JP4082142B2

JP4082142B2 - Solution measuring microelectrode, electrochemical measuring device, electrode manufacturing method, and solution measuring method

Info

Publication number: JP4082142B2
Application number: JP2002255802A
Authority: JP
Inventors: 信雄本多; 習一庄子; 敬之本間; 裕崇佐藤
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: JP2004093406A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法に係り、特に、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野において、酸化還元反応を利用して生理活性物質の微量測定に用いる溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アンペロメトリック型電気化学測定方法の１つとして、電流シグナルを検出するために基板上に櫛歯型電極を平面的に配置し、陽極と陰極の電極を独立して電位制御することで酸化還元物質（酸化型と還元型が可逆的に生じる酸化還元物質）の電気的な検出信号を増幅させ、シングル電極に比較して約５倍から１０倍の電流シグナルを得ていた（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３、６５、１５５９−１５６３）。
【０００３】
図１５の断面図に示す従来の溶液測定用電極は、平面的な二つの櫛歯形電極がかみあった構造を有している。この電極に接触する被検液中のレドックス活性基は、アノード電極４にレドックス活性基（Ｒ）が酸化するような電位を印加し、カソード電極３に酸化されたレドックス活性基（ｏ）が還元されてもとに戻るような電位を印加する。この電位状態を保持し、アノード電極４とカソード電極３の間でレドックス活性基が拡散移動することで酸化と還元のサイクルを繰り返し、化学増幅効果（レドックスサイクリング）によって被検液中のレドックス活性基を検出していた（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３、６５、１５５９−１５６３）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前述の如く、従来の溶液測定用電極は、平面状の櫛歯形電極が噛みあった構造であるから、レドックス活性基が電極と接触する接触領域が櫛歯形アノード電極４と櫛歯形カソード電極３の平面上に制限されている。また、サンプル量や櫛歯形電極が微小になると絶対的な電気信号のレベルが下がり感度が低くなるという問題が存在する。
【０００５】
そのため、電気化学測定において、平面櫛歯電極表面近傍の被検液下層に存在するレドックス活性基の検出が可能であるとしても、被検液の中層又は上層のレドックス活性基の検出に一定の限界が生じていた。
【０００６】
本発明は、斯かる実情に鑑み、電気化学測定を行う際に高感度な電流シグナルを得る溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様にかかる溶液測定用微小電極は、例えば、図１に示すように、被測定溶液を受容する、絶縁材料で形成された基板１０と、基板１０上に基板面から所定の高さを有する三次元的に複数枚に形成された第１の作用電極１６と、基板１０上に基板面から所定の高さを有する三次元的に複数枚に形成された第２の作用電極１８と、基板１０上に形成された参照電極１２と、基板１０上に形成された対向電極１４とを備え、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８とを互い違いに平行に配置するように構成する。ここで三次元的に形成とは、作用電極１６及び１８の高さは１μｍ以上のことを言う。
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明の第２の態様は、第１の態様の溶液測定用微小電極において、例えば、図７に示すように、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８の断面幅が各々独立して０．１μｍから１００μｍであり、第１の作用電極１６及び第２の作用電極１８との対面距離が０．１μｍから１００μｍに構成する。
【０００９】
このように構成すると、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８との間に受容された被測定溶液の測定感度を向上させることができる。
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の第３の態様は、第１又は第２の態様の溶液測定用微小電極において、例えば、図１に示すように、第１及び第２の作用電極１６、１８の高さは、各々１μｍから１０００μｍに構成する。
【００１１】
このように構成すると、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８との間に受容された被測定溶液の測定感度を向上させることができる。
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明の第４の態様の溶液測定用微小電極の製造方法は、第１の態様の溶液測定用微小電極の製造において、例えば、図８から図１１に示すように、透明材料製の平面基板１０上に金属５４の電極パターンを形成する工程（ｃ）と、電極パターンが形成された基板１０を絶縁材料５５でコーティングする工程（ｄ）と、コーティングされた絶縁材料５５を、少なくとも電極を形成する領域から選択的に除去する工程（ｆ）と、絶縁材料５５が電極を形成する領域から除去された基板１０に厚膜型のネガ型フォトレジスト５６をコーティングする工程（ｇ）と、基板１０の裏面から露光５２した後に、ネガ型フォトレジスト５６を現像してパターニングする工程（ｉ）と、基板１０上にパターニングしたネガ型フォトレジスト５６を鋳型として金属６３を堆積させ電極を形成する工程（ｊ）と、金属６３を堆積させた後に、ネガ型フォトレジスト５６を剥離する工程（ｋ）とを備える。なお、電極を形成する手段としては、電解メッキ法、無電解メッキ法、蒸着などの種々の金属堆積手段から選択することができる。電極の材質としては、例えば金が好ましく、白金、カーボン、あるいはニッケル、ニッケル基合金を基体として表面を金メッキ或いは白金メッキをした材料等をあげることができる。
【００１３】
このように構成すると、基板１０上にパターニングしたネガ型フォトレジスト５６を鋳型として金属６３を堆積させ電極を形成する工程（ｊ）と、金属６３を堆積させた後に、ネガ型フォトレジスト５６を剥離する工程（ｋ）とを備えるので、高アスペクト比の溶液測定用微小電極を製造することができる。
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明の第５の態様の電気化学測定用装置は、例えば、図１及び図１２に示すように、第１乃至第３の何れかの態様の溶液測定用微小電極１６、１８と、一方の作用電極（１６）の電位と他方の作用電極（１８）の電位を各々独立に制御し、少なくとも一方の電極に流れる電流値を測定する装置７２とを備える。
【００１５】
このような構成に基づけば、一方の作用電極（１６）の電位と他方の作用電極（１８）の電位を各々独立に制御し、少なくとも一方の電極に流れる電流値を測定する装置７２とを備えるので、本発明の微小電極の優位点を生かした溶液の電気化学測定ができる。
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明の第６の態様の溶液測定方法は、例えば、図１３に示すように、第１乃至第３の何れかの態様の溶液測定用微小電極を使用した溶液測定をすることができる。
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明の第７の態様の溶液測定方法は、例えば、図１３に示すように、第１乃至第３の何れかの態様の溶液測定用微小電極による、酸化還元物質の電気化学的溶液測定をすることができる。
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明の第８の態様は、第７の態様の溶液測定方法において、例えば、図１３に示すように、抗原又は抗体に標識した酵素により生産される酸化還元物質の測定をすることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図示例と共に説明する。図１から図１４は発明を実施する形態の一例であって、図中、図と同一または類似の符号を付した部分は同一物または相当物を表わし、重複した説明は省略する。
【００２０】
図１は、本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置１の一部破断斜視図である。溶液測定装置１は、紫外線光を透過する透明な絶縁材料で形成された基板１０と、この基板１０の中央領域上に１μｍから１０００μｍの所定の高さを有する三次元的に形成された複数の第１の作用電極１６と、この第１の作用電極１６と互い違いに平行に配置され、基板１０の中央領域上に１μｍから１０００μｍの所定の高さを有する三次元的に形成された複数の第２の作用電極１８と、基板１０上に形成され、第２の作用電極１８と電気的に接続された引出配線２０と、この引出配線２０に隣接し第２の作用電極１８と間隔を置いて基板１０上に形成された参照電極１２と、基板１０上に形成され、第１の作用電極１６と電気的に接続された引出配線２２と、この引出配線２２に隣接し第１の作用電極１６と間隔を置いて基板１０上に形成された対向電極１４とを備える。なお、説明の便宜上、少なくとも引出配線２０、２２の表面を被覆する絶縁層を剥がした状態を示している。
【００２１】
また、溶液測定装置１は、矢印２６及び矢印２８で示す方向に被測定溶液を流すチャンネル領域を確定させるシリコンラバー製のチャンネル側壁２４を設け、幅ｗと高さｈのチャンネルを形成している。このチャンネルを流れる被測定溶液は、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８とを互い違いに平行に配置する領域を通過し、例えば、免疫反応及び酵素反応により生じた酸化還元物質ｐ−アミノフェノール（以下、ＰＡＰ）を含む反応溶液を被測定溶液として受容する。第１の作用電極１６と第２の作用電極１８の配置は、図示するように被測定溶液の流れる方向に沿って平行に並べ、被測定溶液の流れを妨げることなく電気化学測定を行うことができる。但し、被測定溶液を流すことなく溶液測定装置１内で受容し電気化学測定を実施する場合は、チャンネルの長手方向に対して直角に配置してもよい。
【００２２】
上記チャンネルは、例えば、幅ｗを２０００μｍ、高さｈを三次元の作用電極の高さと同等の高さに設定し被測定溶液を受容し、流すことができる。また、三次元に形成した作用電極１６と作用電極１８は、例えば、断面幅を約０．１μｍから１００μｍの間で任意に選択することができ、好ましくは０．１から１０μｍの断面幅に設定する。
【００２３】
作用電極１６、１８の高さは、１μｍ以上であればよく、１μｍから１０００μｍの間で任意に選択することができ、好ましくは１０μｍから１０００μｍ、さらに好ましくは３０μｍから１０００μｍの高さｈに設定する。
【００２４】
さらに、第１と第２の作用電極の間隔、すなわち、両電極の対面距離が０．１μｍから１００μｍの間で任意に選択することができ、好ましくは０．１μｍから１０μｍ、さらに好ましくは０．１μｍから５μｍの対面距離に設定する。
【００２５】
このように作用電極１６と１８の断面幅、高さ、間隔を各々設定することにより、被測定溶液を受容する領域を確保することができる。
【００２６】
図２は、本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置１の模式的な平面図である。溶液測定装置１は、基板１０の略中央領域上に所定の高さを有する三次元的に形成された複数本の第１の作用電極１６と、この第１の作用電極１６と互い違いに平行に配置され、基板１０の略中央領域上に所定の高さを有する三次元的に形成された複数本の第２の作用電極１８と、基板１０上に形成され、第２の作用電極１８の左端部と電気的に接続された引出配線２０と、この引出配線２０の左に隣接し間隔を置いて基板１０上に形成された参照電極１２と、基板１０上に形成され、第１の作用電極１６の右端部と電気的に接続された引出配線２２と、この引出配線２２の右に隣接し間隔を置いて基板１０上に形成された対向電極１４とを備える。本発明による第１の実施の形態における作用電極の高さは５０μｍ、幅は５μｍ、第１の作用電極と第２の作用電極との間隔は５μｍ、電極数は第１の作用電極が９０本、第２の作用電極が９０本、合計１８０本（９０対）である。
【００２７】
引出配線２０は、第２の作用電極１８との電気的なコンタクト領域から溶液測定装置１の左縁部まで延在し、その先端に外部から電気的接続を許容するコネクティングパッド２０ａを設けている。
【００２８】
引出配線２２は、第１の作用電極１６との電気的なコンタクト領域から溶液測定装置１の左縁部まで延在し、その先端に外部から電気的接続を許容するコネクティングパッド２２ａを設けている。
【００２９】
参照電極１２は、引出配線２０と平行して溶液測定装置１の左縁部まで延在し、その先端に外部から電気的接続を許容するコネクティングパッド１２ａを設けている。
【００３０】
対向電極１４は、引出配線２２と平行して溶液測定装置１の左縁部まで延在し、その先端に外部から電気的接続を許容するコネクティングパッド１４ａを設けている。
【００３１】
また、溶液測定装置１は、左縁部と右縁部に挟まれた本体領域に配置された基板１０、引出配線２０、引出配線２２、参照電極１２、及び対向電極１４の表面を被覆する絶縁層３６を備える。この絶縁層３６には、基板１０の略中央領域に配置された櫛歯形の三次元作用電極１６、１８を露出する開口部３２と、作用電極１６の近傍に配置された対向電極１４の一部を露出する開口部３４と、作用電極１８の近傍に配置された参照電極１２の一部を露出する開口部３０と、を有している。
【００３２】
さらに、矢印２８で示す方向に流れる被測定溶液は、開口部３０内の参照電極１２と接触し、開口部３２内の作用電極１６、１８と接触し、開口部３４内の対向電極１４と接触するように構成されている。
【００３３】
図３は、本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置の概略図である。図上部の（ａ）に示す平面図を参照して溶液測定装置の構成を説明する。溶液測定装置は、コネクティングパッド１２ａ、コネクティングパッド１４ａ、コネクティングパッド２０ａ、及びコネクティングパッド２２ａを露出するように、基板１０上を被覆するシリコンラバー製の封止材３８によりパッケージングされている。
【００３４】
溶液測定装置は、図中破線で囲まれた基板中心領域に被測定溶液を流す縦長の流路４０が中空状態に形成されている。この流路４０の一端部（コネクティングパッド群側）には外部に通じる貫通口４２が設けられ、被測定溶液をチャンネルとしての流路４０内部に流入させることができる。一方、流路４０の他端部には外部に通じる貫通口４４が設けられ、被測定溶液を外部に排出することができる。
【００３５】
図下部の（ｂ）に示す断面図を参照して溶液測定装置の構成を説明する。溶液測定装置は、基板１０上に形成された作用電極１６と作用電極１８を有し、この作用電極１６、１８を囲むように封止材３８によりパッケージングされている。
【００３６】
図４の経路図を参照して、本発明の実施の形態である溶液測定方法を説明する。測定材料のサンプルは、ヒト血清又は標準液としてのヒト血清中に存在するαフェトプロテイン（ＡＦＰ）溶液を用い、固相抗体は、抗ＡＦＰ抗体固定化磁性体粒子を用い、標識抗体は、アルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体を用い、基質は、ｐ−アミノフェニルリン酸塩（以下、ＰＡＰＰ）を０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）による緩衝液で溶解する。
【００３７】
第１ステップは、抗ＡＦＰ抗体固定化磁性体粒子溶液にサンプル溶液（ヒト血清又はＡＦＰ標準溶液）を混合し、免疫反応を行う。サンプル溶液中のＡＦＰは磁性粒子に固定化されている抗ＡＦＰ抗体と特異的に結合させる。
【００３８】
第２ステップは、免疫反応後の磁性粒子に対して磁石を用いて磁性粒子を固定させ、洗浄液により洗浄処理を施しサンプル溶液中の不純物成分を除去する。
【００３９】
第３ステップは、洗浄後の磁性粒子に対して過剰量のアルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液を加え免疫反応を行い、アルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体と磁性粒子に免疫結合しているＡＦＰを特異的に結合させる。
【００４０】
第４ステップは、免疫反応後の磁性粒子に対して磁石を用いて磁性粒子を固定させた状態で、洗浄液により洗浄処理を施し反応液中の未結合アルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体を除去する。
【００４１】
第５ステップは、引き続き、十分な量のＰＡＰＰ溶液（０．１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液に溶解）を反応させ、アルカリフォスファターゼによる酵素反応によりＰＡＰＰの燐酸基が加水分解され遊離する結果、ＰＡＰを産生させる。
【００４２】
このＰＡＰの産生量は、アルカリフォスファターゼの濃度（量）に比例し、またアルカリフォスファターゼの濃度（量）は免疫反応におけるサンプル中の目的物質（ＡＦＰ）の濃度（量）に比例するため、ＰＡＰ濃度の定量をすることにより目的物質（ＡＦＰ）の定量が可能となる。
【００４３】
第６ステップは、一方の作用電極にＰＡＰが酸化するような電位を印加し、他方の作用電極に酸化されたＰＡＰすなわちｐ−キノンイミン（以下、ＰＱＩ）が還元されてＰＡＰに戻るような電位を印加する。この電位状態を保持することで酸化と還元のサイクルを繰り返し、化学増幅効果（レドックスサイクリング）を生じさせ、各々の作用電極に流れる電流値を測定しＰＡＰの定量を行うことができる。
【００４４】
このＰＡＰの測定は、酵素反応によって生じたＰＡＰの電気化学測定により実施するため作用電極を用いて行うが、他の第１から第５ステップまでの処理は、溶液測定装置の外部で遂行してから、これら反応により得られたＰＡＰを溶液測定装置の参照電極、作用電極、対向電極に滴下して電気化学測定を実施してもよく、ＰＡＰを参照電極、作用電極、対向電極を囲むチャンネルに流して電気化学測定を実施もよい。
【００４５】
また、上記第１から第５ステップまでの処理を溶液測定装置のチャンネルの中で遂行することができる。この場合、抗体固定化磁性粒子の位置を磁石によって制御することで任意の場所を固相場（反応場）として利用することができる。
【００４６】
さらに、固相場として磁性体を用いずにチャンネルの表面（内壁）やその他の材料表面に予め抗体を固定化し、上記第２から第６ステップまでの処理を溶液測定装置のチャンネルの中で遂行することができる。この場合も、第６ステップによるＰＡＰの電気化学測定以外の処理は、溶液測定装置の外部で第１から第５ステップを遂行することもできる。
【００４７】
上記第１から第５ステップまでの処理において、免疫反応から酵素反応を遂行する反応方法として、溶液測定装置の外部で反応処理をする方法と、参照電極、作用電極、対向電極に到達する前のチャンネルの中で反応処理をする方法と、参照電極、作用電極、対向電極の配置されている位置で反応処理をする方法の何れの方法をも適用することができる。
【００４８】
図５は、本発明による実施の形態である溶液測定装置の模式的斜視図である。溶液測定装置は、基板１０の第１の作用電極１６と第２の作用電極１８の間に受容する溶液の酸化還元反応を繰り返すように構成する。
【００４９】
溶液は、第１の作用電極１６と第２の作用電極１８の間で複数の酸化と還元を繰り返す。図示した酸化還元反応は基板１０の近傍と、チャンネルの中間と、チャンネルの上方で酸化還元反応を繰り返すように構成されている。
【００５０】
溶液測定装置は、基板１０上に作用電極としての陰極１６（Ｃａｔｈｏｄｅ）と作用電極としての陽極１８（Ａｎｏｄｅ）を備え、陰極１６と陽極１８は、レドックス活性基（Ｒ）としてのＰＡＰの電気化学測定に用いられる。レドックス活性基（Ｒ）は種類に限定はなく、例えば、ＰＡＰの他にフェノチアジンやフェロセロン等の可逆的に酸化還元反応する活性基を用いることができる。
【００５１】
陽極１８（Ａｎｏｄｅ）にＰＡＰが酸化する電位を印加すると陽極１８表面でＰＡＰが酸化されＰＱＩが生じる。このとき陽極１８で生じた電流値を酸化電流値として検出できる。また同時に陰極１６（Ｃａｔｈｏｄｅ）にＰＱＩが還元する電位を印加しておくと、酸化反応によって生じたＰＱＩが陰極１６表面で還元されＰＡＰが生じる。このとき陰極１６で生じた電流値を還元電流値として検出できる。
【００５２】
このように陽極及び陰極の電位をＰＡＰの酸化電位及びＰＱＩの還元電位に保持することにより酸化還元反応が繰り返され、陽極１８と陰極１６に流れる電流値を測定できる。各々の測定電流値は酸化還元物質の濃度に比例するのでＰＡＰ及びＰＱＩの定量が可能となる。
【００５３】
図６は、本発明による第２の実施の形態である溶液測定装置の模式的な平面図である。溶液測定装置は、第１の実施の形態の電極と配線のパターンを変更し、同様の溶液測定を実施することができる。基板は、幅（図中縦方向）約２０ｍｍ、長さ（図中横方向）約３０ｍｍの透明部材で形成され、基板上に参照電極１２、対向電極１４、第１の作用電極１６、第２の作用電極１８、引出配線２０、及び引出配線２２を形成している。第１と第２の作用電極の構造は上述した実施の形態と同等であり、重複する説明を省略する。
【００５４】
参照電極１２は、図中右から左へ長手方向に形成された幅が約２０００μｍのチャンネル４０の略中央領域から装置右縁部まで延材し端部にコネクティングパッド１２ａを備え、この参照電極１２の線幅ルールは約４００μｍで形成されている。
【００５５】
引出配線２０は、参照電極１２の右に隣接し、チャンネル４０の略中央領域から装置右縁部まで延材し端部にコネクティングパッド２０ａを備え、この引出配線２０の線幅ルールは約４００μｍで形成されている。
【００５６】
引出配線２２は、作用電極を引出配線２０と挟むようにチャンネル４０の略中央領域から装置右縁部まで延材し端部にコネクティングパッド２２ａを備え、この引出配線２２の線幅ルールは約４００μｍで形成されている。
【００５７】
対向電極１４は、引出配線２２の右に隣接し、チャンネル４０の略中央領域から装置右縁部まで延材し端部にコネクティングパッド１４ａを備え、この対向電極１４の線幅ルールは約４００μｍで形成されている。
【００５８】
チャンネル４０は、溶液の流路を形成し、図中左の参照電極１２側から右の対向電極１４側へ溶液を順次流すことができる。すなわち、矢印２６で示す溶液流入方向から矢印２８で示す溶液排出方向へ溶液を流す。
【００５９】
上記チャンネル４０内に配置された参照電極１２と隣接する引出配線２０との間隔ａは約４００μｍ、同様に、対向電極１４と隣接する引出配線２２との間隔ｂは約４００μｍに設定されている。
【００６０】
また、各コネクティングパッド１２ａ、１４ａ、２０ａ、２２ａは、縦２０００μｍ、横２０００μｍに設定されている。
【００６１】
図７は、本発明による第２の実施の形態である溶液測定装置に用いる第１と第２の作用電極の模式的な平面図である。平行に形成された引出配線２０と２２の間に互い違いに平行に三次元立体構造の第１の作用電極１６と第２の作用電極１８が形成されている。
【００６２】
第１の作用電極１６は、引出配線２２と電気的に接続され、図中左側に配置した引出配線２２から右水平方向に延材するように形成されている。一方、第２の作用電極１８は、引出配線２０と電気的に接続され、図中右側に配置した引出配線２０から左水平方向に延材するように形成されている。
【００６３】
第１と第２の作用電極が互い違いに平行に配置する領域には、矩形状の開口部３２が形成され、第１と第２の作用電極が溶液と接触することを可能にしている。この開口部３２の上方縁部と隣接する第１の作用電極１６との間隔ｇは、約５０μｍに設定し、この作用電極１６と開口部３２の下方縁部に隣接する第２の作用電極１８との距離ｄは、１８００μｍに設定し、開口部３２の縦方向の長さは、距離ｃの約２０００μｍ以内の範囲で距離ｉの約５０μｍを上部と下部から差し引いた約１９００μｍに設定している。
【００６４】
また、引出配線２０と引出配線２２との対向距離ｅは、約２２００μｍに設定し、引出配線２０と２２との間に配置する開口部３２の横方向の長さｆは、約２２００μｍ未満であって約２０００μｍ以上の範囲から任意に選択することができる。
【００６５】
上記開口部３２の中に配置される作用電極１６、１８は、例えば、線幅を各々２μｍ、５μｍ、１０μｍ等の何れか１つのルールを採用し、作用電極間の距離（間隔）を２μｍ、５μｍ、１０μｍ等の何れか１つのルールを採用することができる。
【００６６】
図８は、本発明による実施の形態である溶液測定用微小電極の製造工程図である。図示した（ａ）工程は、出発材料である透明材料製の基板１０上にポジ型フォトレジスト５０をスピンコートにより塗布し、フォトマスク５１を介して紫外線光５２を表面から基板１０に向けて露光する。基板１０は、例えば、石英ガラスやサファイアガラス等を使用することができ、本発明はこのガラスに限定するものではなく、他の透明材料を用いてもよい。
【００６７】
（ｂ）工程は、フォトリソグラフィ処理により、パターニングしたポジ型フォトレジスト５０と基板１０の表面にクロム５３（Ｃｒ）と金５４（Ａｕ）を順にデポジションする。堆積したクロム５３の膜厚は１００Å、金５４の膜厚は１０００Åに設定する。
【００６８】
（ｃ）工程は、基板１０上のポジ型フォトレジスト５０を、例えばアセトンにより溶解しリフトオフ法により除去することにより、クロム５３と金５４の下地電極をパターニングする。
【００６９】
この下地電極のリフトオフ工程に本発明は限定されることはなく、例えば、基板１０の全面にクロム５３と金５４を順次堆積させた後にレジストを塗布し、フォトリソグラフィ処理によってレジストをパターニングしてからクロム５３と金５４をエッチングし下地電極をパターニングすることができる。
【００７０】
（ｄ）工程は、下地電極を形成した基板１０上にフッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ、登録商標、旭硝子）の絶縁膜５５をコーティングする工程である。フッ素樹脂に代えてシリコン酸化膜ＳｉＯ_２等を絶縁膜として使用することができる。
【００７１】
図９は、本発明による実施の形態である溶液測定用微小電極の製造工程図である。図示した（ｅ）工程は、絶縁膜（ＣＹＴＯＰ）をコーティングした基板１０上にポジ型フォトレジスト５０ａをコーティングし、フォトマスク５７を介して基板１０の表面から紫外線光で露光し、ポジ型フォトレジスト５０ａをパターニングし図２に示した作用電極１６、１８、開口部３２、参照電極１２、開口部３０、対向電極１４、開口部３４、及びコネクティングパッド１２ａ、１４ａ、２０ａ、２２を露出するためのマスクを形成する工程断面図である。
【００７２】
（ｆ）工程は、ドライエッチング（Ｏ_２アッシング）により、絶縁膜５５を選択的に除去して図２に示した作用電極１６、１８、開口部３２、参照電極１２、開口部３０、対向電極１４、開口部３４、及びコネクティングパッド１２ａ、１４ａ、２０ａ、２２を露出してから、残存する絶縁膜５５上のポジ型フォトレジスト５０ａをアセトンにより除去する工程である。
【００７３】
（ｇ）工程は、基板１０上に約５０μｍの厚さの厚膜メッキ用ネガ型フォトレジスト５６を塗布し、紫外線光５２を基板１０の裏面から照射して電極パターン上以外のレジストを基板裏面より露光するセルフアライメントによる露光工程である。
【００７４】
（ｈ）工程は、基板１０表面からフォトマスク５７ａを介して紫外線光５２を照射し、作用電極領域、及び、コネクティングパット上以外の領域に塗布したネガ型フォトレジスト５６を露光する工程である。
【００７５】
（ｉ）工程は、紫外線光５２により露光したネガ型フォトレジスト５６をフォトリソグラフィ工程により現像し、作用電極の下地電極、コネクティングパッドを露出する工程である。
【００７６】
図１０は、本発明による実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。図示した（ｊ）工程は、ネガ型フォトレジスト５６の開口部に形成された作用電極を包囲する領域５８をメッキ用浴に浸漬させ、コネクティングパットをメッキ浴水面上から離して引出配線から作用電極の下地電極へ負の電位を印加し、ネガ型フォトレジスト５６を鋳型として用い、作用電極の下地電極上にニッケル６３（Ｎｉ）を堆積させる電解メッキを施す工程である。
【００７７】
この電解メッキ工程では、メッキ処理時の電流密度を制御することにより、ニッケル６３の堆積速度をコントロールし、ポジ型フォトレジスト５６層の高さを超えないレベルでメッキ処理を停止させる。仮に、ニッケル６３がネガ型フォトレジスト５６層の高さを超えオーバハング状態に至った場合には、基板１０の表面側からポリッシング処理を施し、ニッケル層の平坦性を確保することができる。
【００７８】
（ｋ）工程は、基板１０上のネガ型フォトレジスト５６層をレジスト剥離液で剥離した工程である。図示したように、基板１０上には、パターニングした絶縁膜５５と、クロム５３、金５４の二層の電極及び配線層、クロム５３、金５４、ニッケル６３の三層構造の作用電極が形成されている。このニッケル６３の電極をＳＥＭで観察した結果、幅が１０μｍ、高さが３０μｍ、ニッケル電極間の間隔が１０μｍであることを確認することができた。
【００７９】
（ｌ）工程は、電解メッキ法又は無電解メッキ法により領域５９中のニッケル６３の露出面に金６０（Ａｕ）をコーティングする工程である。上記工程を大別すると、鋼性が高く寸法精度や高速形成性に優れるニッケルで基体となる構造を形成する工程と、その表面を電気化学的特性や表面修飾性に優れた金でコーティングする。この金コーティング処理に引き続き、参照電極３０部分に硝酸銀溶液を浸しコネクティングパッドを通し負の電位を印加し参照電極３０の表面にＡｇを電解メッキし、その後塩酸水溶液を浸しコネクティングパッドを通し正の電位を印加し参照電極の表面に被着したＡｇ層の一部をＡｇＣｌ化することによりＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を形成することができる。
【００８０】
図１１は、本発明による他の実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。図示した（ｍ）工程は、ネガ型フォトレジスト５６の開口部に形成された作用電極を包囲する領域６１をメッキ用浴に浸漬させ、コネクティングパッドをメッキ浴水面上から離して引出配線から作用電極の下地電極へ負の電位を印加し、ネガ型フォトレジスト５６を鋳型として作用電極の下地電極上に金６２（Ａｕ）を堆積させる電解メッキを施す工程である。
【００８１】
（ｎ）工程は、ネガ型フォトレジスト５６からオバーハングした金６２を基板１０の表面側からポリッシング処理を施し、金６２上部の平坦性を確保する工程である。
【００８２】
引き続き、（ｏ）工程で基板１０上のネガ型フォトレジスト５６層をレジスト剥離液で剥離し、基板１０上に、パターニングした絶縁膜５５と、クロム５３、金５４の二層の電極及び配線層と、クロム５３、金５４、金６２の二層構造の作用電極が形成される。この金メッキ処理に引き続き、参照電極３０部分に硝酸銀溶液を浸しコネクティングパッドを通し参照電極部に負の電位を印加し参照電極部の表面にＡｇを電解メッキし、その後塩酸水溶液を浸しコネクティングパッドを通し正の電位を印加し参照電極の表面に被着したＡｇ層の一部をＡｇＣｌ化することによりＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を形成することができる。
【００８３】
図１２は、本発明による実施の形態である溶液測定装置のブロック図である。封止材３８によりパッケージングされた溶液測定装置は、貫通口４２から溶液を注入し、貫通口４４から溶液を排出する。溶液測定装置はコネクタ７０を挿入しポテンショスタット７２と電気的に接続される。
【００８４】
コネクタ７０は、ポテンショスタット７２とライン１４ｂ、ライン２２ｂ、ライン１２ｂ、ライン２０ｂを介して電気信号を伝送し、溶液測定装置中の溶液の電気化学測定をするように構成されている。ポテンショスタット７２はスイーパー７４により酸化還元反応の増加領域を探索し、Ｘ−Ｙレコーダ７６へ作用電極に流れる電流の測定値を記憶するように構成されている。
【００８５】
図１３は、本発明による実施の形態である溶液測定装置において得られるサイクリックボルタモグラムである。縦軸に各々の電極における電流値を示し、横軸にアノード電極の電位を示す。溶液を注入した溶液測定装置のカソード電極をレドックス活性物質が還元する電位に保持しておき、アノード電極の電位を掃引したときのアノード電極における電流値７８，７９及びカソード電極における電流値８０、８１を測定することで酸化還元物質の測定が可能となる。
【００８６】
図１４は、本発明による他の実施の形態である溶液測定装置の概略図である。図上部の（ａ）に示す平面図を参照して溶液測定装置の構成は、上述した実施の形態と同等であり重複する説明を省略する。溶液測定装置は、コネクティングパッド１２ａ、コネクティングパッド１４ａ、コネクティングパッド２０ａ、及びコネクティングパッド２２ａを露出するように、基板１０上を被覆するシリコンラバー製の封止材３８によりパッケージングされている。
【００８７】
図下部の（ｂ）に示す断面図を参照して溶液測定装置の構成を説明する。溶液測定装置は、基板１０上に形成された作用電極１６と作用電極１８を有し、この作用電極１６、１８の頂部と底部を挟むようにチャンネルが形成され封止材３８によりパッケージングされている。被測定溶液は、この頂部と底部に挟まれた第１の作用電極１６と第２の作用電極１８の間で受容され、電気化学測定を実施する。
【００８８】
尚、本発明の溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法は、上述の図示例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００８９】
【発明の効果】
以上、説明したように本発明の請求項１から請求項８に記載の溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法によれば、電気化学測定を行う際に高感度な電流シグナルを得る溶液測定用微小電極、電極の製造方法、及び溶液測定方法を提供するという優れた効果を奏し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置１の一部破断斜視図である。
【図２】本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置１の模式的な平面図である。
【図３】本発明による第１の実施の形態である溶液測定装置の概略図である。
【図４】本発明の実施の形態である溶液測定方法を説明する経路図である。
【図５】本発明の実施の形態である溶液測定装置の模式的斜視図である。
【図６】本発明による第２の実施の形態である溶液測定装置の模式的な平面図である。
【図７】本発明による第２の実施の形態である溶液測定装置に用いる櫛歯形電極の模式的な平面図である。
【図８】本発明による実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。
【図９】本発明による実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。
【図１０】本発明による実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。
【図１１】本発明による実施の形態である溶液測定装置の製造工程図である。
【図１２】本発明による実施の形態である溶液測定装置のブロック図である。
【図１３】本発明による実施の形態である溶液測定装置の電気化学測定結果の電圧対電流値の関係図である。
【図１４】本発明による他の実施の形態である溶液測定装置の概略図である。
【図１５】従来の溶液測定装置の断面図である。
【符号の説明】
１溶液測定装置
１０基板
１２参照電極
１４対向電極
１６第１の作用電極
１８第２の作用電極
２０引出配線
２２引出配線
２４チャンネル側壁
３４対向電極（開口部）
３６絶縁層
４０チャンネル
４６チャンネル
５０ポジ型フォトレジスト
５０ａポジ型フォトレジスト
５３クロム
５４金
５５絶縁膜
５６ネガ型フォトレジスト
６０金
６３ニッケル
７０コネクタ
７２ポテンショスタット
７４スイーパー
７６Ｘ−Ｙレコーダ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a solution measuring microelectrode, an electrode manufacturing method, and a solution measuring method, and in particular, in various fields such as medicine, pharmacy, biology, chemistry, and food science, a physiologically active substance using an oxidation-reduction reaction. The present invention relates to a microelectrode for measuring a solution used for micro-measurement, a method for manufacturing an electrode, and a method for measuring a solution.
[0002]
[Prior art]
As one of the amperometric electrochemical measurement methods, a comb-shaped electrode is arranged in a plane on a substrate to detect a current signal, and the potentials of the anode and cathode are independently controlled for redox. An electric detection signal of a substance (a redox substance in which an oxidized form and a reduced form are reversibly generated) was amplified, and a current signal about 5 to 10 times that of a single electrode was obtained (Anal. Chem. 1993, 65, 1559-1563).
[0003]
The conventional solution measuring electrode shown in the cross-sectional view of FIG. 15 has a structure in which two planar comb-shaped electrodes are engaged. The redox active group in the test solution in contact with the electrode applies a potential such that the redox active group (R) is oxidized to the anode electrode 4, and the oxidized redox active group (o) is reduced to the cathode electrode 3. A potential that returns to the original state is applied. This potential state is maintained, and the redox active group diffuses and moves between the anode electrode 4 and the cathode electrode 3 so that the oxidation and reduction cycle is repeated, and the redox active group in the test solution is obtained by the chemical amplification effect (redox cycling). (Anal. Chem. 1993, 65, 1559-1563).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, since the conventional solution measuring electrode has a structure in which a planar comb-shaped electrode is engaged, the contact region where the redox active group contacts the electrode is the comb-shaped anode electrode 4 and the comb-shaped cathode electrode 3. Limited to a plane. Further, when the sample amount or the comb-shaped electrode becomes minute, there is a problem that the absolute electric signal level is lowered and the sensitivity is lowered.
[0005]
Therefore, even if it is possible to detect the redox active group present in the lower layer of the test solution near the surface of the planar comb electrode in electrochemical measurement, there is a certain limit to the detection of the redox active group in the middle layer or upper layer of the test solution. Has occurred.
[0006]
In view of such circumstances, the present invention is intended to provide a microelectrode for solution measurement, an electrode manufacturing method, and a solution measurement method that obtain a highly sensitive current signal when performing electrochemical measurement.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
To achieve the above objective, According to the first aspect of the present invention For example, as shown in FIG. 1, the microelectrode for measuring a solution is a substrate 10 made of an insulating material that receives a solution to be measured, and a three-dimensionally having a predetermined height on the substrate 10 from the substrate surface. A first working electrode 16 formed on a plurality of sheets, a second working electrode 18 formed on the substrate 10 in a three-dimensional manner having a predetermined height from the substrate surface, and formed on the substrate 10. The reference electrode 12 and the counter electrode 14 formed on the substrate 10 are provided, and the first working electrode 16 and the second working electrode 18 are alternately arranged in parallel. Here, “three-dimensionally formed” means that the working electrodes 16 and 18 have a height of 1 μm or more.
[0008]
To achieve the above objective, According to a second aspect of the present invention, in the microelectrode for measuring a solution according to the first aspect, For example, as shown in FIG. 7, the first working electrode 16 and the second working electrode 18 each have a cross-sectional width of 0.1 μm to 100 μm independently, and the first working electrode 16 and the second working electrode The facing distance to 18 is configured to be 0.1 μm to 100 μm.
[0009]
If comprised in this way, the measurement sensitivity of the to-be-measured solution received between the 1st working electrode 16 and the 2nd working electrode 18 can be improved.
[0010]
To achieve the above objective, According to a third aspect of the present invention, in the microelectrode for solution measurement according to the first or second aspect, For example, as shown in FIG. 1, the heights of the first and second working electrodes 16 and 18 are each configured to be 1 μm to 1000 μm.
[0011]
If comprised in this way, the measurement sensitivity of the to-be-measured solution received between the 1st working electrode 16 and the 2nd working electrode 18 can be improved.
[0012]
To achieve the above objective, The method for producing a microelectrode for measuring a solution according to a fourth aspect of the present invention includes the method for producing a microelectrode for measuring a solution according to the first aspect. For example, as shown in FIGS. 8 to 11, a step (c) of forming an electrode pattern of a metal 54 on a flat substrate 10 made of a transparent material, and the substrate 10 on which the electrode pattern is formed is coated with an insulating material 55. A step (d), a step (f) of selectively removing the coated insulating material 55 from at least the region where the electrode is formed, and a thick film on the substrate 10 where the insulating material 55 is removed from the region where the electrode is formed A step (g) of coating a negative photoresist 56 of the type, a step (i) of developing and patterning the negative photoresist 56 after exposure 52 from the back surface of the substrate 10, and a negative patterned on the substrate 10 A step (j) of forming an electrode by depositing a metal 63 using the mold photoresist 56 as a mold, and after depositing the metal 63, a negative photoresist 56 is formed. And a step of releasing (k). The means for forming the electrode can be selected from various metal deposition means such as electrolytic plating, electroless plating, and vapor deposition. As the material of the electrode, for example, gold is preferable. Examples thereof include a material whose surface is gold-plated or platinum-plated using platinum, carbon, nickel, or a nickel-based alloy as a base.
[0013]
With this configuration, the electrode 63 is formed by depositing the metal 63 using the negative photoresist 56 patterned on the substrate 10 as a template, and the negative photoresist 56 is peeled after the metal 63 is deposited. The step (k) is provided, so that a high aspect ratio solution measuring microelectrode can be manufactured.
[0014]
To achieve the above objective, The electrochemical measurement device according to the fifth aspect of the present invention comprises: For example, as shown in FIGS. Any one of the first to third aspects Solution measuring microelectrodes 16 and 18, and a device 72 for independently controlling the potential of one working electrode (16) and the other working electrode (18) to measure the value of a current flowing through at least one of the electrodes Is provided.
[0015]
Based on such a configuration, there is provided a device 72 for independently controlling the potential of one working electrode (16) and the other working electrode (18) and measuring the value of the current flowing through at least one of the electrodes. Therefore, it is possible to perform electrochemical measurement of a solution taking advantage of the advantages of the microelectrode of the present invention.
[0016]
To achieve the above objective, The solution measuring method according to the sixth aspect of the present invention includes: For example, as shown in FIG. Any one of the first to third aspects Solution measurement using a solution measuring microelectrode can be performed.
[0017]
To achieve the above objective, The solution measuring method according to the seventh aspect of the present invention includes: For example, as shown in FIG. Any one of the first to third aspects Electrochemical solution measurement of an oxidation-reduction substance can be performed with a solution measurement microelectrode.
[0018]
To achieve the above objective, According to an eighth aspect of the present invention, in the solution measurement method of the seventh aspect, For example, as shown in FIG. 13, a redox substance produced by an enzyme labeled with an antigen or antibody can be measured.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 to FIG. 14 are examples of embodiments for carrying out the invention. In the drawings, the same reference numerals as those in the drawings denote the same or equivalent parts, and duplicate descriptions are omitted.
[0020]
FIG. 1 is a partially broken perspective view of a solution measuring apparatus 1 according to a first embodiment of the present invention. The solution measuring apparatus 1 includes a substrate 10 made of a transparent insulating material that transmits ultraviolet light, and a plurality of three-dimensionally formed on the central region of the substrate 10 having a predetermined height of 1 μm to 1000 μm. A first working electrode 16 and a plurality of three-dimensionally arranged first and second working electrodes 16 alternately arranged in parallel and having a predetermined height of 1 μm to 1000 μm on the central region of the substrate 10. Two working electrodes 18, a lead wire 20 formed on the substrate 10 and electrically connected to the second working electrode 18, and adjacent to the lead wire 20 and spaced apart from the second working electrode 18. A reference electrode 12 formed on the substrate 10, a lead wire 22 formed on the substrate 10 and electrically connected to the first working electrode 16, and a first working electrode 16 adjacent to the lead wire 22. And form on the substrate 10 at intervals. And a counter electrode 14. For convenience of explanation, a state in which the insulating layer covering at least the surfaces of the lead wires 20 and 22 is removed is shown.
[0021]
Further, the solution measuring apparatus 1 is provided with a channel side wall 24 made of silicon rubber for defining a channel region through which the solution to be measured flows in the directions indicated by the arrows 26 and 28, thereby forming a channel having a width w and a height h. . The solution to be measured flowing through this channel passes through a region where the first working electrode 16 and the second working electrode 18 are alternately arranged in parallel. For example, the redox material p− generated by an immune reaction and an enzymatic reaction is used. A reaction solution containing aminophenol (hereinafter referred to as PAP) is received as a solution to be measured. As shown in the drawing, the first working electrode 16 and the second working electrode 18 are arranged in parallel along the direction in which the solution to be measured flows, so that the electrochemical measurement can be performed without obstructing the flow of the solution to be measured. it can. However, in the case where the solution to be measured is received in the solution measuring apparatus 1 without flowing and the electrochemical measurement is performed, it may be arranged at right angles to the longitudinal direction of the channel.
[0022]
For example, the channel can receive and flow the solution to be measured by setting the width w to 2000 μm and the height h to the same height as the three-dimensional working electrode. In addition, the working electrode 16 and the working electrode 18 formed in three dimensions can be arbitrarily selected, for example, in cross-sectional width between about 0.1 μm and 100 μm, and preferably set to a cross-sectional width of 0.1 to 10 μm. To do.
[0023]
The height of the working electrodes 16 and 18 may be 1 μm or more, and can be arbitrarily selected between 1 μm and 1000 μm, preferably 10 μm to 1000 μm, more preferably 30 μm to 1000 μm. .
[0024]
Furthermore, the distance between the first and second working electrodes, that is, the facing distance between both electrodes, can be arbitrarily selected between 0.1 μm and 100 μm, preferably 0.1 μm to 10 μm, and more preferably 0.8 μm. The facing distance is set to 1 μm to 5 μm.
[0025]
Thus, by setting the cross-sectional width, height, and interval of the working electrodes 16 and 18, it is possible to secure a region for receiving the solution to be measured.
[0026]
FIG. 2 is a schematic plan view of the solution measuring apparatus 1 according to the first embodiment of the present invention. The solution measuring apparatus 1 includes a plurality of first working electrodes 16 that are three-dimensionally formed on a substantially central region of the substrate 10 and have a predetermined height, and the first working electrodes 16 are alternately parallel to each other. A plurality of second working electrodes 18 arranged in a three-dimensional manner and having a predetermined height on a substantially central region of the substrate 10, and the left end of the second working electrode 18 formed on the substrate 10. A lead wire 20 electrically connected to the electrode, a reference electrode 12 formed on the substrate 10 adjacent to and spaced from the left of the lead wire 20, and a first working electrode formed on the substrate 10 16 and a lead wire 22 electrically connected to the right end of the lead wire 16 and a counter electrode 14 formed on the substrate 10 adjacent to the right of the lead wire 22 and spaced apart. In the first embodiment of the present invention, the height of the working electrode is 50 μm, the width is 5 μm, the distance between the first working electrode and the second working electrode is 5 μm, and the number of electrodes is 90 for the first working electrode. There are 90 second working electrodes, for a total of 180 (90 pairs).
[0027]
The lead-out wiring 20 extends from the electrical contact region with the second working electrode 18 to the left edge of the solution measuring apparatus 1, and is provided with a connecting pad 20a that allows electrical connection from the outside at the tip thereof. .
[0028]
The lead-out wiring 22 extends from the electrical contact region with the first working electrode 16 to the left edge of the solution measuring device 1, and is provided with a connecting pad 22a that allows electrical connection from the outside at the tip thereof. .
[0029]
The reference electrode 12 extends to the left edge portion of the solution measuring device 1 in parallel with the lead-out wiring 20, and is provided with a connecting pad 12a that allows electrical connection from the outside at the tip thereof.
[0030]
The counter electrode 14 extends to the left edge portion of the solution measuring device 1 in parallel with the lead-out wiring 22, and a connecting pad 14 a that allows electrical connection from the outside is provided at the tip of the counter electrode 14.
[0031]
In addition, the solution measuring apparatus 1 is an insulating material that covers the surfaces of the substrate 10, the extraction wiring 20, the extraction wiring 22, the reference electrode 12, and the counter electrode 14 disposed in the main body region sandwiched between the left edge portion and the right edge portion. Layer 36 is provided. The insulating layer 36 includes an opening 32 that exposes the comb-shaped three-dimensional working electrodes 16 and 18 disposed in a substantially central region of the substrate 10 and a part of the counter electrode 14 disposed in the vicinity of the working electrode 16. And an opening 30 exposing a part of the reference electrode 12 disposed in the vicinity of the working electrode 18.
[0032]
Further, the solution to be measured flowing in the direction indicated by the arrow 28 contacts the reference electrode 12 in the opening 30, contacts the working electrodes 16 and 18 in the opening 32, and contacts the counter electrode 14 in the opening 34. Is configured to do.
[0033]
FIG. 3 is a schematic view of the solution measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention. The configuration of the solution measuring apparatus will be described with reference to the plan view shown in FIG. The solution measuring device is packaged by a silicon rubber sealing material 38 that covers the substrate 10 so as to expose the connecting pad 12a, the connecting pad 14a, the connecting pad 20a, and the connecting pad 22a.
[0034]
In the solution measuring apparatus, a vertically long channel 40 for flowing the solution to be measured is formed in a hollow state in a central region of the substrate surrounded by a broken line in the figure. At one end (connecting pad group side) of the flow path 40, a through-hole 42 communicating with the outside is provided, so that the solution to be measured can flow into the flow path 40 as a channel. On the other hand, the other end of the flow path 40 is provided with a through-hole 44 leading to the outside, and the solution to be measured can be discharged to the outside.
[0035]
The configuration of the solution measuring apparatus will be described with reference to a cross-sectional view shown in (b) at the bottom of the figure. The solution measuring apparatus has a working electrode 16 and a working electrode 18 formed on the substrate 10, and is packaged by a sealing material 38 so as to surround the working electrodes 16 and 18.
[0036]
A solution measurement method according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the route diagram of FIG. The sample of the measurement material uses human serum or α-fetoprotein (AFP) solution present in human serum as a standard solution, the solid phase antibody uses anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles, and the labeled antibody uses alkaline phosphatase. Using a labeled anti-AFP antibody, p-aminophenyl phosphate (hereinafter, PAPP) is dissolved in a buffer solution of 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0) as a substrate.
[0037]
In the first step, a sample solution (human serum or AFP standard solution) is mixed with the anti-AFP antibody-immobilized magnetic particle solution to perform an immune reaction. The AFP in the sample solution is specifically bound to the anti-AFP antibody immobilized on the magnetic particles.
[0038]
In the second step, the magnetic particles are fixed to the magnetic particles after the immune reaction using a magnet, and a cleaning process is performed with a cleaning solution to remove impurity components in the sample solution.
[0039]
In the third step, an excess amount of alkaline phosphatase-labeled anti-AFP antibody solution is added to the washed magnetic particles to perform an immune reaction, and the alkaline phosphatase-labeled anti-AFP antibody and the AFP immunologically bound to the magnetic particles are specifically identified. Combine.
[0040]
In the fourth step, the magnetic particles after the immune reaction are fixed with a magnet using a magnet, and a washing treatment is performed with a washing solution to remove unbound alkaline phosphatase-labeled anti-AFP antibody in the reaction solution.
[0041]
In the fifth step, a sufficient amount of PAPP solution (dissolved in 0.1 M Tris-Cl buffer) is reacted, and the PAPP phosphate group is hydrolyzed and released by the enzymatic reaction with alkaline phosphatase, thereby producing PAP. Let
[0042]
The amount of PAP produced is proportional to the concentration (amount) of alkaline phosphatase, and the concentration (amount) of alkaline phosphatase is proportional to the concentration (amount) of the target substance (AFP) in the sample in the immune reaction. The target substance (AFP) can be quantified by quantifying the above.
[0043]
In the sixth step, a potential at which PAP is oxidized is applied to one working electrode, and a potential at which oxidized PAP, that is, p-quinoneimine (hereinafter, PQI) is reduced and returned to PAP is applied to the other working electrode. Apply. By maintaining this potential state, the cycle of oxidation and reduction can be repeated to cause a chemical amplification effect (redox cycling), and the value of the current flowing through each working electrode can be measured to quantify PAP.
[0044]
The measurement of PAP is performed using a working electrode in order to carry out the electrochemical measurement of PAP generated by the enzyme reaction, but the other processes from the first to fifth steps are performed outside the solution measuring apparatus. From the above, the PAP obtained by these reactions may be dropped onto the reference electrode, working electrode, and counter electrode of the solution measuring device to perform electrochemical measurement. The PAP is placed in a channel surrounding the reference electrode, working electrode, and counter electrode. It is also possible to carry out the electrochemical measurement.
[0045]
Further, the processing from the first to fifth steps can be performed in the channel of the solution measuring apparatus. In this case, an arbitrary place can be used as a solid phase field (reaction field) by controlling the position of the antibody-immobilized magnetic particles with a magnet.
[0046]
Further, the antibody is immobilized on the surface (inner wall) of the channel or other material surface without using a magnetic substance as a solid phase field, and the processing from the second to sixth steps is performed in the channel of the solution measuring apparatus. be able to. Also in this case, the processes other than the electrochemical measurement of PAP in the sixth step can be performed from the first to the fifth steps outside the solution measuring apparatus.
[0047]
In the processes from the first to fifth steps, as a reaction method for performing an enzyme reaction from an immune reaction, a method of performing a reaction process outside the solution measuring apparatus, and a method before reaching the reference electrode, the working electrode, and the counter electrode Either a method of performing a reaction process in a channel or a method of performing a reaction process at a position where a reference electrode, a working electrode, and a counter electrode are arranged can be applied.
[0048]
FIG. 5 is a schematic perspective view of a solution measuring apparatus according to an embodiment of the present invention. The solution measuring apparatus is configured to repeat the redox reaction of the solution received between the first working electrode 16 and the second working electrode 18 of the substrate 10.
[0049]
The solution repeats a plurality of oxidations and reductions between the first working electrode 16 and the second working electrode 18. The illustrated oxidation-reduction reaction is configured to repeat the oxidation-reduction reaction in the vicinity of the substrate 10, in the middle of the channel, and above the channel.
[0050]
The solution measuring apparatus includes a cathode 16 (Cathode) as a working electrode and an anode 18 (Anode) as a working electrode on a substrate 10, and the cathode 16 and the anode 18 are electrochemical elements of PAP as a redox active group (R). Used for measurement. The type of redox active group (R) is not limited. For example, in addition to PAP, an active group that undergoes a reversible oxidation-reduction reaction such as phenothiazine or ferrocellone can be used.
[0051]
When a potential at which PAP is oxidized is applied to the anode 18 (Anode), PAP is oxidized on the surface of the anode 18 to generate PQI. At this time, the current value generated at the anode 18 can be detected as the oxidation current value. At the same time, if a potential at which PQI is reduced is applied to the cathode 16 (Cathode), PQI generated by the oxidation reaction is reduced on the surface of the cathode 16 to generate PAP. At this time, the current value generated at the cathode 16 can be detected as the reduction current value.
[0052]
Thus, by maintaining the anode and cathode potentials at the PAP oxidation potential and the PQI reduction potential, the oxidation-reduction reaction is repeated, and the current value flowing through the anode 18 and the cathode 16 can be measured. Since each measured current value is proportional to the concentration of the redox substance, PAP and PQI can be quantified.
[0053]
FIG. 6 is a schematic plan view of a solution measuring apparatus according to the second embodiment of the present invention. The solution measuring apparatus can perform the same solution measurement by changing the electrode and wiring pattern of the first embodiment. The substrate is formed of a transparent member having a width (vertical direction in the figure) of about 20 mm and a length (lateral direction in the figure) of about 30 mm. The reference electrode 12, the counter electrode 14, the first working electrode 16, and the second electrode are formed on the substrate. Working electrode 18, lead wire 20, and lead wire 22 are formed. The structure of the first and second working electrodes is the same as that of the above-described embodiment, and a duplicate description is omitted.
[0054]
The reference electrode 12 extends from the substantially central region of the channel 40 having a width of about 2000 μm formed in the longitudinal direction from right to left in the drawing to the right edge of the device, and includes a connecting pad 12a at the end. The line width rule is about 400 μm.
[0055]
The lead-out wiring 20 is adjacent to the right of the reference electrode 12, extends from a substantially central region of the channel 40 to the right edge of the device, and includes a connecting pad 20a at the end. The line-width rule of the lead-out wiring 20 is about 400 μm. Is formed.
[0056]
The lead wire 22 extends from a substantially central region of the channel 40 to the right edge of the device so that the working electrode is sandwiched between the lead wire 20 and has a connecting pad 22a at the end. The line width rule of the lead wire 22 is about 400 μm. It is formed with.
[0057]
The counter electrode 14 is adjacent to the right side of the lead wire 22, extends from a substantially central region of the channel 40 to the right edge of the device, and includes a connecting pad 14a at the end. The line width rule of the counter electrode 14 is about 400 μm. Is formed.
[0058]
The channel 40 forms a solution flow path, and can sequentially flow the solution from the left reference electrode 12 side to the right counter electrode 14 side in the drawing. That is, the solution flows from the solution inflow direction indicated by the arrow 26 to the solution discharge direction indicated by the arrow 28.
[0059]
An interval a between the reference electrode 12 disposed in the channel 40 and the adjacent lead wire 20 is set to about 400 μm, and similarly, a distance b between the counter electrode 14 and the adjacent lead wire 22 is set to about 400 μm.
[0060]
Each of the connecting pads 12a, 14a, 20a, and 22a is set to 2000 μm in length and 2000 μm in width.
[0061]
FIG. 7 is a schematic plan view of first and second working electrodes used in the solution measuring apparatus according to the second embodiment of the present invention. A first working electrode 16 and a second working electrode 18 having a three-dimensional structure are alternately formed in parallel between the lead wires 20 and 22 formed in parallel.
[0062]
The first working electrode 16 is electrically connected to the lead wire 22 and is formed to extend in the right horizontal direction from the lead wire 22 arranged on the left side in the drawing. On the other hand, the second working electrode 18 is electrically connected to the lead wire 20 and is formed to extend in the left horizontal direction from the lead wire 20 arranged on the right side in the drawing.
[0063]
A rectangular opening 32 is formed in a region where the first and second working electrodes are alternately arranged in parallel to allow the first and second working electrodes to come into contact with the solution. The distance g between the upper edge of the opening 32 and the adjacent first working electrode 16 is set to about 50 μm, and the second working electrode 18 adjacent to the lower edge of the working electrode 16 and the opening 32 is set. The distance d is set to 1800 μm, and the longitudinal length of the opening 32 is set to about 1900 μm obtained by subtracting about 50 μm of the distance i from the upper part and the lower part within a range of about 2000 μm of the distance c. .
[0064]
The opposing distance e between the lead-out wiring 20 and the lead-out wiring 22 is set to about 2200 μm, and the lateral length f of the opening 32 disposed between the lead-out wirings 20 and 22 is less than about 2200 μm. Can be arbitrarily selected from a range of about 2000 μm or more.
[0065]
For the working electrodes 16 and 18 arranged in the opening 32, for example, any one rule such as a line width of 2 μm, 5 μm, and 10 μm is adopted, and a distance (interval) between the working electrodes is 2 μm, Any one rule such as 5 μm and 10 μm can be adopted.
[0066]
FIG. 8 is a manufacturing process diagram of a solution measuring microelectrode according to an embodiment of the present invention. In the step (a) shown in the drawing, a positive photoresist 50 is applied by spin coating on a substrate 10 made of a transparent material as a starting material, and ultraviolet light 52 is exposed from the surface toward the substrate 10 through a photomask 51. To do. For example, quartz glass or sapphire glass can be used for the substrate 10, and the present invention is not limited to this glass, and other transparent materials may be used.
[0067]
In the step (b), chromium 53 (Cr) and gold 54 (Au) are sequentially deposited on the surface of the patterned positive photoresist 50 and the substrate 10 by photolithography. The film thickness of the deposited chromium 53 is set to 100 mm, and the film thickness of the gold 54 is set to 1000 mm.
[0068]
In the step (c), the base electrode of the chromium 53 and the gold 54 is patterned by dissolving the positive photoresist 50 on the substrate 10 with, for example, acetone and removing it by a lift-off method.
[0069]
The present invention is not limited to the lift-off process of the base electrode. For example, after sequentially depositing chromium 53 and gold 54 on the entire surface of the substrate 10, a resist is applied, and the resist is patterned by photolithography. The base electrode can be patterned by etching the chromium 53 and the gold 54.
[0070]
Step (d) is a step of coating the insulating film 55 of fluororesin (CYTOP, registered trademark, Asahi Glass) on the substrate 10 on which the base electrode is formed. Silicon oxide film SiO instead of fluororesin ₂ Etc. can be used as the insulating film.
[0071]
FIG. 9 is a manufacturing process diagram of a solution measurement microelectrode according to an embodiment of the present invention. In the step (e) shown in the figure, a positive photoresist 50a is coated on the substrate 10 coated with an insulating film (CYTOP), and exposed to ultraviolet light from the surface of the substrate 10 through a photomask 57. 50a is patterned to expose the working electrodes 16, 18, opening 32, reference electrode 12, opening 30, counter electrode 14, opening 34, and connecting pads 12a, 14a, 20a, 22 shown in FIG. It is process sectional drawing which forms a mask.
[0072]
(F) Process is dry etching (O ₂ Ashing) to selectively remove the insulating film 55, the working electrodes 16, 18, the opening 32, the reference electrode 12, the opening 30, the counter electrode 14, the opening 34, and the connecting pad 12a shown in FIG. This is a step of removing the positive photoresist 50a on the remaining insulating film 55 with acetone after exposing 14a, 20a, and 22.
[0073]
(G) In the step, a negative photoresist 56 for thick film plating having a thickness of about 50 μm is applied on the substrate 10, and ultraviolet light 52 is irradiated from the back surface of the substrate 10 to apply a resist other than the electrode pattern to the back surface of the substrate. This is an exposure process by self-alignment for more exposure.
[0074]
Step (h) is a step of irradiating ultraviolet light 52 from the surface of the substrate 10 through the photomask 57a to expose the negative photoresist 56 applied to the working electrode region and the region other than on the connecting pad.
[0075]
Step (i) is a step in which the negative photoresist 56 exposed by the ultraviolet light 52 is developed by a photolithography step to expose the base electrode of the working electrode and the connecting pad.
[0076]
FIG. 10 is a manufacturing process diagram of the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention. In the step (j) shown in the drawing, a region 58 surrounding the working electrode formed in the opening of the negative photoresist 56 is immersed in a plating bath, and the connecting pad is separated from the surface of the plating bath to remove the working electrode from the lead wire. In this step, a negative potential is applied to the underlying electrode, and negative plating 56 is used as a template, and electrolytic plating is performed to deposit nickel 63 (Ni) on the underlying electrode of the working electrode.
[0077]
In this electrolytic plating process, the deposition rate of nickel 63 is controlled by controlling the current density during the plating process, and the plating process is stopped at a level not exceeding the height of the positive photoresist 56 layer. If the nickel 63 exceeds the height of the negative photoresist 56 layer and reaches an overhang state, a polishing process can be performed from the surface side of the substrate 10 to ensure the flatness of the nickel layer.
[0078]
Step (k) is a step in which the negative photoresist 56 layer on the substrate 10 is stripped with a resist stripping solution. As shown in the drawing, a patterned insulating film 55, a two-layer electrode and a wiring layer of chromium 53 and gold 54, and a working electrode having a three-layer structure of chromium 53, gold 54 and nickel 63 are formed on the substrate 10. ing. As a result of observing this nickel 63 electrode by SEM, it was confirmed that the width was 10 μm, the height was 30 μm, and the interval between the nickel electrodes was 10 μm.
[0079]
The step (l) is a step of coating the exposed surface of the nickel 63 in the region 59 with gold 60 (Au) by an electrolytic plating method or an electroless plating method. The above steps are roughly divided into a step of forming a base structure with nickel, which has high steel properties and excellent dimensional accuracy and high-speed formability, and the surface thereof is coated with gold having excellent electrochemical characteristics and surface modification properties. Subsequent to this gold coating treatment, a silver nitrate solution is immersed in the reference electrode 30 portion, a negative potential is applied through the connecting pad, and Ag is electroplated on the surface of the reference electrode 30, and then a hydrochloric acid aqueous solution is immersed in the electrode and a positive potential is passed through the connecting pad. The Ag / AgCl reference electrode can be formed by applying Ag and converting part of the Ag layer deposited on the surface of the reference electrode to AgCl.
[0080]
FIG. 11 is a manufacturing process diagram of a solution measuring apparatus according to another embodiment of the present invention. In the step (m) shown in the drawing, the region 61 surrounding the working electrode formed in the opening of the negative photoresist 56 is immersed in the plating bath, and the connecting pad is separated from the surface of the plating bath to remove the working electrode from the lead wire. In this step, a negative potential is applied to the underlying electrode and electrolytic plating is performed by depositing gold 62 (Au) on the underlying electrode of the working electrode using the negative photoresist 56 as a template.
[0081]
In the step (n), the gold 62 overhanging from the negative photoresist 56 is polished from the surface side of the substrate 10 to ensure the flatness of the upper portion of the gold 62.
[0082]
Subsequently, in step (o), the negative photoresist 56 layer on the substrate 10 is stripped with a resist stripping solution, and a patterned insulating film 55, two layers of electrodes of chromium 53 and gold 54, and a wiring layer are formed on the substrate 10. Then, a working electrode having a two-layer structure of chromium 53, gold 54, and gold 62 is formed. Subsequent to the gold plating process, a silver nitrate solution is immersed in the reference electrode 30 portion, a negative potential is applied to the reference electrode portion through a connecting pad, and Ag is electroplated on the surface of the reference electrode portion. Thereafter, an aqueous hydrochloric acid solution is immersed in the reference electrode portion and passed through the connecting pad. An Ag / AgCl reference electrode can be formed by applying a positive potential and converting part of the Ag layer deposited on the surface of the reference electrode to AgCl.
[0083]
FIG. 12 is a block diagram of a solution measuring apparatus according to an embodiment of the present invention. The solution measuring device packaged by the sealing material 38 injects the solution from the through hole 42 and discharges the solution from the through hole 44. The solution measuring apparatus is electrically connected to the potentiostat 72 by inserting the connector 70.
[0084]
The connector 70 is configured to transmit an electrical signal via the potentiostat 72 and the line 14b, the line 22b, the line 12b, and the line 20b, and perform an electrochemical measurement of the solution in the solution measuring apparatus. The potentiostat 72 is configured to search the increased region of the oxidation-reduction reaction by the sweeper 74 and store the measured value of the current flowing through the working electrode to the XY recorder 76.
[0085]
FIG. 13 is a cyclic voltammogram obtained in the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention. The vertical axis represents the current value in each electrode, and the horizontal axis represents the potential of the anode electrode. The cathode electrode of the solution measuring apparatus into which the solution has been injected is held at a potential at which the redox active substance is reduced, and current values 78 and 79 at the anode electrode and current values 80 and 81 at the cathode electrode when the potential of the anode electrode is swept. It is possible to measure redox substances by measuring.
[0086]
FIG. 14 is a schematic view of a solution measuring apparatus according to another embodiment of the present invention. With reference to the plan view shown at (a) in the upper part of the figure, the configuration of the solution measuring apparatus is the same as that of the above-described embodiment, and redundant description is omitted. The solution measuring device is packaged by a silicon rubber sealing material 38 that covers the substrate 10 so as to expose the connecting pad 12a, the connecting pad 14a, the connecting pad 20a, and the connecting pad 22a.
[0087]
The configuration of the solution measuring apparatus will be described with reference to a cross-sectional view shown in (b) at the bottom of the figure. The solution measuring device has a working electrode 16 and a working electrode 18 formed on the substrate 10, and a channel is formed so as to sandwich the top and bottom of the working electrodes 16, 18 and is packaged by a sealing material 38. Yes. The solution to be measured is received between the first working electrode 16 and the second working electrode 18 sandwiched between the top and bottom, and an electrochemical measurement is performed.
[0088]
The solution measurement microelectrode, the electrode manufacturing method, and the solution measurement method of the present invention are not limited to the above illustrated examples, and various modifications can be made without departing from the scope of the present invention. Of course.
[0089]
【The invention's effect】
As described above, according to the microelectrode for measuring a solution, the method for manufacturing an electrode, and the method for measuring a solution according to claims 1 to 8 of the present invention, a high-sensitivity current signal when performing electrochemical measurement. It is possible to provide an excellent effect of providing a microelectrode for solution measurement, an electrode manufacturing method, and a solution measurement method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a partially broken perspective view of a solution measuring apparatus 1 according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic plan view of the solution measuring apparatus 1 according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic view of a solution measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a route diagram illustrating a solution measurement method according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a schematic perspective view of a solution measuring apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a schematic plan view of a solution measuring apparatus according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a schematic plan view of a comb-shaped electrode used in a solution measuring apparatus according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a manufacturing process diagram of the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a manufacturing process diagram of the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a manufacturing process diagram of the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a manufacturing process diagram of a solution measuring apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a block diagram of a solution measuring apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a relationship diagram of voltage versus current value of the electrochemical measurement result of the solution measuring apparatus according to the embodiment of the present invention.
FIG. 14 is a schematic view of a solution measuring apparatus according to another embodiment of the present invention.
FIG. 15 is a cross-sectional view of a conventional solution measuring apparatus.
[Explanation of symbols]
1 Solution measuring device
10 Substrate
12 Reference electrode
14 Counter electrode
16 First working electrode
18 Second working electrode
20 Lead wiring
22 Lead wiring
24 Channel side wall
34 Counter electrode (opening)
36 Insulation layer
40 channels
46 channels
50 positive photoresist
50a positive photoresist
53 Chrome
54 gold
55 Insulating film
56 Negative photoresist
60 gold
63 Nickel
70 connector
72 Potentiostat
74 Sweeper
76 XY recorder

Claims

A substrate formed of an insulating material that receives the solution to be measured;
A first working electrode formed in a plurality of three-dimensionally on the substrate having a predetermined height from the substrate surface;
A second working electrode formed in a plurality of three dimensions on the substrate having a predetermined height from the substrate surface;
A reference electrode formed on the substrate;
A counter electrode formed on the substrate;
A microelectrode for measuring a solution in which the first working electrode and the second working electrode are alternately arranged in parallel;
The cross-sectional widths of the first working electrode and the second working electrode are each independently 0.1 μm to 100 μm, and the facing distance between the first working electrode and the second working electrode is 0.1 μm to 100 μm. Is;
The heights of the first and second working electrodes are each 10 μm to 1000 μm;
Microelectrode for solution measurement.

In the manufacture of the microelectrode according to claim 1;
Forming a metal electrode pattern on a flat substrate made of a transparent material;
Coating the substrate on which the electrode pattern is formed with an insulating material;
Selectively removing the coated insulating material from at least the region forming the electrode;
Coating a thick film negative photoresist on the substrate from which the insulating material has been removed from the region forming the electrode;
Developing and patterning the negative photoresist after exposure from the back side of the substrate;
Forming an electrode by depositing metal using a negative photoresist patterned on the substrate as a mold;
Stripping the negative photoresist after depositing the metal;
A method for producing a solution measuring microelectrode.

A microelectrode for measuring a solution according to claim 1;
A device for independently controlling the potential of one working electrode and the other working electrode and measuring the value of the current flowing through at least one of the electrodes;
An electrochemical measurement device comprising:

A channel is formed so as to sandwich a top portion and a bottom portion of the first working electrode and the second working electrode, and is packaged with a sealing material;
The electrochemical measurement apparatus according to claim 3.

A solution measuring method using the solution measuring microelectrode according to claim 1.

An electrochemical solution measurement method for a redox substance using the solution measurement microelectrode according to claim 1.

7. The solution measuring method according to claim 6, wherein the redox substance produced by an enzyme labeled with an antigen or antibody is measured.