０℃程度である。発酵温度が４０℃を越えると得られる発酵液の香味が悪くなることがあり、また１０℃未満であると発酵液が所望のエタノール濃度に達するまでに要する時間が長くなる。
【００３２】
調味用ソースの場合、発酵液中のエタノール濃度が１〜３％となったところで、適当な方法により、例えば９５℃達温程度での加熱殺菌等により発酵を停止させる。その後、発酵液は必要に応じて遠心分離や濾過等で除菌され、得られた発酵液に調味用ソースに用いられるその他原料成分、例えば、食塩、食酢、香辛料、カラメル、糊料等が適宜添加、混合されて調味用ソースとなる。
【００３３】
（２）本発明の発酵飲食品の製造方法
本発明の発酵飲食品の製造方法は、酵母としてサッカロマイセス セレビジェＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３等のサッカロマイセス セレビジェに分類され、フルオロフェニルアラニン耐性を有し、且つβ−フェネチルアルコール生産能力の高い菌株を用いることに特徴がある。この様な特性を有する上記サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１等は、具体的には、以下の様にして取得することができる。
【００３４】
サッカロマイセス セレビジェ、例えば、サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２を菌株保存用培地、例えば、ＰＤＡ培地（組成を実施例に示す）等に接種し、２５〜３５℃で２４〜７２時間程度培養する。この菌体の一白金耳を菌体調製用培地、例えば、ＹＰＤ培地（組成を実施例に示す）等に無菌的に接種し、２５〜３５℃で振盪培養を行い、対数増殖期（培養開始からおよそ１５〜３０時間後）に培養を停止して変異対象菌体を調製する。これを適当な濃度に希釈し、予め調製された突然変異操作用培地、例えば、ＰＤＡ培地等に接種し表面を乾燥させた後、１０〜５００μｗ／ｃｍ2の強度の紫外線を１５〜６０秒間照射する。
【００３５】
その後、これを２５〜３５℃で２４〜７２時間培養してコロニーを形成する菌体を分離し、得られた全ての菌体について、それぞれｏ−フルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニンを適当な濃度で添加した選択培地、例えば、バークホルダー（Burkholder）−寒天培地（組成を実施例に示す）等に植菌し、なおも生育する菌体を分離する。これらの菌体をそれぞれ菌体調製用培地（ＹＰＤ培地等）で前培養した後、アルコール発酵原料液、例えば、ソース用発酵原料液等に接種し、２５〜３５℃で２４〜７２時間振盪培養し、得られる発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量をガスクロマトグラフィー等で測定し、サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２を用いて同様のアルコール発酵を行った場合の発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量と比較してその量の多いものを選択することにより得られる。
【００３６】
本発明の発酵飲食品の製造方法は、酵母として上記サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３等を用いる以外は、全てそれぞれの発酵飲食品の製造において従来公知の製造方法、例えば、調味用ソースにおいては上記（１）の様な製造方法、に従って製造することが可能である。
【００３７】
【実施例】
以下に本発明の実施例を説明する。まず、本発明の製造方法に用いるβ−フェネチルアルコール高生産能を有する新規酵母について説明する。
【００３８】
【実施例１】
ＰＤＡ培地（表１に組成を示す）を用いて３０℃で４８時間培養したサッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２（ＩＦＯ ２２６０）の一白金耳を、ＹＰＤ培地（表２に組成を示す）に無菌的に接種した。これを３０℃で振盪培養し培養開始から２１時間後に培養を停止して、変異対象菌体を調製した。得られた変異対象菌体を１ｍｌ当たりの菌体個数が１０4オーダーとなるように無菌水で希釈しこの５０μｌを予め調製されたＰＤＡ培地に接種し、表面を乾燥させた後、２００μｗ／ｃｍ2の強度の紫外線を３０秒間照射した。その後、これを３０℃で４８時間培養した後、コロニーを形成する菌株を分離した。分離された全ての菌株のそれぞれを、ＤＬ−ｏ−フルオロフェニルアラニンを２．０ｍｇ／ｍｌ濃度で、ＤＬ−ｍ−フルオロフェニルアラニンを５．０ｍｇ／ｍｌ濃度で、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンを１．５ｍｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ添加したバークホルダー−寒天培地（表３に組成を示す）に植菌し、なおも生育する菌株を分離した。
【００３９】
分離したフルオロフェニルアラニン耐性菌をＹＰＤ培地を用いて３０℃で４８時間培養した後、これについて発酵原液に添加したときの１ｍｌ当たりの初発菌数が１０5オーダーとなるように、無菌水で希釈した菌体懸濁液を、予め１２１℃で１５分間殺菌処理された調味用ソース発酵原液（表６に組成を示す）に１容量％接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。得られた発酵液のβ−フェネチルアルコール含有量を、ヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで測定した。また、サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２を用いて上記同様のアルコール発酵を行い、発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量を測定した。
【００４０】
サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２を用いた場合の発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量に比べ、得られた発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量が多かったフルオロフェニルアラニン耐性菌を選択したところ、ＤＬ−ｏ−フルオロフェニルアラニン耐性菌、ＤＬ−ｍ−フルオロフェニルアラニン耐性菌、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性菌のそれぞれから１株ずつが選択された。これらは、それぞれサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２及びサッカロマイセスセレビジェ ＫＧＭ−９６００３である。この３株をＰＤＡ培地に保存した。
【００４１】
比較のために、特開平２−９２２６５号公報記載の方法に従ってサッカロマイセス セレビジェ 日本醸造協会９０１号酵母をエチルメタンスルフォネート処理して得られた変異株からフルオロフェニルアラニン耐性菌を取得した。これらのフルオロフェニルアラニン耐性菌を上記調味用ソース発酵原液に上記と同様にして接種し上記と同様のアルコール発酵を行わせ、得られた発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量を測定して、β−フェネチルアルコール生産能を有する菌株を選択した。選択された菌株１株をＰＤＡ培地に保存した。
【００４２】
上記各種菌株を用いて行われたアルコール発酵で得られた発酵液中のβ−フェネチルアルコール含有量を表７に示す。
【００４３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
＊２：ソース用糖液としては、可溶性固形分７０％、全糖分６０％（ショ糖４５％、ブドウ糖５％、果糖５％）の糖蜜様の液糖を使用した。
【００５０】
【表７】
この結果から明らかなように、本発明の新規菌株はこれまでにβ−フェネチルアルコールの生産能がよいことで知られている菌株と比べて、よりβ−フェネチルアルコールを生産する能力が高い。
【００５２】
【実施例２〜４】
調味用ソースの製造
上記で得られたサッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２、サッカロマイセス セレビジェＫＧＭ−９６００３を用いて調味用ソースの製造を行った。また、参考としてサッカロマイセス セレビジェ 日本醸造協会９０１号酵母をエチルメタンスルフォネート処理した変異株から得られたフルオロフェニルアラニン耐性で且つβ−フェネチルアルコール生産能を有する菌株を用いて調味用ソースの製造を行った。さらに、比較のために調味用ソースの製造に従来用いられていたサッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２（ＩＦＯ ２２６０）を酵母として用いて調味用ソースを製造した。
【００５３】
発酵原液に添加したときの１ｍｌ当たりの初発菌数が１０5オーダーとなるように、無菌水で希釈した上記各菌株の菌体懸濁液を、予め１２１℃で１５分間殺菌処理された調味用ソース発酵原液（上記表６に組成を示す）に１容量％ずつ接種し、それぞれ回分発酵（３０℃で４８時間の振盪培養）し、発酵を停止させた。
【００５４】
得られた各発酵液を発酵に用いた菌株毎に、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００１、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００２、サッカロマイセス セレビジェ ＫＧＭ−９６００３及びサッカロマイセス セレビジェ 日本醸造協会９０１号酵母をエチルメタンスルフォネート処理した変異株から得られたフルオロフェニルアラニン耐性で且つβ−フェネチルアルコール生産能を有する菌株、サッカロマイセス セレビジェ ＯＣ−２（ＩＦＯ ２２６０）の順に、ソース用発酵液１、ソース用発酵液２、ソース用発酵液３、ソース用発酵液４、ソース用発酵液５とし、これらを含有する調味用ソースを作製した。すなわち、表８に示す各成分を十分に混合し、９５℃の加熱殺菌を行って調味用ソースとした。
【００５５】
【表８】
【００５６】
＜本発明の製造方法による調味用ソースの評価＞
上記各実施例及び比較例で得られた調味用ソースについて３０名の男女パネラーが官能評価を行った。評価は、パネラー全員に全ての調味用ソースを味見してもらい、各実施例の調味用ソースをそれぞれ比較例の調味用ソースと比較してどちらを嗜好するか答えてもらう方法で行った。また、得られた結果をもとに有意差検定を行った。結果を表９に示す。なお、表中の有意差検定の結果では、Ａが５％の危険率で、Ｂが１％の危険率で、Ｃが０．１％の危険率で有意差があることを表している。
【００５７】
【表９】
この結果から明らかなように、本発明の調味用ソースの製造方法によれば、従来の発酵を利用した製造方法により得られる調味用ソースに比べて、嗜好性のよい調味用ソースが得られる。特に、本発明の高いβ−フェネチルアルコール生産能を有する新規酵母を用いて製造された調味用ソースにおいては、嗜好性を改善する効果がより高いことがわかる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の製造方法により、調味用ソース等の発酵飲食品をβ−フェネチルアルコール含量の高い香味のよい製品として製造することが可能となる。また、本発明のアルコール発酵に際して高いβ−フェネチルアルコール生産能を示す酵母は、発酵飲食品の製造に有効に利用できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a fermented food and drink and a novel yeast, and more specifically, a method for producing a fermented food and drink such as a seasoning sauce as a flavorful product having a high β-phenethyl alcohol content and alcohol fermentation. The present invention relates to a novel yeast exhibiting high β-phenethyl alcohol production ability.
[0002]
[Prior art]
In the production of fermented foods and beverages using yeast, it is known that various flavor components such as alcohols, esters, and aldehydes other than ethanol are produced along with ethanol in the process of alcoholic fermentation by yeast enzymatic reaction. It has been. In fermented foods and drinks, flavor components generated in the process of such alcohol fermentation occupy an important element in the product. For this reason, many studies have been made to efficiently produce flavor components in alcoholic fermentation using yeast. For example, a method for producing fermented foods and drinks using yeasts having high productivity such as isoamyl alcohol, isobutyl alcohol, β-phenethyl alcohol or 2-methyl-1-butanol has been proposed.
[0003]
Among these, yeast having a high ability to produce β-phenethyl alcohol having a rose-like fragrance as one of aromatic alcohols has been described so far from Saccharomyces-resistant yeasts belonging to the genus Saccharomyces to Saccharomyces cerevisiae F44 (FERM BP- 2025) etc. are obtained, and an example (Japanese Patent Laid-Open No. 2-92265) in which this is used for the production of sake or the like is known.
[0004]
However, there has been no known example of using such yeast having high ability to produce β-phenethyl alcohol for the production of seasoning sauce. That is, in the seasoning sauce production method, for the purpose of obtaining a seasoning sauce with high flavor containing various flavor components obtained by alcohol fermentation, a production method involving alcohol fermentation, for example, processed vegetables, fruit A method of mixing a processed product or a fermented solution obtained by alcohol fermentation of saccharides and other raw material components has been proposed (Japanese Patent Publication No. 57-28538, Japanese Patent Publication No. 57-42302, Japanese Patent Publication No. 56-169563, Japanese Patent Publication No. 56-169563). No. 58-5164, JP-A 58-5165, JP-A 63-116675, and JP-A-4-17371). In these methods, the ability to produce flavor components, particularly β-phenethyl alcohol, as yeast The high yeast was not used. Therefore, there is a problem that the flavor components produced by alcohol fermentation are not sufficient, and therefore the flavor of the seasoning sauce obtained is not sufficiently improved.
[0005]
Furthermore, even in the β-phenethyl alcohol high productivity yeast known so far, the β-phenethyl alcohol production ability of the yeast is still satisfactory in terms of imparting flavor to fermented foods and drinks. It wasn't going to be good.
[0006]
Therefore, a highly flavored fermented food or drink that has a sufficient flavor due to β-phenethyl alcohol, in particular, a method for producing a seasoning sauce, and a novel yeast having a sufficiently high β-phenethyl alcohol-producing ability during alcohol fermentation used therefor Research and development were desired.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and a method for producing a fermented food and drink such as a seasoning sauce as a flavorful product having a high β-phenethyl alcohol content, and a high β-phenethyl alcohol-producing ability in alcohol fermentation used therefor. It is an object to provide the yeast to be shown.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor uses a fermentation broth obtained by performing alcoholic fermentation using a yeast having β-phenethyl alcohol-producing ability in the production of a seasoning sauce. In order to obtain a flavorful seasoning sauce, and to obtain a fermented food or drink with a more flavorful flavor containing the seasoning sauce, research for earning yeast with high β-phenethyl alcohol-producing ability As a result, the inventors succeeded in obtaining a novel yeast exhibiting the above properties from a mutant strain of yeast belonging to the genus Saccharomyces, and completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention provides a seasoning sauce characterized in that a yeast having the ability to produce β-phenethyl alcohol is allowed to act on a fermentation raw material of a seasoning sauce to perform alcoholic fermentation, and the resulting fermentation broth is blended. Is the method.
[0010]
In addition, the present invention belongs to the genus Saccharomyces, has a resistance to fluorophenylalanine, and has the ability to produce β-phenethyl alcohol. In the production method, there is provided a method for producing a fermented food or drink characterized by using a yeast selected from Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002 and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 as the yeast.
[0011]
Furthermore, the present invention provides Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003, which have fluorophenylalanine resistance and have the ability to produce β-phenethyl alcohol, as novel strains.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Manufacturing method of seasoning sauce of the present invention
The yeast used for the seasoning sauce production method of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to produce β-phenethyl alcohol. Examples of the yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces and Tigosaccharomyces. As yeast belonging to the genus Saccharomyces, specifically, each strain of Saccharomyces cerevisia described later is used, and as a yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces, specifically, Tigosaccharomyces rouxis, more specifically, Tigosaccharomyces cerevisiae. FPA69 (Agricultural and Biological Chemistry, 54, pp. 273-274) and the like can be mentioned.
[0013]
The yeast having the ability to produce β-phenethyl alcohol used in the seasoning sauce production method of the present invention is preferably selected from yeast belonging to the genus Saccharomyces and resistant to fluorophenylalanine using β-phenethyl alcohol producing ability as an index. The yeast etc. which were made can be mentioned. Further, among these yeasts, more preferably, yeasts having a high β-phenethyl alcohol-producing ability, such as Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 obtained as described below, are mentioned. be able to.
[0014]
These yeasts belong to the conventionally known Saccharomyces genus, have resistance to fluorophenylalanine, and have β-phenethyl alcohol-producing ability, for example, Saccharomyces cerevisiae F44 (FERM BP-2025) and the like. It is a yeast that exhibits high β-phenethyl alcohol-producing ability when used in the production of seasoning sauces.
[0015]
In addition, in the production of seasoning sauce, there is no example of using yeast having β-phenethyl alcohol-producing ability for the purpose of improving the flavor, but even this known yeast is used for the production of seasoning sauce. By using it, it is possible to improve the flavor of the seasoning sauce.
[0016]
The strains such as Saccharomyces cerevisiae KGM-96001 are strains obtained by screening yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae with fluorophenylalanine resistance as an index in order to obtain a strain having high β-phenethyl alcohol production ability. The yeast used in the method for producing a seasoning sauce of the present invention does not necessarily have resistance to fluorophenylalanine, and may have β-phenethyl alcohol-producing ability as described above. Specific examples of such Saccharomyces cerevisiae include Saccharomyces cerevisiae K901-T12 (described in Journal of the Japanese Brewing Society, 86, 616-618).
[0017]
In the seasoning sauce of the present invention, specifically, the production method of Worcester sauce, tonkatsu sauce, medium concentration sauce, koikuchi sauce, etc., first, at least one of the above yeasts is allowed to act on the fermentation raw material of the seasoning sauce. As a fermentation raw material for seasoning sauce, regardless of the type of the sauce, a fermentation raw material that is usually used as a fermentation raw material in the production of a seasoning sauce containing a fermentation broth by alcohol fermentation, specifically, a processed vegetable product 1 type, or 2 or more types appropriately selected from processed fruit products, sugars, amino acid solutions and the like. Moreover, it is also possible to add to the fermentation raw material ingredients for seasoning other than the fermentation raw material, for example, salt, vinegar, spices, caramel, paste, etc. in an amount that does not impair the fermentation. . Alcohol fermentation is performed at a temperature of about 10 to 40 ° C., preferably about 10 to 30 ° C., and the ethanol concentration in the fermentation solution is about 1 to 3% in the same manner as in the case of obtaining a fermentation liquid usually blended in a seasoning sauce. It is done until it becomes. The obtained fermentation broth is sterilized as necessary, and then mixed with various raw material components other than the fermentation broth to form a seasoning sauce in the same manner as the seasoning sauce containing the fermentation broth by ordinary alcohol fermentation.
[0018]
(2) Manufacturing method of fermented food / beverage products of this invention
In the method for producing a fermented food or drink product of the present invention, yeast selected from Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002 and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 is used as the yeast. If it is a yeast with the capability to produce (beta) -phenethyl alcohol as high as said 3 strains, it can be used for the manufacturing method of the fermented food / beverage products of this invention similarly to the said 3 strains.
[0019]
In order to obtain a strain of Saccharomyces cerevisiae having a high ability to produce β-phenethyl alcohol as described above, first, Saccharomyces cerevisiae is mutated according to a conventional method. The parent strain to be used is not particularly limited as long as it is Saccharomyces cerevisiae, and examples thereof include Saccharomyces cerevisiae OC-2 (IFO 2260), Saccharomyces cerevisiae IFO 0251, Saccharomyces cerevisiae Japan Brewing Association No. 901 yeast, and the like. Mutation methods include N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonate, a method using ultraviolet irradiation, a site-specific mutation method using a gene recombination method Etc.
[0020]
Each of the mutant strains thus obtained is examined for resistance to o-fluorophenylalanine, m-fluorophenylalanine, and p-fluorophenylalanine. All strains resistant to any of these fluorophenylalanines are further subjected to alcohol fermentation by causing them to act on appropriate raw materials, and the amount of β-phenethyl alcohol produced is measured. A strain having a larger β-phenethyl alcohol production amount than the amount of β-phenethyl alcohol produced when alcohol fermentation is similarly performed using the parent strain Saccharomyces cerevisiae is used in the method for producing a fermented food or beverage according to the present invention. It is a possible strain.
[0021]
Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 are novel strains obtained in the examples described below according to the above screening method. Among them, Saccharomyces cerevisiae KGM-96001 is o-fluorophenyl. Saccharomyces cerevisiae KGM-96002 is a strain selected from m-fluorophenylalanine-resistant bacteria, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 is a strain selected from p-fluorophenylalanine-resistant bacteria. is there. On February 20, 1996, the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal Code 305 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan), Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, KGM- Deposited as microorganism accession numbers FERM P-15461, FERM P-15462, and FERM P-15463, respectively, in the order of 96002 and KGM-96003.
[0022]
The fermented food or drink to which the production method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a fermented food or drink that involves alcohol fermentation by yeast. Examples of such fermented foods and drinks include bread, alcoholic beverages, seasonings, and the like, but the production method of the present invention provides a higher flavor improvement effect when used in a seasoning sauce.
[0023]
In the method for producing a fermented food / beverage product of the present invention, the yeast is allowed to act on the fermentation raw material of the fermented food / beverage product to cause alcohol fermentation. It is possible to take the manufacturing method similar to the manufacturing method of normal fermented food / beverage products except using yeast selected from.
[0024]
For example, the seasoning sauce is manufactured as described above, but for other fermented foods and drinks, the same raw material components as those used for each fermented food and drink are used, and the fermented foods and drinks are produced. It can be produced by taking similar alcohol fermentation conditions and other production conditions.
[0025]
According to the method for producing a seasoning sauce of the present invention, by adding a fermentation broth obtained by performing alcoholic fermentation using yeast having the ability to produce β-phenethyl alcohol, which is one of the flavor components, A seasoning sauce having a better flavor than the seasoning sauce is obtained. Furthermore, by performing alcoholic fermentation using a novel yeast exhibiting a high β-phenethyl alcohol-producing ability during alcoholic fermentation, that is, Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, Saccharomyces cerevisiae KGM-96003, etc., flavor is obtained. Fermented foods and beverages such as a seasoning sauce with a high content of β-phenethyl alcohol, which is a component, are obtained.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
(1) Manufacturing method of seasoning sauce of the present invention
First, an embodiment of a method for producing a seasoning sauce of the present invention will be described below.
[0027]
In the method for producing a seasoning sauce of the present invention, in order to obtain a fermentation broth to be blended therein, a yeast having the ability to produce β-phenethyl alcohol as described above, preferably belonging to the genus Saccharomyces, resistant to fluorophenylalanine And at least one yeast having the ability to produce β-phenethyl alcohol is allowed to act on the fermentation raw material of the seasoning sauce to perform alcohol fermentation. As a fermentation raw material of the seasoning sauce, one or two or more kinds appropriately selected from a processed vegetable product, a processed fruit product, a saccharide, an amino acid solution and the like can be mentioned. Moreover, it is also possible to add to the fermentation raw material ingredients for seasoning other than the fermentation raw material, for example, salt, vinegar, spices, caramel, paste, etc. in an amount that does not impair the fermentation. .
[0028]
Specific examples of the processed vegetable product and processed fruit product include juices of vegetables such as tomatoes, onions, carrots, celery, lettuce, cabbage, and fruits such as apples, mandarin oranges, and grapes. Specific examples of the saccharide include liquid sugar, isomerized liquid sugar, syrups such as glucose syrup, molasses and the like in addition to purified sugars such as sucrose and glucose. Specific examples of amino acids include purified amino acids such as leucine, isoleucine, valine, threonine, phenylalanine, and soy protein hydrolysates. Specific examples of spices include keihi, nutmeg, sage, thyme, black pepper and the like. Further, specific examples of the paste include xanthan gum and tamarind.
[0029]
Regarding the method of alcoholic fermentation when producing a seasoning sauce by blending a fermented liquor from alcoholic fermentation, a conventionally known method, for example, subjecting a processed vegetable product or a processed fruit product to alcoholic fermentation, and the obtained fermented solution may be used. (See JP-A-56-169563, JP-A-58-5165, etc.), alcohol fermentation of only saccharides, and addition of the resulting fermentation broth to other components According to the method (see Japanese Patent Laid-Open No. 4-173071), the method of performing alcoholic fermentation using all raw material components except vinegar and then adding vinegar (see Japanese Patent Laid-Open No. 6-169732), etc. Good.
[0030]
Specifically, when alcoholic fermentation is performed, the fermentation raw material has an appropriate concentration, for example, about 20 to 50% by weight for soluble solids, and about 1% by weight for sodium chloride containing salt. An aqueous solution is prepared, and if necessary, a fermentation stock solution obtained by adjusting the pH to about 5.0 to 7.0 with a known neutralizing agent and further sterilizing by heating at about 90 to 130 ° C. and cooling. The form of alcohol fermentation may be either batch fermentation by standing or shaking, or continuous fermentation using a bioreactor, but continuous fermentation using a bioreactor is preferable from the viewpoint of workability and productivity.
[0031]
In the case of performing fermentation in batches, 10 fermented stock solutions prepared as described above were previously conditioned with one of the above yeasts. 2 -10 6 Fermentation is performed in addition to about 1 / ml. When continuous fermentation is carried out using a bioreactor, fermentation is carried out by feeding the fermentation stock solution prepared as described above into a bioreactor that has been acclimated and immobilized in advance. . In any case, it is preferable to take measures to prevent contamination by various bacteria during alcoholic fermentation. Moreover, it is preferable that the temperature at the time of performing alcoholic fermentation is about 10-40 degreeC, More preferably, it is about 10-30 degreeC. When fermentation temperature exceeds 40 degreeC, the flavor of the fermentation liquid obtained may worsen, and when it is less than 10 degreeC, the time required for a fermentation liquid to reach a desired ethanol density | concentration becomes long.
[0032]
In the case of the seasoning sauce, when the ethanol concentration in the fermentation solution becomes 1 to 3%, the fermentation is stopped by an appropriate method, for example, by heat sterilization at a temperature of about 95 ° C. Thereafter, the fermentation broth is sterilized by centrifugation or filtration as necessary, and other raw material components used for the seasoning sauce in the obtained fermentation broth, for example, salt, vinegar, spices, caramel, paste etc. Add and mix to make seasoning sauce.
[0033]
(2) Manufacturing method of fermented food / beverage products of this invention
The method for producing a fermented food or drink product of the present invention is classified into Saccharomyces cerevisiae such as Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 as yeast, and has resistance to fluorophenylalanine and β-phenethyl alcohol It is characterized by using a strain with high production capacity. The Saccharomyces cerevisiae KGM-96001 etc. having such characteristics can be specifically obtained as follows.
[0034]
Saccharomyces cerevisiae, for example, Saccharomyces cerevisiae OC-2, is inoculated into a strain storage medium such as PDA medium (composition is shown in the Examples) and cultured at 25 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours. One platinum loop of this microbial cell is aseptically inoculated into a microbial cell preparation medium, for example, YPD medium (composition is shown in the Examples), followed by shaking culture at 25 to 35 ° C., and a logarithmic growth phase (culture start) About 15 to 30 hours after the culturing, the culture is stopped to prepare the cells to be mutated. This is diluted to an appropriate concentration, inoculated into a previously prepared mutation manipulation medium, such as PDA medium, and the surface is dried, and then 10 to 500 μw / cm. 2 Of 15 to 60 seconds.
[0035]
Thereafter, the cells are cultured at 25 to 35 ° C. for 24 to 72 hours to separate cells forming colonies, and all of the obtained cells are respectively o-fluorophenylalanine, m-fluorophenylalanine, p-fluorophenylalanine. Is inoculated into a selective medium added with a suitable concentration, for example, Burkholder-agar medium (composition is shown in Examples), and the cells still growing are isolated. Each of these cells is pre-cultured on a cell preparation medium (YPD medium or the like) and then inoculated into an alcohol fermentation raw material solution, for example, a fermentation raw material solution for sauce, and cultured at 25 to 35 ° C. for 24 to 72 hours. The β-phenethyl alcohol content in the fermentation broth when the same alcoholic fermentation was performed using Saccharomyces cerevisiae OC-2 by measuring the β-phenethyl alcohol content in the obtained fermentation broth by gas chromatography or the like. It can be obtained by selecting the one having a larger amount than that.
[0036]
The method for producing a fermented food / beverage product of the present invention is a conventionally known production method for producing each fermented food / beverage product except that the above Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 are used as yeast. In a seasoning sauce, for example, the seasoning sauce can be produced according to the production method as described in (1) above.
[0037]
【Example】
Examples of the present invention will be described below. First, a novel yeast having high β-phenethyl alcohol production ability used in the production method of the present invention will be described.
[0038]
[Example 1]
One platinum loop of Saccharomyces cerevisiae OC-2 (IFO 2260) cultured for 48 hours at 30 ° C. using PDA medium (shown in Table 1) is aseptically inoculated into YPD medium (shown in Table 2). did. This was shake-cultured at 30 ° C., and after 21 hours from the start of the culture, the culture was stopped to prepare mutant cells. The number of bacterial cells to be mutated is 10 Four Dilute with sterile water to the order and inoculate 50 μl of this onto PDA medium prepared in advance, dry the surface, then 200 μw / cm 2 Were irradiated for 30 seconds. Thereafter, this was cultured at 30 ° C. for 48 hours, and then a strain forming a colony was isolated. For each of the isolated strains, DL-o-fluorophenylalanine at a concentration of 2.0 mg / ml, DL-m-fluorophenylalanine at a concentration of 5.0 mg / ml, and DL-p-fluorophenylalanine at 1.5 mg / ml. Inoculated in a bark holder-agar medium (composition shown in Table 3) added at a concentration of / ml, and strains still growing were isolated.
[0039]
After the cultured fluorophenylalanine-resistant bacteria are cultured at 30 ° C. for 48 hours using YPD medium, the initial bacterial count per ml when added to the fermentation stock solution is 10 Five The bacterial cell suspension diluted with sterile water was inoculated in an order of 1% by volume into a seasoning sauce fermentation stock solution (composition shown in Table 6) previously sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and 30 ° C. For 48 hours. The β-phenethyl alcohol content of the obtained fermentation broth was measured by gas chromatography using a headspace method. Moreover, alcohol fermentation similar to the above was performed using Saccharomyces cerevisiae OC-2, and β-phenethyl alcohol content in the fermentation broth was measured.
[0040]
When Saccharomyces cerevisiae OC-2 was used, a fluorophenylalanine-resistant bacterium having a high content of β-phenethyl alcohol in the fermentation broth compared to the content of β-phenethyl alcohol in the fermentation broth was selected. One strain was selected from each of o-fluorophenylalanine resistant bacteria, DL-m-fluorophenylalanine resistant bacteria, and DL-p-fluorophenylalanine resistant bacteria. These are Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002 and Saccharomyces cerevisiae KGM-96003, respectively. These three strains were stored in PDA medium.
[0041]
For comparison, fluorophenylalanine-resistant bacteria were obtained from a mutant obtained by treating Saccharomyces cerevisiae No. 901 yeast with ethyl methanesulfonate according to the method described in JP-A-2-92265. These fluorophenylalanine-resistant bacteria are inoculated in the above-mentioned seasoning sauce fermentation stock solution in the same manner as described above to cause alcohol fermentation similar to the above, and the β-phenethyl alcohol content in the obtained fermentation broth is measured, and β A strain having the ability to produce phenethyl alcohol was selected. One selected strain was stored in PDA medium.
[0042]
Table 7 shows the β-phenethyl alcohol content in the fermentation broth obtained by alcohol fermentation performed using the above various strains.
[0043]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
[Table 4]
[Table 5]
[Table 6]
* 2: A molasses-like liquid sugar having a soluble solid content of 70% and a total sugar content of 60% (sucrose 45%, glucose 5%, fructose 5%) was used as the sugar solution for sauce.
[0050]
[Table 7]
As is apparent from the results, the novel strain of the present invention has a higher ability to produce β-phenethyl alcohol than the strains known to have a good ability to produce β-phenethyl alcohol.
[0052]
[ Examples 2-4 ]
Production of seasoning sauce
Saccharomyces cerevisiae KGM-96001 obtained above, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, Saccharomyces cerevisiae KGM-96003 The sauce for seasoning was manufactured using. Also, support The seasoning sauce was manufactured using the strain | stump | stock which has a fluorophenylalanine tolerance and (beta) -phenethyl alcohol production ability obtained from the mutant which processed the brewery | strain of Kalomamyces cerevisiae Japan Brewing Association No. 901 with ethyl methanesulfonate. further, For comparison, a seasoning sauce was produced using Saccharomyces cerevisiae OC-2 (IFO 2260), which was conventionally used in the production of seasoning sauces, as yeast.
[0053]
The initial number of bacteria per ml when added to the fermentation stock solution is 10 Five 1% by volume in a seasoning sauce fermentation stock solution (composition shown in Table 6 above), which was previously sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, was obtained by suspending the cell suspension of each of the above strains diluted with sterile water so as to be ordered. Each was inoculated and batch-fermented (shaking culture at 30 ° C. for 48 hours) to stop fermentation.
[0054]
For each strain used in fermentation for each of the obtained fermentation broths, Saccharomyces cerevisiae KGM-96001, Saccharomyces cerevisiae KGM-96002, Saccharomyces cerevisiae KGM-96003, and Saccharomyces cerevisiae Japan Brewing Association No. 901 yeast were treated with ethyl methanesulfonate. Saccharomyces cerevisiae OC-2 (IFO 2260) in the order of a fluorophenylalanine resistant and β-phenethyl alcohol-producing strain obtained from the strain, in order of fermentation broth 1 for sauce, fermentation broth 2 for sauce, fermentation broth 3 for sauce, Sauce fermentation broth 4 and sauce fermentation broth 5 were used, and seasoning sauces containing these were prepared. That is, each component shown in Table 8 was sufficiently mixed and sterilized by heating at 95 ° C. to obtain a seasoning sauce.
[0055]
[Table 8]
[0056]
<Evaluation of sauce for seasoning by the production method of the present invention>
Thirty male and female panelists performed sensory evaluation on the seasoning sauces obtained in the above Examples and Comparative Examples. The evaluation was performed by a method in which all the panelists tasted all the seasoning sauces, and each seasoning sauce of each example was compared with the seasoning sauce of each comparative example to answer which one they prefer. In addition, a significant difference test was performed based on the obtained results. The results are shown in Table 9. In addition, the result of the significant difference test in the table indicates that there is a significant difference in that A is a risk factor of 5%, B is a risk factor of 1%, and C is a risk factor of 0.1%.
[0057]
[Table 9]
As is apparent from the results, according to the seasoning sauce production method of the present invention, a seasoning sauce having better palatability can be obtained as compared with a seasoning sauce obtained by a conventional production method using fermentation. In particular, in the seasoning sauce manufactured using the novel yeast having the high β-phenethyl alcohol-producing ability of the present invention, it can be seen that the effect of improving palatability is higher.
[0059]
【The invention's effect】
By the manufacturing method of this invention, it becomes possible to manufacture fermented food-drinks, such as a seasoning sauce, as a flavorful product with a high beta-phenethyl alcohol content. Moreover, the yeast which shows the high (beta) -phenethyl alcohol production ability in the case of alcohol fermentation of this invention can be utilized effectively for manufacture of fermented food / beverage products.
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