JP4016656B2

JP4016656B2 - Coliform group determination device

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Publication number: JP4016656B2
Application number: JP2001396757A
Authority: JP
Inventors: 暁若狭; 一博舘野; 良浩寒川; 政貴高井; 洋志中岡
Original assignee: Miura Co Ltd
Current assignee: Miura Co Ltd
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2021-12-27
Also published as: JP2003189844A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸菌群判定装置、特に、被試験水中における大腸菌群の存否を判定するための大腸菌群判定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
飲料水や食品の衛生管理においては、大腸菌群の存否の検査が必要不可欠となっている。ここで、「大腸菌群」とは、好気性または通性嫌気性のグラム陰性無芽胞の桿菌であり、乳糖を分解して酸とガスとを生じるか、β−ガラクトシダーゼをもつ細菌群をいい（例えば、社団法人日本水道協会発行、「上水試験方法２００１解説」８４５頁参照）、「大腸菌」そのものとは異なる概念である。因みに、飲料水中に大腸菌群が含まれている場合、当該飲料水は、単に汚物で汚染されているということだけではなく、病原菌類も含んでいる可能性があることを示唆することになるため、水道法上の水質基準では飲用に不適なものと判定されることになる。
【０００３】
ところで、大腸菌群の指標となる性状は乳糖発酵性であり、それに関与する酵素はβ−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）である。したがって、飲料水等の被試験水を細菌の培養環境に設定し、そこからβ−ガラクトシダーゼを検出することができると、間接的に大腸菌群の存在を証明することができる。そこで、このような大腸菌群の性状を利用した、飲料水等の被試験水中における大腸菌群の存否を迅速に判定するための方法として、合成酵素基質培地法が知られている。合成酵素基質培地法は、発色物質または発光物質を結合させた酵素基質を培地に使用し、目的とする細菌がもつ特異酵素により当該酵素基質が加水分解されて発色または発光することを利用した検査方法（判定方法）であり、大腸菌群の検出用の合成酵素基質培地法として、被試験水の変色の有無により大腸菌群の存否を判定するＭＭＯ−ＭＵＧ法やＸＧａｌ−ＭＵＧ法が知られている。
【０００４】
このうち、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法では、発色合成酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ―３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（通称Ｘ−Ｇａｌ）、大腸菌群の栄養素となるペプトン等およびピルビン酸ナトリウム等の炭素源、塩類、界面活性剤並びにｐＨ調整剤を所定の濃度で含む合成酵素基質培地を一定量の被試験水中に所定量添加し、３６±１℃で合成酵素基質培地の種類に応じて２４〜４８時間培養する。ここで、被試験水中に大腸菌群が含まれている場合は、大腸菌群が栄養素により培養され、β−ガラクトシダーゼが生成する。生成したβ−ガラクトシダーゼは、発色合成酵素基質であるＸＧａｌを加水分解し、青〜青緑色を呈する５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを生成させる。これにより、被試験水は青〜青緑色に変色するので、大腸菌群を含むものと判定することができる。一方、被試験水中に大腸菌群が含まれていない場合は、上述の合成酵素基質培地を添加しても大腸菌群が培養されることはないので、β−ガラクトシダーゼが生成することはなく、被試験水は上述のような青〜青緑色に変色しない。これにより、被試験水には大腸菌群が含まれないものと判定することができる。
【０００５】
ところが、上述のような合成酵素基質培地法は、経験を積んだ検定者の手作業により実施され、被試験水の変色は当該検定者が目視で判断しているため、作業が煩雑である。
【０００６】
本発明の目的は、被試験水中における大腸菌群の存否を合成酵素基質培地法に基づいて自動的に判定できるようにすることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る大腸菌群判定装置は、被試験水中における大腸菌群の存否を判定するためのものであり、被試験水を貯留するための容器と、容器内に貯留された被試験水の温度を調節するための温度調節装置と、容器内に貯留された被試験水に対し、β−ガラクトシダーゼと反応して発色する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを発色合成酵素基質として含む合成酵素基質培地を供給するための試薬供給装置と、合成酵素基質培地の供給後における、発色合成酵素基質とβ−ガラクトシダーゼとの反応による被試験水の変色を判定するための判定装置とを備えている。判定装置は、被試験水における赤色光の透過率の変化に基づいて被試験水の変色を判定している。
【０００８】
ここで、合成酵素基質培地は、例えば、大腸菌群を検出するためのＸＧａｌ−ＭＵＧ培地である。
【０００９】
この大腸菌群判定装置において用いられる合成酵素基質培地の濃度は、通常、被試験水中における大腸菌群の存否を判定するための合成酵素基質培地法において用いられる合成酵素基質培地の規定濃度の少なくとも２倍に設定されている。
【００１１】
なお、本発明の大腸菌群判定装置は、例えば、容器に被試験水を供給するための供給路と、容器内に貯留された被試験水を容器の外部に排出するための排出路と、供給路を通じて容器に洗浄液を供給するための洗浄液供給装置とをさらに備えていてもよい。この場合に用いられる洗浄液は、例えば殺菌剤を含んでいる。
【００１２】
また、本発明の大腸菌群判定装置は、例えば、被試験水に対して試薬供給装置が合成酵素基質培地を供給する前に、容器の洗浄状態を確認するための洗浄確認装置をさらに備えていてもよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１を参照して、本発明の実施の一形態に係る大腸菌群判定装置を説明する。図において、大腸菌群判定装置１は、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法により被試験水中の大腸菌群の存否を自動的に判定するためのものであり、容器２、温度調節装置３、試薬供給装置４、洗浄液供給装置５、吸光度測定装置６および制御装置７を主に備えている。
【００１４】
容器２は、大腸菌群の存否の判定対象となる被試験水を貯留するためのものであり、例えば、石英ガラスなどの透光性を有する無色透明の材料を用いて形成された、底部を有する円筒状のもの（例えば試験管）である。容器２の上端部は、栓２７により気密に封止されている。また、この容器２は、被試験水を内部に供給するための供給路２０と、容器２に貯留された被試験水を外部に排出するための排出路２１とを備えている。供給路２０は、被試験水を供給するための供給ポンプ２２と、被試験水の流通を制御するための第１電磁弁２３とを備えており、栓２７を通じて容器２内の下方に向けて延びている。一方、排出路２１は、容器２内に貯留された被試験水を排出するためのものであり、栓２７から容器２の外部に向けて延びている。
【００１５】
上述の容器２は、マグネチックスターラー２５上に配置されており、また、内部の底部には磁石を内蔵した攪拌子２６が配置されている。
【００１６】
温度調節装置３は、容器２内に貯留された被試験水の温度を大腸菌群の培養に適した温度に調節するためのものであり、容器２の上部外周に配置された、例えばアルミニウム等の良伝熱性材料からなるブロック３０と、このブロック３０を加熱するためのヒーター３１とを備えている。
【００１７】
試薬供給装置４は、容器２内に貯留された被試験水に対してＸＧａｌ−ＭＵＧ法において用いられる合成酵素基質培地を供給するためのものであり、当該合成酵素基質培地を貯蔵するための試薬タンク４０と、試薬タンク４０から容器２内に延びる試薬供給路４１とを備えている。試薬供給路４１は、試薬タンク４０内の合成酵素基質培地を容器２内に送り出すための試薬ポンプ４２と、逆止弁４３とを有している。
【００１８】
洗浄液供給装置５は、容器２および被試験水供給路２０を洗浄するためのものであり、洗浄液を貯蔵するための洗浄液タンク５０と、洗浄液タンク５０から延びる洗浄液供給路５１とを備えている。洗浄液供給路５１は、洗浄液タンク５０内の洗浄液を送り出すための洗浄液ポンプ５２と、洗浄液の流量を制御するための第２電磁弁５３とを有しており、供給路２０において、供給ポンプ２２と第１電磁弁２３との間に連絡している。
【００１９】
吸光度測定装置６は、主として、容器２を通過する可視紫外光の吸光度を測定するためのものであり、容器２の下部近傍に配置された光源６１と、容器２を挟んで光源６１と対向する受光装置６２とを主に備えている。受光装置６２は、光源６１からの可視紫外光のうち、後述する特定の波長の光を選択するためのフイルタを備えている。
【００２０】
制御装置７は、大腸菌群判定装置１の動作を制御するためのものであり、図２に示すように、中央処理装置（ＣＰＵ）７０、大腸菌群判定装置１の動作プログラムを記憶している読出し専用メモリー（ＲＯＭ）７１、各種の電子情報を記憶するためのランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）７２および入出力ポート７３を備えている。入出力ポート７３の入力側には、オペレーターが大腸菌群判定装置１に対して各種の動作指令を入力するためのスイッチ類７４、受光装置６２およびその他の装置が接続されている。一方、入出力ポート７３の出力側には、光源６１、各電磁弁２３，５３、各ポンプ２２，４２，５２、マグネチックスターラー２５、ヒーター３１、大腸菌群の存否の判定結果を表示するための表示装置７５および当該判定結果を印字するためのプリンタその他の装置が接続されている。
【００２１】
なお、この制御装置７に記憶された動作プログラムは、吸光度測定装置６で測定された被試験水の吸光度に基づいて被試験水の変色の有無を判定する判定プログラム（判定装置の一例）、および吸光度測定装置６で測定された容器２の吸光度に基づいて容器２の洗浄状態を確認するための洗浄確認プログラム（洗浄確認装置の一例）を含んでいる。
【００２２】
上述の大腸菌群判定装置１において用いられる合成酵素基質培地、すなわち、試薬タンク４０内に貯蔵される合成酵素基質培地は、基本的には、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法において用いられる合成酵素基質培地（ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地）である。より具体的には、例えば、社団法人日本水道協会発行、「上水試験方法２００１解説」８４２〜８４３頁の表に挙げられたピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地であり、１リットル中において次のような酵素基質、大腸菌群培養のための栄養成分、塩類、界面活性剤およびｐＨ調製剤を含みかつｐＨが７．１±０．２に調整されたものである。
【００２３】
酵素基質
β−ガラクトシターゼと反応して発色する発色合成酵素基質であるＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ―３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．１０ｇ、大腸菌群酵素誘導剤であるＩＰＴＧ（１−イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を０．１０ｇおよび大腸菌検出のための酵素基質であるＭＵＧ（４−メチルアンベルリフェリル−β−グルクロニド）を０．１０ｇ。
大腸菌群培養のための栄養成分
ペプトンを５．０ｇおよびその他の炭素源としてピルビン酸ナトリウムを１．０ｇ。
塩類
塩化物として塩化ナトリウムを５．０ｇ、硝酸塩として硝酸カリウムを１．０ｇ。
界面活性剤
ラウリル硫酸ナトリウムを０．１０ｇ。
ｐＨ調整剤
リン酸二水素カリウムを１．０ｇ、リン酸水素二カリウムを４．０ｇ。
【００２４】
なお、上述のようなピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は市販されており、一例として日水製薬株式会社の商品名“ＥＣブルー”を挙げることができる。
【００２５】
但し、この大腸菌群判定装置１では、上述の合成酵素基質培地として、各成分の濃度が規定濃度の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも６倍、より好ましくは少なくとも１１倍に設定されているものを用いるのが好ましい。ここで、規定濃度とは、例えば上述の「上水試験方法２００１解説」８４２〜８４３頁の表等において規定された、大腸菌群検出のための合成酵素基質培地法において用いる合成酵素基質培地の濃度をいう。因みに、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の規定濃度は、上述のような各成分の含有量により規定されている。
【００２６】
なお、上述のような高濃度の合成酵素基質培地は、所要の成分をその含有量が規定濃度の少なくとも２倍になるよう水中に溶解するか、あるいは、規定濃度の既存の合成酵素基質培地を液量が少なくとも１／２になるまで濃縮すると調製することができる。
【００２７】
因みに、規定濃度の合成酵素基質培地は、上述のような栄養素を含んでいるため、試薬タンク４０での貯蔵中において各種の雑菌が繁殖し易く、これらの雑菌により短時間のうちに汚染される可能性が極めて高い。したがって、大腸菌群判定装置１において規定濃度の合成酵素基質培地を試薬タンク４０で貯蔵しながら用いると、被試験水における大腸菌群の存否の判定が不正確で信頼性を欠く可能性がある。これに対し、上述のような高濃度の合成酵素基質培地は、高濃度の塩類を含むため、試薬タンク４０内で貯蔵しても雑菌の繁殖が抑制されるので、すなわち、雑菌により汚染される可能性が小さくなるので、被試験水における大腸菌群の存否を正確に判定することができる。
【００２８】
なお、上述のような高濃度の合成酵素基質培地を用いると、規定濃度のものを用いる場合に比べて試薬タンク４０の容量を小さく設定することができるので、大腸菌群判定装置１を小型化することもできる。
【００２９】
一方、上述の大腸菌群判定装置１において用いられる洗浄液、すなわち、洗浄タンク５０に貯蔵される洗浄液は、容器２内および被試験水の供給路２０を洗浄するためのものであり、通常、界面活性剤、酸類（有機酸類若しくは無機酸類またはこれらの任意の混合物）、アルカリ類（アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、リン酸塩若しくはケイ酸塩またはこれらの任意の混合物）および酵素（アミラーゼ、プロテアーゼ若しくはリパーゼまたはこれらの任意の混合物）のうちの一つまたは二つ以上を洗浄剤として含む水溶液である。特に、この洗浄液は、被試験水供給路２０および容器２内が各種の細菌類により汚染されていない清浄な状態に維持するために、殺菌剤を含むのが好ましい。ここで利用可能な殺菌剤は、特に限定されるものではないが、通常、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素系殺菌剤、過酸化水素、逆性石鹸および両性石鹸のうちの一つまたは二つ以上のものが好ましく用いられる。
【００３０】
なお、殺菌剤として特に好ましいものは、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素系殺菌剤である。塩素系殺菌剤は、各種の菌類に対して殺菌作用を示すだけではなく、漂白剤としても機能するため、後述する容器２の洗浄工程において、容器２の透明性を高めることができる。特に、合成酵素基質培地として上述のようなピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いると、被試験水中に大腸菌群が含まれる場合は当該被試験水が青〜青緑色に変色するため、容器２の内面がそのような色で着色する場合があるが、塩素系殺菌剤を用いると、そのような着色も洗浄工程において容易に除去することができる。
【００３１】
次に、図３〜図５に示す動作プログラムのフローチャートに基づいて、大腸菌群判定装置１の動作を説明する。
オペレータが大腸菌群判定装置１の電源をＯＮにすると、プログラムは、ステップＳ１において、第１電磁弁２３を開放状態に設定し、また、第２電磁弁５３を閉鎖する等の初期設定動作を実施する。
【００３２】
次に、プログラムは、ステップＳ２において、オペレータが判定開始スイッチをＯＮしたか否かを判断する。ここで、オペレータが判定開始スイッチをＯＮにしない場合、プログラムはそのまま待機状態を維持する。一方、オペレータが判定開始スイッチをＯＮにすると、プログラムはステップＳ３に移行し、制御装置７の判定開始識別フラグをＯＮに設定する。
【００３３】
次に、ステップＳ４において、プログラムは、被試験水の採水工程を実施する。ここでは、供給ポンプ２２が動作し、目的とする被試験水が供給路２０を通じて容器２内に供給される。そして、所定量の被試験水（通常は５０ｍｌ）が容器２内に供給されると、第１電磁弁２３が閉鎖すると共に供給ポンプ２２が停止し、被試験水の供給は停止する。
【００３４】
ステップＳ４の終了後、プログラムはステップＳ５に移行し、試薬供給工程を実施する。ここでは、試薬供給装置４において、試薬ポンプ４２が作動する。この結果、試薬タンク４０内に貯留されている合成酵素基質培地が試薬ポンプ４２により送り出され、試薬供給路４１を通じて容器２内に貯留されている被試験水中に注入される。ここで、合成酵素基質培地は、上述のように濃縮されている場合、被試験水中に溶解したときの濃度が被試験水に対して規定濃度の合成酵素基質培地を規定量注入した場合の濃度と等しくなるよう注入量が設定される。この注入量は、試薬ポンプ４２の動作により制御される。また、このような合成酵素基質培地の注入時には、同時にマグネチックスターラー２５が作動し、容器２内の被試験水が攪拌子２６により攪拌される。この結果、注入された合成酵素基質培地は、被試験水中において均等に分散することになる。所定量の合成酵素基質培地が被試験水に注入されると、試薬ポンプ４２が停止し、試薬供給工程は終了する。また、マグネチックスターラー２５が停止し、被試験水の攪拌が停止される。
【００３５】
次に、プログラムはステップＳ６に移行し、培養設定工程を実施する。ここでは、温度調節装置３においてヒーター３１が作動し、ブロック３０を加熱する。この結果、容器２がブロック３０により加熱され、容器２内の被試験水は温められる。さらに、マグネチックスターラー２５が作動し、被試験水が加熱撹拌される。そして、次のステップＳ７では、被試験水の温度が大腸菌群の培養に適した温度、例えば３６±１℃に設定されたか否かを判断する。被試験水の温度が当該温度に設定されると、プログラムは、ステップＳ８において内部タイマーを作動させ（すなわち、経過時間ｔを０に設定し）、続いてステップＳ９において大腸菌群の培養に必要な所要の経過時間、例えばピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いる本実施の形態の場合は２４時間が経過したか否か（すなわち、ｔ＝２４時間になったか否か）を判断する。これにより、被試験水は、上述の合成酵素基質培地の存在下で２４時間培養されることになる。
【００３６】
ｔ＝２４時間になると、プログラムはステップＳ１０に移行し、判定設定工程を実施する。ここでは、ヒーター３１およびマグネチックスターラー２５の作動を停止し、培養を停止する。また、吸光度測定装置６を作動させ、光源６１から受光装置６２に向けて可視紫外光を照射する。そして、プログラムは、次のステップＳ１１〜ステップＳ１３において、被処理水中に大腸菌群が含まれているか否かを判定する。
【００３７】
ここで、先ず、大腸菌群の存否の判定原理を説明する。被試験水は、大腸菌群を含む場合（ケース１）、上述のような合成酵素基質培地（すなわち、ＸＧａｌを含む合成酵素基質培地）の存在下で培養処理が施されると、培養された大腸菌群に由来のβ−ガラクトシダーゼを含むことになる。このβ−ガラクトシダーゼは、合成酵素基質培地中に含まれるＸＧａｌと反応し、被処理水を青〜青緑色に変色させる。したがって、被試験水の可視紫外光吸収スペクトルは、図６に実線で示すように、青〜青緑色に対応する６５０ｎｍ付近に吸収ピークを有することになる。これに対し、被試験水が大腸菌群および大腸菌群以外の細菌を含まない場合（ケース２）、被試験水は、上述のような培養処理後であっても青〜青緑色には変色しないことになる。従って、この場合における被試験水の可視紫外光吸収スペクトルは、図６に点線で示すように高波長側に向けてなだらかに減少し、特定の波長での吸収ピークを示さない。
【００３８】
一方、被試験水が大腸菌群を含まず、大腸菌群以外の細菌を含む場合（ケース３）、被試験水は、上述のような培養処理後に青〜青緑色には変色しないが、大腸菌群以外の細菌の増殖のために白濁する。このため、この場合における被試験水の可視紫外光吸収スペクトルは、図６に一点鎖線で示すように高波長側に向けてなだらかに減少し、ケース２の場合と同じく特定の波長での吸収ピークを示さないが、全波長領域における吸光度がケース２の場合に比べて上昇することになる。
【００３９】
したがって、培養処理後の被試験水は、青〜青緑色に対応する６５０ｎｍ付近の吸光度の測定結果からだけでは、大腸菌群の存在を示す青〜青緑色に変色しているのか、大腸菌群以外の細菌により単に白濁しているだけなのかの判別が困難である。すなわち、被試験水は、ケース１に該当するのかケース３に該当するのかの判別が困難である。しかし、ケース１の吸収スペクトルは６５０ｎｍ付近に吸収ピークを有しているのに対し、ケース３の吸収スペクトルは当該波長付近において吸収ピークを有していない。したがって、ケース１の場合、６５０ｎｍ付近の高波長側の吸光度に比べ、当該波長付近の吸収ピークの低波長側の裾にあたる５５０ｎｍ付近の吸光度が小さくなる。これに対し、ケース３の場合、被試験水は、６５０ｎｍ付近の吸光度が５５０ｎｍ付近の吸光度よりも小さくなる。これによると、５５０ｎｍ付近の吸光度と６５０ｎｍ付近の吸光度とを比較し、前者が後者に比べて小さい場合は、被試験水が青〜青緑色に変色しているものと判断することができる。逆に、前者が後者に比べて大きい場合は、被試験水が青〜青緑色に変色していないものと判断することができる。
【００４０】
そこで、プログラムは、ステップＳ１１において、受光装置６２のフイルタを選択して５５０ｎｍの波長の光の吸光度を測定し、そのデータを記録する。また、次のステップＳ１２において、受光装置６２の他のフイルタを選択して６５０ｎｍの波長の光の吸光度を測定し、そのデータを記録する。そして、ステップＳ１３において、記録した５５０ｎｍの光の吸光度と６５０ｎｍの光の吸光度とを比較する。
【００４１】
ここで、５５０ｎｍの吸光度が６５０ｎｍの吸光度に比べて小さい場合、プログラムはステップＳ１４に移行し、制御装置７において洗浄識別フラグがＯＮか否かを判断する。洗浄識別フラグがＯＦＦの場合、プログラムはステップＳ１５に移行し、被試験水中に大腸菌群が存在していることを示す「大腸菌群陽性」の旨を表示装置７５に表示すると共にその旨をプリンタで印字する。
【００４２】
一方、５５０ｎｍの吸光度が６５０ｎｍの吸光度に比べて大きい場合、プログラムはステップＳ１３からステップＳ１６に移行し、制御装置７において判定開始識別フラグがＯＮか否かを判定する。判定開始識別フラグがＯＮの場合、プログラムはステップＳ１７に移行し、被試験水中に大腸菌群が存在しないことを示す「大腸菌群陰性」の旨を表示装置７５に表示すると共にその旨をプリンタで印字する。
【００４３】
ステップＳ１５またはステップＳ１７の後、プログラムは、ステップＳ１８において、ステップＳ１５またはステップＳ１７から一定時間（例えば、数分）が経過したか否かを判断する。一定時間が経過すると、プログラムは、ステップＳ１９において制御装置７の判定開始識別フラグをＯＦＦに設定し、続くステップＳ２０において制御装置７の洗浄識別フラグをＯＮに設定する。その後、プログラムは、ステップＳ２１に移行し、殺菌設定工程を実施する。ここでは、ヒーター３１およびマグネチックスターラー２５を作動させ、容器２内の被試験水を再度加熱撹拌する。
【００４４】
そして、次のステップＳ２２において、プログラムは、被試験水の温度が大腸菌群の殺菌に適した温度、例えば８０℃に設定されたか否かを判断する。被試験水の温度が８０℃に設定されると、プログラムはステップＳ２３において内部タイマーを作動させ（すなわち、経過時間ｔを０に設定し）、続いてステップＳ２４において大腸菌群の殺菌に必要な所要の経過時間、例えば３０分が経過したか否か（すなわち、ｔ＝３０分になったか否か）を判断する。ｔ＝３０分になると、プログラムは次のステップＳ２５に移行する。なお、このような殺菌工程により、容器２は、被試験水中での培養により生育した高濃度の大腸菌群による汚染が防止されることになる。
【００４５】
ステップＳ２５において、プログラムは、被試験水の排出工程を実施する。ここでは、供給ポンプ２２を一定時間作動させて容器２に被試験水を再度供給する。これにより、容器２内の被試験水は、新たに供給される被試験水により押出され、排出路２１を通じて外部に排出される。この結果、容器２内の被試験水は、新たに供給される被試験水により置換されることになる。
【００４６】
次に、ステップＳ２６において、プログラムは容器２の洗浄工程を実施する。ここでは、マグネチックスターラー２５を作動させ、同時に洗浄液供給装置５の第２電磁弁５３を開放状態に設定すると共に洗浄液ポンプ５２を一定時間作動させる。これにより、洗浄液タンク５０内の洗浄液は、洗浄液供給路５１から供給路２０を経由して容器２内に連続的に供給され、容器２内の被試験水を排出路２１を通じて外部に押出す。この結果、容器２内の被試験水は洗浄液により置換され、また、当該洗浄液は、この間、攪拌子２６により攪拌されながら容器２内を洗浄、殺菌する。なお、洗浄液は、供給路２０を通過して容器２内に供給されることになるため、同時に供給路２０を洗浄、殺菌することもできる。
【００４７】
上述の洗浄工程の終了後、すなわち、ステップＳ２６における一定時間が経過して洗浄液ポンプ５２が停止した後、プログラムはステップＳ２７に移行し、洗浄確認準備工程を実施する。ここでは、第２電磁弁５３を閉鎖すると共にマグネッチクスターラー２５を停止する。これにより、容器２内では、先のステップＳ２６で供給された洗浄液が静置した状態で貯留されることになる。
【００４８】
次に、プログラムは、再びステップＳ１１に戻り、ステップＳ１１〜Ｓ１２を実施する。これにより、洗浄液が貯留された容器２について、５５０ｎｍの波長の光の吸光度と、６５０ｎｍの波長の光の吸光度とが測定され、ステップＳ１３において両吸光度が比較される。ここで、６５０ｎｍの吸光度が５５０ｎｍの吸光度よりも大きい場合は、容器２が青〜青緑色に変色した被試験水により着色しており、先の洗浄工程による容器２の洗浄が不十分なことになる。したがって、プログラムは、ステップＳ１３からステップＳ１４に移行する。ここでは、先のステップＳ２０において洗浄識別フラグがＯＮに設定されているため、プログラムはステップＳ２６に移行する。そして、ステップＳ２６〜Ｓ２７を実行し、容器２を再度洗浄する。ステップＳ２７の終了後、プログラムは再度ステップＳ１１〜Ｓ１３を実行し、容器２の洗浄を確認する。
【００４９】
ステップＳ１３において、６５０ｎｍの吸光度が５５０ｎｍの吸光度よりも小さい場合は、容器２が青〜青緑色に変色した被試験液により着色していないと判断することができるため、すなわち、容器２が十分に洗浄されていると判断することができるため、プログラムはステップＳ１６に移行する。ここでは、先のステップＳ１９において判定開始識別フラグがＯＦＦに設定されているため、プログラムは、ステップＳ２８に移行して洗浄識別フラグをＯＦＦに設定し、続いてステップＳ２９において別の被試験水についての大腸菌群存否の判定が可能の旨の「判定開始可能」を表示装置７５に表示する。その後、プログラムは、ステップＳ２に戻り、オペレータが判定開始スイッチをＯＮするのを待つ。そして、オペレータが判定開始スイッチをＯＮにすると、プログラムは上述の工程を繰り返し、別の被試験水における大腸菌群の存否を判定することになる。なお、この際、容器２に貯留されている洗浄液は、ステップＳ４において新たに供給される被試験水により押出され、当該被試験水により置換されることになる。
【００５０】
以上のように、この大腸菌群判定装置１は、被試験水中における大腸菌群の存否を合成酵素基質培地法により自動的に高精度で判定することができるので、検定者の手作業による場合に比べて判定作業を簡素にかつ容易にすることができる。
【００５１】
また、この装置１は、上述のような洗浄液供給装置５を備えており、これが上述のように容器２および供給路２０、さらには排出路２１を確実に洗浄するので、容器２、供給路２０および排出路２１を交換せずに、異なる被試験水についての大腸菌群の存否を連続的に判定することができる。
【００５２】
［他の実施の形態］
（１）上述の実施の形態では、被試験水の変色を判定するために、可視紫外光スペクトルの５５０ｎｍの吸光度と６５０ｎｍの吸光度とを比較したが、これは一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。一般には、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いる場合、５００〜５９０ｎｍの低波長側の吸光度と、６００〜６８０ｎｍの高波長側の吸光度とを比較し、後者が前者に比べて高ければ被試験水が青〜青緑色に変色しているものと判定することができる。
【００５３】
（２）上述の実施の形態は、合成酵素基質培地としてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を利用する場合を例に説明したが、発色合成酵素基質を含む他の合成酵素基質培地、例えば、通常のＸＧａｌ−ＭＵＧ培地、ＭＭＯ−ＭＵＧ培地、ＩＰＴＧ添加ＭＭＯ−ＭＵＧ培地等を用いる場合も本発明は同様に実施することができる。なお、ＭＭＯ−ＭＵＧ培地を用いる場合、被試験水中に大腸菌群が含まれていると黄色に変色するため、判定装置において大腸菌群の存否を判断するための根拠となる吸光度は、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いる場合とは異なる波長の光について測定する必要がある。
【００５４】
なお、上述のような他の合成酵素基質培地を用いる場合、その濃度は、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の場合と同様に、規定濃度の少なくとも２倍、好ましくは６倍、より好ましくは１１倍に設定するのが好ましい。因みに、他の合成酵素基質培地の規定濃度は、上述の社団法人日本水道協会発行、「上水試験方法２００１解説」８４２〜８４３頁、或いはその他の文献に記載の通りである。
【００５５】
（３）上述の実施の形態では、判定装置において、５５０ｎｍの波長の光の吸光度と６５０ｎｍの波長の光の吸光度とを比較することにより、被試験水が青〜青緑色に変色したか否かを判定したが、他の方法によりこのような変色を判定することもできる。例えば、吸光度測定装置６として、赤色光の発光素子（例えば、赤色ダイオード）とその受光素子とを用い、発光素子から照射される赤色光を受光素子で受光する。そして、被試験水が青〜青緑色に変色しない場合は赤色光の透過率が低下しにくいのに対し、被試験水が青〜青緑色に変色すると赤色光の透過率が急激に低下することから、そのような赤色光の透過率に応じて被試験水の変色を判定することができる。このようにすれば、受光装置６２にフイルタを用いた高価な吸光度測定装置６を用いる上述の実施の形態の場合に比べ、大腸菌群判定装置を安価に実現することができる。
【００５６】
但し、この場合、被試験水が大腸菌群以外の細菌を含むと白濁し、赤色光の透過率はやはり低下することになるため、被試験水が単に白濁しているだけ（便宜上、「単純白濁」という）なのか、或いは青〜青緑色に変色すると共に白濁している（便宜上、「変色白濁」という）のかの判別が必要になる。
【００５７】
そこで、この場合は、単純白濁と変色白濁とを判別するために、単純白濁時の赤色光の透過率と変色白濁時の赤色光の透過率との差に基づいて、赤色光の透過率に判別のための基準値を設定する。そして、赤色光の透過率が当該基準値以上に低下している場合は変色白濁と判定し、基準値未満の場合は単純白濁と判定する。具体的には、被試験水が大腸菌群を含まず、大腸菌群以外の細菌を含む場合、被試験水は、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の存在下、３６±１℃で２４時間培養されると、図７に点線で示すように赤色光の透過率が１２時間を経過したあたりから単純白濁のために低下するが、その低下の程度は一定レベルで維持される。これに対し、被試験水が大腸菌群を含む場合、図７に実線で示すように赤色光の透過率は１５時間を経過したあたりから急激に低下し続ける。このため、培養開始から２４時間後（すなわち、培養終了後）では、単純白濁の場合と変色白濁の場合とでは赤色光の透過率に大きな差（Ｄ）が生じる。したがって、この差Ｄの範囲内において、赤色光の透過率についての任意の基準値Ｘを設定すれば、赤色光の透過率が当該基準値Ｘよりも高レベル側にあるか低レベル側にあるかを判定することにより、単純白濁か変色白濁かを判別することができる。
【００５８】
なお、上述の差Ｄは、発光装置および受光装置の種類や感度により異なるので、判別のための基準値Ｘは、これらの種類や感度等に応じて適宜設定するのが好ましい。
【００５９】
［合成酵素基質培地濃度の実験例］
規定濃度のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と、その数種類の濃縮物（濃縮培地）とを用意した。そして、各培地に大腸菌（グラム陰性菌）、緑膿菌（グラム陰性菌）および黄色ブドウ球菌（グラム陽性菌）を濃度が１０²個／ｍｌになるよう個別に添加して９日間培養し、菌類の生育の有無を確認した。結果を表１〜表３に示す。なお、各表において、＋は菌が生育したことを示し、−は菌が生育しなかったことを示している。
【００６０】
【表１】

【００６１】
【表２】

【００６２】
【表３】

【００６３】
また、各培地に各菌を濃度が１０⁷個／ｍｌになるよう個別に添加して同様に培養し、菌類の生育の有無を確認した。結果を表４〜表６に示す。各表における＋，−は表１〜表３の場合と同様である。
【００６４】
【表４】

【００６５】
【表５】

【００６６】
【表６】

【００６７】
表１〜表６によると、規定濃度のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は、培養開始後１日で添加した菌が生育している。これに対し、濃縮した培地は、濃縮倍率が高い程、高濃度の菌を含む場合でも菌の生育を効果的に抑制できる。これによれば、上述の大腸菌群判定装置１において用いる合成酵素基質培地は、被試験水中に含まれる大腸菌群が一般には１０²個／ｍｌ以下の比較的低濃度で微量であるため、濃縮倍率が２倍以上であれば、試薬タンク４０内に貯蔵しても雑菌が生育しにくく、判定結果の信頼性を損ないにくくなることがわかる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の大腸菌群判定装置は、上述のような容器、温度調節装置、試薬供給装置および判定装置を備えているため、被試験水中における大腸菌群の存否を合成酵素基質培地法により自動的に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態に係る大腸菌群判定装置の概略構成図。
【図２】前記大腸菌群判定装置において用いられる制御装置の概略図。
【図３】前記大腸菌群判定装置の動作フローチャート。
【図４】前記大腸菌群判定装置の動作フローチャート。
【図５】前記大腸菌群判定装置の動作フローチャート。
【図６】被試験水における一般的な可視紫外光吸収スペクトルを示す図。
【図７】合成酵素基質培地を含む被試験水における、赤色光の一般的な経時的透過率変化を示す図。
【符号の説明】
１大腸菌群判定装置
２容器
３温度調節装置
４試薬供給装置
５洗浄液供給装置
６吸光度測定装置
７制御装置
２０供給路
２１排出路[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an Escherichia coli group determination device, and more particularly to an Escherichia coli group determination device for determining the presence or absence of an Escherichia coli group in water to be tested.
[0002]
[Prior art and its problems]
In the hygiene management of drinking water and food, it is indispensable to test for the presence of coliform bacteria. Here, the “coliform group” is an aerobic or facultative anaerobic Gram-negative absorptive gonococcus, which refers to a group of bacteria that decompose lactose to produce acid and gas or have β-galactosidase ( For example, it is a concept different from “Escherichia coli” itself, published by the Japan Water Works Association, “see Water Supply Test Method 2001,” page 845). By the way, if coliforms are contained in the drinking water, this suggests that the drinking water may not only be contaminated with filth but also contain pathogenic fungi. According to the water quality standards under the Water Supply Law, it will be judged unsuitable for drinking.
[0003]
By the way, the property that serves as an indicator of coliforms is lactose fermentability, and the enzyme involved in it is β-galactosidase. Therefore, if the test water such as drinking water is set in a bacterial culture environment and β-galactosidase can be detected therefrom, the presence of coliforms can be proved indirectly. Therefore, a synthetic enzyme substrate medium method is known as a method for quickly determining the presence or absence of coliforms in water to be tested such as drinking water using the properties of these coliforms. The Synthetic Enzyme Substrate Medium Method uses an enzyme substrate combined with a chromogenic substance or a luminescent substance in the medium, and tests that the enzyme substrate is hydrolyzed by a specific enzyme possessed by the target bacteria to produce color or luminescence. MMO-MUG method and XGal-MUG method for determining the presence or absence of E. coli group based on the presence or absence of discoloration of the water to be tested are known as a method (determination method) and a synthetic enzyme substrate medium method for detecting E. coli group .
[0004]
Among these, in the XGal-MUG method, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (commonly known as X-Gal) which is a chromogenic enzyme substrate, peptone which is a nutrient of E. coli group, etc. And a synthetic enzyme substrate medium containing a carbon source such as sodium pyruvate, salts, a surfactant and a pH adjuster at a predetermined concentration in a predetermined amount of water to be tested, and a synthetic enzyme substrate medium at 36 ± 1 ° C. Incubate for 24-48 hours depending on the type. Here, when the coliform group is contained in the water to be tested, the coliform group is cultured with nutrients to produce β-galactosidase. The produced β-galactosidase hydrolyzes XGal, which is a chromogenic synthase substrate, to produce 5,5-dibromo-4,4-dichloroindigo having a blue to blue-green color. Thereby, since the water to be tested changes from blue to blue-green, it can be determined that it contains coliforms. On the other hand, if the E. coli group is not contained in the water under test, β-galactosidase is not produced since the E. coli group is not cultured even if the above-mentioned synthetic enzyme substrate medium is added. Water does not change from blue to blue-green as described above. Thereby, it can be determined that the test water does not contain coliforms.
[0005]
However, the synthetic enzyme substrate culture method as described above is performed manually by an experienced tester, and the color change of the water to be tested is visually judged by the tester, so the work is complicated.
[0006]
An object of the present invention is to enable automatic determination of the presence or absence of coliforms in water under test based on the synthetic enzyme substrate culture method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The coliform group determination apparatus according to the present invention is for determining the presence or absence of coliform group in the water under test, the container for storing the water under test, and the temperature of the water under test stored in the container. Color is developed by reacting with β-galactosidase to the temperature control device for adjustment and to-be-tested water stored in the container5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideChromogenic synthase substrateInclude asA reagent supply device for supplying a synthetic enzyme substrate medium, and a determination device for determining the color change of the test water due to the reaction between the chromogenic synthetic enzyme substrate and β-galactosidase after the supply of the synthetic enzyme substrate medium ing.The determination device determines discoloration of the water under test based on a change in the transmittance of red light in the water under test.
[0008]
here,The synthetic enzyme substrate medium is, for example, an XGal-MUG medium for detecting coliform bacteria.
[0009]
The concentration of the synthetic enzyme substrate medium used in this coliform group determination apparatus is usually at least twice the prescribed concentration of the synthetic enzyme substrate medium used in the synthetic enzyme substrate medium method for determining the presence or absence of coliform groups in the test water. Is set to
[0011]
The coliform determination apparatus of the present invention includes, for example, a supply path for supplying test water to the container, a discharge path for discharging the test water stored in the container to the outside of the container, and a supply You may further provide the washing | cleaning liquid supply apparatus for supplying a washing | cleaning liquid to a container through a channel | path. The cleaning liquid used in this case contains a disinfectant, for example.
[0012]
The coliform determination apparatus of the present invention further includes, for example, a washing confirmation device for confirming the washing state of the container before the reagent supply device supplies the synthetic enzyme substrate medium to the water to be tested. Also good.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
With reference to FIG. 1, the coliform determination apparatus according to an embodiment of the present invention will be described. In the figure, the coliform group determination apparatus 1 is for automatically determining the presence or absence of coliform groups in the water under test by the XGal-MUG method. The container 2, the temperature control apparatus 3, the reagent supply apparatus 4, the cleaning liquid supply A device 5, an absorbance measuring device 6 and a control device 7 are mainly provided.
[0014]
The container 2 is for storing the water to be tested which is a target for determining the presence or absence of coliform bacteria, and has a bottom formed using, for example, a transparent and colorless material such as quartz glass. It is cylindrical (for example, a test tube). The upper end of the container 2 is hermetically sealed with a stopper 27. Further, the container 2 includes a supply path 20 for supplying water to be tested to the inside and a discharge path 21 for discharging the water to be tested stored in the container 2 to the outside. The supply path 20 includes a supply pump 22 for supplying water to be tested and a first electromagnetic valve 23 for controlling the flow of the water to be tested, and is directed downward in the container 2 through a plug 27. It extends. On the other hand, the discharge path 21 is for discharging the water to be tested stored in the container 2, and extends from the stopper 27 toward the outside of the container 2.
[0015]
The container 2 described above is disposed on a magnetic stirrer 25, and a stirrer 26 containing a magnet is disposed at the bottom of the container 2.
[0016]
The temperature adjusting device 3 is for adjusting the temperature of the water to be tested stored in the container 2 to a temperature suitable for culturing coliform bacteria, and is disposed on the upper outer periphery of the container 2, such as aluminum. A block 30 made of a highly heat conductive material and a heater 31 for heating the block 30 are provided.
[0017]
The reagent supply device 4 is for supplying a synthetic enzyme substrate medium used in the XGal-MUG method to the water to be tested stored in the container 2, and a reagent for storing the synthetic enzyme substrate medium A tank 40 and a reagent supply path 41 extending from the reagent tank 40 into the container 2 are provided. The reagent supply path 41 has a reagent pump 42 for sending out the synthetic enzyme substrate medium in the reagent tank 40 into the container 2, and a check valve 43.
[0018]
The cleaning liquid supply device 5 is for cleaning the container 2 and the test water supply path 20 and includes a cleaning liquid tank 50 for storing the cleaning liquid and a cleaning liquid supply path 51 extending from the cleaning liquid tank 50. The cleaning liquid supply path 51 includes a cleaning liquid pump 52 for sending out the cleaning liquid in the cleaning liquid tank 50 and a second electromagnetic valve 53 for controlling the flow rate of the cleaning liquid. It communicates with the first electromagnetic valve 23.
[0019]
The absorbance measurement device 6 is mainly for measuring the absorbance of visible ultraviolet light passing through the container 2, and faces the light source 61 with the light source 61 disposed near the lower part of the container 2 and the container 2 interposed therebetween. A light receiving device 62 is mainly provided. The light receiving device 62 includes a filter for selecting light having a specific wavelength, which will be described later, from the visible ultraviolet light from the light source 61.
[0020]
The control device 7 is for controlling the operation of the coliform determination device 1, and as shown in FIG. 2, the central processing unit (CPU) 70 and the operation program for the coliform determination device 1 are read. A dedicated memory (ROM) 71, a random access memory (RAM) 72 for storing various electronic information, and an input / output port 73 are provided. Connected to the input side of the input / output port 73 are switches 74, a light receiving device 62, and other devices for an operator to input various operation commands to the coliform determination device 1. On the other hand, on the output side of the input / output port 73, the light source 61, the

electromagnetic valves

23, 53, the

pumps

22, 42, 52, the magnetic stirrer 25, the heater 31, and the determination result of the presence or absence of coliforms are displayed. A display device 75 and a printer or other device for printing the determination result are connected.
[0021]
The operation program stored in the control device 7 includes a determination program (an example of a determination device) that determines the presence or absence of discoloration of the water under test based on the absorbance of the water under test measured by the absorbance measuring device 6, and A cleaning confirmation program (an example of a cleaning confirmation device) for confirming the cleaning state of the container 2 based on the absorbance of the container 2 measured by the absorbance measuring device 6 is included.
[0022]
The synthetic enzyme substrate medium used in the coliform determination apparatus 1 described above, that is, the synthetic enzyme substrate medium stored in the reagent tank 40 is basically a synthetic enzyme substrate medium (XGal−) used in the XGal-MUG method. MUG medium). More specifically, for example, an XGal-MUG medium supplemented with pyruvic acid listed in the table of pages 842 to 843, published by Japan Water Works Association, “Explanation of Water Supply Test Method 2001”, 842 to 843. An enzyme substrate, a nutrient component for coliform culture, salts, a surfactant and a pH adjuster, and the pH is adjusted to 7.1 ± 0.2.
[0023]
Enzyme substrate
0.10 g of XGal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), a chromogenic synthetic enzyme substrate that develops color by reacting with β-galactosidase, coliform group enzyme inducer 0.10 g of IPTG (1-isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside), and MUG (4-methylambelliferyl-β-glucuronide), which is an enzyme substrate for detection of E. coli, were reduced to 0.000. 10 g.
Nutritional components for coliform culture
5.0 g of peptone and 1.0 g of sodium pyruvate as other carbon source.
salts
5.0 g of sodium chloride as the chloride and 1.0 g of potassium nitrate as the nitrate.
Surfactant
0.10 g of sodium lauryl sulfate.
pH adjuster
1.0 g of potassium dihydrogen phosphate and 4.0 g of dipotassium hydrogen phosphate.
[0024]
The pyruvate-added XGal-MUG medium as described above is commercially available. As an example, the trade name “EC Blue” of Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. can be mentioned.
[0025]
However, in this coliform group determination apparatus 1, as the above-mentioned synthase substrate medium, one in which the concentration of each component is set to at least twice the specified concentration, preferably at least 6 times, more preferably at least 11 times is used. Is preferred. Here, the prescribed concentration is, for example, the concentration of the synthetic enzyme substrate medium used in the synthetic enzyme substrate medium method for detecting coliform bacteria defined in the table of pages 842 to 843 of “Water Supply Test Method 2001” described above. Say. Incidentally, the defined concentration of the pyruvate-added XGal-MUG medium is defined by the content of each component as described above.
[0026]
The high-concentration synthase substrate medium as described above is prepared by dissolving the required components in water so that the content thereof is at least twice the specified concentration, or by using an existing synthase substrate medium having the specified concentration. It can be prepared by concentrating until the liquid volume is at least 1/2.
[0027]
Incidentally, since the synthase substrate medium having a prescribed concentration contains the nutrients as described above, various germs are likely to propagate during storage in the reagent tank 40, and are contaminated by these germs in a short time. Very likely. Therefore, when the synthase substrate medium having a specified concentration is used while being stored in the reagent tank 40 in the coliform determination apparatus 1, the determination of the presence or absence of the coliform group in the test water may be inaccurate and lack reliability. On the other hand, since the high-concentration synthase substrate medium as described above contains high-concentration salts, the propagation of miscellaneous bacteria is suppressed even when stored in the reagent tank 40. Since the possibility is reduced, it is possible to accurately determine the presence or absence of coliforms in the water to be tested.
[0028]
In addition, since the capacity | capacitance of the reagent tank 40 can be set small compared with the case where the thing of a regular density | concentration is used when the above high concentration synthetic enzyme substrate culture media are used, coliform group determination apparatus 1 is reduced in size. You can also.
[0029]
On the other hand, the cleaning liquid used in the above-described coliform group determination apparatus 1, that is, the cleaning liquid stored in the cleaning tank 50 is for cleaning the inside of the container 2 and the supply path 20 of the water to be tested. Agents, acids (organic or inorganic acids or any mixtures thereof), alkalis (alkali metal or alkaline earth metal hydroxides, carbonates, phosphates or silicates or any mixture thereof) and An aqueous solution containing one or more of enzymes (amylase, protease or lipase or any mixture thereof) as a cleaning agent. In particular, the cleaning liquid preferably contains a disinfectant in order to maintain the test water supply path 20 and the container 2 in a clean state that is not contaminated with various bacteria. The disinfectant usable here is not particularly limited, but usually one or two of a chlorine-based disinfectant such as sodium hypochlorite, hydrogen peroxide, inverse soap and amphoteric soap. The above are preferably used.
[0030]
Particularly preferred as the bactericidal agent is a chlorine-based bactericidal agent such as sodium hypochlorite. The chlorine-based disinfectant not only exhibits a bactericidal action against various fungi, but also functions as a bleaching agent, so that the transparency of the container 2 can be increased in the cleaning process of the container 2 described later. In particular, when the above-described pyruvate-added XGal-MUG medium is used as the synthetic enzyme substrate medium, when the E. coli group is contained in the water under test, the water under test changes from blue to blue-green. Although the inner surface may be colored with such a color, when a chlorine-based disinfectant is used, such a color can be easily removed in the cleaning process.
[0031]
Next, the operation of the coliform determination apparatus 1 will be described based on the flowchart of the operation program shown in FIGS.
When the operator turns on the power of the coliform determination apparatus 1, the program performs an initial setting operation such as setting the first electromagnetic valve 23 to the open state and closing the second electromagnetic valve 53 in step S <b> 1. To do.
[0032]
Next, in step S2, the program determines whether the operator has turned on the determination start switch. Here, if the operator does not turn on the determination start switch, the program maintains the standby state as it is. On the other hand, when the operator turns on the determination start switch, the program proceeds to step S3 and sets the determination start identification flag of the control device 7 to ON.
[0033]
Next, in step S4, the program carries out a water sampling process for water to be tested. Here, the supply pump 22 operates, and the target water to be tested is supplied into the container 2 through the supply path 20. When a predetermined amount of water to be tested (usually 50 ml) is supplied into the container 2, the first electromagnetic valve 23 is closed, the supply pump 22 is stopped, and the supply of water to be tested is stopped.
[0034]
After the end of step S4, the program moves to step S5 and performs a reagent supply process. Here, the reagent pump 42 operates in the reagent supply device 4. As a result, the synthetic enzyme substrate medium stored in the reagent tank 40 is sent out by the reagent pump 42 and injected into the test water stored in the container 2 through the reagent supply path 41. Here, when the synthase substrate medium is concentrated as described above, the concentration when a specified amount of a synthase substrate medium is dissolved in the test water is injected into the test water at a specified amount. The injection amount is set to be equal to. This injection amount is controlled by the operation of the reagent pump 42. Further, when such a synthetic enzyme substrate medium is injected, the magnetic stirrer 25 is simultaneously operated, and the water to be tested in the container 2 is stirred by the stirrer 26. As a result, the injected synthase substrate medium is evenly dispersed in the test water. When a predetermined amount of the synthetic enzyme substrate medium is injected into the test water, the reagent pump 42 is stopped, and the reagent supply process is completed. Further, the magnetic stirrer 25 is stopped, and the stirring of the water to be tested is stopped.
[0035]
Next, the program proceeds to step S6, and the culture setting process is performed. Here, the heater 31 operates in the temperature control device 3 to heat the block 30. As a result, the container 2 is heated by the block 30 and the water under test in the container 2 is warmed. Further, the magnetic stirrer 25 is activated, and the water to be tested is heated and stirred. Then, in the next step S7, it is determined whether or not the temperature of the water to be tested is set to a temperature suitable for culturing the coliform group, for example, 36 ± 1 ° C. When the temperature of the water to be tested is set to that temperature, the program activates the internal timer in step S8 (ie, sets the elapsed time t to 0), and then, in step S9, is necessary for culturing the coliform group. In the case of the present embodiment using a required elapsed time, for example, an XGal-MUG medium supplemented with pyruvic acid, it is determined whether or not 24 hours have elapsed (that is, whether or not t = 24 hours has been reached). As a result, the water to be tested is cultured for 24 hours in the presence of the aforementioned synthetic enzyme substrate medium.
[0036]
When t = 24 hours, the program proceeds to step S10, and the determination setting process is performed. Here, the operation of the heater 31 and the magnetic stirrer 25 is stopped, and the culture is stopped. Further, the absorbance measuring device 6 is operated to irradiate visible light from the light source 61 toward the light receiving device 62. And a program determines whether coliform bacteria are contained in to-be-processed water in following step S11-step S13.
[0037]
Here, first, the principle of determining whether or not the coliform group exists is described. When the water to be tested contains coliforms (case 1), the cultured E. coli is subjected to culture treatment in the presence of the above-described synthase substrate medium (ie, a synthase substrate medium containing XGal). It will contain β-galactosidase from the group. This β-galactosidase reacts with XGal contained in the synthase substrate medium to change the color of the water to be treated from blue to blue-green. Therefore, the visible ultraviolet absorption spectrum of the water to be tested has an absorption peak in the vicinity of 650 nm corresponding to blue to blue-green, as shown by the solid line in FIG. On the other hand, when the water to be tested does not contain coliform bacteria and bacteria other than coliform bacteria (case 2), the water to be tested should not change color from blue to blue-green even after the culture treatment as described above. become. Therefore, in this case, the visible ultraviolet absorption spectrum of the water to be tested gradually decreases toward the high wavelength side as shown by the dotted line in FIG. 6, and does not show an absorption peak at a specific wavelength.
[0038]
On the other hand, when the water to be tested does not contain coliform bacteria and contains bacteria other than coliform bacteria (case 3), the water to be tested does not turn blue to blue-green after the culture treatment as described above, but other than coliform bacteria. It becomes cloudy due to the growth of bacteria. Therefore, in this case, the visible ultraviolet absorption spectrum of the water to be tested gradually decreases toward the high wavelength side as shown by the one-dot chain line in FIG. 6, and the absorption peak at a specific wavelength is the same as in case 2. Although the absorbance is not shown, the absorbance in the entire wavelength region is increased compared to the case 2.
[0039]
Therefore, whether the water to be tested after the culture treatment is discolored from blue to blue-green indicating the presence of coliforms only from the absorbance measurement result around 650 nm corresponding to blue to blue-green, It is difficult to determine whether it is simply clouded by bacteria. That is, it is difficult to determine whether the water under test corresponds to Case 1 or Case 3. However, the absorption spectrum of Case 1 has an absorption peak near 650 nm, whereas the absorption spectrum of Case 3 does not have an absorption peak near the wavelength. Therefore, in case 1, the absorbance near 550 nm corresponding to the bottom of the low wavelength side of the absorption peak near the wavelength is smaller than the absorbance near 650 nm on the high wavelength side. On the other hand, in the case 3, the water to be tested has an absorbance near 650 nm smaller than an absorbance near 550 nm. According to this, the absorbance near 550 nm is compared with the absorbance near 650 nm, and when the former is smaller than the latter, it can be determined that the water to be tested is discolored from blue to blue-green. On the other hand, when the former is larger than the latter, it can be determined that the water to be tested is not discolored from blue to blue-green.
[0040]
Therefore, in step S11, the program selects the filter of the light receiving device 62, measures the absorbance of light having a wavelength of 550 nm, and records the data. In the next step S12, another filter of the light receiving device 62 is selected, the absorbance of light having a wavelength of 650 nm is measured, and the data is recorded. In step S13, the recorded absorbance of light at 550 nm is compared with the absorbance of light at 650 nm.
[0041]
Here, when the absorbance at 550 nm is smaller than the absorbance at 650 nm, the program proceeds to step S14 and the control device 7 determines whether or not the cleaning identification flag is ON. If the washing identification flag is OFF, the program proceeds to step S15, and the fact that the coliform group is present in the water under test is displayed on the display device 75 and that fact is displayed on the printer. Print.
[0042]
On the other hand, when the absorbance at 550 nm is larger than the absorbance at 650 nm, the program proceeds from step S13 to step S16, and the control device 7 determines whether the determination start identification flag is ON. If the determination start identification flag is ON, the program proceeds to step S17, and the display device 75 displays that the coliform group is negative indicating that the coliform group does not exist in the water under test, and prints that effect on the printer. To do.
[0043]
After step S15 or step S17, the program determines in step S18 whether or not a fixed time (for example, several minutes) has elapsed from step S15 or step S17. When the fixed time has elapsed, the program sets the determination start identification flag of the control device 7 to OFF in step S19, and sets the cleaning identification flag of the control device 7 to ON in the following step S20. Then, a program transfers to step S21 and implements a sterilization setting process. Here, the heater 31 and the magnetic stirrer 25 are operated, and the water under test in the container 2 is heated and stirred again.
[0044]
In the next step S22, the program determines whether or not the temperature of the water under test has been set to a temperature suitable for sterilization of coliform bacteria, for example, 80 ° C. When the temperature of the water to be tested is set to 80 ° C., the program activates the internal timer in step S23 (ie, sets the elapsed time t to 0), and then, in step S24, is necessary for sterilization of coliform bacteria. E.g., whether or not 30 minutes have elapsed, i.e., whether or not t = 30 minutes has elapsed. When t = 30 minutes, the program proceeds to the next step S25. In addition, such a sterilization process prevents the container 2 from being contaminated by high-concentration coliforms grown by culturing in the test water.
[0045]
In step S25, the program performs a process for discharging water to be tested. Here, the water to be tested is supplied again to the container 2 by operating the supply pump 22 for a certain period of time. As a result, the water to be tested in the container 2 is pushed out by the newly supplied water to be tested and discharged to the outside through the discharge path 21. As a result, the water to be tested in the container 2 is replaced with newly supplied water to be tested.
[0046]
Next, in step S <b> 26, the program performs a cleaning process for the container 2. Here, the magnetic stirrer 25 is operated, and at the same time, the second electromagnetic valve 53 of the cleaning liquid supply device 5 is set to an open state and the cleaning liquid pump 52 is operated for a predetermined time. Accordingly, the cleaning liquid in the cleaning liquid tank 50 is continuously supplied from the cleaning liquid supply path 51 through the supply path 20 into the container 2, and the water to be tested in the container 2 is pushed out through the discharge path 21. As a result, the water to be tested in the container 2 is replaced with the cleaning liquid, and the cleaning liquid is cleaned and sterilized while being stirred by the stirrer 26 during this period. Since the cleaning liquid is supplied into the container 2 through the supply path 20, the supply path 20 can be simultaneously cleaned and sterilized.
[0047]
After the completion of the above-described cleaning process, that is, after the fixed time in step S26 has elapsed and the cleaning liquid pump 52 has stopped, the program proceeds to step S27, and the cleaning confirmation preparation process is performed. Here, the second electromagnetic valve 53 is closed, and the magnetic custler 25 is stopped. Thereby, in the container 2, the washing | cleaning liquid supplied by previous step S26 will be stored in the state left still.
[0048]
Next, the program returns to step S11 again and executes steps S11 to S12. Thereby, the absorbance of light having a wavelength of 550 nm and the absorbance of light having a wavelength of 650 nm are measured for the container 2 in which the cleaning liquid is stored, and both absorbances are compared in step S13. Here, when the absorbance at 650 nm is larger than the absorbance at 550 nm, the container 2 is colored with the water to be tested that has changed from blue to blue-green, and the container 2 is not sufficiently washed in the previous washing step. Become. Therefore, the program moves from step S13 to step S14. Here, since the cleaning identification flag is set to ON in the previous step S20, the program proceeds to step S26. And step S26-S27 are performed and the container 2 is wash | cleaned again. After step S27 ends, the program executes steps S11 to S13 again to confirm cleaning of the container 2.
[0049]
In step S13, when the absorbance at 650 nm is smaller than the absorbance at 550 nm, it can be determined that the container 2 is not colored by the test liquid that has changed from blue to blue-green. Since it can be determined that the object has been washed, the program proceeds to step S16. Here, since the determination start identification flag is set to OFF in the previous step S19, the program shifts to step S28 to set the washing identification flag to OFF, and subsequently, in step S29, for another water to be tested. The display device 75 displays “determination can be started” indicating that it is possible to determine whether or not the Escherichia coli group exists. Thereafter, the program returns to step S2 and waits for the operator to turn on the determination start switch. When the operator turns on the determination start switch, the program repeats the above steps to determine whether or not the coliform group is present in another test water. At this time, the cleaning liquid stored in the container 2 is pushed out by the water to be tested newly supplied in step S4 and replaced with the water to be tested.
[0050]
As described above, this coliform group determination apparatus 1 can automatically and accurately determine the presence or absence of coliform groups in the water under test by the synthetic enzyme substrate medium method, so that it can be compared with the case where it is performed manually by the examiner. Thus, the determination work can be simplified and facilitated.
[0051]
Further, the apparatus 1 includes the cleaning liquid supply device 5 as described above, which cleans the container 2 and the supply path 20 as well as the discharge path 21 as described above. And without exchanging the discharge path 21, the presence or absence of the coliform group about different test water can be determined continuously.
[0052]
[Other embodiments]
(1) In the embodiment described above, the absorbance at 550 nm and the absorbance at 650 nm in the visible ultraviolet spectrum were compared to determine the discoloration of the water to be tested, but this is an example, and the present invention is not limited to this. It is not limited. In general, when XGal-MUG medium is used, the absorbance on the lower wavelength side of 500 to 590 nm is compared with the absorbance on the higher wavelength side of 600 to 680 nm, and if the latter is higher than the former, the test water is blue to It can be determined that the color changes to blue-green.
[0053]
(2) In the above-described embodiment, the case where the pyruvate-added XGal-MUG medium is used as the synthase substrate medium is described as an example. The present invention can also be carried out in the same manner when an XGal-MUG medium, an MMO-MUG medium, an IPTG-added MMO-MUG medium, or the like is used. In addition, when MMO-MUG medium is used, if the coliform group is contained in the water to be tested, the color changes to yellow. Therefore, the absorbance that is the basis for determining the presence or absence of the coliform group in the determination apparatus is XGal-MUG medium. It is necessary to measure light having a wavelength different from that in the case of using.
[0054]
In the case of using other synthase substrate medium as described above, the concentration is at least twice, preferably 6 times, more preferably 11 times the specified concentration, as in the case of XGal-MUG medium with pyruvate. It is preferable to set to. Incidentally, the specified concentrations of other synthetic enzyme substrate media are as described in the above-mentioned Japan Water Works Association, “Composition of Water Supply Test Method 2001”, pages 842 to 843, or other documents.
[0055]
(3) In the above-described embodiment, whether or not the water under test has changed from blue to blue-green by comparing the absorbance of light having a wavelength of 550 nm and the absorbance of light having a wavelength of 650 nm in the determination apparatus. However, it is also possible to determine such discoloration by other methods. For example, a red light emitting element (for example, a red diode) and a light receiving element thereof are used as the absorbance measuring device 6, and red light emitted from the light emitting element is received by the light receiving element. And when the water under test does not change from blue to blue-green, the transmittance of red light is unlikely to decrease, whereas when the water under test changes from blue to blue-green, the transmittance of red light rapidly decreases. Therefore, the color change of the water to be tested can be determined according to the transmittance of such red light. In this case, the coliform determination device can be realized at a lower cost than in the case of the above-described embodiment using the expensive absorbance measurement device 6 using a filter for the light receiving device 62.
[0056]
However, in this case, if the water to be tested contains bacteria other than coliform bacteria, it becomes cloudy and the transmittance of red light also decreases. Therefore, the water to be tested is merely cloudy (for convenience, “simple cloudiness” ") Or a color change from blue to blue-green and white turbidity (referred to as" discolored white turbidity "for convenience).
[0057]
Therefore, in this case, in order to discriminate between simple cloudiness and discolored cloudiness, the red light transmittance is determined based on the difference between the transmittance of red light during simple cloudiness and the transmittance of red light during discoloration cloudiness. Set a reference value for discrimination. And when the transmittance | permeability of red light has fallen more than the said reference value, it determines with discoloration cloudiness, and when less than a reference value, it determines with simple cloudiness. Specifically, when the test water does not contain coliform bacteria and contains bacteria other than coliform bacteria, the test water is cultured at 36 ± 1 ° C. for 24 hours in the presence of pyruvate-added XGal-MUG medium. Then, as shown by the dotted line in FIG. 7, the red light transmittance decreases due to simple cloudiness after about 12 hours, but the degree of the decrease is maintained at a constant level. On the other hand, when the water to be tested contains coliforms, the red light transmittance continues to drop sharply after about 15 hours, as shown by the solid line in FIG. For this reason, after 24 hours from the start of the culture (that is, after the end of the culture), there is a large difference (D) in the transmittance of red light between the case of simple white turbidity and the case of discolored white turbidity. Therefore, if an arbitrary reference value X for the transmittance of red light is set within the range of this difference D, the transmittance of red light is higher or lower than the reference value X. It is possible to determine whether it is simple cloudy or discolored cloudy.
[0058]
The difference D described above varies depending on the types and sensitivities of the light emitting device and the light receiving device, and therefore the reference value X for determination is preferably set as appropriate according to the type, sensitivity, and the like.
[0059]
[Experimental example of substrate concentration of synthase substrate]
A prescribed concentration of pyruvate-added XGal-MUG medium and several types of concentrates (concentrated medium) were prepared. Each medium contains Escherichia coli (Gram-negative bacteria), Pseudomonas aeruginosa (Gram-negative bacteria) and Staphylococcus aureus (Gram-positive bacteria) at a concentration of 10²Individually added so that the number of cells / ml was increased and cultured for 9 days, and the presence or absence of fungal growth was confirmed. The results are shown in Tables 1 to 3. In each table, + indicates that the bacteria have grown, and-indicates that the bacteria have not grown.
[0060]
[Table 1]

[0061]
[Table 2]

[0062]
[Table 3]

[0063]
In addition, the concentration of each bacterium in each medium is 10⁷Individually added so that the number of cells / ml was increased and cultured in the same manner, and the presence or absence of fungal growth was confirmed. The results are shown in Tables 4-6. + And − in each table are the same as those in Tables 1 to 3.
[0064]
[Table 4]

[0065]
[Table 5]

[0066]
[Table 6]

[0067]
According to Tables 1 to 6, in the XGaal-MUG medium with a prescribed concentration of pyruvic acid, the added bacteria are grown one day after the start of the culture. On the other hand, the concentrated medium can effectively suppress the growth of bacteria as the concentration factor is higher, even when it contains a high concentration of bacteria. According to this, the synthetic enzyme substrate medium used in the above-mentioned coliform determination apparatus 1 is generally 10 coliforms contained in the water to be tested.²Since the concentration is relatively low at a level of not more than 1 cell / ml, if the concentration rate is 2 times or more, it is difficult for germs to grow even if stored in the reagent tank 40, and the reliability of the determination result is not easily impaired. I understand.
[0068]
【The invention's effect】
Since the coliform group determination apparatus of the present invention includes the container, the temperature control apparatus, the reagent supply apparatus, and the determination apparatus as described above, the presence or absence of the coliform group in the test water is automatically determined by the synthetic enzyme substrate medium method. can do.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an Escherichia coli group determination device according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram of a control device used in the coliform determination device.
FIG. 3 is an operation flowchart of the coliform group determination apparatus.
FIG. 4 is an operation flowchart of the coliform determination apparatus.
FIG. 5 is an operation flowchart of the coliform determination apparatus.
FIG. 6 is a view showing a general visible ultraviolet light absorption spectrum in water to be tested.
FIG. 7 is a diagram showing a general change in transmittance of red light with time in water to be tested containing a synthetic enzyme substrate medium.
[Explanation of symbols]
1 coliform determination device
2 containers
3 Temperature controller
4 Reagent supply device
5 Cleaning liquid supply device
6 Absorbance measuring device
7 Control device
20 Supply path
21 Discharge channel

Claims

A coliform determination apparatus for determining the presence or absence of coliforms in the water under test,
A container for storing the test water;
A temperature adjusting device for adjusting the temperature of the water under test stored in the container;
With respect to the tested water stored in the container, including the 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside which develops a color by reacting with β- galactosidase as chromogenic enzyme substrate A reagent supply device for supplying a synthetic enzyme substrate medium;
Wherein after synthase substrate medium supply, and a determination device for determining the color change of the test water by reaction between the β- galactosidase and the chromogenic enzyme substrate,
The determination device determines the color change of the test water based on a change in transmittance of red light in the test water.
Coliform group determination device .

The coliform group determination apparatus according to claim 1, wherein the synthase substrate medium is an XGal-MUG medium for detecting coliform groups.

The concentration of the synthetic enzyme substrate medium is set to at least twice the specified concentration of the synthetic enzyme substrate medium used in the synthetic enzyme substrate medium method for determining the presence or absence of coliforms in the water under test. Or the coliform determination apparatus according to 2;

A supply path for supplying the water to be tested to the container, a discharge path for discharging the water to be tested stored in the container to the outside of the container, and a cleaning liquid to the container through the supply path The coliform group determination apparatus according to claim 1, 2 or 3, further comprising a cleaning liquid supply apparatus for supplying.

The coliform group determination apparatus according to claim 4, wherein the cleaning liquid contains a bactericide.

6. The device according to claim 4, further comprising a cleaning confirmation device for confirming a cleaning state of the container before the reagent supply device supplies the synthetic enzyme substrate medium to the water to be tested. Coliform group determination device.