JP4069024B2

JP4069024B2 - 化学変性ｄｎａ断片増幅装置及び該装置によるｄｎａ断片増幅方法

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Publication number: JP4069024B2
Application number: JP2003170815A
Authority: JP
Inventors: 久萩原; 利治白石; 佳之榊
Original assignee: Aida Engineering Ltd
Current assignee: Aida Engineering Ltd
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-06-16
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2023-06-16
Also published as: JP2005006504A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡの増幅装置に関する。更に詳細には、本発明は化学変性によりＤＮＡを増幅するための小型装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、ヒトや動植物などの生命現象を遺伝子レベルで解明するための研究が活発に続けられている。このような研究の中心は遺伝子操作技術又は遺伝子組換え技術の開発に向けられている。ヒトや動植物などの生物の遺伝情報は遺伝子ＤＮＡに格納されている。従って、このＤＮＡに格納されている塩基配列が遺伝情報の本質である。このような塩基配列の決定を行うために、被分析サンプルのＤＮＡを多量に増幅する必要性が生じた。
【０００３】
特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応を繰り返すことにより、その特定領域を数十万倍に増幅する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)）法が１９８５年にマリス(Mullis)らにより開発された。
【０００４】
この方法は、その後、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラーゼを利用した方法に改良されたことで、効率の良いＰＣＲ法として確立された。ＰＣＲ法の原理は、例えば、非特許文献１に詳細に説明されている。このＰＣＲ法は基本的に、▲１▼変性ステップ、▲２▼アニーリングステップ及び▲３▼伸張ステップの３つのステップを順に繰り返すことにより特定のＤＮＡのコピーを増やしていく。通常サイクルを２５〜３０回繰り返す。この反応によってｎサイクル後には理論的には約２^ｎ倍に増幅されることになる。しかし、増幅が進むとともに、増幅物同士のアニーリングが起こるため、反応が頭打ちになり、実際は数十万倍程度の増幅となる。
【０００５】
実際的には、ＰＣＲ法は、▲１▼先ず、９４℃で７分間加熱し、２本鎖ＤＮＡを熱変性により一本鎖に変性し、その後、Ｔａｑポリメラーゼを加える。▲２▼続いて、５４℃、３０秒間で一本鎖になったＤＮＡとプライマーとのアニーリングを行う。▲３▼次に、７２℃、１分間でＴａｑポリメラーゼによりＤＮＡ鎖を伸長させる。▲４▼次に再びＤＮＡ加熱変性を行うが、２回目以降のＤＮＡ加熱変性は９４℃で１分間で行う。この後、以上のステップ▲２▼〜▲３▼〜▲４▼のサイクルを２９回繰り返すが、最後のサイクルではステップ▲３▼を７２℃、７分間としＰＣＲを終了する。
【０００６】
しかし、加熱変性式のＰＣＲ法では、９４℃、５４℃及び７２℃の３種類の温度を繰り返し必要とするので、温度制御が難しく、また、マイクロチャネル内には数ピコリットルという量の試薬及びＤＮＡ断片溶液が含まれていることから、局部的な加熱や冷却によりチャネル内を勝手に移動してしまう可能性も考えられる。更に、チップの特定部位を各ＰＣＲステップの温度に対応させるには幾つかの方式が考えられているが、温度精度の点、総反応時間の点、反応効率に疑問がある。これは、現在扱われているＰＣＲのように５０℃〜７０℃の一点のアニーリング温度が正確に試料に伝達されているか疑問だからである。特に、９０℃〜９８℃の一点に解離（ディネーチャー）作業からアニーリング作業は連続工程であり、サンプルにより異なる温度領域がそれぞれ干渉してはならないからである。
【０００７】
加熱変性式のＰＣＲ法の別法として、化学変性式のＰＣＲ法が提案されている。二本鎖ＤＮＡは周囲のｐＨを１０以上に傾けると解離し、一本鎖に変性する。この方法はアルカリ変性と呼ばれ、当業者に公知である。次に、ｐＨを中性域の７近くに戻すと再対合（アニーリング）する（中和反応）。この中和再対合も当業者に公知である。この原理を３０回繰り返せば、現在行われている加熱変性式のＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ法）と同等のことができると考えられる。しかし、一般的には正確な試薬の量を秤量して添加していく手間などを考えると、小型の自動装置化に不向きであり、実際には装置化されていない。
【０００８】
【非特許文献１】
服巻保行、ＰＣＲ法の原理と実際、実験医学第９巻第１０号「ＤＮＡ診断と疾患の分子生物学」、１９９１（２８−３４）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は化学変性によりＤＮＡ断片を増幅するための小型装置を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、化学変性によりＤＮＡ断片を増幅するための装置であって、化学変性によりＤＮＡ断片の増幅反応を行わせるための所定の方向に延長される第１の流路と、前記第一の流路の一方の側に並列に配置された、アルカリ変性試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第二の流路と、前記前記第一の流路の他方の側に並列に配置された、中和反応試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第三の流路を有し、前記第二の流路は該流路壁に開口する、所定量のアルカリ変性試薬溶液を秤取するための複数本の第四の流路を有し、前記第三の流路は該流路壁に開口する、所定量の中和反応試薬溶液を秤取するための複数本の第五の流路を有し、前記第四の流路は、該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第六の流路を有し、かつ、前記第五の流路は該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第七の流路を有し、前記第六の流路と第七の流路とは前記第一の流路の両側に相対峙しないように離間されて互い違いに配置されていることを特徴とする化学変性ＤＮＡ断片増幅装置により解決される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面を参照しながら本発明による化学変性ＤＮＡ断片増幅装置を具体的に説明する。
【００１２】
図１は本発明による化学変性ＤＮＡ断片増幅装置の一例の部分概要平面図である。図１に示されるように、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１は基本的に、化学変性反応を行わせるための所定の方向に延長される第一の流路３と、この第一の流路３の一方の側に並列に配置された、アルカリ変性試薬を供給するための所定の方向に延長される第二の流路５と、この前記第一の流路の他方の側に並列に配置された、中和反応試薬を供給するための所定の方向に延長される第三の流路７を有する。第二の流路５は該流路壁に開口する、所定量のアルカリ変性試薬を秤取するための複数本の第四の流路９を有する。第四の流路９は例えば、３０本配設することができる。この本数はＰＣＲ増幅反応の回数と一致させることが好ましい。また、第三の流路７も、該流路壁に開口する、所定量の中和反応試薬を秤取するための複数本の第五の流路１１を有する。第五の流路１１の本数は前記第四の流路９の本数と同一であることが好ましい。アルカリ変性試薬秤取用の第四の流路９は第六の流路１３により前記第一の流路３と連通されている。第六の流路１３は前記第一の流路３，第二の流路５及び第四の流路９の何れよりも細く、濡れ難い又は相対的に毛管引力が働き難い性質を有することが好ましい。同様に、中和反応試薬秤取用の第五の流路１１は第七の流路１５により前記第一の流路３と連通されている。第七の流路１５は前記第一の流路３，第三の流路７及び第五の流路１１の何れよりも細く、濡れ難い又は相対的に毛管引力が働き難い性質を有することが好ましい。
【００１３】
第一の流路３、第二の流路５及び第三の流路７はそれぞれ、それらの両端に、流路内に液体を出し入れするための大気に向かって開放されたポート１７ａと１７ｂ、１９ａと１９ｂ及び２１ａと２１ｂを有する。例えば、ポート１７ａ、１９ａ及び２１ａには流路内の液体を圧送するための加圧手段（図示されていない）を接続することができる。
【００１４】
第六の流路１３と第七の流路１５は、第一の流路の両側に相対峙しないように離間されて互い違いに配置することが好ましい。これは、第四の流路９内のアルカリ変性試薬が第六の流路１３を介して第１の流路３内に押し出されることにより形成される液滴と、第五の流路１１内の中和反応試薬が第七の流路１５を介して第１の流路３内に押し出されることにより形成される液滴とが接触して不用意に反応してしまうことを防止するためである。従って、第六の流路１３と第七の流路１５との間隔はこれらの流路から押し出されて形成される液滴のサイズ及び化学変性ＤＮＡ断片増幅反応の進行につれて徐々に増量していく反応液の容量を考慮して決定することができる。
【００１５】
図２は図１におけるII-II線に沿った断面図である。図示されているように、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１は、基本的に、高分子材料（例えば、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコン樹脂、）、ガラスなど素材から形成された上側基板２３と下側基板２５の２枚の平板状基板を重ねて接合させることにより構成することができる。図２（ａ）では、第一の流路３，第二の流路５、第三の流路７、第四の流路９及び第五の流路１１と各ポート１７ａ〜２１ｂが上側基板２３内に形成され、第六の流路１３及び第七の流路１５が下側基板２５内に形成されている。これにより、各流路は封止され、ポートだけが大気に開放されている。別法として、図２（ｂ）に示されるように、全ての流路及びポートを上側基板２３内に形成し、これら流路を下側基板２５で封止することもできる。基板２３及び２５は透明でも、あるいは不透明でもよい。
【００１６】
第一の流路３，第二の流路５、第三の流路７、第四の流路９及び第五の流路１１の深さ（又は高さ）は特に限定されない。一般的に、１〜３００μｍの範囲内で適宜選択することができる。また、その幅も１００〜３００μｍの範囲内で適宜選択することができる。第一の流路３を第二の流路５及び第三の流路７よりも幅広にすることもできる。第四の流路９及び第五の流路１１の高さ及び幅はこの流路で秤取すべきアルカリ変性試薬量及び中和液量を考慮して決定することができる。第六の流路１３及び第七の流路１５の幅は数μｍ〜数十μｍの範囲内であることが好ましい。
【００１７】
基板内に流路及びポートを形成する技法としては例えば、光リソグラフィー法により鋳型を作製し、この鋳型からレプリカを作製することからなる、当業者に公知慣用の技法を使用することができる。その他、金型注型などの技術を用いて作製することもできる。
【００１８】
図３は第四の流路９及び第五の流路１１により所定量のアルカリ変性試薬又は中和液が秤取される原理を説明する図である。ここでは、説明の便宜上、第三の流路７と第五の流路で中和液を秤取する態様について説明する。ポート２１ａ（図１参照）から中和液を注入し、ポート２１ｂ（図１参照）に達するまで第三の流路７内全体に中和液を満たさせる。第三の流路７に中和液１００を導入した場合、第三の流路７の流路壁ａａにおいて開口する第五の流路１１の開口部ｃ１を介して、中和液１００を第五の流路１１に導入することができる。第三の流路７および第五の流路１１が濡れやすい流路壁を有する場合は、第三の流路７より第五の流路１１を細くしておけば、中和液１００はより強い毛管引力により第三の流路７の流路壁ａａに開口する第五の流路１１の開口部ｃ１を介して第五の流路１１に自発的に引き込まれる。第三の流路７および第五の流路１１が濡れにくい流路壁を有する場合は、ポート２１ａより中和液１００に適当な圧力を付与することにより第五の流路１１に中和液１００を導入することができる（図３（ａ）参照）。
【００１９】
この際、第七の流路１５（ｃ２とｄ１の間の流路区間）の第五の流路１１側の端面ｃ２まで到達した中和液１００は、濡れにくい流路壁を有する第七の流路１５の毛管斥力によってせき止められ、第七の流路１５に入り込むことはない。第五の流路１１が濡れにくい流路壁の場合にも、第五の流路１１の毛管斥力よりも第七の流路１５の毛管斥力の方が強いため、第七の流路１５に中和液１００が入り込むことはない（図３（ａ）参照）。
【００２０】
続いて、第三の流路７内に残留する中和液１００を、例えば、ポート２１ａ、２１ｂ（図１参照）の両端部に適当な圧力差を生起させてより低圧側に移動させるなどし、第三の流路７内から取り除く。この際、第五の流路１１内の中和液１００は、通常、第三の流路７内に戻って入り込むようなことはない。その結果、第五の流路１１内の中和液１００の両端面たる端面１００ａと端面１００ｂとが、第五の流路１１の開口部ｃ１ならびに第三の流路７に繋がる側の端面ｃ２に位置するようになり、第五の流路１１のｃ１とｃ２の区間の容積に応じた体積の中和液１００の秤取が可能となる（図３（ｂ）参照）。
【００２１】
さらに、第五の流路１１内に秤取された中和液１００は、第三の流路７の圧力が第一の流路３の圧力より僅かに大きくなるように、ポート２１ｂを閉じてポート２１ａから圧力を加えるなどして、第七の流路１５およびその開口部ｄ１を介して、第一の流路３内に導入することができる。この際、中和液１００を第一の流路３内に全て押し出してしまわず、第七の流路１５内に一部残すと中和液１００を第七の流路１５の位置に留めておくことができる（図３（ｃ）参照）。
【００２２】
図４は本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１によりＤＮＡ断片が増幅される原理を説明する概要図である。ポート１９ａ（図１参照）から反応液２００を第一の流路３内に注入し、該流路内を矢線の方向に移動させる。反応液２００は例えば、ＰＣＲ用試薬、ＤＮＡサンプル、プライマー、酵素などが混合されている。反応液２００は第四の流路９で秤取され第六の流路１３を介して第１の流路３内に押し出されたアルカリ変性試薬液３００と接触し、ｐＨ１０以上となりサンプルのＤＮＡ２本鎖は解離する。このｐＨ１０以上に変性された反応液２００は更に移動され、中和液１００と接触し、ｐＨ７付近に戻されアニーリング（再対合）し、ＤＮＡサンプルが増幅する。本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１により、このアルカリ変性と中和を所定回数（例えば、３０回）繰り返すことによりＤＮＡサンプルは次々と増幅される。増幅反応生成物は第一の流路３の他端にあるポート１９ｂ（図１参照）から取り出すことができる。
【００２３】
本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１によりＤＮＡサンプルを効率的に増幅するために、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１をアニーリング反応に好適な５４℃付近に保つことが好ましい。このような目的のために、例えば、加熱手段（図示されていない）を下側基板２５側に配置し、５４℃付近に温度制御するか、又は、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１を５４℃付近の温度に維持された恒温槽内に配置して増幅反応を実施させる。
【００２４】
アルカリ変性反応と中和反応が交互に進行するにつれて反応液２００の容量が徐々に増大する。従って、図５に示されるように、第一の流路３の幅が反応液２００の進行方向に向けて逓増するように構成することもできる。
【００２５】
本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１は図１に示されるような矩形状（例えば、長方形状）に造形することもできるが、図６（ａ）に示されるような渦巻き状又は図６（ｂ）に示されるような同心円状などの形状にして円盤上に造形することもできる。
【００２６】
以上、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１について好ましい実施態様を挙げて具体的に説明してきたが、本発明は前記実施態様にのみ限定されるものではない。例えば、第一の流路３の反応液注入ポート１９ａを図７に示されるように変更することもできる。この実施態様では、ポート２３ａとポート２３ｂとを繋ぐ第八の流路２５が存在し、この第八の流路２５は該流路壁に開口する、所定量の反応液を秤取するための第九の流路２７を有する。この第九の流路２７は細い第十の流路２９を介して第１の流路３と連通されている。このような構成により、常に一定量の反応液を容易に第一の流路３内に送り出すことができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１によるＤＮＡ増幅反応を具体的に例証する。
【００２８】
実施例１
図１に示されるような化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１を用いてＤＮＡ増幅反応を実施した。図１の装置は、アルカリ変性試薬を秤取する第四の流路及び中和液を秤取する第五の流路をそれぞれ３０本有していた。各第四の流路９及び第五の流路の容量はそれぞれ４０ｐｌ（ピコリットル）であった。化学変性ＤＮＡ断片増幅装置１の下部に加熱手段を配置し、装置１を５４℃の温度に維持した。
先ず、ポート１７ａからアルカリ変性試薬として０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を第二の流路５に注入し、各第四の流路９内にアルカリ変性試薬液を充填した。第二の流路５内の余ったアルカリ変性試薬はポート１７ｂから排出した。その後、ポート１７ｂを閉じ、ポート１７ａから空気圧を利用して各第四の流路９内のアルカリ変性試薬溶液を第六の流路１３を介して第１の流路３内に押し出した。この際、第六の流路１３内にアルカリ変性試薬溶液が一部残存するようにした。これにより、アルカリ変性試薬溶液を第六の流路１３の位置に定置させておくことができる。
同様に、ポート２１ａから中和液として０．１Ｍの塩酸溶液を第三の流路７に注入し、各第五の流路１１内に中和液を充填した。第三の流路７内の余った中和液はポート２１ｂから排出した。その後、ポート２１ｂを閉じ、ポート２１ａから空気圧を利用して各第五の流路１１内の中和液を第七の流路１５を介して第１の流路３内に押し出した。この際、第七の流路１５内にアルカリ変性試薬溶液が一部残存するようにした。これにより、中和液を第七の流路１５の位置に定置させておくことができる。
次いで、５０ミリモルのＫＣｌ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ミリモルのＭｇＣｌ_２、０．１％トライトンＸ−１００、４種類のｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三燐酸）各２００マイクロモル、５０〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、TaqＤＮＡポリメラーゼ０．２単位と２種類のプライマー各１０ピコモルからなる組成を有する反応液を２ｎｌ（ナノリットル）使用し、この反応液をポート１９ａから第１の流路３の移動開始点に注入した。その後、ポート１９ａから空気圧を利用して反応液を移動前進させ、最初の第六の流路１３の位置に定置されたアルカリ変性試薬溶液と接触させることによりＤＮＡを変性させ、ＤＮＡ相補鎖を分離しランダム構造に変化させた。次いで、この変性された反応液を更に前進させ、最初の第七の流路１５の位置に定置された中和液と接触させることにより、分離していた相補鎖を再対合（アニーリング）させ元の２本鎖に戻してＤＮＡを増幅させた。この増幅された反応液を次ぎのアルカリ変性試薬溶液と接触させて再び変性させ、次いで、中和して再対合させ、以後この変性−中和の反応を最後の３０番目の第六の流路１３及び第七の流路１５まで繰り返した。増幅反応生成物をポート１９ｂから取り出した。この生成物を電気泳動分析したところ、分析可能な量まで十分に増幅されていることが確認された。
【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、従来の加熱変性式のＰＣＲ法では、９４℃、５４℃及び７２℃の３種類の温度を繰り返し必要とし、温度制御が非常に煩雑かつ困難であったが、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置によれば、アニーリングに必要な温度だけでＤＮＡサンプルを増幅することができる。その結果、本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置は従来の加熱変性式ＤＮＡ断片増幅装置に比べてサイズが著しく小型化できると共に、同時に、分析時間を短縮することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置の一例の部分平面図である。
【図２】図１におけるII-II線に沿った断面図である。
【図３】図１に示した装置でアルカリ変性試薬溶液又は中和液を秤取する原理を示す概念図である。
【図４】図１に示した装置で化学変性ＤＮＡ断片増幅反応を実施する状態を示す概念図である。
【図５】本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置の別の例の部分平面図である。
【図６】本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置の更に別の例の概要平面図である。
【図７】図１に示した装置を部分的に変更した例の部分平面図である。
【符号の説明】
１本発明の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置
３第一の流路
５第二の流路
７第三の流路
９第四の流路
１１第五の流路
１３第六の流路
１５第七の流路
１７ａ，１７ｂ，１９ａ，１９ｂポート
２１ａ，２１ｂ，２３ａ，２３ｂポート
２５第八の流路
２７第九の流路
２９第十の流路
１００中和液
２００反応液
３００アルカリ変性試薬溶液

Claims

化学変性によりＤＮＡ断片を増幅するための装置であって、化学変性によりＤＮＡ断片の増幅反応を行わせるための所定の方向に延長される第１の流路と、前記第一の流路の一方の側に並列に配置された、アルカリ変性試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第二の流路と、前記第一の流路の他方の側に並列に配置された、中和反応試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第三の流路を有し、前記第二の流路は該流路壁に開口する、所定量のアルカリ変性試薬溶液を秤取するための複数本の第四の流路を有し、前記第三の流路は該流路壁に開口する、所定量の中和反応試薬溶液を秤取するための複数本の第五の流路を有し、前記第四の流路は、該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第六の流路を有し、かつ、前記第五の流路は該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第七の流路を有し、前記第六の流路と第七の流路とは前記第一の流路の両側に相対峙しないように離間されて互い違いに配置されていることを特徴とする化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記第一の流路、第二の流路及び第三の流路は該流路の両端に大気に連通するポートをそれぞれ更に有することを特徴とする請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記第一の流路は前記増幅反応が段階的に行われる方向に向かって流路の幅が徐々に拡大するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記第一の流路、第二の流路及び第三の流路は並列的に渦巻き状に配列されていることを特徴とする請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記第一の流路、第二の流路及び第三の流路は同心円状に並列的に配列されていることを特徴とする請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記第１の流路の一方の端部には一定量の反応液を秤取するための反応液秤取機構が配設されており、該反応液秤取機構は、両端にポートを有する第八の流路と、該第八の流路の流路壁に開口する、所定量の反応液を秤取するための第九の流路と、この第九の流路と前記第１の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第十の流路とからなることを特徴とする請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記細い第六の流路、第七の流路及び第十の流路は相対的に毛管引力が働き難い性質を有することを特徴とする請求項１又は６に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
前記装置を５４℃の温度に維持するための手段を更に有することを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置。
請求項１に記載の化学変性ＤＮＡ断片増幅装置を使用し、ＤＮＡ断片含有反応液をアルカリ変性試薬と混合することにより前記ＤＮＡ断片を一本鎖に解離させ、次いで、この混合液を中和液で中和することにより一本鎖に解離されたＤＮＡ断片をアニーリングして二本鎖に戻すことからなるステップを複数回反復することによりＤＮＡ断片を増幅することからなる化学変性ＤＮＡ断片増幅方法。
前記ステップの反復回数が１５回〜３０回の範囲内の回数であることを特徴とする請求項９の方法。