JP4093630B2

JP4093630B2 - Nucleic acid primer for eel species identification and eel species identification method using the same

Info

Publication number: JP4093630B2
Application number: JP10220998A
Authority: JP
Inventors: 俊宏常吉; 眞壽梶
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1998-03-30
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2018-03-30
Also published as: JPH11276179A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウナギの種を鑑定するために用いられる核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種の鑑定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本産のウナギは、学名がAnguilla japonica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フランス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のあるA. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. australis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等がある。
【０００３】
養鰻業は、ウナギの稚魚（シラス）を養殖することにより行われている。シラスは市販のものを購入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入している場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖しても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外見上、区別がつかない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、外見上区別がつかないシラスの段階においてもウナギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定手段を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子増幅法を利用して、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定領域を増幅し、増幅された断片を調べることによりウナギの種を鑑定することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、第１の核酸プライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、第２の核酸プライマーを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを調べることによりウナギ種を鑑定することから成るウナギ種の鑑定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡをＨｉｎｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断片長を調べることによりウナギがAnguilla japonicaか否かを鑑定する方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定の領域を遺伝子増幅法により増幅する。この増幅には、第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーが用いられる。
【０００８】
第１の核酸プライマーは、配列表の配列番号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号１に示される配列から成る核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。
【０００９】
第２の核酸プライマーは、配列表の配列番号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号４に示される配列から成る核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。例えば、下記実施例で具体的に記載される第２の核酸プライマーであるＴＷ１１は、５’末端から２７番目のアデニンを意図的にシトシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を導入している。
【００１０】
なお、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要がある。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列から成るプライマーを用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号４に示される塩基配列と同一又は相同な配列から成る核酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列から成る核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとしては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列から成るプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸鎖とその相補鎖は、バックボーンの５’→３’方向が逆になっており、一方、明細書における塩基配列は５’側を左側（上流側）に記載するように決められているから、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する場合、元の核酸鎖の下流側（３’側）と相補的な領域が上流側（５’側）に記載される。
【００１１】
本発明のウナギ種の鑑定方法では、上記第１及び第２のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて遺伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの一領域を増幅する。増幅される領域は、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子内の領域である。本発明の方法により増幅可能な、Anguilla japonica のミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番号７に示す。また、各種ウナギの当該領域の塩基配列と、制限酵素部位を図１及び図２に示す。なお、図１及び図２中、A. japonica 以外のウナギの配列は、A. japonica と異なる部位のみ記載してある。また、制限酵素の切断部位が矢印で示されていないものは、japonica以外の種において制限酵素部位が存在するものである。図２は図１の続きである。
【００１２】
配列番号１に示される配列は、図１に示される第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。また、配列番号４に示される配列は、図２に示される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。第１及び第２のプライマーを用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによって挟まれた領域が増幅される。
【００１３】
ウナギのシラスから、遺伝子増幅法の鋳型として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法をも採用することができる。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げることができる。第１法では、先ず、シラスを液体窒素で凍結し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。第２法では、シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。なお、試料はシラスに限定されるものではなく、成鰻や蒲焼き等、どのような成育段階のものや加工された食品であっても構わない。
【００１４】
遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこの分野において周知であり、それらのいずれをも用いることが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例にも、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
【００１５】
次いで、増幅されたＤＮＡを分析することにより、ウナギ種を鑑定する。図１及び図２に示すように、ウナギの種類により、増幅領域の塩基配列が異なっている。従って、例えば増幅領域の全塩基配列を決定することにより、ウナギ種を容易に同定することができる。あるいは、増幅領域中には制限酵素部位が含まれるので、いわゆる制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法により種の鑑定を行うことも可能である。さらに、日本産ウナギと外国産ウナギの区別を行うことも重要な鑑定業務であるが、例えば、１５６ｎｔや３７８ｎｔのようにjaponicaのみが他の外国産の種と異なる塩基を有している部位が存在するので、このような部位の塩基が何であるかを調べることによって日本産ウナギと外国産ウナギの識別が可能になる。これは、ミスマッチプローブ又はミスマッチプライマーを用いた公知の点突然変異検出法により行うことができる。
【００１６】
上記のうち、ＲＦＬＰ法は、簡便、迅速で、かつ、日本産と外国産の識別にも種の同定にも用いることができるので、好ましい方法である。以下、ＲＦＬＰ法についてさらに説明する。
【００１７】
図１及び図２に示されるように、増幅領域には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩの制限酵素部位が含まれるので、これらの制限酵素を用いてＲＦＬＰを行うことにより種の鑑定を行うことができる。また、下記実施例で用いられるプライマーＴＷ１１は、japonicaの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるように、上記の通り人為的に塩基を置換している。これらのうち、ＨｉｎｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔＩは、japonicaの切断部位のみが外国産ウナギの切断部位と異なっているので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれか一方を用いることにより、日本産と外国産との識別が可能である。また、(1)ＨｉｎｆＩと、(2)ＭｂｏIIとＲｓａＩとをそれぞれ別個に用い、それぞれにおいて得られる消化断片の大きさから種を同定することも可能である。例えば、下記実施例において用いられる、配列番号３で示される塩基配列から成る第１プライマー（ＴＷ６、配列番号７の１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイズ）と、配列番号６で示される第２プライマー（ＴＷ１１、配列番号７の３７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハイブリダイズ）とを用いて増幅を行った場合には、下記表１に示されるサイズの断片を指標として種の同定を行うことができる。
【００１８】
【表１】

【００１９】
表１からわかるように、ＨｉｎｆＩで消化した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるのは日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いることができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用いて調べ、外国産であることが判明した試料についてのみＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定することもできる。
【００２０】
なお、ＲＦＬＰ法自体はこの分野において周知であり、例えば消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫外線を照射して泳動バンドの位置を調べることにより、消化断片のサイズを調べることができる。また、ゲル電気泳動により消化産物のサイズを測定する場合、通常分子量マーカーが用いられるが、本発明の方法では、予想される泳動パターンが数種類しかないため、種のわかっているウナギのＤＮＡを上記のように増幅し、消化したものを分子量マーカーに代えて対照として用いることもできる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
１．ＤＮＡ試料の調製
各種ウナギのシラスを液体窒素で凍結後、別個に乳鉢を用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投入した。洗浄用バッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M NaCl 1.0 ml、蒸留水45.5 ml を混合して調製）０．５ｍｌを加え、すりつぶし、５分間遠心分離した。上澄み液をデカンテーションで捨て、ＳＴＥバッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M NaCl 1.0 ml、10% SDS 0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合して調製）０．５ｍｌとProteinase K溶液（10 mg/ml) ４０μｌを加え、５６℃で３０分間消化した。消化物をボルテックスミキサーで撹拌後、５分間遠心分離し、１００μｌの上清を取り、９８℃、１０分間加熱処理して酵素を失活させた。このうち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
【００２３】
２．ＰＣＲ
市販のＰＣＲキット及び装置を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライマーとしては、上記したＴＷ６及びＴＷ１１を用いた。
【００２４】
蒸留水 14.8μｌ
10xGA バッファー（Mg²⁺ 1.5 mM) 2.0μｌ
2.5 mM dNTP 1.6μｌ
25μＭ各プライマー 0.4μｌ
Taq ポリメラーゼ（5U/ μｌ） 0.2μｌ
ＤＮＡ 1.0μｌ
【００２５】
ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、６０℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工程を３５サイクル行った。
【００２６】
３．ＲＦＬＰ
各ＰＣＲ産物６μｌ、１０ｘバッファー１．５μｌ、各制限酵素０．７５μｌ及び蒸留水６．７５μｌから成る混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることにより消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％アガロースゲル電気泳動にかけた。
【００２７】
４．結果
結果を図３ないし図５に示す。図３ないし図５より、ＨｉｎｆＩ又はＰｓｔＩで消化することにより、日本産か外国産かを識別することができることがわかる。また、ＭｂｏIIとＲｓａＩとで消化することにより、各種類に応じて種々のパターンが得られ、これらとＨｉｎｆＩ消化において得られる断片長の情報とを組み合わせることにより、８種のウナギ種の同定が可能であることがわかる。
【００２８】
実施例２
一尾のウナギシラスについて、制限酵素としてはＨｉｎｆＩ及びＰｓｔＩだけを用い、かつ、電気泳動では分子量マーカーを用いずにjaponicaのＤＮＡを同様に増幅、消化したものを対照として用いること以外は実施例１と同様な操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaと同じ位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaであることが鑑定できた。
【００２９】
実施例３
実施例２とは異なる一尾のウナギシラスについて、実施例２と同じ操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaとは異なる位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaではないことが鑑定できた。
【００３０】
実施例４
実施例３において、japonicaではないことがわかった試料の増幅産物を、実施例１と同様にＭｂｏIIとＲｓａＩで消化し、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。ただし、分子量マーカーは用いず、japonica、marmorata 及びanguillaのＤＮＡを同様に増幅し、消化したものを対照として用いた。その結果、試料の泳動パターンはjaponicaと同じであった。このため、試料はreinhardtiであることが同定できた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、外見的には区別できなかったシラス等を用いてウナギの種の鑑定を行うことが初めて可能になった。従って、本発明は、養鰻分野に大いに貢献するものと期待される。
【００３２】
【配列表】

【００３３】

【００３４】

【００３５】

【００３６】

【００３７】

【００３８】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により増幅される、各種ウナギのミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵素部位を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＨｉｎｆＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＰｓｔＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図５】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＭｂｏII／ＲｓａＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid primer used for identifying eel species and a method for identifying eel species using the same.
[0002]
[Prior art]
The Japanese eel is known as Anguilla japonica, and is the most popular and expensive among Japanese consumers. On the other hand, foreign eels include French A. anguilla, Australian spotted A. reinhardti, Australian spotless A. australis, Indonesian A. celebesensis, Philippines A. marmorata, There are A. rostrata etc. from America.
[0003]
The sericulture is carried out by raising eel fry (shirasu). Shirasu is often purchased commercially. There are cases where foreign eel shirasu is mixed in what is sold as Japanese eel shirasu. If Japanese eel shirasu is mixed in with Japanese eel shirasu, even if it is cultivated at a high cost, the growth of the foreign eel is significantly worse, so all are the same as in the case of Japanese eel Even if you spend money, sales will decrease and the sericulture industry will suffer damage. However, the Japanese eel shirasu is indistinguishable both in Japan and abroad.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide an eel species identification means that can identify eel species even in the shirasu stage, which is indistinguishable in appearance.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research, the inventors of the present application can identify a species of eel by amplifying a specific region of the cytochrome b gene of eel mitochondria using a gene amplification method and examining the amplified fragment. The present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention relates to a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence (provided that T may be U) Or a first nucleic acid primer comprising a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising 15 or more consecutive bases is substituted, deleted, inserted or added. The present invention also relates to a base sequence comprising 15 or more consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence (wherein T may be U) Or a second nucleic acid primer comprising a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising 15 or more consecutive bases is substituted, deleted, inserted or added. Further, the present invention uses the first nucleic acid primer of the present invention and the second nucleic acid primer of the present invention, amplifies the DNA by a gene amplification method using eel DNA as a template, and examines the amplified DNA An eel species identification method comprising: identifying an eel species. Furthermore, the present invention uses the first nucleic acid primer of the present invention and the second nucleic acid primer of the present invention to amplify DNA by a gene amplification method using eel DNA as a template, and the amplified DNA is HinfI Alternatively, a method is provided for determining whether an eel is Anguilla japonica by digesting with RsaI and examining the resulting restriction fragment length.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the method of the present invention, a specific region of the eel mitochondrial cytochrome b gene is amplified by a gene amplification method. For this amplification, a first nucleic acid primer and a second nucleic acid primer are used.
[0008]
The first nucleic acid primer is a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence, or the continuous 15 to 10% of the number of bases substituted in the nucleotide sequence consisting of nucleotides or more, consisting of a nucleic acid consisting of deletion, insertion or addition of a nucleotide sequence. The nucleic acid may be DNA or RNA, and therefore T in the sequence may be U. The size of the nucleic acid primer is preferably about 15 to 50 bases. The sequence of the nucleic acid primer may be the same sequence as either the nucleic acid consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary strand. Even a sequence in which 10% or less of the base is substituted, deleted, inserted or added can be used because it can hybridize with the template nucleic acid. It is also possible to intentionally introduce a specific restriction enzyme site by using a substance in which a specific base is intentionally substituted using this fact.
[0009]
The second nucleic acid primer is a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a base sequence complementary to the base sequence, or the continuous 15 to 10% of the number of bases substituted in the nucleotide sequence consisting of nucleotides or more, consisting of a nucleic acid consisting of deletion, insertion or addition of a nucleotide sequence. The nucleic acid may be DNA or RNA, and therefore T in the sequence may be U. The size of the nucleic acid primer is preferably about 15 to 50 bases. The sequence of the nucleic acid primer may be the same sequence as either the nucleic acid consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 4 or its complementary strand. Even a sequence in which 10% or less of the base is substituted, deleted, inserted or added can be used because it can hybridize with the template nucleic acid. It is also possible to intentionally introduce a specific restriction enzyme site by using a substance in which a specific base is intentionally substituted using this fact. For example, TW11, which is the second nucleic acid primer specifically described in the following examples, introduces a PstI site by intentionally replacing the 27th adenine from the 5 ′ end with cytosine.
[0010]
In addition, it is necessary to use either the first nucleic acid primer or the second nucleic acid primer as a forward primer and the other as a reverse primer. Therefore, when a primer composed of the same or homologous sequence as shown in SEQ ID NO: 1 is used as the first primer, the second primer is identical or homologous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. A complementary strand of nucleic acid consisting of a sequence is used. Conversely, when a complementary strand of a nucleic acid consisting of the same or homologous sequence as shown in SEQ ID NO: 1 is used as the first primer, the second primer is identical or homologous to the sequence shown in SEQ ID NO: 4. Primer consisting of a simple sequence is used. As is well known, the nucleic acid strand and its complementary strand are reverse in the 5 ′ → 3 ′ direction of the backbone, while the base sequence in the specification describes the 5 ′ side on the left side (upstream side). Therefore, when the base sequence of the complementary strand of a certain nucleic acid strand is described in the specification, the region complementary to the downstream side (3 ′ side) of the original nucleic acid strand is upstream (5 ′ side). It is described in.
[0011]
In the eel species identification method of the present invention, a region of eel DNA is amplified by gene amplification using the first and second primers and eel DNA as a template DNA. The region to be amplified is a region within the eel mitochondrial cytochrome b gene. The nucleotide sequence of the mitochondrial cytochrome b gene region of Anguilla japonica that can be amplified by the method of the present invention is shown in SEQ ID NO: 7. Moreover, the base sequence of the said area | region and restriction enzyme site | part of various eels are shown in FIG. In addition, in FIG.1 and FIG.2, as for the arrangement | sequence of eels other than A. japonica, only the site | parts different from A. japonica are described. In addition, when the restriction enzyme cleavage site is not indicated by an arrow, a restriction enzyme site is present in species other than japonica. FIG. 2 is a continuation of FIG.
[0012]
The sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the region from the first base shown in FIG. 1 (hereinafter referred to as “1nt”) to 142 nt, and generalized sites with different bases depending on eel species It is shown as a general formula. The sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the base sequence of the region from 279 nt to 410 nt shown in FIG. 2, and generalized sites with different bases depending on eel species are shown as a general formula. When gene amplification is performed using the first and second primers, a region sandwiched between both primers is amplified.
[0013]
A method for preparing DNA used as a template for gene amplification from eel shirasu is not particularly limited, and any known method can be employed. The following two methods can be mentioned as preferred methods. In the first method, shirasu is first frozen in liquid nitrogen, ground and digested with proteinase K in an SDS-containing buffer, for example, overnight at 56 ° C. The obtained digest is extracted with phenol chloroform according to a conventional method, and ethanol-precipitated is used as a DNA sample for gene amplification. In the second method, shirasu is cut into 1-2 cm pieces or frozen with liquid nitrogen and ground, and digested with proteinase K in an SDS-containing buffer, for example, at 56 ° C. for 15 minutes to 2 hours. The obtained digest is centrifuged (for example, 1000 rpm, 10 minutes), a part of the supernatant is taken, and the enzyme is inactivated by heating at 98 ° C. for 10 minutes, for example. Provide. Note that the sample is not limited to shirasu, and may be any growth stage or processed food such as matured rice cake or grilled rice cake.
[0014]
Several gene amplification methods are well known in the art, and any of them can be used. A typical method includes, but is not limited to, polymerase chain reaction (PCR). Since reagent kits and devices for gene amplification methods are commercially available, the gene amplification method itself can be easily performed using them. In the following examples, examples of amplification by PCR are also specifically described.
[0015]
The eel species is then identified by analyzing the amplified DNA. As shown in FIGS. 1 and 2, the base sequence of the amplification region varies depending on the type of eel. Therefore, for example, eel species can be easily identified by determining the entire base sequence of the amplified region. Alternatively, since a restriction enzyme site is contained in the amplification region, it is possible to perform species identification by a so-called restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) method. Furthermore, it is also important to distinguish between Japanese eels and foreign eels. For example, there are parts where only japonica has a different base from other foreign species such as 156 nt and 378 nt. Since it exists, it is possible to distinguish Japanese eels from foreign eels by examining what the bases at such sites are. This can be performed by a known point mutation detection method using a mismatch probe or a mismatch primer.
[0016]
Among the above, the RFLP method is a preferred method because it is simple and rapid, and can be used for identification between Japanese and foreign products and species. Hereinafter, the RFLP method will be further described.
[0017]
As shown in FIGS. 1 and 2, the amplification region contains restriction sites for HinfI, MboII, and RsaI. Therefore, species can be identified by performing RFLP using these restriction enzymes. . In addition, the primer TW11 used in the following examples has artificially substituted bases as described above so that a PstI site is generated only in the case of japonica. Among these, PstI when using HinfI and TW11 is different only in the cleavage site of japonica from the cleavage site of foreign eel. Therefore, by using either HinfI or PstI, Can be identified. In addition, (1) HinfI, (2) MboII and RsaI can be used separately, and the species can be identified from the size of the digested fragment obtained in each. For example, a first primer (TW6, hybridizes with 1nt to 32nt of SEQ ID NO: 7) comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a second primer (TW11, TW11, shown in SEQ ID NO: 6) used in the following Examples When amplification is performed using the 379 nt to 408 nt complementary strand of SEQ ID NO: 7), the species can be identified using a fragment of the size shown in Table 1 below as an index.
[0018]
[Table 1]

[0019]
As can be seen from Table 1, the fragments of 220 bp and 118 bp appear when digested with HinfI only from Japan (japonica), so if you only want to judge whether it is from Japan or not, only HinfI is used. Can be used. Alternatively, first, whether or not it is made in Japan is examined using only HinfI, or PstI for confirmation with HinfI, and only those samples that are found to be foreign are digested with MboII and RsaI to identify the species You can also
[0020]
The RFLP method itself is well known in this field. For example, the size of the digested fragment can be determined by subjecting the digested product to gel electrophoresis and irradiating with ultraviolet rays to examine the position of the electrophoresis band. In addition, when measuring the size of a digested product by gel electrophoresis, a molecular weight marker is usually used. However, in the method of the present invention, since there are only a few types of expected migration patterns, DNA of eels with known species is used for the above. The amplified and digested product can be used as a control in place of the molecular weight marker.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0022]
Example 1
1. Preparation of DNA Samples Various eel shirasu were frozen in liquid nitrogen, then ground separately using a mortar and placed in an Eppendorf tube. Add 0.5 ml of washing buffer (prepared by mixing 2.5 ml of 1M Tris-HCl (pH8.0), 0.5M EDTA (pH8.0), 1.0 ml of 5M NaCl, 45.5 ml of distilled water), grind and mix for 5 minutes Centrifuged. Discard the supernatant by decantation, and add STE buffer (2.5 ml of 1M Tris-HCl (pH8.0), 1.0 ml of 0.5M EDTA (pH8.0), 1.0 ml of 5M NaCl, 0.5 ml of 10% SDS, 45.0 ml of distilled water). Prepared by mixing) 0.5 ml and 40 μl of Proteinase K solution (10 mg / ml) were added and digested at 56 ° C. for 30 minutes. The digest was agitated with a vortex mixer and then centrifuged for 5 minutes, and 100 μl of the supernatant was collected and heat-treated at 98 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. Of this, 1 μl was taken and subjected to PCR.
[0023]
2. PCR
PCR was performed using a commercially available PCR kit and apparatus. The composition of the PCR mixture was as follows. In addition, TW6 and TW11 described above were used as primers.
[0024]
Distilled water 14.8μl
10xGA buffer (Mg ²⁺ 1.5 mM) 2.0 μl
2.5 mM dNTP 1.6 μl
25μM each primer 0.4μl
Taq polymerase (5U / μl) 0.2μl
DNA 1.0 μl
[0025]
In PCR, 35 cycles of a denaturation step at 95 ° C. for 30 seconds, an annealing step at 60 ° C. for 30 seconds, and an extension step at 72 ° C. for 30 seconds were performed.
[0026]
3. RFLP
Digestion was performed by incubating a mixture of 6 μl of each PCR product, 1.5 μl of 10 × buffer, 0.75 μl of each restriction enzyme and 6.75 μl of distilled water at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, each digest was subjected to 3% agarose gel electrophoresis by a conventional method.
[0027]
4). The results are shown in FIGS. From FIG. 3 to FIG. 5, it can be seen that digestion with HinfI or PstI makes it possible to distinguish between Japanese and foreign products. In addition, digestion with MboII and RsaI yields various patterns according to each type, and by combining these with the fragment length information obtained by HinfI digestion, it is possible to identify eight eel species It can be seen that it is.
[0028]
Example 2
Example 1 with the exception of using only HinfI and PstI as restriction enzymes, and amplifying and digesting japonica DNA in the same manner without using a molecular weight marker as a control for a single eel shirasu The same operation was performed. As a result, when digested with either HinfI or PstI, an amplified band was detected at the same position as the control japonica, and it was confirmed that the sample was japonica.
[0029]
Example 3
The same operation as in Example 2 was performed on one eel shirasu different from that in Example 2. As a result, when digested with either HinfI or PstI, an amplified band was detected at a position different from that of the control japonica, and it was determined that the sample was not japonica.
[0030]
Example 4
In Example 3, the amplification product of the sample that was found not to be japonica was digested with MboII and RsaI in the same manner as in Example 1 and subjected to 3% agarose gel electrophoresis. However, molecular weight markers were not used, and japonica, marmorata and anguilla DNAs were similarly amplified and digested and used as controls. As a result, the migration pattern of the sample was the same as japonica. For this reason, the sample could be identified as reinhardti.
[0031]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible for the first time to identify eel species using shirasu or the like that could not be distinguished in appearance. Therefore, the present invention is expected to greatly contribute to the sericulture field.
[0032]
[Sequence Listing]

[0033]

[0034]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the base sequence and restriction enzyme sites of amplified regions of various eel mitochondrial DNA amplified by the method of the present invention.
FIG. 2 is a continuation of FIG.
FIG. 3 is a diagram schematically showing the results of PCR-RFLP of various eels obtained in Examples of the present invention when digested with HinfI.
FIG. 4 is a diagram schematically showing the results of PCR-RFLP of various eels obtained in Examples of the present invention when digested with PstI.
FIG. 5 is a diagram schematically showing the results of PCR-RFLP obtained by digesting with MboII / RsaI for various eels obtained in the examples of the present invention.

Claims

Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence, a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases (however, T may be U) or the continuous 15 An eel species detection primer comprising a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising at least bases is substituted, deleted, inserted or added.

Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence, a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases (however, T may be U) or the continuous 15 The primer according to claim 1, comprising a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising at least bases is substituted, deleted, inserted or added.

The primer according to claim 2, comprising a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing (provided that T may be U).

Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence, a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases (however, T may be U) or the continuous 15 An eel species detection primer comprising a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising at least bases is substituted, deleted, inserted or added.

Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or a base sequence complementary to the base sequence, a base sequence consisting of 15 or more consecutive bases (however, T may be U) or the continuous 15 The primer according to claim 4, which comprises a nucleic acid comprising a base sequence in which 10% or less of the base sequence comprising at least bases is substituted, deleted, inserted or added.

6. The primer according to claim 5, comprising a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (where T may be U).

Using the primer according to any one of claims 1 to 3 and the primer according to any one of claims 4 to 6, the DNA is amplified by a gene amplification method using eel DNA as a template. A method for identifying an eel species comprising identifying an eel species by examining the obtained DNA.

The method according to claim 7, wherein the amplified DNA is digested with a restriction enzyme, and a restriction fragment length obtained by digestion is examined.

The method according to claim 8, wherein the restriction enzyme is one or more restriction enzymes selected from the group consisting of HinfI, PstI, MboII and RsaI.

The method according to claim 9, wherein digestion with HinfI and digestion with MboII and RsaI are carried out to determine the length of restriction fragments generated by each digestion.

The method according to claim 10, wherein the primer according to claim 3 is used as a forward primer and the primer according to claim 6 is used as a reverse primer.

Using the primer according to any one of claims 1 to 3 and the primer according to any one of claims 4 to 6, the DNA is amplified by a gene amplification method using eel DNA as a template. To determine whether the eel is Anguilla japonica by digesting the DNA with HinfI or RsaI and examining the resulting restriction fragment length.

The method according to claim 12, wherein the primer according to claim 3 is used as a forward primer, and the primer according to claim 6 is used as a reverse primer.