【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、微量タンパク質の高感度分析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、分析時間を短縮し、分析感度を著しく高めることができ、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能とする、新しい酵素標識免疫分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、肝臓ガン、大腸ガン、前立腺ガン等の診断においては腫瘍マーカーと呼ばれる各々のガンに特有なタンパク質の血中濃度の変化を観察することが行われている。また、感染症の場合にも、各々の抗体タンパク質が体液中に増えることから、このようなタンパク質の濃度変化が診断において有用な情報として取扱われている。
【０００３】
たとえば、このように有益な生体情報を与えるタンパク質の分析については、従来より、微量のタンパク質の定量分析法として、酵素標識免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）が知られている。この方法では、分析の対象としてのタンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識として結合し、抗原タンパク質の濃度に対応して濃度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原としてのタンパク質の濃度を求めている。
【０００４】
また、従来より、タンパク質の定量分析方法としては、前記の酵素標識免疫分析法以外にも各種のものが知られているが、生体情報を与えるタンパク質は、通常、その濃度がｐｇ／ｍＬオーダーからμｇ／ｍＬ程度までと低濃度であることから、どうしてもその分析には複雑で面倒な操作や、大型の装置と、長時間が必要とされる場合が多い。
【０００５】
実際、たとえば、現状での臨床検査による腫瘍マーカーの速度測定は、デスクトップ装置での長時間にわたる測定が必要とされている。このため、酵素標識免疫分析法をはじめとする従来の方法によっては、腫瘍マーカーや前記の感染症についてのタンパク質測定の場合だけでなく、今後その臨床的ニーズがさらに高まることが予想される、心筋梗塞や脳卒中での血液凝固に関連するタンパク質の分析の場合のように、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での小型装置による、簡便で高感度、かつ、迅速な分析測定が必要とされる状況には対応することが困難であった。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点を解消し、分析時間を短縮し、分析感度を高めることができ、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析をも可能とする、改善された新しい微量タンパク質の高感度分析方法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基板上に対極並びに参照電極とともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挾み込んで対向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能とすることを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第２には、超常磁性ビーズの径は、２０μｍ以下であることを特徴とする上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供し、第３には、一対の櫛型電極における互いに挾み込んだ歯の対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴とする上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００９】
さらに具体的にも、この出願の発明は、第４には、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量することを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１１】
この出願の発明の方法では、前記のとおりの酵素標識免疫分析法が前提とされている。すなわち、従来と同様に、分析対象タンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識として結合しておき、抗原濃度に対応して温度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原濃度を求めることになる。このような方法として、たとえばサンドイッチ法が周知である。
【００１２】
そしてこのような抗原−抗体の酵素標識免疫反応について、この出願の発明では、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズが用いられる。
【００１３】
酵素標識免疫分析法では免疫抗体を固体表面に固定したり、抗原−抗体反応を進行させるのに一晩程度インキュベーションすることが多いが、このインキュベーションを短縮する方法として超常磁性微粒子を内部に含む有機ポリマー球形粒子コロイドを用いる方法が知られている。このような方法のための粒子コロイドが市販されていることから、この出願の発明においては、このものを、前記の酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズとして使用することができる。ここで「超常磁性」とは磁場が印加された場合のみに磁性を有することとして定義される。
【００１４】
一方、微小の櫛型電極は、微量の生成物を分析電気化学の手法で高感度に測定する方法に有効であることが知られているものであるが、この出願の発明のように、免疫反応による分析に利用することはこれまでほとんど考えられていない。分析のためのこの微小櫛型電極は、その構造として、二個の櫛型電極が互いに歯を挟み込んでμｍオーダーの狭い対向間隔で配列され、二個がそれぞれ独立した電位を与え得る作用電極として機能する構造を持つことを特徴としている。このような構造は、石英等の適宜な基板上に、対極(counter electrode, CE)並びに参照電極(reference electrode, RE)とともに、半導体や電子デバイスにおける微細加工技術によって形成可能とされる。
【００１５】
この出願の発明においては、抗原タンパク質と抗体との免疫反応にともなう標識酵素と基質との反応により発生する対向する微小電極間の電位差から、タンパク質の濃度を電流値として検出する。
【００１６】
この発明の櫛型電極には、前記のとおりの抗原としてのタンパク質を付着させた超常磁性ビーズ（微粒子の集合としてのコロイド）を接触させればよい。
【００１７】
櫛型電極との関係で、磁性ビーズ、つまり超常磁性ビーズを用いることを特徴とするこの出願の発明方法についてさらに説明すると、磁石により磁場を働かせて超常磁性ビーズを電極に引き寄せることによって、超常磁性ビーズ表面に固定化された酵素（標識として免疫抗体に結合させてある酵素）が生成する反応物が迅速かつ高濃度で電極に到達する。
【００１８】
この場合、基質と超常磁性ビーズ、反応性生物を含む溶液が基板表面を覆い、櫛形電極の上部は、雲のように超常磁性ビーズコロイドにより覆われる。たとえば、後述の実施例では、基板の下に小さな永久磁石（２〜４ｍｍφ×１０ｍｍ長さ、表面磁束密度３５００ガウス程度）を置いて超常磁性ビーズコロイドを電極に引き寄せている。
【００１９】
この発明の超常磁性ビーズは、抗体を固定化したり、抗体に抗原を結合させる度に洗浄する。普通のビーズの場合、ビーズは、洗浄液と溶液の全体に広がってしまい希釈状態になるが、超常磁性ビーズの場合は洗浄・攪拌したあと、ビーズを磁石で引き寄せることができる。ビーズを含まない部分の液は不要であるから廃棄して、超常磁性ビーズが濃縮されたコロイドを使うことができる。重力による自然沈下などより迅速に洗浄→廃液＝再濃縮できることが大きな特徴である。
【００２０】
測定分析における電気化学的分析法には種々のものが知られており、たとえばアンペロメトリー法や、微分パルスボルタンメトリー法などがあるが、たとえぱ短時間測定には、アンペロメトリー法が適している。この出願の発明では、高感度と迅速性を両立させることができるが、このためには、分析のための櫛型電極を備えたチップの設計と抗体の選択について次のことが考慮される。
【００２１】
１）電気化学的検出器を利用する酵素標識免疫分析法では、標識酵素による酵素反応で生成する反応生成物Ｐの生成量ｎｐ（ｔ）と、電極表面における生成物Ｐの濃度Ｃｐ（ｔ）が比例することを前提にしている｛ｔは時間を表す｝。
【００２２】
２）１０秒以内、望ましくは数秒程度の迅速測定をするためには、生成物が電極に到達する時間遅れが０．１秒程度以下であることが望ましい。（時間遅れ／測定時間）比が誤差を決めるからである。
【００２３】
３）電気化学的検出器を利用する酵素標識免疫分析法でよく用いられる酵素反応生成物の代表的化合物がパラアミノフェノール（ＰＡＰ、分子量１０９）である。この程度の小さな分子量の化合物では水溶液中の拡散速度Ｄは１０-5ｃｍ2ｔのオーダーである。拡散時間を０．１ｓ以下とすると、拡散距離ＬはＬ＝（Ｄ・ｔ）1/2＝１０-3ｃｍ＝１０μｍ以下であることが必要である。
【００２４】
４）単分散に近い、狭い粒度分布幅を持つ球形の超常磁性ビーズを使うことが望ましい。
【００２５】
ビーズ表面の酵素の作用で生成する生成物が密着した電極に到達する平均所要時間は、拡散距離がビーズの半径に等しくなる程度の時間である。上記３）のことから、ビーズの半径は１０μｍ以下であることが時間遅れが０．１秒以下になるための必要条件である。また、単分散の球は空隙率が大きく、その空隙を生成物分子が拡散しやすい。微小櫛型電極のアノードとカソードの間のredoxサイクルが起りやすい。これは高感度になるための必要条件を充たす。
【００２６】
５）感度の向上という目的からすると、微小櫛型電極から１０μｍ程度以内の領域に、できるだけ高密度に酵素標識抗体が存在することが望ましい。このために、発明者は抗体分子ＩｇＧから余分なタンパク質を取り除いたＦ（ａｂ1）2を使って良い結果を得ている。
【００２７】
６）電極から離れた所にある標識酵素による生成物は、電極に到達する比率が小さく、残りは電極から離れた空間に拡散していく。上記１）〜５）のように、電極から１０μｍ以内の距離に高い密度で酵素標識抗体を集めることで高い感度が得られる。
【００２８】
この出願の発明においては、以上のことから、超常磁性ビーズの径は２０μｍ（つまり半径１０μｍ）以下とすることを具体的に好ましい形態として提供する。そして、さらには、櫛型電極の対向する歯の間の間隔は、前記の超常磁性ビーズの径と同等、もしくはそれ以下とすることも好ましい形態としている。たとえば、好適には、超常磁性ビーズの径を３μｍ以下とし、前記電極の対向間隔もこれ以下として、かつ超常磁性ビーズの径よりも小さくすることである。
【００２９】
たとえば以上のような形態において、この出願の発明では、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微量タンパク質を、１０秒以内の応答速度で定量する方法も具体的に提供される。
【００３０】
この方法は、肝臓ガンの腫瘍マーカー（ＡＦＰ）検出に必要な目標性能に適している。ＡＦＰの分子量は約６８，０００であるから、１ｎｇ／ｍＬは１５ｐｍｏｌ／Ｌに相当する。
【００３１】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく発明の実施の形態について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【００３２】
【実施例】
１．櫛型電極作成
石英基板上にＥＢ露光装置（ＥＬＳ７７００）で櫛型パタニングを行った。現像処理後、下地にＣｒ、その上にＰｔを真空蒸着した。図１にその平面図を示したように、リフトオフしたＰｔパタンにリード線（Ｗ１）（Ｗ２）、参照電極（ＲＥ）、対電極（ＣＥ）、絶縁部を作成した。参照電極になる部分に銀メッキを施した後、塩化銀メッキ処理を行いＡｇ／ＡｇＣｌにして櫛型白金電極（Ｗ）を作成した。
【００３３】
Ｐｔ櫛型電極の幅は３μｍ、歯の対向間隔は２μｍとした。
２．磁性ビーズ上への抗体の固定化
粒径２．８±０．２μｍの磁性ビーズ(Dynal社，dynabeads（登録商標）：M270Amine)に抗原−抗体をサンドイッチ法により固定した。固定化する際、磁石で攪拌することと温度を調節することで免疫反応時間の短縮を図った。
【００３４】
なお、測定対象にはＡＦＰ（α−fetoprotein、癌マーカー蛋白質）を使用した。
３．アンペロメトリー法による測定
デュアルポテンショスタットＡＬＳ８３２ａを使用し、アンペロメトリー法で電流値を測定した。
【００３５】
電極電位のコントロールには多機能のポテンショスタットである電気化学ワークステーションを使い、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。標識酵素による反応生成物を電気化学的に検出するとき、生成物によって最適電位が異なるが、実施例ではパラアミノフェノールが生成する基質を選んでいる。この場合、櫛型電極の一方の歯を作用電極Ｉとして＋０．４Ｖを印加してアノード酸化を行わせ、櫛型電極の他方の歯を−０．１Ｖに設定し、カソード還元を行わせた。
４．結 果
図２は、前記の磁性ビーズに濃度の異なる抗原タンパク質と抗体を付着させて電流を測定した結果を時間との関係で例示したものである。この図２より、ＡＦＰ濃度と電流との比例関係が確認される。
【００３６】
また、図３は、ＡＦＰ濃度と電流との関係を初期時間の観点で示したものである。１０ｎｇ／ｍＬ以下の濃度でも電流値との比例関係が得られ、１０秒以下でも比例関係が確認できた。
【００３７】
また、ＡＦＰ高濃度領域での阻害が生起しないことも確認された。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、分析時間を短縮し、微量タンパク質の高感度分析が可能となり、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例を示した平面図である。
【図２】実施例としての時間と電流値との関係をＡＦＰ濃度について例示した図であ る。
【図３】ＡＦＰ濃度と電流との関係を初期時間の観点で例示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a highly sensitive analysis method for trace proteins. More specifically, the invention of this application can shorten the analysis time, significantly increase the analysis sensitivity, and enable quick and simple high-sensitivity analysis in a place where the burden on the patient is low at the bedside or the like. The present invention relates to a new enzyme-labeled immunoassay method.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, in the diagnosis of liver cancer, colorectal cancer, prostate cancer, etc., changes in the blood concentration of proteins specific to each cancer called tumor markers have been observed. Also, in the case of infectious diseases, since each antibody protein increases in the body fluid, such changes in protein concentration are handled as useful information in diagnosis.
[0003]
For example, for the analysis of proteins that provide such useful biological information, an enzyme-labeled immunoassay (ELISA) is conventionally known as a quantitative analysis method for minute amounts of protein. In this method, an enzyme is bound as a label to an antibody whose target is the protein to be analyzed, and the chemical reaction of the substrate is promoted by a labeling enzyme that changes in concentration according to the concentration of the antigen protein, resulting in a product production rate. Alternatively, the concentration of the protein as an antigen is determined by measuring the amount produced.
[0004]
Conventionally, various methods other than the enzyme-labeled immunoassay are known as protein quantitative analysis methods. However, proteins that give biological information usually have a concentration from the order of pg / mL. Since the concentration is as low as about μg / mL, the analysis often requires a complicated and troublesome operation, a large apparatus, and a long time.
[0005]
In fact, for example, the speed measurement of a tumor marker by a current clinical test requires a long-time measurement using a desktop device. Therefore, depending on conventional methods including enzyme-labeled immunoassay, not only in the case of protein measurement for tumor markers and infectious diseases, but also in the future, its clinical needs are expected to increase further. As in the case of analysis of proteins related to blood coagulation in infarcts and strokes, simple, high-sensitivity, and rapid analytical measurement is required with a small device at a place where the burden on the patient is low, such as at the bedside. It was difficult to cope with the situation.
[0006]
Therefore, the invention of this application can solve the problems of the prior art as described above, shorten the analysis time, increase the analysis sensitivity, and quickly at a place where the burden on the patient at the bedside is low. It is an object of the present invention to provide an improved new method for high-sensitivity analysis of trace proteins that enables simple high-sensitivity analysis.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the invention of this application firstly forms an enzyme-labeled immune reaction by an antigen protein with superparamagnetic beads immobilized with an enzyme-labeled immune antibody on a substrate together with a counter electrode and a reference electrode. A pair of micro comb-shaped electrodes functioning as working electrodes that can be applied with an independent potential by detecting the correlation between the concentration of the antigen protein and the current value. The present invention provides a method for highly sensitive analysis of trace proteins, characterized in that the protein concentration can be discriminated by the current value.
[0008]
In addition, the invention of this application provides, secondly, a high-sensitivity analysis method of the above-mentioned trace protein, wherein the diameter of the superparamagnetic beads is 20 μm or less, and thirdly, a pair of combs Provided is a high-sensitivity analysis method for trace proteins as described above, wherein the spacing between the teeth swallowed in the mold electrode is equal to or less than the diameter of the superparamagnetic beads to which the enzyme-labeled immune antibody is immobilized. .
[0009]
More specifically, according to the invention of the present application, fourthly, high sensitivity of a trace protein characterized by quantifying a 1 ng / mL trace protein with a response speed within 10 seconds by an amperometry method. Provide analytical methods.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The invention of this application has the features as described above, and an embodiment thereof will be described below.
[0011]
In the method of the invention of this application, the enzyme-labeled immunoassay as described above is assumed. That is, in the same way as before, an enzyme is bound to an antibody whose target is the protein to be analyzed as a label, and the chemical reaction of the substrate is promoted by the labeling enzyme that changes in temperature according to the antigen concentration, and the product production rate Alternatively, the antigen concentration is determined by measuring the amount produced. As such a method, for example, the sandwich method is well known.
[0012]
With regard to such an antigen-antibody enzyme-labeled immune reaction, in the invention of this application, superparamagnetic beads on which an enzyme-labeled immune antibody is immobilized are used.
[0013]
In enzyme-labeled immunoassay, immune antibodies are often immobilized on a solid surface or incubated overnight to allow the antigen-antibody reaction to proceed. As a method for shortening this incubation, superparamagnetic fine particles are contained inside. Methods using polymer spherical particle colloids are known. Since the particle colloid for such a method is commercially available, in the invention of this application, it can be used as a superparamagnetic bead having the enzyme-labeled immune antibody immobilized thereon. Here, “superparamagnetism” is defined as having magnetism only when a magnetic field is applied.
[0014]
On the other hand, a minute comb-shaped electrode is known to be effective for a method of measuring a very small amount of product with high sensitivity by an analytical electrochemical technique. It has hardly been considered to be used for analysis by reaction. This micro-comb electrode for analysis has a structure in which two comb-shaped electrodes sandwich teeth and are arranged at narrow opposing intervals on the order of μm, and the two can serve as independent working electrodes. It is characterized by having a functioning structure. Such a structure can be formed on a suitable substrate such as quartz, together with a counter electrode (CE) and a reference electrode (RE), by a fine processing technique in a semiconductor or an electronic device.
[0015]
In the invention of this application, the protein concentration is detected as a current value from the potential difference between the opposing microelectrodes generated by the reaction between the labeling enzyme and the substrate accompanying the immune reaction between the antigenic protein and the antibody.
[0016]
The comb-shaped electrode of the present invention may be brought into contact with superparamagnetic beads (colloid as a collection of fine particles) to which a protein as an antigen is attached as described above.
[0017]
The invention method of this application, which is characterized by using magnetic beads, that is, superparamagnetic beads in relation to the comb-shaped electrode, will be further described. A reaction product produced by an enzyme immobilized on the bead surface (an enzyme bound to an immune antibody as a label) reaches the electrode rapidly and at a high concentration.
[0018]
In this case, the substrate, superparamagnetic beads, and a solution containing reactive organisms cover the substrate surface, and the upper part of the comb-shaped electrode is covered with superparamagnetic bead colloid like a cloud. For example, in the examples described later, a small permanent magnet (2 to 4 mmφ × 10 mm length, surface magnetic flux density of about 3500 gauss) is placed under the substrate and the superparamagnetic bead colloid is attracted to the electrode.
[0019]
The superparamagnetic beads of the present invention are washed each time an antibody is immobilized or an antigen is bound to the antibody. In the case of ordinary beads, the beads spread throughout the washing solution and the solution and become diluted. In the case of superparamagnetic beads, the beads can be drawn with a magnet after washing and stirring. Since the liquid not containing the beads is unnecessary, it can be discarded and a colloid enriched with superparamagnetic beads can be used. The main feature is that cleaning can be performed more quickly, such as natural settlement due to gravity, and waste liquid can be reconcentrated.
[0020]
Various electrochemical analysis methods in measurement analysis are known, such as amperometry and differential pulse voltammetry, but amperometry is suitable for short-time measurements. Yes. In the invention of this application, both high sensitivity and rapidity can be achieved. For this purpose, the following is considered in the design of a chip having comb-shaped electrodes for analysis and the selection of antibodies.
[0021]
1) In an enzyme-labeled immunoassay method using an electrochemical detector, the production amount np (t) of a reaction product P produced by an enzyme reaction with a labeled enzyme and the concentration Cp (t) of the product P on the electrode surface Is assumed to be proportional {t represents time}.
[0022]
2) In order to perform quick measurement within 10 seconds, preferably about several seconds, the time delay for the product to reach the electrode is preferably about 0.1 seconds or less. This is because the (time delay / measurement time) ratio determines the error.
[0023]
3) A typical compound of an enzyme reaction product often used in enzyme-labeled immunoassay utilizing an electrochemical detector is paraaminophenol (PAP, molecular weight 109). With a compound having such a low molecular weight, the diffusion rate D in the aqueous solution is on the order of 10 −5 cm 2 t. When the diffusion time is 0.1 s or less, the diffusion distance L needs to be L = (D · t) 1/2 = 10 −3 cm = 10 μm or less.
[0024]
4) It is desirable to use spherical superparamagnetic beads having a narrow particle size distribution width close to monodispersion.
[0025]
The average required time for the product produced by the action of the enzyme on the bead surface to reach the closely contacted electrode is such a time that the diffusion distance becomes equal to the radius of the bead. From the above 3), it is a necessary condition for the time delay to be 0.1 seconds or less that the radius of the beads is 10 μm or less. In addition, monodisperse spheres have a large porosity, and product molecules are likely to diffuse through the voids. The redox cycle between the anode and cathode of the micro comb-shaped electrode tends to occur. This satisfies the requirement for high sensitivity.
[0026]
5) For the purpose of improving the sensitivity, it is desirable that the enzyme-labeled antibody is present as densely as possible in a region within about 10 μm from the micro comb-shaped electrode. For this reason, the inventor has obtained good results using F (ab 1 ) 2 obtained by removing excess protein from the antibody molecule IgG.
[0027]
6) The product of the labeling enzyme located away from the electrode has a small ratio of reaching the electrode, and the rest diffuses into the space away from the electrode. As described in 1) to 5) above, high sensitivity can be obtained by collecting enzyme-labeled antibodies at a high density at a distance within 10 μm from the electrode.
[0028]
In the invention of this application, from the above, it is specifically provided that the diameter of the superparamagnetic beads is 20 μm (that is, the radius is 10 μm) or less. Further, it is also preferable that the interval between the teeth facing each other of the comb-shaped electrode is equal to or less than the diameter of the superparamagnetic beads. For example, preferably, the diameter of the superparamagnetic beads is 3 μm or less, the distance between the electrodes is less than this, and is smaller than the diameter of the superparamagnetic beads.
[0029]
For example, in the form as described above, the invention of this application also specifically provides a method for quantifying a 1 ng / mL trace amount protein with a response speed within 10 seconds by an amperometry method.
[0030]
This method is suitable for the target performance required for tumor marker (AFP) detection of liver cancer. Since the molecular weight of AFP is about 68,000, 1 ng / mL corresponds to 15 pmol / L.
[0031]
Therefore, examples will be shown below, and the embodiments of the invention will be described in more detail. Of course, the invention is not limited by the following examples.
[0032]
【Example】
1. Comb electrode preparation Comb patterning was performed on a quartz substrate with an EB exposure apparatus (ELS7700). After the development processing, Cr was deposited on the base and Pt was vacuum deposited thereon. As shown in the plan view of FIG. 1, lead wires (W1) (W2), a reference electrode (RE), a counter electrode (CE), and an insulating portion were formed on the lifted off Pt pattern. After silver plating was applied to the portion serving as the reference electrode, silver chloride plating treatment was performed to make Ag / AgCl to form a comb-shaped platinum electrode (W).
[0033]
The width of the Pt comb-shaped electrode was 3 μm, and the spacing between teeth was 2 μm.
2. Immobilization of antibody on magnetic beads Antigen-antibody was immobilized on magnetic beads (Dynal, dynabeads (registered trademark): M270Amine) having a particle size of 2.8 ± 0.2 μm by a sandwich method. When immobilizing, the immune reaction time was shortened by stirring with a magnet and adjusting the temperature.
[0034]
In addition, AFP ((alpha) -fetoprotein, cancer marker protein) was used for the measuring object.
3. Measurement by amperometry The current value was measured by amperometry using a dual potentiostat ALS832a.
[0035]
An electrochemical workstation, which is a multifunction potentiostat, was used to control the electrode potential, and an Ag / AgCl electrode was used as the reference electrode. When the reaction product by the labeling enzyme is detected electrochemically, the optimum potential varies depending on the product, but in the examples, a substrate that produces paraaminophenol is selected. In this case, one tooth of the comb-shaped electrode was used as the working electrode I, +0.4 V was applied to cause anodic oxidation, the other tooth of the comb-shaped electrode was set to -0.1 V, and cathode reduction was performed. .
4). Results FIG. 2 illustrates the result of measuring the current by attaching antigen proteins and antibodies having different concentrations to the magnetic beads in relation to time. FIG. 2 confirms the proportional relationship between the AFP concentration and the current.
[0036]
FIG. 3 shows the relationship between the AFP concentration and the current from the viewpoint of the initial time. A proportional relationship with the current value was obtained even at a concentration of 10 ng / mL or less, and a proportional relationship could be confirmed even at 10 seconds or less.
[0037]
It was also confirmed that no inhibition occurred in the AFP high concentration region.
[0038]
【The invention's effect】
As explained in detail above, the invention of this application shortens the analysis time, enables high-sensitivity analysis of trace amounts of protein, and enables quick and simple high-sensitivity analysis at a place where the burden on the patient is low, such as at the bedside. It becomes.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view showing an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram illustrating a relationship between time and current value as an example with respect to AFP concentration.
FIG. 3 is a diagram illustrating the relationship between AFP concentration and current from the viewpoint of initial time.
