JP4019433B2

JP4019433B2 - Particle carrier for nucleic acid binding

Info

Publication number: JP4019433B2
Application number: JP10793694A
Authority: JP
Inventors: 可君范; 裕之田野; 澄笠井
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2022-12-12
Also published as: JPH07289296A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸結合用粒子担体に関し、さらに詳しくは遺伝子工学、クローニング、ゲノム核酸解析等の分野における特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出、特に生植物のゲノム核酸の解読に行われる制限酵素ランドマークの一次スクリーニングに有効な粒子担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一本鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして固定化された水不溶性固相担体と、プローブと相補的な塩基配列とを相補的な結合で結合させることによって形成される特定の制限酵素の認識部位を有する担体を用いて、標的核酸（またはその断片）を前記特定の制限酵素を用いた反応により結合させ、特定の塩基配列を抽出、分離する試みは以前から行われてきた。
従来の水不溶性固相担体にオリゴヌクレオチドを固定化する技術としては、例えばオリゴヌクレオチドの末端部位にアーム、スペーサー等の物質を介して水不溶性固相担体の表面に存在する所望の官能基に結合する方法、スペーサー等を介することなく、オリゴヌクレオチドの末端塩基を化学的に修飾することによって水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法、オリゴヌクレオチドの末端塩基をそのまま水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法等を挙げることができる（特開昭６１−１３０３０５号、特開昭６１−２４６２０１号、特開昭６３−２７０００号、特開平１−１７１４９９号、特開平３−１４７８００号、Ｃｅｌｌ５，３０１（１９７５）等）。しかしながら、いずれの場合においても一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を選択的に固相担体表面に固定化する技術であり、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。
また、一般に知られている化学反応あるいはビオチン／アビジン反応のような生化学的な反応も一本鎖オリゴヌクレオチドの固相表面への固定化には利用することができるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。そこで、それらの反応により固定化された一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体は、ハイブリタイゼーション法を用いた特定の核酸、プローブ核酸およびターゲット核酸の捕捉、検出等への利用に限られていた。
【０００３】
一方、一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化した固相担体を、特定の制限酵素によって処理した核酸断片の回収、接続あるいはＤＮＡ結合蛋白質との結合に用いる場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドに相補鎖をアニールし、前記特定の制限酵素の認識部位に形成させることが必要である。
そこで、例えば固定化された一本鎖オリゴヌクレオチドを一旦、相補鎖過剰の条件でアニーリングさせて固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し、さらにその末端に特定の制限酵素認識部位を形成させた後、余分な相補鎖を除去することによって調製される特定の制限酵素認識部位を末端にもつ二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体を用いて、前記制限酵素で切断されるＤＮＡ断片の分離、抽出に使用する方法が挙げられる（特開平３−１４７８００号）。
しかし上記方法において固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させるには過剰な相補鎖と長時間とを必要とし、また固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドの結合が数十ベース長の塩基による水素結合のみであるために、アニーリングの効率の悪さによって満足に制限酵素認識部位を末端に形成させられないという欠点がある。さらに、得られる固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドは保存安定性が悪く、二本鎖形成時の条件で保存しなければならず、使用上および保存上、効率的であるとはいえない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度よく行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部位を有するオリゴヌクレオチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、
（１）該粒子は、平均粒子径が０．１〜１０μｍ、該平均粒子径の標準偏差が１５％以下、かつ比重が０．９〜２ｇ／ｃｍ³であり、
（２）該オリゴヌクレオチドは、アニール後も常に一本鎖状態を維持する塩基数１〜７０の中央部Ａと互いに相補的な塩基数２〜１００の両側鎖ＢおよびＢ’とより構成される一本鎖オリゴヌクレオチドを、同一分子内および他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドであり、同一分子内でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドと他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドとの割合は０／１０〜９／１（モル数比）であり、かつ形成された二本鎖オリゴヌクレオチドの末端および必要に応じて相補鎖中に特定の制限酵素の認識部位を有し、
（３）該オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該オリゴヌクレオチドを構成する中央部Ａ内の塩基に少なくとも１つ以上存在する第１級アミノ基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結合により固定化されており、かつ
（４）該粒子担体表面には、該粒子担体１個当たり１〜１０⁵個の前記二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されている、
ことを特徴とする核酸結合用粒子担体、によって達成される。
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。これにより、本発明の目的、構成および効果がより明確になるであろう。
本発明に用いる粒子は、有機高分子を主成分とする水不溶性の粒子である。ここで主成分となる有機高分子としては、例えばスチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機高分子を挙げることができる。さらに他の有機高分子としてアガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体を挙げることができる。
これらの粒子は、乳化重合、懸濁重合、溶液沈澱重合等によって製造することができる。また、有機高分子を非溶媒中に分散し架橋したり、または溶媒を揮散させることなどによって該粒子を得ることができるが、粒子の製造方法はこれらに限定されるものではない。
【０００７】
なお、これらの粒子には必要に応じて粒子の内部、または表面に有機染料、顔料、蛍光色素を含有または被覆させてもよいし、無機物質からなる充填剤、例えばマグネタイト、ニッケル等の金属あるいは金属化合物のような磁性もしくは超常磁性を有する物質を含有させ、粒子を複合化させてもよい。
【０００８】
以上のようにして得られる粒子の表面は非多孔質であることが望ましい。ここで、粒子の表面が「非多孔質」であるとは、長径が０．０１μｍ以上である孔を粒子の表面に有しないことを意味する。粒子の表面が非多孔質でないと、すなわち、長径で０．０１μｍ以上である孔が粒子の表面に存在すると、核酸の検出法等で用いられる制限酵素切断末端をもつ核酸断片が粒子の内部に捕捉される等の原因により感度や精度の向上が望めない。なお、このように、粒子の表面は非多孔質であることが望ましいが、粒子の内部に独立気泡等が存在してもよい。
【０００９】
粒子の平均粒子径は０．１〜１０μｍであり、好ましくは０．３〜５μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満であると遠心分離等の簡便な操作で粒子を回収しにくくなり、一方１０μｍを超えると粒子の単位体積当たりの表面積が小さくなり、かつ核酸断片の分離、抽出等において適当な条件下で粒子が均一に分散する状態を保てなくなるために、高い分離率、抽出率等を達成できない恐れがある。
【００１０】
粒子の平均粒子径の標準偏差（ＣＶ値）は、１５％以下であることが必要であり、好ましくは１０％以下である。ＣＶ値が１５％を超えると核酸断片の分離、抽出等にバラつきが生じ再現性が乏しくなる。
また、粒子の比重は使用する条件によって異なるが、通常、０．９〜２ｇ／ｃｍ³であり、さらに好ましくは１〜１．５ｇ／ｃｍ³である。比重が前記範囲内であると特定の制限酵素による反応の間にも検査試料中での粒子担体の分散状態が均一に保たれ、また反応後の特定の制限酵素認識部位をもつ核酸断片と粒子担体とが結合した結合型と特定の制限酵素認識部位をもたない核酸断片とが結合していない型（遊離型）との分離（すなわちＢ／Ｆ分離）も容易に行うことができる。比重が０．９ｇ／ｃｍ³未満であったり、２ｇ／ｃｍ³を超えると検査試料中での粒子担体の分散性が悪くなる。
【００１１】
さらに、本発明において使用する粒子は、後述するようにオリゴヌクレオチド中の塩基のアミノ基とのアミド結合を形成させるために、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必要がある。もし粒子がその表面にカルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必要がある。カルボキシル基は粒子表面積１ｎｍ²当たり少なくとも１個存在することが好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。
このようなカルボキシル基を表面に有する前記有機高分子からなる粒子としては、例えばイムテックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０３２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１およびＬ０１０２；ならびにイムテックスＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３等の商品名（日本合成ゴム（株））で市販しているものが挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する粒子は酵素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの耐熱性を有している。また、カルボキシル基を有しない粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従来より知られている種々の方法を利用することができる。
【００１２】
次に本発明に用いるオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明に用いるオリゴヌクレオチドは中央部Ａと両側鎖ＢおよびＢ’により構成される。中央部Ａは粒子との固定化部位であり、塩基配列には相補性がないため、アニール後も常に一本鎖状態を維持する。中央部Ａは、中央部Ａ内の塩基に少なくとも１つ以上の第１級アミノ基を有し、かつその塩基数は１〜７０であり、より好ましくは５〜３５である。中央部Ａの塩基数が７０を超えるとオリゴヌクレオチドの合成効率が低下したりする恐れがある。
ここで第１級アミノ基を有する塩基としては、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）等を挙げることができるが、粒子表面にあるカルボキシル基との反応性が高い点でｄＡおよびｄＣが好ましい。中央部Ａの塩基配列は、１種の塩基で構成されていてもよいし、相補性を回避した２種以上の塩基で構成されていてもよいが、オリゴヌクレオチドをより効率的に粒子の表面に固定化するためには、１種の塩基、例えばｄＡあるいはｄＣのみを使用することが好ましい。
【００１３】
両側鎖ＢおよびＢ’はアニーリングにより二本鎖を形成するものであり、かつアニール後に得られる二本鎖オリゴヌクレオチドの末端および必要に応じて相補鎖中に特定の制限酵素の認識部位を形成するものである。また、必要に応じて、該二本鎖オリゴヌクレオチドに複数の同一または異なる制限酵素の認識部位をもたせてもよい。
両側鎖ＢおよびＢ’によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチドの制限酵素の認識部位は、塩基数の異なる接着末端型であってもよいし、塩基数の揃った平滑末端型であってもよい。さらにＤＮＡリガーゼ等の酵素反応によって二本鎖オリゴヌクレオチドの末端を延長して制限酵素の認識部位を導入してもよい。
なお、両側鎖ＢおよびＢ’の塩基数はそれぞれ２〜１００であり、好ましくは４〜７５、より好ましくは５〜５０である。塩基数が１であると二本鎖オリゴヌクレオチドの末端が制限酵素の認識部位を形成することができず、また、１００を超えるとオリゴヌクレオチド合成の効率が低下する恐れがある。
ここで、両側鎖ＢおよびＢ’の塩基数はまったく同一に揃える必要はなく、前述したような末端の制限酵素の認識部位の型によって同一塩基数であってもよいし、異なる塩基数であってもよい。
【００１４】
また、両側鎖ＢおよびＢ’により形成される二本鎖オリゴヌクレオチドは、同一分子内で形成されたもおよび他分子間で形成されたものである。同一分子内で形成された二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「分子内二本鎖」という。）は図１で模式的に表されるような形状を有し、他分子間で形成された二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「分子間二本鎖」という。）は図２で模式的に表されるような形状を有する。
なお、分子内二本鎖と分子間二本鎖との割合は、０／１０〜９／１であることが必要であり、好ましくは１／９〜８／２である。
二本鎖オリゴヌクレオチドの割合が前記範囲内であることによって固定化効率が高く、かつ二本鎖オリゴヌクレオチドの調整を容易に行うことができる。
ここで、分子内二本鎖のみを調製することはオリゴヌクレオチドの濃度を極度に低くしなければならない一方、固定化反応に使用するには濃度を高くしなければならず実用的でない。
【００１５】
二本鎖オリゴヌクレオチドによって形成される制限酵素の認識部位は、粒子１個当たり１〜１０⁵個であり、より好ましくは１０〜１０，０００個である。制限酵素の認識部位が１０⁵個を超えると粒子表面に存在するカルボキシル基の約５０％が固定化されるため粒子の分散安定性が著しく劣る傾向がある。
本発明に用いるオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成器を用いて容易に調製することができる。
【００１６】
以上のような中央部Ａおよび両側鎖ＢおよびＢ’から構成されるオリゴヌクレオチドはアニーリングによって中央部Ａが一本鎖状態、かつ両側鎖ＢおよびＢ’が二本鎖状態となる。アニール後のオリゴヌクレオチドは両側鎖ＢおよびＢ’の塩基配列中に存在する第１級アミノ基がアニーリングにより水素結合で束縛され、中央部Ａの塩基中にあるアミノ基のみがフリーな状態となるため、中央部Ａが特異的に粒子表面に固定化される。従って、前記オリゴヌクレオチドを用いればオリゴヌクレオチドの特定部位を特別な化学的修飾をすることなく、特異的に、かつ高い効率で粒子表面に固定化することができる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドを粒子に固定化させる方法としては、操作の簡便さ、固定化効率の高さおよび精度を考慮すると、粒子表面のカルボキシル基とオリゴヌクレオチド中の塩基のアミノ基とをアミド結合によって固定化させることが必要である。
上記固定化反応は、例えば適当な大きさの反応容器に粒子と、前記オリゴヌクレオチドとを仕込んだ後、１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）プロピルカルボジイミド等の水溶性カルボジイミドを添加することにより行うことができる。粒子の使用量は、オリゴヌクレオチド１ミリモル当たり、通常、０．５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常、ｐＨ３〜１１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。また、水溶性カルボジイミドの使用量は、使用する粒子の表面に存在するカルボキシル基１グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モルである。
【００１８】
上述のようにして得られる本発明の担体を用いて目的の特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片と結合させるとき、粒子担体は通常、水溶性媒体に分散させた状態で用いられる。この際の分散液の濃度は、通常、０．５〜２５重量％であり、より好ましくは１〜１５重量％である。粒子濃度が０．５重量％未満であると、特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片と効率的に結合することができず、２５重量％を超えると制限酵素が粒子表面に付着して有効に働かない。
【００１９】
本発明の粒子担体を実際に特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出等に用いる際に、粒子の表面に固定化されたオリゴヌクレオチドの両側鎖ＢおよびＢ’部分が一本鎖状態となっている場合には、アニーリングにより二本鎖状態に戻す必要がある。その際、分子内二本鎖が固定化されていた場合にはアニーリングにより再度分子内二本鎖を形成する確立が高いが、分子内二本鎖が固定化されていた場合にはアニーリングにより再度分子間二本鎖を形成する以外に新たに分子内二本鎖を形成しうるので、アニーリングの効率が良く好ましい。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例
（１）一本鎖オリゴヌクレオチドの調整
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社モデルＡＢＩ３８１Ａ型）を用いてβ−シアノエチルホスホアミド法で図３に示す塩基配列を有し、かつ両末端がアニーリングによってＮｏｔＩの認識部位を形成しうる一本鎖オリゴヌクレオチドａを１μＭスケールで合成した。
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドａを濃水酸化アンモニウム１０ｍｌで前記装置のカラムから切り出した後、５５℃で一夜放置した。次いで２０本のＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ社製）を用いて前記濃水酸化アンモニウムで切り出した一本鎖オリゴヌクレオチドａを０．５ｍｌずつ分取し、２０重量％のアセトニトリルで一本鎖オリゴヌクレオチドａを溶出した。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドａの溶出液から、エタノールで沈澱させることにより一本鎖オリゴヌクレオチドａを精製した。続いて精製した一本鎖オリゴヌクレオチドａ全量を５００μｌの滅菌水に溶解した後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量したところ、約５ｍｇの一本鎖オリゴヌクレオチドａが得られた。
【００２１】
（２）一本鎖オリゴヌクレオチドの末端リン酸化処理
（１）で合成した一本鎖オリゴヌクレオチドａを８８μｌ（３ｍｇ）、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）５００ユニットおよびアデノシン−５’三リン酸２ｎｍｏｌを混合し、１０倍プロトレーディンエンドキナーゼ緩衝液（東洋紡社製）５０μｌを加えてから滅菌蒸留水で５００μｌに調整した。
これを３７℃のウォーターバス中で２時間反応させた後、９５℃で３分間放置し、エタノールを用いて沈澱、精製した。続いて、精製した末端リン酸化処理された一本鎖オリゴヌクレオチドａ１ｍｇをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）５００μｌに溶解した。
【００２２】
（３）二本鎖オリゴヌクレオチドの形成
（２）で得られた末端リン酸化処理した一本鎖オリゴヌクレオチドａを６ｎｍｏｌ採取し、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、１０倍アニーリング溶液（１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）、６０ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液）を１０μｌ加え、滅菌蒸留水で１００ｍｌに調整した。
これを８０℃のウォーターバスにて１０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時間４時間）。この反応により一本鎖オリゴヌクレオチドａ中の両側鎖ＢおよびＢ’が分子内二本鎖および分子間二本鎖となり、それぞれの末端に制限酵素ＮｏｔＩの認識部位が形成された。
【００２３】
（４）分子内二本鎖および分子間二本鎖の割合
２０％ポリアクリルアミドゲルを８．５％の過硫酸アンモニウムとＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリスホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡおよび８９ｍＭホウ酸からなる緩衝液）で調製した（村松正實，ラボマニュアル遺伝子工学，２２−２４）。このゲル溶液をスラブゲル用泳動板に組み立て、（３）で得られた二本鎖オリゴヌクレオチド３μｌを６倍のＢＰＢ色素およびＸＣ色素（タカラ社製）とともに２０Ｖの定電圧で４０分間泳動させた。次いで０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド液をゲルにかけ、３０分間放置した後、紫外線照射下で二本鎖オリゴヌクレオチドのバンドを観察した。その結果、３７塩基（分子内二本鎖）に対応するＢＰＢ色素のバンドと、７４塩基（分子間二本鎖）に対応するＸＣ色素のバンドの発色光はほぼ同じ強度であった。
次いで、上記の３７塩基および７４塩基に対応するバンドの前後をカッターで切断し、ＷｈａｔｍａｎＤＥ８１ペーパーを入れ、上記と同様の条件で電気泳動させた。２つのバンドに完全に吸着させた２つの上記ペーパーを取り出してそれぞれを底に穴のある２本の２００ｍｌのチューブにいれてから別々の１．５ｍｌのチューブに入れた。これに１００μｌのＴＥ緩衝液／１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えてから１５，０００ｒｐｍで５分間遠心洗浄し、さらに１００μｌのＴＥ緩衝液／１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、遠心した。この操作を３回繰り返した後、ＴＥ緩衝液／ＮａＣｌ溶液を１００μｌ加え、５分間静置してから、５００ｒｐｍで２分間遠心洗浄した。この操作を３回繰り返し、それぞれのチューブに回収された６００μｌの溶液をフェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を各１回行ってからエタノール沈澱させたところ、３７塩基長のオリゴヌクレオチドが０．９１μｇおよび７４塩基長のオリゴヌクレオチドが０．８４μｇ得られていた。この結果から分子内二本鎖と分子間二本鎖との割合がほぼ１．０８：１であることが確認された。
【００２４】
（５）二本鎖オリゴヌクレオチドの粒子への固定化
平均粒子径が１．０μｍ、平均粒子径の標準偏差が５％、かつ粒子表面積１ｎｍ²当たり５個のカルボキシル基を有するポリスチレン粒子イムノテックスＬ０１０１（日本合成ゴム（株）製）の１０（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（３）で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを４ｎｍｏｌおよび１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０．５（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸溶液５００μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより二本鎖オリゴヌクレオチド中の中央部Ａのｄｃ塩基の塩基配列のアミノ基と粒子表面のカルボキシル基とをアミド結合させた。
その後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してオリゴヌクレオチド固定化粒子を沈澱として回収した。次に結合用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１（Ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）をオリゴヌクレオチド固定化粒子に１ｍｌ添加し再分散させた後、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、オリゴヌクレオチドが固定化された粒子を回収した。この操作を３回繰り返して最終的にオリゴヌクレオチドが固定化された粒子をＴＥ緩衝液１ｍｌ（固形分１０（Ｗ／Ｖ）％）に分散した（以下、「分散液ａ」という。）。
【００２５】
（６）ＮｏｔＩ末端をもつ核酸断片の調整
プラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）（ｐＢＳII 東洋紡社製）７５μｇ（約３８μＭ）、ＮｏｔＩ（１０ユニット／μｌ）２００ユニット、１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌ（いずれもタカラ社製）および滅菌蒸留水２９４μｌを混合し、３７℃にて３時間反応させた。反応終了後、反応混合液と等量のＰ．Ｃ．Ｉ（フェノール：クロロホルム：イソアミノアルコール＝２５：２４：１（容量比））溶液を加えて充分に混和し、１５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上部の水層を回収した。回収した水層に８Ｍアンモニウムアセテート１００μｌを加えて充分に混合をし、次いで１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離してＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）をＴＥ緩衝液２０μｌに分散させた。
【００２６】
（７）³²Ｐによる標識
（６）で調整したＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）のＴＥ緩衝液にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８ユニット）、α−³²Ｐシトシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水１９μｌを加えて混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
次に反応液からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（”Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratories,1982,458）によって除去した後、反応液をＴＥ緩衝液で膨潤させたセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。
組成；０．５Ｍトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．６
０．１Ｍ塩化マグネシウム
５０ｍＭジチオスレイトール
１ｍＭスペルミジン
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各画分の放射線量をチェレンコフカウント法によって測定して素通り画分を判別し集めた。
この結果、³²Ｐによって標識したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）のＮｏｔＩ消化物のＴＥ緩衝液（以下、「ＴＥ緩衝液Ｉ」という。）２０μｌが得られた。
【００２８】
（８）ＳｃａＩによる消化
（７）で得られたＴＥ緩衝液ＩにＳｃａＩ（１００／μｌ、タカラ社製）および１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌを加え、滅菌水で４００μｌに調製してから３７℃で３時間反応させた。反応終了後、等量のＰ．Ｃ．Ｉ溶液を加えて充分に混合し、次いで１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上部の水層を回収した。
回収した水層に８Ｍアンモニアアセテート１００μｌおよびエタノール８００μｌを加えて充分に混合してから１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の断片を１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。（７）と同様にしてチェレンコフ−カウント法によって放射線量を測定したところ、１μｌ当たり４０，０００ｒｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。また、プラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の断片の濃度は０．３０ｐｍｏｌ／μｌ、ＮｏｔＩ末端サイトは０．６ｐｍｏｌｅ／μｌであった。
【００２９】
（９）ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の断片の捕獲および分離の評価
（５）で得られた分散液ａを１０μｌずつＡ−１〜Ａ−５までの５本の遠心管に入れた。（８）で調製したＮｏｔＩおよびＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の断片を１、２、４、６、６ｐｍｏｌとなるようにＡ−１からＡ−５まで５本の遠心管に加えた。それら５本の遠心管にそれぞれ１０倍のライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、６６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液）５μｌ、５０ｍＭ５’−アデノシン三リン酸５μｌ、５０％ポリエチレングリコール５μｌおよび３Ｍ塩化ナトリウム５μｌを加えた。そしてＡ−１からＡ−４までの遠心管にＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ社製、３５０ユニット／μｌ）５μｌを加えた後、Ａ−１からＡ−５までの５本の遠心管に滅菌蒸留水を加えて５０μｌに調製した後、１７℃にて１２時間反応させた。反応終了後、５本の遠心管のチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のトータルカウントとした。
また、上記反応終了後、５本の遠心管にＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液）１０００μｌずつを加え、反応を停止させた。次いで５本の遠心管を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ＴＥ緩衝液５０μｌに分散してチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のカウント２とした。
次いで、５本の遠心管にＮｏｔＩ（１００ユニット／μｌ）４０ユニットおよび１０倍ＨＢ緩衝液１０μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌに調製し、３７℃で３時間反応させた。続いて１０，０００ｒｐｍで５分間遠心洗浄し、沈澱物をＴＥ緩衝液／０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回遠心洗浄した後、ＴＥ緩衝液で５０μｌに再分散したもののチェレンコフカウントを測定し、これらをカウント３とした。
ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の捕獲率および分離率を次式により算出し、表１に示した。
【００３０】
【数１】

【００３１】
【数２】

【００３２】
【表１】

【００３３】
【本発明の効果】
本発明によれば特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度良く行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】分子内二本鎖の形状を示す図である。
【図２】分子間二本鎖の形状を示す図である。
【図３】一本鎖オリゴヌクレオチドａの塩基配列を説明する図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a particle carrier for nucleic acid binding, and more specifically, separation or extraction of a nucleic acid fragment having a specific restriction enzyme cleavage end in the fields of genetic engineering, cloning, genomic nucleic acid analysis, or the like, separation or extraction of a DNA binding protein, In particular, the present invention relates to a particle carrier that is effective for primary screening of restriction enzyme landmarks used in the decoding of genomic nucleic acids of living plants.
[0002]
[Prior art]
A carrier having a specific restriction enzyme recognition site formed by binding a water-insoluble solid phase carrier in which a single-stranded oligonucleotide is immobilized as a probe and a base sequence complementary to the probe through a complementary bond. Attempts to extract and isolate a specific base sequence by binding a target nucleic acid (or a fragment thereof) by a reaction using the specific restriction enzyme using the above have been performed.
As a technique for immobilizing oligonucleotides on a conventional water-insoluble solid phase carrier, for example, binding to a desired functional group present on the surface of the water-insoluble solid phase carrier via a substance such as an arm or a spacer at the terminal site of the oligonucleotide. A method of binding to a functional group on the surface of a water-insoluble solid phase carrier by chemically modifying the terminal base of the oligonucleotide without using a spacer or the like, a water-insoluble solid phase carrier as it is And the like (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-130305, Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-246201, Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-27000, Japanese Unexamined Patent Publication No. 1-1171499, Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 3). -147800, Cell 5,301 (1975), etc.). However, in either case, this is a technique for selectively immobilizing the ends of single-stranded oligonucleotides on the surface of a solid support, and cannot be used for immobilizing double-stranded oligonucleotides.
In addition, generally known chemical reactions or biochemical reactions such as biotin / avidin reaction can be used to immobilize single-stranded oligonucleotides on the solid surface. It cannot be used for immobilization. Therefore, the carrier on which the single-stranded oligonucleotides immobilized by those reactions are immobilized is limited to use for capture, detection, etc. of specific nucleic acids, probe nucleic acids and target nucleic acids using the hybridization method. It was.
[0003]
On the other hand, when the solid phase carrier on which the single-stranded oligonucleotide is immobilized is used for recovering, connecting or binding to a DNA-binding protein of a nucleic acid fragment treated with a specific restriction enzyme, it is complementary to the single-stranded oligonucleotide. Must be annealed to form a recognition site for the specific restriction enzyme.
Therefore, for example, an immobilized single-stranded oligonucleotide is annealed once under the condition of excess complementary strand to form an immobilized double-stranded oligonucleotide, and a specific restriction enzyme recognition site is formed at the end. Thereafter, a DNA fragment to be cleaved by the restriction enzyme is prepared using a carrier on which a double-stranded oligonucleotide having a specific restriction enzyme recognition site terminal is prepared by removing an extra complementary strand. Examples include methods used for separation and extraction (Japanese Patent Laid-Open No. 3-147800).
However, in order to form an immobilized double-stranded oligonucleotide in the above method, an excessive complementary strand and a long time are required, and the binding of the immobilized double-stranded oligonucleotide is caused by a base having a length of several tens of bases. Since there are only hydrogen bonds, there is a drawback that a restriction enzyme recognition site cannot be satisfactorily formed at the terminal due to inefficient annealing. Furthermore, the obtained immobilized double-stranded oligonucleotide has poor storage stability and must be stored under the conditions at the time of double-strand formation, which is not efficient in use and storage.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to have a specific restriction enzyme recognition site capable of easily and accurately performing separation and extraction of a nucleic acid fragment having a specific restriction enzyme cleavage end or separation and extraction of a DNA-binding protein. An object of the present invention is to provide a particle carrier on which a double-stranded oligonucleotide is immobilized.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The subject is a particle carrier for binding nucleic acid, in which an oligonucleotide having a recognition site for a specific restriction enzyme is immobilized on the surface of a particle mainly composed of an organic polymer,
(1) The particles have an average particle size of 0.1 to 10 μm, a standard deviation of the average particle size of 15% or less, and a specific gravity of 0.9 to 2 g / cm. ^Three And
(2) The oligonucleotide is composed of a central part A having 1 to 70 bases that always maintains a single-stranded state even after annealing, and both side chains B and B ′ having 2 to 100 bases complementary to each other. A double-stranded oligonucleotide formed by annealing a single-stranded oligonucleotide within the same molecule and between other molecules, and between a double-stranded oligonucleotide and another molecule formed by annealing within the same molecule The ratio of the double-stranded oligonucleotide formed by annealing with 0/10 to 9/1 (molar ratio), and the end of the formed double-stranded oligonucleotide and, if necessary, the complementary strand Has a specific restriction enzyme recognition site in it,
(3) The oligonucleotide and the particle are formed by an amide bond between at least one primary amino group present in the base in the central part A constituting the oligonucleotide and a carboxyl group present on the particle surface. Is fixed, and
(4) The surface of the particle carrier is 1 to 10 per particle carrier. ^Five The double-stranded oligonucleotides are immobilized,
This is achieved by a particle carrier for nucleic acid binding characterized in that.
[0006]
The present invention is described in detail below. This will make the purpose, configuration and effect of the present invention clearer.
The particles used in the present invention are water-insoluble particles whose main component is an organic polymer. Examples of the organic polymer as the main component include styrene, chlorostyrene, chloromethylstyrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, sodium styrenesulfonate, (meth) acrylic acid, methyl (meth) acrylate, (meth ) Ethyl acrylate, (meth) acrylic acid-n-butyl, (meth) acrylic acid-2-hydroxyethyl, (meth) acrylic acid polyoxyethylene, (meth) acrylic acid glycidyl, ethylene glycol di- (meth) Acrylic acid ester, (meth) acrylic acid tribromophenyl, (meth) acrylonitrile, (meth) acrolein, (meth) acrylamide, methylenebis (meth) acrylamide, butadiene, isoprene, vinyl acetate, vinylpyridine, N-vinylpyrrolidone, chloride Vinyl, vinyl bromide A vinyl-based unit comprising an aromatic vinyl compound such as α, β-unsaturated carboxylic acid esters or amides, an α, β-unsaturated nitrile compound, a vinyl halide compound, a conjugated diene compound, and a lower fatty acid vinyl ester. Mention may be made of water-insoluble organic polymers obtained by polymerizing one or more monomers. Still other organic polymers include cross-linked products of polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose and carboxymethylcellulose, and cross-linked products of proteins such as methylated albumin, gelatin, collagen and casein.
These particles can be produced by emulsion polymerization, suspension polymerization, solution precipitation polymerization or the like. Further, the particles can be obtained by dispersing and crosslinking the organic polymer in a non-solvent or volatilizing the solvent, but the method for producing the particles is not limited to these.
[0007]
These particles may contain or coat organic dyes, pigments, fluorescent dyes on the inside or the surface of the particles as necessary, or fillers made of inorganic substances such as metals such as magnetite and nickel, A particle having a magnetic property or superparamagnetism such as a metal compound may be contained and the particles may be combined.
[0008]
The surface of the particles obtained as described above is desirably non-porous. Here, the particle surface being “non-porous” means that the particle surface does not have pores having a major axis of 0.01 μm or more. If the surface of the particle is not non-porous, that is, if a pore having a long diameter of 0.01 μm or more is present on the surface of the particle, a nucleic acid fragment having a restriction enzyme cleavage end used in a nucleic acid detection method or the like is present in the particle Sensitivity and accuracy cannot be improved due to the cause of being captured. As described above, the surface of the particles is preferably non-porous, but closed cells may exist inside the particles.
[0009]
The average particle diameter of the particles is 0.1 to 10 μm, preferably 0.3 to 5 μm. When the average particle size is less than 0.1 μm, it becomes difficult to collect the particles by a simple operation such as centrifugation. On the other hand, when the average particle size exceeds 10 μm, the surface area per unit volume of the particles is reduced, and nucleic acid fragments are separated and extracted. In this case, the particles cannot be uniformly dispersed under appropriate conditions, so that a high separation rate and extraction rate may not be achieved.
[0010]
The standard deviation (CV value) of the average particle diameter of the particles needs to be 15% or less, preferably 10% or less. If the CV value exceeds 15%, the nucleic acid fragments will be separated and extracted, resulting in poor reproducibility.
The specific gravity of the particles varies depending on the conditions to be used, but is usually 0.9-2 g / cm. ^Three And more preferably 1 to 1.5 g / cm. ^Three It is. When the specific gravity is within the above range, the dispersion state of the particle carrier in the test sample is kept uniform during the reaction with the specific restriction enzyme, and the nucleic acid fragments and particles having the specific restriction enzyme recognition site after the reaction Separation (that is, B / F separation) between a bound type bound to a carrier and a type not bound to a nucleic acid fragment not having a specific restriction enzyme recognition site (free type) can be easily performed. Specific gravity is 0.9g / cm ^Three Less than 2g / cm ^Three If it exceeds 1, the dispersibility of the particle carrier in the test sample will deteriorate.
[0011]
Furthermore, in order to form an amide bond with the amino group of the base in the oligonucleotide as described later, the particle used in the present invention needs to have a carboxyl group involved in the formation of the amide bond on the surface. If the particle does not have a carboxyl group on its surface, it is necessary to introduce a carboxyl group on the surface in advance. Carboxyl group has a particle surface area of 1 nm ² It is preferable that there is at least one per, more preferably 3 or more, and still more preferably 5 or more.
Examples of the particles made of the organic polymer having a carboxyl group on the surface thereof include IMTX SSM-60, SSM-58, SSM-57, G0101, G0303, G03032, G0301, G0201, G0202, G0501, L0101, and L0102. And those commercially available under trade names (Nippon Synthetic Rubber Co., Ltd.) such as Imtex DRB-F1, DRB-F2, and DRB-F3. The particles having a carboxyl group on the surface can be used without hindrance to the enzyme reaction and have heat resistance up to 100 ° C. In order to introduce a carboxyl group into the surface of a particle having no carboxyl group, various conventionally known methods can be used.
[0012]
Next, the oligonucleotide used for this invention is demonstrated.
The oligonucleotide used in the present invention comprises a central part A and both side chains B and B ′. The central part A is an immobilization site with the particle, and since the base sequence has no complementarity, it always maintains a single-stranded state even after annealing. The central part A has at least one or more primary amino groups in the base in the central part A, and the number of bases is 1 to 70, more preferably 5 to 35. If the number of bases in the central part A exceeds 70, the synthesis efficiency of the oligonucleotide may be lowered.
Examples of the base having a primary amino group include deoxyadenylic acid (dA), deoxycytidylic acid (dC), deoxyguanylic acid (dG), and the like. DA and dC are preferred because of their high reactivity. The base sequence of the central part A may be composed of one kind of base or may be composed of two or more kinds of bases avoiding complementarity. It is preferable to use only one kind of base, for example, dA or dC.
[0013]
Both strands B and B ′ form a double strand by annealing, and form a recognition site for a specific restriction enzyme in the end of the double-stranded oligonucleotide obtained after annealing and, if necessary, in the complementary strand Is. Further, if necessary, the double-stranded oligonucleotide may be provided with a plurality of recognition sites for the same or different restriction enzymes.
The recognition site of the restriction enzyme of the double-stranded oligonucleotide formed by both side strands B and B ′ may be an adhesive terminal type having a different number of bases or a blunt end type having a uniform number of bases. . Furthermore, a restriction enzyme recognition site may be introduced by extending the end of the double-stranded oligonucleotide by an enzymatic reaction such as DNA ligase.
In addition, the base number of both side chains B and B ′ is 2 to 100, preferably 4 to 75, more preferably 5 to 50. If the number of bases is 1, the end of the double-stranded oligonucleotide cannot form a restriction enzyme recognition site, and if it exceeds 100, the efficiency of oligonucleotide synthesis may be reduced.
Here, the number of bases of both side chains B and B ′ need not be exactly the same, and may be the same or different depending on the type of the recognition site of the restriction enzyme at the end as described above. May be.
[0014]
Further, the double-stranded oligonucleotide formed by both side chains B and B ′ is formed in the same molecule and between other molecules. A double-stranded oligonucleotide formed in the same molecule (hereinafter referred to as “intramolecular double-stranded”) has a shape schematically represented in FIG. A double-stranded oligonucleotide (hereinafter referred to as “intermolecular double-stranded”) has a shape schematically represented in FIG.
In addition, the ratio between the intramolecular duplex and the intermolecular duplex is required to be 0/10 to 9/1, and preferably 1/9 to 8/2.
When the ratio of the double-stranded oligonucleotide is within the above range, the immobilization efficiency is high and the double-stranded oligonucleotide can be easily adjusted.
Here, preparing only the intramolecular double strand requires that the concentration of the oligonucleotide be extremely low, while it is not practical to use in the immobilization reaction because the concentration must be increased.
[0015]
The restriction enzyme recognition sites formed by the double-stranded oligonucleotide are 1-10 per particle. ^Five The number is more preferably 10 to 10,000. 10 restriction enzyme recognition sites ^Five If the number of particles exceeds the number, about 50% of the carboxyl groups present on the particle surface are fixed, and the dispersion stability of the particles tends to be extremely inferior.
The oligonucleotide used in the present invention can be easily prepared using a commercially available DNA synthesizer.
[0016]
The oligonucleotide composed of the central part A and both side chains B and B ′ as described above is annealed so that the central part A is in a single-stranded state and both side chains B and B ′ are in a double-stranded state. In the annealed oligonucleotide, the primary amino group present in the base sequences of both side chains B and B ′ is bound by hydrogen bonding by annealing, and only the amino group in the base at the center A is free. Therefore, the central portion A is specifically immobilized on the particle surface. Therefore, if the oligonucleotide is used, a specific site of the oligonucleotide can be specifically and efficiently immobilized on the particle surface without any special chemical modification.
[0017]
As a method for immobilizing oligonucleotides to particles, considering the ease of operation, high immobilization efficiency, and accuracy, the carboxyl group on the particle surface and the amino group of the base in the oligonucleotide are immobilized by amide bonds. It is necessary to make it.
In the immobilization reaction, for example, particles and the oligonucleotide are charged into a reaction vessel having an appropriate size, and then a water-soluble carbodiimide such as 1-ethyl-3- (N, N-diethylamino) propylcarbodiimide is added. Can be done. The amount of particles used is usually 0.5 to 500 g, preferably 5 to 50 g, per mmol of oligonucleotide. The above reaction may be usually performed in an aqueous medium having a pH of about 3 to 11, for example, in water at 4 to 70 ° C. for 5 minutes to overnight. Moreover, the usage-amount of water-soluble carbodiimide is 1-20 mol normally with respect to 1 gram equivalent of the carboxyl group which exists in the surface of the particle | grains to be used, Preferably it is 2-10 mol.
[0018]
When the carrier of the present invention obtained as described above is used to bind to a nucleic acid fragment having a target specific restriction enzyme cleavage end, the particle carrier is usually used in a state of being dispersed in an aqueous medium. The concentration of the dispersion at this time is usually 0.5 to 25% by weight, more preferably 1 to 15% by weight. When the particle concentration is less than 0.5% by weight, it cannot efficiently bind to a nucleic acid fragment having a specific restriction enzyme cleavage end. When the particle concentration exceeds 25% by weight, the restriction enzyme adheres to the particle surface. Does not work effectively.
[0019]
When the particle carrier of the present invention is actually used for separation, extraction or the like of a nucleic acid fragment having a specific restriction enzyme cleavage end, one side chain B and B ′ portion of the oligonucleotide immobilized on the surface of the particle is one. If it is in a chain state, it must be returned to a double-stranded state by annealing. At that time, if the intramolecular duplex has been immobilized, there is a high probability of forming an intramolecular duplex again by annealing, but if the intramolecular duplex has been immobilized, it will be re-established by annealing. Since an intramolecular duplex can be newly formed in addition to forming an intermolecular duplex, the efficiency of annealing is good and preferable.
[0020]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example
(1) Preparation of single-stranded oligonucleotide
A single-stranded oligo having the base sequence shown in FIG. 3 by the β-cyanoethylphosphoamide method using a DNA synthesizer (Applied Biosystems model ABI381A type) and having both ends capable of forming a NotI recognition site by annealing. Nucleotide a was synthesized on a 1 μM scale.
The synthesized single-stranded oligonucleotide a was cut out from the column of the apparatus with 10 ml of concentrated ammonium hydroxide and then left overnight at 55 ° C. Next, using a 20 OPC cartridge (ABI), 0.5 ml each of the single-stranded oligonucleotide a cut out with the concentrated ammonium hydroxide was fractionated, and the single-stranded oligonucleotide a was washed with 20% by weight of acetonitrile. Eluted. From the eluate of the obtained single-stranded oligonucleotide a, the single-stranded oligonucleotide a was purified by precipitation with ethanol. Subsequently, the entire amount of the purified single-stranded oligonucleotide a was dissolved in 500 μl of sterilized water, and the absorbance at 260 nm was measured and quantified. As a result, about 5 mg of single-stranded oligonucleotide a was obtained.
[0021]
(2) Terminal phosphorylation treatment of single-stranded oligonucleotides
88 μl (3 mg) of the single-stranded oligonucleotide a synthesized in (1), 500 units of polynucleotide kinase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and 2 nmol of adenosine-5 ′ triphosphate were mixed, and 10-fold protradined endokinase buffer solution (Toyobo Co., Ltd.) 50 μl was added and adjusted to 500 μl with sterile distilled water.
This was reacted in a water bath at 37 ° C. for 2 hours, then allowed to stand at 95 ° C. for 3 minutes, precipitated and purified using ethanol. Subsequently, 1 mg of purified terminal-phosphorylated single-stranded oligonucleotide a1 mg was dissolved in 500 μl of TE buffer (buffer consisting of 10 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8) and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid).
[0022]
(3) Formation of double-stranded oligonucleotide
6 nmol of the single-stranded oligonucleotide a subjected to terminal phosphorylation treatment obtained in (2) was collected, put into a 2 ml Eppendorf tube, 10-fold annealing solution (100 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8), 60 mM magnesium chloride, 60 mM β) -10 μl of a buffer solution consisting of mercaptoethanol and 500 mM sodium chloride) was added and adjusted to 100 ml with sterile distilled water.
This was heated in a water bath at 80 ° C. for 10 minutes and then allowed to stand until it reached room temperature (required time 4 hours). By this reaction, both side strands B and B ′ in the single-stranded oligonucleotide a became an intramolecular double strand and an intermolecular double strand, and a restriction enzyme NotI recognition site was formed at each end.
[0023]
(4) Ratio of intramolecular duplex and intermolecular duplex
A 20% polyacrylamide gel was prepared with 8.5% ammonium persulfate and TBE buffer (buffer consisting of 89 mM trisboric acid, 2 mM EDTA and 89 mM boric acid) (Masamatsu Masaki, Laboratory Manual Genetic Engineering, 22-24) . This gel solution was assembled on a slab gel electrophoresis plate, and 3 μl of the double-stranded oligonucleotide obtained in (3) was electrophoresed with 6 times BPB dye and XC dye (manufactured by Takara) at a constant voltage of 20 V for 40 minutes. Subsequently, 0.5 μg / ml ethidium bromide solution was applied to the gel, allowed to stand for 30 minutes, and then a double-stranded oligonucleotide band was observed under ultraviolet irradiation. As a result, the BPB dye band corresponding to 37 bases (intramolecular double strands) and the XC dye band corresponding to 74 bases (intermolecular double strands) had almost the same intensity.
Next, the bands corresponding to the 37 base and 74 base were cut with a cutter, and Whatman DE81 paper was added, followed by electrophoresis under the same conditions as described above. The two papers, which were completely adsorbed on the two bands, were taken out and placed in two 200 ml tubes with holes in the bottom and then put into separate 1.5 ml tubes. To this, 100 μl of TE buffer / 1M sodium chloride solution was added and then washed by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes, and further 100 μl of TE buffer / 1M sodium chloride solution was added and centrifuged. After repeating this operation three times, 100 μl of TE buffer / NaCl solution was added and allowed to stand for 5 minutes, followed by centrifugal washing at 500 rpm for 2 minutes. This operation was repeated three times, and 600 μl of the solution recovered in each tube was subjected to phenol / chloroform extraction and chloroform extraction once, followed by ethanol precipitation. 0.84 μg of oligonucleotide having a base length was obtained. From this result, it was confirmed that the ratio of intramolecular duplex and intermolecular duplex was approximately 1.08: 1.
[0024]
(5) Immobilization of double-stranded oligonucleotide on particle
The average particle size is 1.0 μm, the standard deviation of the average particle size is 5%, and the particle surface area is 1 nm. ² Double chain obtained by 1000 μl of 10 (W / V)% 0.1 mN hydrochloric acid suspension of polystyrene particle Immunotex L0101 (manufactured by Nippon Synthetic Rubber Co., Ltd.) having 5 carboxyl groups per unit (3) 4 nmol of oligonucleotide and 500 μl of 0.5 (W / V)% 0.1 mN hydrochloric acid solution of 1-ethyl-3- (N, N′-dimethylamino) propylcarbodiimide were placed in an Eppendorf centrifuge tube and set at 10 ° C. By mixing overnight in a thermostatic bath, the amino group of the base sequence of the dc base at the center A in the double-stranded oligonucleotide and the carboxyl group on the particle surface were amide-bonded.
Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes to collect the oligonucleotide-immobilized particles as a precipitate. Next, 1 ml of binding buffer (10 mM Tris hydrochloride buffer, pH 8, 500 mM sodium chloride, 0.1 (W / v)% sodium dodecyl sulfate and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid) was added to the oligonucleotide-immobilized particles. After addition and redispersion, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes, and the oligonucleotide-immobilized particles were collected. This operation was repeated three times to finally disperse the particles on which the oligonucleotide was immobilized in 1 ml of TE buffer (solid content: 10 (W / V)%) (hereinafter referred to as “dispersion a”).
[0025]
(6) Preparation of nucleic acid fragment having NotI end
Plasmid BluescriptII SK (+) (pBSII manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 75 μg (about 38 μM), NotI (10 units / μl) 200 units, 10 × HB buffer 40 μl (both manufactured by Takara) and 294 μl of sterile distilled water were mixed, The reaction was carried out at 37 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, an equivalent amount of P.I. C. An I (phenol: chloroform: isoaminoalcohol = 25: 24: 1 (volume ratio)) solution was added and mixed well, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, and then the upper aqueous layer was recovered. 100 μl of 8M ammonium acetate was added to the recovered aqueous layer and mixed well, and then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to disperse NotI digested plasmid BluescriptII SK (+) in 20 μl of TE buffer.
[0026]
(7) ³² Marking with P
In a TE buffer solution of plasmid BluescriptII SK (+) digested with NotI prepared in (6), 1 μl of T4 polynucleotide kinase (manufactured by Boehringerheim) (8 units in terms of enzyme activity), α- ³² 5 μl of P cytosine triphosphate (50 μCi in terms of radiation dose), 5 μl of 10 × concentration of 5′-phosphorylation buffer and 19 μl of sterilized water were added, mixed, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
Next, after removing T4 polynucleotide kinase from the reaction solution by a phenol extraction method (“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, 458), Sephadex G-50 (Pharmacia) obtained by swelling the reaction solution with a TE buffer solution. The product was subjected to gel filtration using a column (1 ml).
The 10-fold concentration buffer for 5′-phosphorylation used above has the following composition.
Composition; 0.5M Tris hydrochloride buffer, pH 7.6
0.1M magnesium chloride
50 mM dithiothreitol
1 mM spermidine
1 mM ethylenediaminetetraacetic acid
100 μl of the eluate by gel filtration was collected in order, and the radiation dose of each fraction was measured by the Cherenkov count method to identify and collect the passing fraction.
As a result, ³² 20 μl of TE buffer solution (hereinafter referred to as “TE buffer solution I”) of NotI digest of plasmid BluescriptII SK (+) labeled with P was obtained.
[0028]
(8) Digestion with ScaI
ScaI (100 / μl, manufactured by Takara) and 40 μl of 10-fold HB buffer were added to TE buffer I obtained in (7), adjusted to 400 μl with sterilized water, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, an equal amount of P.I. C. The solution I was added and mixed well, then centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to recover the upper aqueous layer.
100 μl of 8M ammonia acetate and 800 μl of ethanol were added to the recovered aqueous layer and mixed well, then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the fragment of plasmid BluescriptII SK (+) digested with ScaI was added to 100 μl of TE buffer. Dissolved. When the radiation dose was measured by the Cherenkov-Count method in the same manner as in (7), it was a solution having a radiation dose of 40,000 rpm per μl. Further, the concentration of the fragment of plasmid BluescriptII SK (+) was 0.30 pmol / μl, and the NotI terminal site was 0.6 pmol / μl.
[0029]
(9) Evaluation of capture and separation of fragments of plasmid BluescriptII SK (+) digested with NotI
10 μl of the dispersion a obtained in (5) was put in five centrifuge tubes A-1 to A-5. The fragments of plasmid BluescriptII SK (+) digested with NotI and ScaI prepared in (8) were added to five centrifuge tubes from A-1 to A-5 so as to be 1, 2, 4, 6, 6 pmol. . In each of these five centrifuge tubes, 10 μl of ligation buffer (660 mM Tris-HCl buffer (pH 8), 66 mM magnesium chloride and 100 mM DTT) 5 μl, 50 mM 5′-adenosine triphosphate 5 μl, 50% 5 μl of polyethylene glycol and 5 μl of 3M sodium chloride were added. After adding 5 μl of T4 DNA ligase (Takara, 350 units / μl) to the centrifuge tubes from A-1 to A-4, sterilized distilled water was added to the 5 centrifuge tubes from A-1 to A-5. In addition, the mixture was adjusted to 50 μl and reacted at 17 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, the Cherenkov counts of 5 centrifuge tubes were measured, and each was used as the total count of each centrifuge tube.
After completion of the above reaction, 1000 μl of SM buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.01% gelatin, 100 mM sodium chloride and 10 mM magnesium chloride) was added to each of five centrifuge tubes. The reaction was stopped. Subsequently, the five centrifuge tubes were centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed, and then dispersed in 50 μl of TE buffer, and the Cherenkov count was measured. Each was counted as 2 in each centrifuge tube.
Subsequently, 40 units of NotI (100 units / μl) and 10 μl of 10-fold HB buffer were added to 5 centrifuge tubes, adjusted to 100 μl with sterile distilled water, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. Subsequently, it was centrifuged and washed at 10,000 rpm for 5 minutes, and the precipitate was centrifuged and washed three times with TE buffer / 0.25M sodium chloride solution, and then re-dispersed in 50 μl with TE buffer, and the Cherenkov count was measured. Was counted 3.
The capture rate and separation rate of the plasmid BluescriptII SK (+) digested with NotI were calculated according to the following equations and are shown in Table 1.
[0030]
[Expression 1]

[0031]
[Expression 2]

[0032]
[Table 1]

[0033]
[Effect of the present invention]
According to the present invention, two nucleic acids having specific restriction enzyme recognition sites that can be easily and accurately separated and extracted from nucleic acid fragments having specific restriction enzyme cleavage ends or DNA binding proteins. A particle carrier having a strand oligonucleotide immobilized thereon is obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the shape of an intramolecular double strand.
FIG. 2 is a diagram showing the shape of an intermolecular double strand.
FIG. 3 is a diagram for explaining the base sequence of a single-stranded oligonucleotide a.

Claims

A particle carrier for nucleic acid binding in which an oligonucleotide having a recognition site for a specific restriction enzyme is immobilized on the surface of a particle mainly composed of an organic polymer, (1) the particle has an average particle size of 0 0.1 to 10 μm, the standard deviation of the average particle diameter is 15% or less, and the specific gravity is 0.9 to 2 g / cm ³ .
(2) The oligonucleotide is composed of a central part A having 1 to 70 bases that always maintains a single-stranded state even after annealing, and both side chains B and B ′ having 2 to 100 bases complementary to each other. A double-stranded oligonucleotide formed by annealing a single-stranded oligonucleotide within the same molecule and between other molecules, and between a double-stranded oligonucleotide and another molecule formed by annealing within the same molecule The ratio of the double-stranded oligonucleotide formed by annealing with 0/10 to 9/1 (molar ratio), and the end of the formed double-stranded oligonucleotide and, if necessary, the complementary strand Has a specific restriction enzyme recognition site in it,
(3) The oligonucleotide and the particle are formed by an amide bond between at least one primary amino group present in the base in the central part A constituting the oligonucleotide and a carboxyl group present on the particle surface. And (4) on the surface of the particle carrier, 1 to 10 ⁵ of the double-stranded oligonucleotide is immobilized per particle carrier.
A particle carrier for binding nucleic acid, characterized in that