JP4048445B2 - プロテインキナーゼ活性の解析方法 - Google Patents
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Description
1.少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際して、直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体を作用させることを特徴とするプロテインキナーゼ活性の検出方法。
2.直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体を作用させた後、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする1のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
3.アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後、更に該アビジンもしくは該ストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることを特徴とする2のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
4.少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を形成させ、該複合体を作用させることを特徴とするプロテインキナーゼ活性の検出方法。
5.複合体を作用させた後、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることを特徴とする4のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
6.直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体の分子量が500〜1000である1〜5のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
7.直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体の分子量が600〜900である6のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
8.リン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体として、式(I) に記載される化合物を用いる1 〜7のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
10.各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも2種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる1〜9のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
11.少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする1〜10のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
12.リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して検出することを特徴とする1〜11のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
13.リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする1〜12のいずれかのプロテインキナーゼ活性の検出方法。
(ペプチド固定化)
末端官能基がチオール基である4armPEG(日本油脂製SUNBRIGHT PTE−100SH)を1mMの濃度で7mlのエタノール:水=6:1の混合溶液に溶解させた。4armPEGの分子量は10000であり、中心からほぼ同等の長さのPEG鎖が4つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、PEGの4つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。18mm四方、2mm厚のSF15ガラススライドにクロムを3nm蒸着し、金を45nm蒸着した金蒸着スライドを、上記4armPEGチオール溶液に3時間浸漬させ、金基板全体に4armPEGチオールを結合させた。
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、PEGチオール(日本油脂製SUNBRIGHT MESH−50H)を1mM濃度になるようにリン酸緩衝液(20mMリン酸、150mM NaCl;pH7.2)に溶解して、300μlをチップ上に注出し、室温で30分反応させた。ここで用いたPEGチオールの分子量は5,000である。
上記のようにブロッキングを行ったアレイをPBS及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式(II)に示されるPhos−tagTMBTL−104(株式会社ナード研究所より購入)を用いた。Phos−tagTMBTL−104は25μg/ml濃度とし、溶解液には0.005%Tween20,10%(v/v)エタノール、0.2M硝酸ナトリウム、1mM硝酸亜鉛を含む10mM HEPES−NaOH緩衝液(pH7.4)を用いた。作用は室温で1時間行った。
実施例1と同じアレイを用いて未反応マレイミド基のブロッキングまでは同様に行い、アレイをPBS及び水でアレイの洗浄を行い、SPR装置(東洋紡績製MultiSPRinterTM)にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例1と同じものを用いた。Phos−tagTMBTL−104をランニングバッファーに溶解して1,5,10μg/ml濃度の溶液を調製し、順次プランンジャーポンプ(フロム製Model−021)を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は30℃に設定して行った。その後ランニングバッファーを送液させながら洗浄を行った後、ストレプトアビジン溶液を1,5,10μg/ml濃度順に送液して作用させた。得られたセンサーグラムを図2上部に示した。この場合においてもリン酸化基質の種類によりその強度に差異はあるものの、いずれのリン酸化基質においても非リン酸化基質と比べると有意なシグナル上昇を確認することができている。また実施例1と同様にしてSPRイメージングを行った結果を図2中段に示した。これについても同様の傾向が確認される。
(ペプチド固定化)
金基板への4armPEGチオールの結合は、実施例1と同様に行った。その後のUV照射に際しては、フォトマスクとして500μm四方の正方形の穴が16個(4個×4個のパターンからなる。)有するものを用いた点以外は、実施例1と同様にしてパターン化を行った。その後のアレイ表面へのアミノ基の導入、架橋剤を用いたマレイミド基表面の形成も、実施例1と同様に行った。基質ペプチドのスポッティングはマニュアル操作により0.1μlずつで行った。基質としては、PKA(プロテインキナーゼA)基質(図1のPKA(Ser)と同じ)、セリン残基が予めリン酸化されたポジティブコントロール(pPKA)、セリン残基がアラニン残基に置換されているネガティブコントロール(nPKA)を用いて、図3下部に示したような配置で固定化させた。スポット後の反応も実施例1と同様に行った。
実施例1と全く同様にして行った。
上記のようにブロッキングを行ったアレイをPBS及び水でアレイの洗浄を行い、PKAによるリン酸化を行った。PKA溶液400μlをアレイ上にドロップして、30℃、30分間反応を行った。PKA溶液の組成は、PKA触媒サブユニット(プロメガ製)1μl、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)375μl、1M塩化マグネシウム溶液20μl、10mM ATP(アマシャムバイオサイエンス製)4μlとした。
実施例3と同じPKA基質及びそのポジティブコントロール、ネガティブコントロール並びにcSrc基質及びそのポジティブコントロールを96点に固定化したアレイを実施例1と同様にして作製した。基質の配置は図4下部に示す通りである。ブロッキング、PKA反応、Phos−tagTMBTL−104の作用を実施例3と同様にして行い、アレイをPBS及び水でアレイの洗浄を行い、SPR装置(東洋紡績製MultiSPRinterTM)にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例1と同じものを用いた。ストレプトアビジン溶液(10μg/ml)を送液により作用させた。シグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体(Vector製)を2.5μg/ml濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラム及びSPRイメージングを行った結果を図4に示した。PKA及びcSrc基質のポジティブコントロールにおいては、いずれも強いシグナル上昇が確認され、PKA基質においてもある程度のシグナル上昇が確認できる。ネガティブコントロール、ブランクにおいいてはほとんどシグナル変化は見られていない。シグナル上昇はストレプトアビジン抗体の作用させるとより顕著になっており、その特異性の面でも優れていることから、優れた増感効果を奏していることが示される。
図1に示したPKA基質(スレオニン型)、PKC基質(セリン型)、cSrc基質(Yao;チロシン型)についてリン酸化、非リン酸化基質を固定化したアレイを実施例1と同様にして作製した。その後のブロッキングも実施例1と同様にして行い、SPR装置(東洋紡績製MultiSPRinterTM)にセッティングした。一方、Phos−tagTMBTL−104溶液(50μg/ml)とストレプトアビジン溶液(75μg/ml)を等量ずつ混合させて室温で30分反応させて、複合体を形成させた。この複合体溶液を実施例1と同じランニングバッファーで10倍、5倍希釈したものを送液しながら作用させた。更にシグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体(Vector製)を2.5μg/ml濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラムを図5に示した。この場合もリン酸化基質においてのみ特異的にシグナル上昇を認めることができる。
Claims (13)
- 少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際して、直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体を作用させることを特徴とするプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体を作用させた後、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする請求項1に記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後、更に該アビジンもしくは該ストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項2に記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を形成させ、該複合体を作用させることを特徴とするプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 複合体を作用させた後、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項4に記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体の分子量が500〜1000である請求項1〜5のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 直鎖状のリンカー構造を介してビオチンにより修飾されてなり、かつリン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体の分子量が600〜900である請求項6記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- リン酸に結合する性質を有するポリアミン亜鉛錯体として、式(I) に記載される化合物を用いる請求項1 〜7のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 前記ペプチドがcGMP依存性プロテインキナーゼファミリー、cAMP 依存性プロテインキナーゼ(PKA)ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC(PKC)ファミリー、プロテインキナーゼD(PKD)ファミリー、プロテインキナーゼB(PKB) ファミリー、MAPキナーゼ(MAPK)カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Srcチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質である請求項1〜8のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも2種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる請求項1〜9のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- 少なくとも1種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも1種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
- リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の検出方法。
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