JP4067114B1 - フェニルジアジリン誘導体とその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
下記式(1)で表される化合物およびその製造方法,並びに中間体の製造方法。
Description
(1)核酸およびその派生物が結合するタンパク質を相同性のあるモチーフから解析する方法は、直接的な確認法ではなく、アミノ酸配列が未知である新規結合タンパク質を探す方法として用いることはできない。
(2)DNAまたはRNAの結合タンパク質の解析に多用されるEMSAは、非変性条件電気泳動という制約から、分離能が非常に悪く、結合タンパク質の有無を確認するのみの解析方法となる。例えば、解析系に複数の結合タンパク質が存在している場合でも、EMSAでは結合タンパク質の有無のみの情報しか得られなく、タンパク質の数を知ることができない。複数のタンパク質が高次の複合体を形成し、DNAまたはRNAに結合していることは良く知られており、その解析法としてはEMSAの限界が指摘されていた。
(3)核酸とその派生物およびその複合体に結合するタンパク質を、タンパク質混合液から分離精製する一般的な方法は未だ確立されていない。
[1]
下記式(1)で表される化合物。
下記式(11)で表される化合物にルイス酸の存在下でCl2CHOCH3を反応させて、下記式(12)で表される化合物を調製し、下記式(12)で表される化合物にNaBH4の存在下でエタノールを反応させて、下記式(13)で表される化合物を調製し、下記式(13)で表される化合物に、トリフェニルホスフィンの存在下でマレイミドを反応させて、下記式(1)で表される化合物を調製することを含む、下記式(1)で表される化合物の製造方法。
下記式(11)で表される化合物にルイス酸とトリスルオロメタンスルホン酸の存在下でCl2CHOCH3を反応させて、下記式(12)で表される化合物を調製することを含む、下記式(12)で表される化合物の製造方法。
フェニルジアジリンは、種々の合成条件に安定である一方、光反応で速やかに分解して安定なクロスリンクを形成できるため、優れた光反応基として知られている。しかし、これを化学物質や生体分子に導入するためには適当な官能基が必要であり、その段階における合成的煩雑さが問題であった。大量合成が可能な(11)を原料に、有用中間体のアルデヒド(12)を簡単に合成する方法をまず開発し、これを経て様々な有用ジアジリンが簡単に誘導できる新しいルートを開拓した。(12)は、これまで7段階を経る収率の悪い合成法が報告されていた[J. M. Delfino, S. L. Schreiber, and F. M. Richards, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 3458-3474]。しかし、本発明では、この合成法に代えて、フェニルジアジリン (11)を直接修飾することにより、一段階でアルデヒド(12)を得るまったく新しいアプローチを用いる (スキーム3)。
Friedel-Crafts反応で簡便に得られるようになったアルデヒド体(12)は、さらにアルデヒド基を還元しベンジルアルコール体(13)、ヒドロキシ基をハロゲン化し化合物(14)などの、様々な有用合成中間体に簡単に変換できる。このハロゲン体は、光反応性のペプチドやタンパク質の合成に有用な、p-位にジアジリン基を持つフェニルアラニン(Tmd(Phe))(15)の合成に利用されている[例えば、M.Nassal, J. Am. Chem. Soc., 106, 7540-7545 (1984) ; L. B. Shih, and H. Bayley, Anal. Biochem., 1985, 144, 132-141C ; W. G. Fishwick, J. M. Sanderson, and J. B. C. Findlay, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 4611-4614.]ジアジリン合成を含む非常に多段階の合成法である。ここでは、アルデヒド体(12)から出発し、還元により(13)を得、次いでハロゲン化により(14) を得る。(14)から(15)が数工程の反応で簡便に不斉合成できる(スキーム4)。尚、下記スキーム4中、(13)は前記化合物(7)と同一化合物であり、(14)は、前記化合物(2)においてHalがBrである化合物であり、(15)は、前記(10)において、RおよびR’が水素原子(H)である化合物である。
4-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzyl alcohol (13) (750 mg, 3.45 mmol)をTHF 28 mLに溶かし、Triphenylphosphine (1.05 g, 3.9 mmol)、maleimide (389 mg, 3.97 mmol)を加え0℃に冷却した。窒素気流下、撹拌しながらDiisoproylazodicarboxylate(789 mg, 4.35 mmol)をゆっくりと加えた。加え終わると黄色の液体となった。0℃で1時間置いた後、反応混合物を減圧溜去し、Hezane : Ether = 1:1を30 mL 加える。沈殿してきた反応物のTriphenylphosphine oxideを濾過で取り除いた。溶媒を減圧溜去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(Hexane : AcOEt = 4 : 1)により精製して、無色の固体物質を得た。
収率 539 mg (68%)
1H-NMR (CDCl3)
:7.37 (d, 2H, J = 7.3 Hz) 7.19 (d, 2H, J = 7.3 Hz) 6.72 (s, 2H) 4.67 (s, 2H).
3-(Phenyl)-3-(trifluoromethyl)-3H-diazirine (11) (1.86 g, 0.01 mol)を0℃でCl2CHOCH3 (3.45 g, 0.03 mol)に溶かした。アルゴン気流下、0℃で、撹拌しながらTfOH (1.77 mL, 0.02 mol)とTiCl4 (2.85 g, 0.015 mol)から得られた黄色の個体をゆっくり加えた。塩化水素が発生するのが収まるとオレンジ色の液体となった。室温で1時間置いた後、反応混合物にヘキサン500 mLを加え、撹拌しながら砕いた氷を氷零下ゆっくり加えて過剰の試薬を分解した後、固体の炭酸ナトリウムをゆっくり加えて中和した。得られたヘキサン層を分離後、飽和食塩水で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane:CH2Cl2 = 2:1) により精製して、黄色の油状物質 (12)を得た。
1H-NMR (CDCl3)
σ:10.04 (s, 1H), 7.91 (d, 2H, J = 8.3 Hz) 7.35 (d, 2H, J = 8.3 Hz).
化合物(12) (3.3 g, 15.4 mmol)をEtOH 7 mLに溶かし0℃で撹拌しながらNaBH4 (0.626 g, 16.5 mmol)をEtOH 7 mL中に懸濁したものを加えた。加え終わったのち室温に戻し4時間撹拌した。これに氷上で1M HClをゆっくり加えて過剰の試薬を分解した後、Etherで抽出し、Ether層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane:Ether = 1:1)により精製して、淡黄色の油状物質(13)を得た。
1H-NMR (CDCl3)
σ:7.39 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.71 (s, 2H), 1.87(bs, 1H)
3-[4-(Bromomethyl)phenyl]-3-(trifluoromethyl)-3H-diazirine (14)
化合物 (13) (344.0 mg, 1.59 mmol)をCH2Cl2 2 mLに溶かし、CBr4 (658.2 mg, 1.985 mmol)を加えた。0℃に冷やしPh3P (474 mg, 1.807 mmol)をゆっくりと加えた。室温まで戻し1時間撹拌した後で、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hexane)で精製して、無色の油状物質(14)を得た。
1H-NMR (CDCl3)
σ:7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.46 (s, 2H).
L-4'-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]phenylalanine (15)
tert-Butylglycinate benzophenone imine (1.136 g, 3.839 mmol)と、不斉触媒のO(9)-Allyl-N-9-anthracenylmethylcinchonidium bromide[9] (0.2127 g, 0.351 mmol, 0.1 eq)をCH2Cl2 9 mLに溶かした。化合物 (14) (1.419 g, 5.085 mmol, 1.5 eq.)を加えアルゴンガス雰囲気下、室温で撹拌した。反応混合液を-78 ℃に冷却しながら2-tert-Butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhirdo-1,3,2-diazaphosphorine (1.41 g, 5.139 mmol, Aldrich)を数秒間で滴下し、-78 ℃で7時間反応させた。室温に戻し減圧蒸留した後、残査をEtherで希釈し蒸留水で2回、飽和食塩水で1回洗った。油層を硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane:EtOAc = 7:1) で精製し、黄色の油状物質を得た。
1H-NMR (CDCl3)
σ:7.57 (d, 2H, J = 6.9 Hz ), 7.39-7.27 (m, 6H), 7.06 (q, 4H, J = 8.4 Hz )
6.59 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 4.09 (q, 1H, J = 8.6, 4.6 Hz), 3.26-3.11 (m, 2H)
1.44 (s, 9H).
1H-NMR (CD3OD)
σ:7.46 (d, 2H, J = 7.9 Hz ), 7.27 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.84 (dd, 1H, J = 8.2, 4.5 Hz), 3.38 (m,1H), 3.10 (d, 1H, J = 4.5, 8.2 Hz).
光学純度 (e.e.)
(5)をFmoc体に誘導し、HPLCによりその光学純度を確認した。適量をMeOHに溶かした後、キラルカラム (Sumichiral OA-3300 2.5μm 4.6 mmφ×25 cm)を用いて0.01 M Ammonium Acetate/MeOH、流速1 mL/minで溶出させ、360 nmのジアジリン由来のUV吸収により検出した。
e.e. = 98%
[α]D+22.4°(c = 0.52, EtOH)
[GTP-γ-S, ADP-β-Sへのジアジリンの導入]
・光反応性GTP-γ-Sの作成
サンプルを終濃度が1 mM GTP-γ-S, 100 mM リン酸バッファー(pH 7.0), 50 mM 4-[3H-[3-trifluoromethyl]diazine-3-yl]benzyl maleimideとなるように調製し、37℃で20時間置いておく。反応後、HPLCにより分析、単離を行いMASSにより分子量を測定した。
サンプルを終濃度が1 mM ADP-β-S, 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0), 50 mM 4-[3H-[3-trifluoromethyl]diazine-3-yl]benzyl maleimideとなるように調製し、37℃で18時間置いた。反応後、HPLCにより分析、単離を行いMASSにより分子量を測定した。結果を図2に示す。
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