JP4015710B2 - 新規擬似糖脂質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な擬似糖脂質に関し、詳しくは、エンドグリコセラミダーゼの基質、発色基質となり得る擬似糖脂質を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖脂質が細胞の分化・増殖を制御する機能分子の１つであるとの認識が定着しつつある。このような認識は、糖脂質組成が空間的及び時間的に細胞の分化とともに変化し、また、外部から加えられた糖脂質によって分化が誘導されるなどの実験結果によるものである。このような研究の中で、従来にないアプローチを可能にしてきたのが、エンドグリコセラミダーゼ（EC 3.2.1.123：以下、「ＥＧＣａｓｅ」ということがある。）の発見である。
【０００３】
ＥＧＣａｓｅは、糖脂質に作用して、その糖鎖とセラミド間を加水分解する酵素（エンド型糖脂質分解酵素）である。この酵素の糖鎖構造に対する基質特異性については、比較的詳しく観察されているが、セラミド部分に関する基質特異性及び構造要求性については明らかにされていない。これは、▲１▼一般に、同一糖鎖を有する糖脂質分子であっても、セラミド部分の構成成分は、脂肪酸及びスフィンゴシンの違いによって著しい分子多様性を示すこと、▲２▼スフィンゴ糖脂質は高価、かつ、希少であること、及び、▲３▼セラミドの化学修飾が困難であること、によるものである。
【０００４】
ＥＧＣａｓｅは微生物から発見されたものであり（Ito, M. & Yamagata, T. (1986) J. Biol. Chem., 261(30), 14278-14282）、今までロドコッカス（Rhodococcus sp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）、環形動物（ヒル、ミミズ）などでは存在が知られているが、哺乳動物からは未だ見出されていない。ＥＧＣａｓｅは、主要な中性スフィンゴ糖脂質及びガングリオシドに作用する酵素であって、哺乳動物における有無あるいは局在部位に興味が持たれている。ＥＧＣａｓｅが哺乳動物から見出されていない理由としては、哺乳動物のＥＧＣａｓｅが触媒することが可能な糖脂質を基質に用いて探索されていないこと、及び基質が高価、かつ、希少であるため十分な探索がなされていないことが考えられる。したがって、入手が容易なＥＧＣａｓｅに対する基質や、今まで知られている糖脂質とはＥＧＣａｓｅに対する受容性が異なる糖脂質が存在すれば、他の微生物や環形動物以外の生物種におけるＥＧＣａｓｅの検索が可能になることが期待される。なお、本明細書において受容性とは、酵素によって認識され、かつ酵素の作用を受けることを言う。換言すれば、酵素の基質となることを言う。
【０００５】
また、従来ＥＧＣａｓｅの酵素反応による糖脂質の加水分解産物の検出は、薄層クロマトグラフィーなどにより行われていたが、多数の試料を分析するには適しているとはいえない。このことも、ＥＧＣａｓｅの検索を困難にしている理由の１つであると考えられる。ＥＧＣａｓｅに対して受容性を有する発色基質があれば、多数の試料を簡便に分析することが可能になると考えられるが、ＥＧＣａｓｅに対する発色基質を指向した化合物は報告されていない。
【０００６】
また、糖脂質の生合成に関わる糖転移酵素に関する研究は緒についたばかりであり、糖脂質の発現制御機構を調べるために、個々の糖転移酵素に対する阻害剤が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、エンドグリコセラミダーゼの基質あるいは糖転移酵素の阻害剤となり得る新規な擬似糖脂質、及び加水分解産物の検出が容易な発色基質を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ガングリオシドを中心とする糖脂質の機能解明に関する研究を行ってきたが、その過程において分子生物学的手法とは異なるアプローチの必要性を認めるに至り、生物学的機能を模倣しうる人工糖脂質の開発を目指してきた。また、そのような人工糖脂質を安価に且つ大量に調製することができるならば、糖鎖生物学、特に糖脂質研究に与える貢献は大きく、多方面への応用が期待できるものである。本発明の掲げる産業上の利用分野もその範疇のひとつである。
【０００９】
従来、ＥＧＣａｓｅの活性測定には、高価且つ希少な天然由来のスフィンゴ糖脂質が用いられてきた。また、その基質特異性を探る研究においては、両親媒性グリコシドとしては最も簡単な構造を有するｎ−アルキルグリコシドが主に用いられてきた。それらは、非常に低いもののＥＧＣａｓｅに対し受容性を示したが、合成基質として実用的なものとはいえず、合成基質は皆無であるといえる状態であった。そこで本発明者らは、比較的簡単な構造でありながらも優れた人工基質を大量且つ安価に開発できないものかと考え、本発明に至った。ラクトシルセラミドがほとんど全ての糖脂質の中間体であること、また、ＥＧＣａｓｅ基質としては最小単位の糖鎖構造であることから、ラクトシルセラミド類縁体を指向した人工糖脂質を開発することとした。具体的には、ラクトシルセラミド中に見られるＮ−アシル基構造が、スフィンゴ糖脂質としての機能発現、他分子との相互作用、物性に重要であろうとの考えから、両親媒性糖脂質のアグリコンにＮ−アシル構造を導入した新規な擬似糖脂質を開発した。本発明者らの研究から、それら新規擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅの優れた基質となることが明らかとなり、また上記概念を発展させて開発した発色基質も高い親和性を有した優れた基質となることが明らかとなり、本発明に至った。当該化合物の高い有用性により、従来煩雑な薄層クロマトグラフィーに依っていた活性検出に簡便な分光学的手法を導入することが可能となり、活性の検出法についてもその問題点を解決することを可能とした。
【００１０】
また最近、糖脂質の細胞内輸送を調べるために、セラミド部分を改変して蛍光色素を結合させたセラミドや糖脂質が使われるようになってきた。
細胞に取り込まれたこれらの物質は、そのセラミド部分の構造により細胞内で運ばれる場所が異なることがわかってきた。この事実と、ラクトシルセラミドが殆どの糖脂質の鍵物質であることに発明者らは着目して、脂溶性部分を改変したグルコシドを合成することに想到した。細胞に取り込まれ、ゴルジをターゲットとする最適な構造の疎水性鎖をラクトースに付けることができれば、ゴルジで糖脂質転移酵素の受容体として機能することが考えられる。ゴルジで糖脂質転移酵素の受容体として働いても、その疎水性の構造により、その先輸送されるためのベシクルに安定に包まれないかもしれないし、あるいは無事に細胞膜まで運ばれてもそこで膜上に安定に発現できないかもしれない。つまり、それまでの糖脂質の発現が狂うことが予想されるので、糖脂質生合成を乱すことで、上記のような物質は糖脂質の機能を調べる試薬として使うことができることが期待できる。一方で、ゴルジに運ぶのに最適化された構造を持つラクトシドがそこで糖転移酵素のよい基質となるならば、ラクトシドの水酸基そのものか、あるいはその近傍を修飾することにより、特定の糖転移酵素の受容体として働くことを阻害する阻害剤となる可能性もある。
【００１１】
上記のような観点から、本発明者らは擬似糖脂質に関する研究を行い、その結果、エンドグリコセラミダーゼの基質となり得る新規な擬似糖脂質を得ることに成功し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち本発明は、下記一般式（１）で表される擬似糖脂質である。
【００１３】
【化１３】
Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−ＮＨＣＯ−Ｒ3 ・・・・ （１）
但し、式（１）中、Ｒ1は単糖数２〜１０の糖残基を、Ｚは酸素原子または硫黄原子を、Ｒ2は低級アルキレン基または置換されていてもよいフェニレン基をそれぞれ示し、また、Ｒ3は−（ＣＨ2）n−ＣＨ3（ｎは２〜２８の整数を表す。）を表す。
【００１４】
また本発明は、上記一般式（１）で表される擬似糖脂質をエンドグリコセラミダーゼに作用させ、前記擬似糖脂質の分解の程度を測定するエンドグリコセラミダーゼの活性の測定法を提供する。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の擬似糖脂質
本発明の擬似糖脂質は、上記一般式（１）で表される化合物である。ここで式（１）中のＲ1は、単糖数２〜１０の糖残基を表すが、本発明においてＲ1は、下記一般式（３）から一般式（９）で表される糖残基から選ばれることが好ましい。
【００１６】
【化１４】
Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（３）
但し、式（３）中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１７】
【化１５】
Ｒ4−Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（４）
但し、式（４）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。なお、この場合は、ガングリオ系列、ラクト・ネオラクト系列、グロボ系列のそれぞれ糖残基、フコース含有糖残基がより好ましい。
【００１８】
【化１６】
Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（５）
但し、式（５）中、Ｍａｎはマンノース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１９】
【化１７】
Ｒ4−Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（６）
但し、式（６）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｍａｎはマンノース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。なお、この場合は、後述の化２５で示されるマンノース含有糖残基がより好ましい。
【００２０】
【化１８】
Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１− ・・・・（７）
但し、式（７）中、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。
【００２１】
【化１９】
Ｒ4−Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１− ・・・・（８）
但し、式（８）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。なお、この場合はガラ系列の糖残基がより好ましい。
【００２２】
【化２０】
Ｒ4−Ｇａｌβ１−６Ｇａｌβ１− ・・・・（９）
但し、式（９）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。なお、この場合はガラ系列の糖残基がより好ましい。
【００２３】
また、上記一般式（４）で表される糖残基のうちより好ましいガングリオ系列、ラクト・ネオラクト系列、グロボ系列の糖残基、フコース含有糖残基の具体例（但し、ラクト・ネオラクト系列の糖残基の具体例には一般式（３）の糖残基を含む）、及び一般式（５）と（６）で表されるマンノース含有糖脂質の糖残基のうちより好ましい糖残基の具体例、並びに一般式（８）、（９）で表される糖残基のうちより好ましいガラ系列の糖残基の具体例（但し、ガラ系列の糖残基の具体例には一般式（７）の糖残基を含む）を挙げると下記式の通りである。なお、下記式中で、NeuAcはアセチルノイラミン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、Fucはフコース残基を表し、Gal、Glc及びManは上記と同じである。
【００２４】
１）ガングリオ系列の糖残基
【００２５】
【化２１】
NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-
２）ラクト・ネオラクト系列の糖残基
【００２６】
【化２２】
Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
３）グロボ系列の糖残基
【００２７】
【化２３】
Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galα1-3Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-3Galα1-3Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galα1-3Galα1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
４）フコース含有糖残基
【００２８】
【化２４】
Fucα1-3GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4Glcβ1-
５）マンノース含有糖残基
【００２９】
【化２５】
GlcNAcβ1-2Manα1-3Manβ1-4Glcβ1-
Manα1-3Manβ1-4Glcβ1-
Manβ1-4Glcβ1-
６）ガラ系列の糖残基
【００３０】
【化２６】
Galβ1-6Galβ1-6Galβ1-
Galα1-4Galβ1-
GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-
また、一般式（１）においてＲ2は、低級アルキレン基または置換されていてもよいフェニレン基等を表すが、本発明においてＲ2は、炭素数２〜６の低級アルキレン基、例えば−ＣＨ2−ＣＨ2−で示されるエチレン基または下記式（２）で表される基であることが好ましい。また、Ｒ2は擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅに対する受容性に大きな影響を及ぼさない限り、他の発色性の基、例えば４−メチルウンベリフェリル誘導体基等に置換することが可能である。
【００３１】
【化２７】
【００３２】
また、上記一般式（１）において、Ｒ3は−（ＣＨ2）n−ＣＨ3（ｎは２〜２８の整数を表す。）を表すが、ｎは６〜１８の整数がさらに好ましく、６〜１４の整数が特に好ましい。また、擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅとの親和性に大きな影響を及ぼさない限り、Ｒ3は置換基や二重結合を有していても差し支えない。
【００３３】
更に、本発明の一般式（１）で表される擬似糖脂質は、下記一般式（１０）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−ラクトシド（以下、「アルキルアミドラクトシド」ともいう）、一般式（１１）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−チオラクトシド（以下、「アルキルアミドチオラクトシド」ともいう）及び一般式（１２）で表される２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ラクトシドが特に好ましい。
【００３４】
【化２８】
【００３５】
但し、式（１０）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
【００３６】
【化２９】
【００３７】
但し、式（１１）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
【００３８】
【化３０】
【００３９】
但し、式（１２）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
上記のような擬似糖脂質は、本発明によりはじめて得られたものであり、ＥＧＣａｓｅに対する基質となる。これらの擬似糖脂質は、各種酵素に対する受容性が従来知られている合成糖脂質であるアルキルラクトシドと異なるので、新規なＥＧＣａｓｅの検索に使用できることが期待できる。
【００４０】
上記擬似糖脂質の中で、Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドは、ＥＧＣａｓｅの種類によっては基質として使用できる一方、ＥＧＣａｓｅの種類によっては阻害剤として使用できることも期待される。
【００４１】
さらに、２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ラクトシドは、加水分解産物の検出を分光学的に簡便に行うことができる発色基質として使用することができる。
【００４２】
＜２＞本発明の擬似糖脂質の製造方法
上記のような本発明の擬似糖脂質は、一般的なグリコシドの製造方法、例えば、グリコシドを形成する糖残基とアグリコンとなる化合物を縮合反応させる方法等によって、製造することができる。この方法で本発明の擬似糖脂質を製造するには、アグリコンとなる化合物として上記一般式（１）のアグリコン部分に示されるような、分子中にアミド結合を有する化合物（ＨＺ−Ｒ2−ＮＨＣＯ−Ｒ3）を用いればよい。
【００４３】
また、擬似糖脂質は、既知の方法でβ体又はα体を選択的に製造することや、β体からα体に変換することや、β体及びα体の混合物を既知の方法で分別することが可能である（第４版 実験化学講座２６ 有機合成VIII, 丸善, p267〜330、Can.J.Chem.57(1979), p2085）。
【００４４】
本発明の擬似糖脂質を製造するには、あるいは、はじめに糖とアミノ基を有するアグリコンを縮合反応させてアミノ基を有するグリコシド（Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−ＮＨ2）を製造し、このグリコシドのアミノ基に炭素数４〜３０の直鎖脂肪酸（Ｒ3−ＣＯＯＨ）またはその反応性誘導体を酸アミド結合させる方法をとってもよい。
【００４５】
これらの製造方法においては、必要に応じて糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、上記糖とアグリコンを縮合反応させ、必要に応じて更にグリコシドのアグリコンを酸アミド化合物とした後に、糖部分の脱保護を行い水酸基に戻すことが行われる。
【００４６】
本発明の擬似糖脂質の製造方法を具体的に説明すると、一般式（１）においてＲ2が低級アルキレン基、Ｚが酸素原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−グリコシドを製造する場合には、まず、糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、これに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルアルコール（アルキル部分は炭素数２〜６）をトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）等を触媒として縮合反応させてＮ−Ｆｍｏｃ−アミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシドとする。次いで、これを脱Ｆｍｏｃ化し、得られたアミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシドに炭素数４〜３０の直鎖脂肪酸の酸ハロゲン化物をアミド結合させてＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシド（アシル部分の炭素数は４〜３０）とし、最後にこれにナトリウムアルコキシド等を加えて脱アセチル化すれば、目的のＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−グリコシドが得られる。
【００４７】
同様に一般式（１）においてＲ2が低級アルキレン基、Ｚが硫黄原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノアルキル−チオグリコシドを製造する場合には、上記９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルアルコールの代わりに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルチオールを用いればよい。
【００４８】
また、一般式（１）においてＲ2が置換されていてもよいフェニレン基、Ｚが酸素原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−グリコシド（フェニル部分はニトロ基等で置換されていてもよい。以下、同様）を製造する場合には、まず、糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、更に糖の１位に臭素を導入する。これに、Ｎ−アシル−アミノフェノール（アシル部分の炭素数は４〜３０）のナトリウム塩を反応させ、Ｎ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−アセチルグリコシドとし、最後にこれにナトリウムアルコキシド等を加えて脱アセチル化すれば、目的のＮ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−グリコシドが得られる。
【００４９】
同様に、一般式（１）においてＲ2が置換されていてもよいフェニレン基、Ｚが硫黄原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノフェニル−チオグリコシド（フェニル部分はニトロ基等で置換されていてもよい。以下、同様）を製造する場合には、上記Ｎ−アシル−アミノフェノールをＮ−アシル−アミノベンゼンチオールに代えて反応を行えばよい。
【００５０】
更に、本発明の擬似糖脂質のより具体的な製造方法を、上記一般式（１０）、（１１）及び（１２）で表される擬似糖脂質を例にして以下に説明する。
【００５１】
〔１〕Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造
Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造方法を化３１に基づいて説明する。
【００５２】
【化３１】
【００５３】
但し、化３１中Ｒは、−（ＣＨ2）k−ＣＨ3（ｋは６〜１８の整数）を表す。
まず、アミノエタノール（化合物（１３））と９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）をジクロロメタン中で反応させ（反応ｉ）９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール（化合物（１４））を得る。
【００５４】
次に、無水酢酸にラクトースと酢酸カリウムの混合物を加えて反応させて得られたアセチルラクトース（化合物（１５））と上記化合物（１４）をジクロロメタンに溶解し必要に応じてモレキュラーシーブスを加え密栓して室温で一夜程度撹拌し、これにトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）を加えて室温で、２〜３時間撹拌する（反応ii）。得られた反応液を冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ入れ、更にこれにクロロホルムを加えて反応生成物であるＮ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１６））を抽出後、炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄する。クロロホルム層を取り出し減圧濃縮して上記化合物（１６）を含む黄色シロップを得る。
【００５５】
この黄色シロップをモルホリンに溶かし、室温で２０〜３０分程度撹拌して黄色シロップ中の化合物（１６）の脱Ｆｍｏｃ化を行う（反応iii）。その後、この溶液にトルエンを加え更にこれを減圧濃縮した後、反応生成物であるアミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１７））をクロロホルム中に抽出し、これを水洗した後濃縮して化合物（１７）を含有する淡黄色シロップを得る。
【００５６】
更に上記淡黄色シロップをピリジンに溶解させ、炭素数が８〜２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物のいずれか１種を加えて室温で一晩撹拌して反応させる（反応iv）。反応液を冷水に注ぎ込みクロロホルムで、Ｎ−アシル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１８））を抽出し、これを冷希硫酸、蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。クロロホルム層を脱水処理した後、これを減圧濃縮して化合物（１８）を含むシロップを得る。
【００５７】
このシロップにナトリウムメトキシドを加え、シロップ中の化合物（１８）を脱アセチル化して（反応V）、Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１９））粗製物を得る。
【００５８】
この様にして得られるＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−ラクトシドの精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６０：２５：４）等を用いて通常の方法で行うことができる。
【００５９】
〔２〕Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドの製造
Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドは、上記Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造方法において、アミノエタノールの代わりにシステアミン（ＨＳ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2）を用いた以外は全く同様にして製造することができる。
【００６０】
〔３〕２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−ラクトシドの製造
上記と同様にして得られたアセチルラクトースを酢酸中に溶かし、この溶液を４〜８℃の水浴中に入れ撹拌しながら、これに臭化水素酢酸溶液をゆっくり滴下し、これを３時間撹拌して十分に反応させた後、得られた反応液を冷水中に注ぎ込み、更にこれにクロロホルムを加えてアセトブロモラクトースを抽出する。クロロホルム層を取り出し、これを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および蒸留水で洗浄した後、これを減圧濃縮してクロロホルムを除去して、シロップ状のアセトブロモラクトース粗製物を得る。
【００６１】
２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮＰ）をベンゼンに懸濁し、これにナトリウムメトキシドメタノール溶液を加えて室温で２〜３時間撹拌した後、約４℃で一晩保存する。その後、析出したＨＮＰナトリウム塩の結晶を濾過により取り出し、これを冷メタノールで洗浄した後乾燥する。このＨＮＰナトリウム塩をアセトンに溶かし、この溶液に、上記で得られたアセトブロモラクトースを含むアセトン溶液を加えて１〜３時間撹拌した後、６〜８時間の煮沸還流を行う。得られた反応液に１Ｎ塩酸を加えて酸性にした後、濾過により不溶部を除去し得られた濾液を濃縮してシロップを得る。このシロップに含まれる２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシドをナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化した後、エタノールにより２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−ラクトシドを結晶化する。
【００６２】
＜３＞本発明のエンドグリコセラミダーゼの活性測定法
上記本発明の擬似糖脂質を用いることにより、エンドグリコセラミダーゼ活性の測定が可能であり、酵素の作用及び基質特異性を調べることができる。エンドグリコセラミダーゼ活性の測定に用いる擬似糖脂質としては、アルキルアミドグリコシドや発色基質が導入されたアルキルアミドグリコシドが特に好ましい。アルキルアミドグリコシドを用いてのエンドグリコセラミダーゼ活性の測定は、例えば次のような方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
まず、アルキルアミドグリコシドとエンドグリコセラミダーゼもしくは該酵素を含む試料とを混合し、エンドグリコセラミダーゼが作用する温度、ｐＨでインキュベーションを行う。インキュベーションの温度、ｐＨ等の条件は、エンドグリコセラミダーゼの由来や種類等により当業者が適宜選択しうるものであるが、温度としては３７℃付近、ｐＨとしては約５．０〜６．５を例示することができる。インキュベーションは酢酸緩衝液等の緩衝液中で行うことが好ましく、また界面活性剤を共存させることが好ましい。界面活性剤の種類や、その濃度は、当業者が適宜選択しうるものであるが、例えば、０．４％程度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００や２．５μｇ／μＬ程度のタウロデオキシコール酸ナトリウム等を例示することができる。インキュベーションの時間は、インキュベーションの条件により変更しうるが、３０分〜１６時間を例示することができる。
【００６４】
インキュベーション後の混合溶液を、例えば薄層クロマトグラフィー等に付し、適当な展開溶媒により展開し、オルシノール−硫酸等の糖を発色させる試薬で糖を視覚化することにより検出する。エンドグリコセラミダーゼによりアルキルアミドグリコシドが切断されると（すなわちエンドグリコセラミダーゼがアルキルアミドグリコシドに対して活性を有すると）、糖のクロマトグラフィー上の位置が、切断されていないアルキルアミドグリコシドに比較して異なるので、これによりエンドグリコセラミダーゼ活性を測定することができる。なお、必要に応じてクロマトスキャナーを用いることによりエンドグリコセラミダーゼ活性の定量を行うことができる。
【００６５】
また、ｐ−ニトロフェノール等の発色基質を導入したアルキルアミドグリコシドを用いることにより、より簡単にエンドグリコセラミダーゼ活性の測定を行うことができる。上記アルキルアミドグリコシドとエンドグリコセラミダーゼとをインキュベーションする。酵素反応を、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）等により停止させ、エタノール等により糖を不溶化し、遠心により糖を沈殿させる。これより、上清には、エンドグリコセラミダーゼにより切断された発色基質を含むＮ−アシル鎖誘導体が含まれる。この上清の発色を分光光度計等により検出することにより、エンドグリコセラミダーゼ活性の定量的な測定が可能である。なお、分光光度計の測定波長は、用いた発色基質により異なるが、例えば、ｐ−ニトロフェノールを発色基質として用いた場合、４１０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
【００６６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。まずはじめに、ＥＧＣａｓｅの基質としてのコントロールに用いたｎ−アルキルラクトシド及びｎ−オクチルチオラクトシドについて製造例を説明する。
【００６７】
【製造例１】
ｎ−アルキルラクトシド
（１）アセチル−Ｄ−ラクトースの合成
２００ｍＬの無水酢酸にＤ−ラクトース３４ｇと酢酸カリウム１６ｇの混合物を加え、油浴上１４０℃に加熱し撹拌しながら１時間反応させた。この時、前記混合物は１３０℃前後で溶解した。１時間の反応後、反応液を油浴から取り出し冷却してから、反応液の容量が２／３になるまで減圧濃縮を行った。濃縮された反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を中和するまで加え、これに更にクロロホルム４００ｍＬを加えてアセチル−Ｄ−ラクトースを抽出した。溶液全体を水洗した後、クロロホルム層を取り出してこれを減圧濃縮し、得られた濃縮物を熱エタノールにより結晶化してアセチル−Ｄ−ラクトースを得た。収率は８４％であった。
【００６８】
（２）ｎ−アルキルラクトシドの合成
上記で得られたアセチル−Ｄ−ラクトース３．４ｇ（５ｍｍｏｌ）をモレキュラーシーブス４Ａを含むジクロロメタン４０ｍＬに溶かし１００ｍＬ共栓三角フラスコ中に密閉して１時間撹拌した。これに四塩化スズ０．６ｍＬを加え、更に２０ｍＬのジクロロメタンに１−ドデカノール（炭素数１２の脂肪族直鎖アルコール）１．３５ｍＬを添加した溶液を加え、密閉して室温で５時間撹拌した。その後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中にゆっくり注ぎ入れ、更にこれを水洗した後、有機層のみを取り出して減圧濃縮した。これにより得られたｎ−ドデシル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ラクトシドのα体とβ体を乾式カラムクロマトグラフィーによって分離精製した。
【００６９】
得られたｎ−ドデシル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ラクトシドのα体とβ体を別々にメタノールに懸濁あるいは溶解させ、それぞれの懸濁液（又は溶液）にナトリウムメトキシドを加えて１０時間撹拌して、上記化合物を脱アセチル化した。次いで、これらの懸濁液（又は溶液）を撹拌しながら、これに陽イオン交換樹脂ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ+）を加え、濾過後、それぞれの濾液を減圧濃縮してｎ−ドデシル−Ｄ−ラクトシドのα体及びβ体を得た。
【００７０】
また、上記１−ドデカノールの代わりに炭素数４の脂肪族直鎖アルコールを用いた以外は上記と同様の反応を行い、更に、炭素数６、８、１０、１４、１６、１８の脂肪族直鎖アルコールについても同様の反応を行い、それぞれのアルコールに対応するｎ−アルキル−Ｄ−ラクトシドのα体、β体をそれぞれ製造した。
【００７１】
【製造例２】
ｎ−オクチルチオラクトシド
上記製造例１において、１−ドデカノールを用いる代わりに、ｎ−オクタンチオールを用いた以外は、上記製造例１と同様の反応を行い、ｎ−オクチル−Ｄ−チオラクトシドのα体、β体をそれぞれ得た。
【００７２】
【実施例１】
Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド
（１）９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール（Ｆｍｏｃ−ＡＥ）の合成
アミノエタノール２ｍＬと９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）１０ｇをジクロロメタン１００ｍＬ中で等モルのトリエチルアミン存在下で室温で２時間反応させた後、反応液を０．１Ｎ塩酸水溶液、蒸留水で順次洗浄した。有機層を脱水後、濃縮し目的物を結晶化させて９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノールを得た。
【００７３】
（２）Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの合成
上記製造例１と同様にして得られたアセチル−Ｄ−ラクトース６．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）と上記９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール２．８３ｇ（１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２００ｍＬに溶解し、モレキュラーシーブス４Ａを約６ｇ加え密栓して一夜室温で撹拌した。更に、これにトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）１．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）を加え３時間室温で撹拌した。得られた反応液を冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ入れ、これにクロロホルムを加えて反応物を抽出後、炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄した。クロロホルム層を取り出し、これを減圧濃縮して、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを含む黄色シロップを得た。
【００７４】
この黄色シロップを精製することなくモルホリン２０ｍＬに溶かし、室温で２０分間撹拌して黄色シロップ中のＮ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの脱Ｆｍｏｃ化を行った。その後、この溶液にトルエン１００ｍＬを加え、これを減圧濃縮後、アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをクロロホルム中に抽出し、これを水洗後濃縮して淡黄色シロップを得た。この淡黄色シロップをピリジン２０ｍＬに溶解させ、これにラウロイルクロリド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌを加えて一夜室温で撹拌して反応させた。反応液を冷水に注ぎ込み、クロロホルムでＮ−ラウロイル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを抽出し、これを冷希硫酸（０．２Ｍ）、蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム層を脱水処理した後、これを減圧濃縮し上記化合物を含むシロップを得た。このシロップにナトリウムメトキシドを加え、シロップ中のＮ−ラウロイル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを脱アセチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６０：２５：４）で精製して、Ｎ−ラウロイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを得た。
【００７５】
また、上記ラウロイルクロリドの代わりに、炭素数が８の直鎖脂肪酸の酸塩化物を用いた以外は上記と同様の反応を行い、更に、炭素数１６、２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物についても同様の反応を行い、それぞれの直鎖脂肪酸の酸塩化物に対応するＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをそれぞれ製造した。
【００７６】
上記で得られた４種類のＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて元素分析を行った。結果を以下に示す。
【００７７】
(i)Ｎ−オクタノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が８の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００７８】
【表１】
表１
【００７９】
(ii)Ｎ−ラウロイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８０】
【表２】
表２
【００８１】
(iii)Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が１６の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８２】
【表３】
表３
【００８３】
(iv)Ｎ−エイコサノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８４】
【表４】
表４
【００８５】
また、Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについては、1Ｈ−ＮＭＲの測定も行った。結果を以下に示す。
δ（２７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ＝９５：５）
０．８９（ｔ,３Ｈ,Ｊ ６．２Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ3）,
１．２２−１．３３（ｍ,２４Ｈ,（ＣＨ2）12ＣＨ3）,
１．５２（ｍ,２Ｈ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
２．１０（ｔ,２Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
４．２５（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．６Ｈｚ,Ｈ−１）,
４．２５（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．６Ｈｚ,Ｈ−１'）
【００８６】
【実施例２】
Ｎ−パルミトイル−アミノエチル−β−Ｄ−チオラクトシド上記実施例１においてアミノエタノールの代わりにシステアミンを用い、更にラウロイルクロリド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌの代わりにパルミトイルクロリド（炭素数が１６の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌを用いた以外は、上記実施例１と同様に反応を行い、Ｎ−パルミトイル−アミノエチル−β−Ｄ−チオラクトシドを得た。
【００８７】
【実施例３】
２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド
（１）アセトブロモラクトースの合成
上記製造例１と同様にして得られたアセチル−Ｄ−ラクトース３．４ｇを酢酸５０ｍＬ中に溶かし、この溶液を２０℃の水浴中に入れ撹拌しながら、これに２５％臭化水素酢酸溶液３．５ｍＬをゆっくり滴下した。その後これを３時間撹拌して十分に反応させた後、得られた反応液を冷水中に注ぎ込み、更にこれにクロロホルムを加えてアセトブロモ−Ｄ−ラクトースを抽出した。クロロホルム層を取り出し、これを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および蒸留水で洗浄した後、これを減圧濃縮してクロロホルムを除去して、シロップ状のアセトブロモ−Ｄ−ラクトース粗製物を得た。
【００８８】
（２）２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの合成
２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮＰ）２．０ｇをベンゼン５０ｍＬに懸濁し、これに０．５Ｍナトリウムメトキシドメタノール溶液を１０ｍＬ加えて室温で２時間撹拌した後、４℃で一夜保存した。その後、析出したＨＮＰナトリウム塩の結晶を濾過により取り出し、これを冷メタノールで洗浄した後乾燥した。このＨＮＰナトリウム塩１．２４ｇをアセトンに溶かし、この溶液に、上記（１）で得られたアセトブロモラクトース約３ｍｍｏｌを含むアセトン溶液を加えて１時間撹拌した後、６時間の煮沸還流を行った。得られた反応液に１Ｎ塩酸を加えて酸性にした後、濾過により不溶部を除去し得られた濾液を濃縮してシロップを得た。このシロップに含まれる２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化した後、エタノールにより２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを結晶化して得た。
【００８９】
上記で得られた２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて、元素分析及び1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。結果を以下に示す。
【００９０】
【表５】
表５
【００９１】
（ＮＭＲデータ）
δ（２７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ＝９５：５）
０．８９（ｔ,３Ｈ,Ｊ ６．６Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ3）,
１．２２−１．４０（ｍ,２４Ｈ,（ＣＨ2）12ＣＨ3）,
１．６６（ｍ,２Ｈ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
２．４８（ｔ,２Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
７．４２（ｄ,１Ｈ,Ｊ ９．２Ｈｚ,フェニル）,
７．９８（ｄｄ,１Ｈ,Ｊ ９．２Ｈｚ,Ｊ ２．６Ｈｚ,フェニル）,
９．０９（ｄ,１Ｈ,Ｊ ２．６Ｈｚ,フェニル）,
４．３２（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．０Ｈｚ,Ｈ−１'）,
５．０８（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,Ｈ−１）
【００９２】
【実施例４】
擬似糖脂質のＥＧＣａｓｅに対する基質としての評価
上記実施例で得られた擬似糖脂質のＥＧＣａｓｅに対する基質としての評価を行った。ＥＧＣａｓｅとしては、ロドコッカス（Rhodococcus sp.）由来のＥＧＣａｓｅ（生化学工業（株）製）、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）由来のＥＧＣａｓｅ（Eur.J.Biochem.205(1992),p729-735,京都大学農学部山本憲二助教授より恵与）、及びヒル（leech）由来のＥＧＣａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。
【００９３】
ロドコッカス由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）中で、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）中で、及びヒル（leech）由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２．５μｇ／μｌタウロデオキシコール酸ナトリウムを含む）中で行った。
【００９４】
アルキルラクトシド、アルキルアミドラクトシド、アルキルアミドチオラクトシド、及びｎ−オクチルチオラクトシドのＥＧＣａｓｅによる加水分解は、基質１ｍＭに適当量の酵素を加え、３７℃で１６時間反応させることにより行った。尚、酵素量は、上記条件で反応を行ったとき、すべての種類の基質を完全に加水分解しない量とした。反応後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ、メルク社製）により反応生成物の分析を行った。糖の発色にはオルシノール−硫酸を用い、必要に応じてクロマトスキャナー（島津製作所製ＣＳ−９０００）を用いて定量を行った。結果を図１に示す。図１に示したグラフの横軸は、アルキルラクトシドのアルキル鎖又はアルキルアミドラクトシドのアシル鎖の炭素数を表す。また、横軸のＳ１６は、Ｃ１６のアルキルアミドチオラクトシドを表す。縦軸は加水分解された基質の割合（％）を示す。
【００９５】
微生物由来のＥＧＣａｓｅを用いた場合には、アルキルラクトシドではＣ１０〜Ｃ１２の鎖長を有するβ−Ｏ−ラクトシドが比較的高い加水分解を受けた。一方、アルキルアミドラクトシドでは全般に加水分解反応を受ける割合が非常に高くなり、中でもＣ１２の鎖長を有するラクトシドが最もよく分解された。すなわち、微生物由来のＥＧＣａｓｅでは、その基質認識の際に少なくともセラミド中のＮ−アシル構造までがその十分な認識に必要であろうことが示唆された。また、加水分解の鎖長依存性にはおそらく、鎖長の短いものでは疎水性が十分でないことが、より長鎖の化合物では溶解性に乏しいことが、各々寄与しているものと考えられる。
【００９６】
また、生体中には存在しないためその基質としての有効性が考えられていなかった、アルキル−α−Ｏ−ラクトシドもβ体に比べると低いもののＥＧＣａｓｅに対する受容性を示し、遊離ラクトースが確認されたことから、ＥＧＣａｓｅの新たな基質特異性が確認された。
【００９７】
これに対し、ｎ−ヘキサデカノイル−２−アミノエチルチオラクトシド及びｎ−オクチルチオラクトシドは、同鎖長のＯ−ラクトシドがＥＧＣａｓｅに対して受容性を有していたのに比べ、非常に弱くしか加水分解を受けなかったが、同鎖長のアルキルラクトシドよりは高い加水分解率を示した。
【００９８】
一方、ヒル由来のＥＧＣａｓｅを用いた場合には、アルキルアミドラクトシドの加水分解率は、アシル鎖がＣ１６及びＣ２０のものについてはアルキルラクトシドよりも低かったが、アシル鎖がＣ８及びＣ１２のものについてはアルキルラクトシドよりも高かった。また、アルキルアミドチオラクトシドは、ヒル由来のＥＧＣａｓｅに対してほとんど受容性を示さなかった。したがって、アルキルアミドチオラクトシドは、ＥＧＣａｓｅの種類によっては基質として使用できるとともに、ＥＧＣａｓｅの種類によっては親和性はあるものの、加水分解は受けにくいと考えられることから阻害剤として使用できることも期待できる。
【００９９】
このように、ヒル由来の酵素は、微生物由来のＥＧＣａｓｅとは全く異なった基質特異性を示すことが、本発明により初めて明らかとなった。従来は、ＥＧＣａｓｅの基質となる糖脂質のアグリコンに必要な構造としては、ただ単にある程度の長さ（Ｃ６）の疎水性構造のみでよいと考えられていたが、本発明により、Ｃ１２程度以上の鎖長が酵素による十分な認識には必要であり、それ以上は長さによって大きな影響がないことが見出された。
【０１００】
以上の結果から、ＥＧＣａｓｅの基質としては、その疎水性構造中にＮ−アシル構造を有する化合物が優れていることが明らかとなった。そこで、Ｎ−アシル構造を持たせたまま発色基質となる擬似糖脂質が得られることを期待して、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを上記のようにして合成し、ＥＧＣａｓｅの基質としての評価を行った。また、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて、上記の各酵素に対する親和性を見積もるために、各酵素反応におけるミカエリス定数（Ｋｍ値）を測定した。酵素反応は、５０μｌ中で３７℃で３０分行った後に、反応液に０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）を５０μｌ加えて酵素反応を停止させた。これにエタノール１００μｌを加えた後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清について波長４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度から酵素の触媒量を算出し、酵素反応の初速度とした。結果を表６に示す。また、文献で報告されているガングリオシド（ＧM1）に対する各種ＥＧＣａｓｅのＫｍ値を同時に示す。
【０１０１】
【表６】
表６
【０１０２】
表６に示したように、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドは、用いたすべてのＥＧＣａｓｅに対して、高い受容性を示し、また非常に高い親和性を有することが示唆された。さらに、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドはＥＧＣａｓｅの酵素反応により加水分解され、ｐ−ニトロフェノール誘導体が遊離して発色し、発色基質として機能し、分光学的手法により簡便にＥＧＣａｓｅ活性を定量することが可能となった。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明により、ＥＧＣａｓｅに対する基質となる新規な擬似糖脂質が得られた。この擬似糖脂質は、各種酵素に対する受容性が従来知られている合成糖脂質であるアルキルラクトシドと異なるので、新規なＥＧＣａｓｅの検索に使用できることが期待できる。また、本発明により得られる発色基質は、加水分解産物の検出を分光学的に簡便に行うことができるので、エンドグリコセラミダーゼの活性測定が容易となる。また、本発明の擬似糖脂質、特に二重結合をアシル基末端に有する擬似糖脂質を、基質としてゲル電気泳動の担体に共有結合させて、酵素の電気泳動を行い基質の分解を測定する方法（Zymography）に使用できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 各種エンドグリコセラミダーゼに対する擬似糖脂質の受容性を示すグラフ図。グラフの横軸は、アルキルラクトシドのアルキル鎖又はアルキルアミドラクトシドのアシル鎖の炭素数を表す。また、横軸のＳ１６は、Ｃ１６のアルキルアミドチオラクトシドを表す。縦軸は加水分解された基質の割合（％）を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な擬似糖脂質に関し、詳しくは、エンドグリコセラミダーゼの基質、発色基質となり得る擬似糖脂質を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖脂質が細胞の分化・増殖を制御する機能分子の１つであるとの認識が定着しつつある。このような認識は、糖脂質組成が空間的及び時間的に細胞の分化とともに変化し、また、外部から加えられた糖脂質によって分化が誘導されるなどの実験結果によるものである。このような研究の中で、従来にないアプローチを可能にしてきたのが、エンドグリコセラミダーゼ（EC 3.2.1.123：以下、「ＥＧＣａｓｅ」ということがある。）の発見である。
【０００３】
ＥＧＣａｓｅは、糖脂質に作用して、その糖鎖とセラミド間を加水分解する酵素（エンド型糖脂質分解酵素）である。この酵素の糖鎖構造に対する基質特異性については、比較的詳しく観察されているが、セラミド部分に関する基質特異性及び構造要求性については明らかにされていない。これは、▲１▼一般に、同一糖鎖を有する糖脂質分子であっても、セラミド部分の構成成分は、脂肪酸及びスフィンゴシンの違いによって著しい分子多様性を示すこと、▲２▼スフィンゴ糖脂質は高価、かつ、希少であること、及び、▲３▼セラミドの化学修飾が困難であること、によるものである。
【０００４】
ＥＧＣａｓｅは微生物から発見されたものであり（Ito, M. & Yamagata, T. (1986) J. Biol. Chem., 261(30), 14278-14282）、今までロドコッカス（Rhodococcus sp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）、環形動物（ヒル、ミミズ）などでは存在が知られているが、哺乳動物からは未だ見出されていない。ＥＧＣａｓｅは、主要な中性スフィンゴ糖脂質及びガングリオシドに作用する酵素であって、哺乳動物における有無あるいは局在部位に興味が持たれている。ＥＧＣａｓｅが哺乳動物から見出されていない理由としては、哺乳動物のＥＧＣａｓｅが触媒することが可能な糖脂質を基質に用いて探索されていないこと、及び基質が高価、かつ、希少であるため十分な探索がなされていないことが考えられる。したがって、入手が容易なＥＧＣａｓｅに対する基質や、今まで知られている糖脂質とはＥＧＣａｓｅに対する受容性が異なる糖脂質が存在すれば、他の微生物や環形動物以外の生物種におけるＥＧＣａｓｅの検索が可能になることが期待される。なお、本明細書において受容性とは、酵素によって認識され、かつ酵素の作用を受けることを言う。換言すれば、酵素の基質となることを言う。
【０００５】
また、従来ＥＧＣａｓｅの酵素反応による糖脂質の加水分解産物の検出は、薄層クロマトグラフィーなどにより行われていたが、多数の試料を分析するには適しているとはいえない。このことも、ＥＧＣａｓｅの検索を困難にしている理由の１つであると考えられる。ＥＧＣａｓｅに対して受容性を有する発色基質があれば、多数の試料を簡便に分析することが可能になると考えられるが、ＥＧＣａｓｅに対する発色基質を指向した化合物は報告されていない。
【０００６】
また、糖脂質の生合成に関わる糖転移酵素に関する研究は緒についたばかりであり、糖脂質の発現制御機構を調べるために、個々の糖転移酵素に対する阻害剤が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、エンドグリコセラミダーゼの基質あるいは糖転移酵素の阻害剤となり得る新規な擬似糖脂質、及び加水分解産物の検出が容易な発色基質を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ガングリオシドを中心とする糖脂質の機能解明に関する研究を行ってきたが、その過程において分子生物学的手法とは異なるアプローチの必要性を認めるに至り、生物学的機能を模倣しうる人工糖脂質の開発を目指してきた。また、そのような人工糖脂質を安価に且つ大量に調製することができるならば、糖鎖生物学、特に糖脂質研究に与える貢献は大きく、多方面への応用が期待できるものである。本発明の掲げる産業上の利用分野もその範疇のひとつである。
【０００９】
従来、ＥＧＣａｓｅの活性測定には、高価且つ希少な天然由来のスフィンゴ糖脂質が用いられてきた。また、その基質特異性を探る研究においては、両親媒性グリコシドとしては最も簡単な構造を有するｎ−アルキルグリコシドが主に用いられてきた。それらは、非常に低いもののＥＧＣａｓｅに対し受容性を示したが、合成基質として実用的なものとはいえず、合成基質は皆無であるといえる状態であった。そこで本発明者らは、比較的簡単な構造でありながらも優れた人工基質を大量且つ安価に開発できないものかと考え、本発明に至った。ラクトシルセラミドがほとんど全ての糖脂質の中間体であること、また、ＥＧＣａｓｅ基質としては最小単位の糖鎖構造であることから、ラクトシルセラミド類縁体を指向した人工糖脂質を開発することとした。具体的には、ラクトシルセラミド中に見られるＮ−アシル基構造が、スフィンゴ糖脂質としての機能発現、他分子との相互作用、物性に重要であろうとの考えから、両親媒性糖脂質のアグリコンにＮ−アシル構造を導入した新規な擬似糖脂質を開発した。本発明者らの研究から、それら新規擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅの優れた基質となることが明らかとなり、また上記概念を発展させて開発した発色基質も高い親和性を有した優れた基質となることが明らかとなり、本発明に至った。当該化合物の高い有用性により、従来煩雑な薄層クロマトグラフィーに依っていた活性検出に簡便な分光学的手法を導入することが可能となり、活性の検出法についてもその問題点を解決することを可能とした。
【００１０】
また最近、糖脂質の細胞内輸送を調べるために、セラミド部分を改変して蛍光色素を結合させたセラミドや糖脂質が使われるようになってきた。
細胞に取り込まれたこれらの物質は、そのセラミド部分の構造により細胞内で運ばれる場所が異なることがわかってきた。この事実と、ラクトシルセラミドが殆どの糖脂質の鍵物質であることに発明者らは着目して、脂溶性部分を改変したグルコシドを合成することに想到した。細胞に取り込まれ、ゴルジをターゲットとする最適な構造の疎水性鎖をラクトースに付けることができれば、ゴルジで糖脂質転移酵素の受容体として機能することが考えられる。ゴルジで糖脂質転移酵素の受容体として働いても、その疎水性の構造により、その先輸送されるためのベシクルに安定に包まれないかもしれないし、あるいは無事に細胞膜まで運ばれてもそこで膜上に安定に発現できないかもしれない。つまり、それまでの糖脂質の発現が狂うことが予想されるので、糖脂質生合成を乱すことで、上記のような物質は糖脂質の機能を調べる試薬として使うことができることが期待できる。一方で、ゴルジに運ぶのに最適化された構造を持つラクトシドがそこで糖転移酵素のよい基質となるならば、ラクトシドの水酸基そのものか、あるいはその近傍を修飾することにより、特定の糖転移酵素の受容体として働くことを阻害する阻害剤となる可能性もある。
【００１１】
上記のような観点から、本発明者らは擬似糖脂質に関する研究を行い、その結果、エンドグリコセラミダーゼの基質となり得る新規な擬似糖脂質を得ることに成功し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち本発明は、下記一般式（１）で表される擬似糖脂質である。
【００１３】
【化１３】
Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−ＮＨＣＯ−Ｒ3 ・・・・ （１）
但し、式（１）中、Ｒ1は単糖数２〜１０の糖残基を、Ｚは酸素原子または硫黄原子を、Ｒ2は低級アルキレン基または置換されていてもよいフェニレン基をそれぞれ示し、また、Ｒ3は−（ＣＨ2）n−ＣＨ3（ｎは２〜２８の整数を表す。）を表す。
【００１４】
また本発明は、上記一般式（１）で表される擬似糖脂質をエンドグリコセラミダーゼに作用させ、前記擬似糖脂質の分解の程度を測定するエンドグリコセラミダーゼの活性の測定法を提供する。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の擬似糖脂質
本発明の擬似糖脂質は、上記一般式（１）で表される化合物である。ここで式（１）中のＲ1は、単糖数２〜１０の糖残基を表すが、本発明においてＲ1は、下記一般式（３）から一般式（９）で表される糖残基から選ばれることが好ましい。
【００１６】
【化１４】
Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（３）
但し、式（３）中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１７】
【化１５】
Ｒ4−Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（４）
但し、式（４）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。なお、この場合は、ガングリオ系列、ラクト・ネオラクト系列、グロボ系列のそれぞれ糖残基、フコース含有糖残基がより好ましい。
【００１８】
【化１６】
Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（５）
但し、式（５）中、Ｍａｎはマンノース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１９】
【化１７】
Ｒ4−Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１− ・・・・（６）
但し、式（６）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｍａｎはマンノース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。なお、この場合は、後述の化２５で示されるマンノース含有糖残基がより好ましい。
【００２０】
【化１８】
Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１− ・・・・（７）
但し、式（７）中、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。
【００２１】
【化１９】
Ｒ4−Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１− ・・・・（８）
但し、式（８）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。なお、この場合はガラ系列の糖残基がより好ましい。
【００２２】
【化２０】
Ｒ4−Ｇａｌβ１−６Ｇａｌβ１− ・・・・（９）
但し、式（９）中、Ｒ4は単糖数１〜８の糖残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を表す。なお、この場合はガラ系列の糖残基がより好ましい。
【００２３】
また、上記一般式（４）で表される糖残基のうちより好ましいガングリオ系列、ラクト・ネオラクト系列、グロボ系列の糖残基、フコース含有糖残基の具体例（但し、ラクト・ネオラクト系列の糖残基の具体例には一般式（３）の糖残基を含む）、及び一般式（５）と（６）で表されるマンノース含有糖脂質の糖残基のうちより好ましい糖残基の具体例、並びに一般式（８）、（９）で表される糖残基のうちより好ましいガラ系列の糖残基の具体例（但し、ガラ系列の糖残基の具体例には一般式（７）の糖残基を含む）を挙げると下記式の通りである。なお、下記式中で、NeuAcはアセチルノイラミン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、Fucはフコース残基を表し、Gal、Glc及びManは上記と同じである。
【００２４】
１）ガングリオ系列の糖残基
【００２５】
【化２１】
NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-
２）ラクト・ネオラクト系列の糖残基
【００２６】
【化２２】
Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-
３）グロボ系列の糖残基
【００２７】
【化２３】
Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galα1-3Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcβ1-3Galα1-3Galβ1-4Glcβ1-
GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galα1-3Galα1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-
４）フコース含有糖残基
【００２８】
【化２４】
Fucα1-3GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4Glcβ1-
５）マンノース含有糖残基
【００２９】
【化２５】
GlcNAcβ1-2Manα1-3Manβ1-4Glcβ1-
Manα1-3Manβ1-4Glcβ1-
Manβ1-4Glcβ1-
６）ガラ系列の糖残基
【００３０】
【化２６】
Galβ1-6Galβ1-6Galβ1-
Galα1-4Galβ1-
GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-
また、一般式（１）においてＲ2は、低級アルキレン基または置換されていてもよいフェニレン基等を表すが、本発明においてＲ2は、炭素数２〜６の低級アルキレン基、例えば−ＣＨ2−ＣＨ2−で示されるエチレン基または下記式（２）で表される基であることが好ましい。また、Ｒ2は擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅに対する受容性に大きな影響を及ぼさない限り、他の発色性の基、例えば４−メチルウンベリフェリル誘導体基等に置換することが可能である。
【００３１】
【化２７】
また、上記一般式（１）において、Ｒ3は−（ＣＨ2）n−ＣＨ3（ｎは２〜２８の整数を表す。）を表すが、ｎは６〜１８の整数がさらに好ましく、６〜１４の整数が特に好ましい。また、擬似糖脂質がＥＧＣａｓｅとの親和性に大きな影響を及ぼさない限り、Ｒ3は置換基や二重結合を有していても差し支えない。
【００３３】
更に、本発明の一般式（１）で表される擬似糖脂質は、下記一般式（１０）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−ラクトシド（以下、「アルキルアミドラクトシド」ともいう）、一般式（１１）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−チオラクトシド（以下、「アルキルアミドチオラクトシド」ともいう）及び一般式（１２）で表される２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ラクトシドが特に好ましい。
【００３４】
【化２８】
但し、式（１０）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
【００３６】
【化２９】
但し、式（１１）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
【００３８】
【化３０】
但し、式（１２）中、ｋは６〜１８の整数を表す。
上記のような擬似糖脂質は、本発明によりはじめて得られたものであり、ＥＧＣａｓｅに対する基質となる。これらの擬似糖脂質は、各種酵素に対する受容性が従来知られている合成糖脂質であるアルキルラクトシドと異なるので、新規なＥＧＣａｓｅの検索に使用できることが期待できる。
【００４０】
上記擬似糖脂質の中で、Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドは、ＥＧＣａｓｅの種類によっては基質として使用できる一方、ＥＧＣａｓｅの種類によっては阻害剤として使用できることも期待される。
【００４１】
さらに、２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ラクトシドは、加水分解産物の検出を分光学的に簡便に行うことができる発色基質として使用することができる。
【００４２】
＜２＞本発明の擬似糖脂質の製造方法
上記のような本発明の擬似糖脂質は、一般的なグリコシドの製造方法、例えば、グリコシドを形成する糖残基とアグリコンとなる化合物を縮合反応させる方法等によって、製造することができる。この方法で本発明の擬似糖脂質を製造するには、アグリコンとなる化合物として上記一般式（１）のアグリコン部分に示されるような、分子中にアミド結合を有する化合物（ＨＺ−Ｒ2−ＮＨＣＯ−Ｒ3）を用いればよい。
【００４３】
また、擬似糖脂質は、既知の方法でβ体又はα体を選択的に製造することや、β体からα体に変換することや、β体及びα体の混合物を既知の方法で分別することが可能である（第４版 実験化学講座２６ 有機合成VIII, 丸善, p267〜330、Can.J.Chem.57(1979), p2085）。
【００４４】
本発明の擬似糖脂質を製造するには、あるいは、はじめに糖とアミノ基を有するアグリコンを縮合反応させてアミノ基を有するグリコシド（Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−ＮＨ2）を製造し、このグリコシドのアミノ基に炭素数４〜３０の直鎖脂肪酸（Ｒ3−ＣＯＯＨ）またはその反応性誘導体を酸アミド結合させる方法をとってもよい。
【００４５】
これらの製造方法においては、必要に応じて糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、上記糖とアグリコンを縮合反応させ、必要に応じて更にグリコシドのアグリコンを酸アミド化合物とした後に、糖部分の脱保護を行い水酸基に戻すことが行われる。
【００４６】
本発明の擬似糖脂質の製造方法を具体的に説明すると、一般式（１）においてＲ2が低級アルキレン基、Ｚが酸素原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−グリコシドを製造する場合には、まず、糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、これに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルアルコール（アルキル部分は炭素数２〜６）をトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）等を触媒として縮合反応させてＮ−Ｆｍｏｃ−アミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシドとする。次いで、これを脱Ｆｍｏｃ化し、得られたアミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシドに炭素数４〜３０の直鎖脂肪酸の酸ハロゲン化物をアミド結合させてＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−アセチルグリコシド（アシル部分の炭素数は４〜３０）とし、最後にこれにナトリウムアルコキシド等を加えて脱アセチル化すれば、目的のＮ−アシル−アミノアルキル−Ｏ−グリコシドが得られる。
【００４７】
同様に一般式（１）においてＲ2が低級アルキレン基、Ｚが硫黄原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノアルキル−チオグリコシドを製造する場合には、上記９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルアルコールの代わりに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルチオールを用いればよい。
【００４８】
また、一般式（１）においてＲ2が置換されていてもよいフェニレン基、Ｚが酸素原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−グリコシド（フェニル部分はニトロ基等で置換されていてもよい。以下、同様）を製造する場合には、まず、糖の水酸基をアセチル基等で保護した後、更に糖の１位に臭素を導入する。これに、Ｎ−アシル−アミノフェノール（アシル部分の炭素数は４〜３０）のナトリウム塩を反応させ、Ｎ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−アセチルグリコシドとし、最後にこれにナトリウムアルコキシド等を加えて脱アセチル化すれば、目的のＮ−アシル−アミノフェニル−Ｏ−グリコシドが得られる。
【００４９】
同様に、一般式（１）においてＲ2が置換されていてもよいフェニレン基、Ｚが硫黄原子である擬似糖脂質すなわちＮ−アシル−アミノフェニル−チオグリコシド（フェニル部分はニトロ基等で置換されていてもよい。以下、同様）を製造する場合には、上記Ｎ−アシル−アミノフェノールをＮ−アシル−アミノベンゼンチオールに代えて反応を行えばよい。
【００５０】
更に、本発明の擬似糖脂質のより具体的な製造方法を、上記一般式（１０）、（１１）及び（１２）で表される擬似糖脂質を例にして以下に説明する。
【００５１】
〔１〕Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造
Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造方法を化３１に基づいて説明する。
【００５２】
【化３１】
但し、化３１中Ｒは、−（ＣＨ2）k−ＣＨ3（ｋは６〜１８の整数）を表す。
まず、アミノエタノール（化合物（１３））と９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）をジクロロメタン中で反応させ（反応ｉ）９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール（化合物（１４））を得る。
【００５４】
次に、無水酢酸にラクトースと酢酸カリウムの混合物を加えて反応させて得られたアセチルラクトース（化合物（１５））と上記化合物（１４）をジクロロメタンに溶解し必要に応じてモレキュラーシーブスを加え密栓して室温で一夜程度撹拌し、これにトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）を加えて室温で、２〜３時間撹拌する（反応ii）。得られた反応液を冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ入れ、更にこれにクロロホルムを加えて反応生成物であるＮ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１６））を抽出後、炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄する。クロロホルム層を取り出し減圧濃縮して上記化合物（１６）を含む黄色シロップを得る。
【００５５】
この黄色シロップをモルホリンに溶かし、室温で２０〜３０分程度撹拌して黄色シロップ中の化合物（１６）の脱Ｆｍｏｃ化を行う（反応iii）。その後、この溶液にトルエンを加え更にこれを減圧濃縮した後、反応生成物であるアミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１７））をクロロホルム中に抽出し、これを水洗した後濃縮して化合物（１７）を含有する淡黄色シロップを得る。
【００５６】
更に上記淡黄色シロップをピリジンに溶解させ、炭素数が８〜２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物のいずれか１種を加えて室温で一晩撹拌して反応させる（反応iv）。反応液を冷水に注ぎ込みクロロホルムで、Ｎ−アシル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１８））を抽出し、これを冷希硫酸、蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。クロロホルム層を脱水処理した後、これを減圧濃縮して化合物（１８）を含むシロップを得る。
【００５７】
このシロップにナトリウムメトキシドを加え、シロップ中の化合物（１８）を脱アセチル化して（反応V）、Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−ラクトシド（化合物（１９））粗製物を得る。
【００５８】
この様にして得られるＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−ラクトシドの精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６０：２５：４）等を用いて通常の方法で行うことができる。
【００５９】
〔２〕Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドの製造
Ｎ−アシル−アミノエチル−チオラクトシドは、上記Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−ラクトシドの製造方法において、アミノエタノールの代わりにシステアミン（ＨＳ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2）を用いた以外は全く同様にして製造することができる。
【００６０】
〔３〕２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−ラクトシドの製造
上記と同様にして得られたアセチルラクトースを酢酸中に溶かし、この溶液を４〜８℃の水浴中に入れ撹拌しながら、これに臭化水素酢酸溶液をゆっくり滴下し、これを３時間撹拌して十分に反応させた後、得られた反応液を冷水中に注ぎ込み、更にこれにクロロホルムを加えてアセトブロモラクトースを抽出する。クロロホルム層を取り出し、これを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および蒸留水で洗浄した後、これを減圧濃縮してクロロホルムを除去して、シロップ状のアセトブロモラクトース粗製物を得る。
【００６１】
２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮＰ）をベンゼンに懸濁し、これにナトリウムメトキシドメタノール溶液を加えて室温で２〜３時間撹拌した後、約４℃で一晩保存する。その後、析出したＨＮＰナトリウム塩の結晶を濾過により取り出し、これを冷メタノールで洗浄した後乾燥する。このＨＮＰナトリウム塩をアセトンに溶かし、この溶液に、上記で得られたアセトブロモラクトースを含むアセトン溶液を加えて１〜３時間撹拌した後、６〜８時間の煮沸還流を行う。得られた反応液に１Ｎ塩酸を加えて酸性にした後、濾過により不溶部を除去し得られた濾液を濃縮してシロップを得る。このシロップに含まれる２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−ラクトシドをナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化した後、エタノールにより２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−ラクトシドを結晶化する。
【００６２】
＜３＞本発明のエンドグリコセラミダーゼの活性測定法
上記本発明の擬似糖脂質を用いることにより、エンドグリコセラミダーゼ活性の測定が可能であり、酵素の作用及び基質特異性を調べることができる。エンドグリコセラミダーゼ活性の測定に用いる擬似糖脂質としては、アルキルアミドグリコシドや発色基質が導入されたアルキルアミドグリコシドが特に好ましい。アルキルアミドグリコシドを用いてのエンドグリコセラミダーゼ活性の測定は、例えば次のような方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
まず、アルキルアミドグリコシドとエンドグリコセラミダーゼもしくは該酵素を含む試料とを混合し、エンドグリコセラミダーゼが作用する温度、ｐＨでインキュベーションを行う。インキュベーションの温度、ｐＨ等の条件は、エンドグリコセラミダーゼの由来や種類等により当業者が適宜選択しうるものであるが、温度としては３７℃付近、ｐＨとしては約５．０〜６．５を例示することができる。インキュベーションは酢酸緩衝液等の緩衝液中で行うことが好ましく、また界面活性剤を共存させることが好ましい。界面活性剤の種類や、その濃度は、当業者が適宜選択しうるものであるが、例えば、０．４％程度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００や２．５μｇ／μＬ程度のタウロデオキシコール酸ナトリウム等を例示することができる。インキュベーションの時間は、インキュベーションの条件により変更しうるが、３０分〜１６時間を例示することができる。
【００６４】
インキュベーション後の混合溶液を、例えば薄層クロマトグラフィー等に付し、適当な展開溶媒により展開し、オルシノール−硫酸等の糖を発色させる試薬で糖を視覚化することにより検出する。エンドグリコセラミダーゼによりアルキルアミドグリコシドが切断されると（すなわちエンドグリコセラミダーゼがアルキルアミドグリコシドに対して活性を有すると）、糖のクロマトグラフィー上の位置が、切断されていないアルキルアミドグリコシドに比較して異なるので、これによりエンドグリコセラミダーゼ活性を測定することができる。なお、必要に応じてクロマトスキャナーを用いることによりエンドグリコセラミダーゼ活性の定量を行うことができる。
【００６５】
また、ｐ−ニトロフェノール等の発色基質を導入したアルキルアミドグリコシドを用いることにより、より簡単にエンドグリコセラミダーゼ活性の測定を行うことができる。上記アルキルアミドグリコシドとエンドグリコセラミダーゼとをインキュベーションする。酵素反応を、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）等により停止させ、エタノール等により糖を不溶化し、遠心により糖を沈殿させる。これより、上清には、エンドグリコセラミダーゼにより切断された発色基質を含むＮ−アシル鎖誘導体が含まれる。この上清の発色を分光光度計等により検出することにより、エンドグリコセラミダーゼ活性の定量的な測定が可能である。なお、分光光度計の測定波長は、用いた発色基質により異なるが、例えば、ｐ−ニトロフェノールを発色基質として用いた場合、４１０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
【００６６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。まずはじめに、ＥＧＣａｓｅの基質としてのコントロールに用いたｎ−アルキルラクトシド及びｎ−オクチルチオラクトシドについて製造例を説明する。
【００６７】
【製造例１】
ｎ−アルキルラクトシド
（１）アセチル−Ｄ−ラクトースの合成
２００ｍＬの無水酢酸にＤ−ラクトース３４ｇと酢酸カリウム１６ｇの混合物を加え、油浴上１４０℃に加熱し撹拌しながら１時間反応させた。この時、前記混合物は１３０℃前後で溶解した。１時間の反応後、反応液を油浴から取り出し冷却してから、反応液の容量が２／３になるまで減圧濃縮を行った。濃縮された反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を中和するまで加え、これに更にクロロホルム４００ｍＬを加えてアセチル−Ｄ−ラクトースを抽出した。溶液全体を水洗した後、クロロホルム層を取り出してこれを減圧濃縮し、得られた濃縮物を熱エタノールにより結晶化してアセチル−Ｄ−ラクトースを得た。収率は８４％であった。
【００６８】
（２）ｎ−アルキルラクトシドの合成
上記で得られたアセチル−Ｄ−ラクトース３．４ｇ（５ｍｍｏｌ）をモレキュラーシーブス４Ａを含むジクロロメタン４０ｍＬに溶かし１００ｍＬ共栓三角フラスコ中に密閉して１時間撹拌した。これに四塩化スズ０．６ｍＬを加え、更に２０ｍＬのジクロロメタンに１−ドデカノール（炭素数１２の脂肪族直鎖アルコール）１．３５ｍＬを添加した溶液を加え、密閉して室温で５時間撹拌した。その後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中にゆっくり注ぎ入れ、更にこれを水洗した後、有機層のみを取り出して減圧濃縮した。これにより得られたｎ−ドデシル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ラクトシドのα体とβ体を乾式カラムクロマトグラフィーによって分離精製した。
【００６９】
得られたｎ−ドデシル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ラクトシドのα体とβ体を別々にメタノールに懸濁あるいは溶解させ、それぞれの懸濁液（又は溶液）にナトリウムメトキシドを加えて１０時間撹拌して、上記化合物を脱アセチル化した。次いで、これらの懸濁液（又は溶液）を撹拌しながら、これに陽イオン交換樹脂ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ+）を加え、濾過後、それぞれの濾液を減圧濃縮してｎ−ドデシル−Ｄ−ラクトシドのα体及びβ体を得た。
【００７０】
また、上記１−ドデカノールの代わりに炭素数４の脂肪族直鎖アルコールを用いた以外は上記と同様の反応を行い、更に、炭素数６、８、１０、１４、１６、１８の脂肪族直鎖アルコールについても同様の反応を行い、それぞれのアルコールに対応するｎ−アルキル−Ｄ−ラクトシドのα体、β体をそれぞれ製造した。
【００７１】
【製造例２】
ｎ−オクチルチオラクトシド
上記製造例１において、１−ドデカノールを用いる代わりに、ｎ−オクタンチオールを用いた以外は、上記製造例１と同様の反応を行い、ｎ−オクチル−Ｄ−チオラクトシドのα体、β体をそれぞれ得た。
【００７２】
【実施例１】
Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド
（１）９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール（Ｆｍｏｃ−ＡＥ）の合成
アミノエタノール２ｍＬと９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）１０ｇをジクロロメタン１００ｍＬ中で等モルのトリエチルアミン存在下で室温で２時間反応させた後、反応液を０．１Ｎ塩酸水溶液、蒸留水で順次洗浄した。有機層を脱水後、濃縮し目的物を結晶化させて９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノールを得た。
【００７３】
（２）Ｎ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの合成
上記製造例１と同様にして得られたアセチル−Ｄ−ラクトース６．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）と上記９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノエタノール２．８３ｇ（１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２００ｍＬに溶解し、モレキュラーシーブス４Ａを約６ｇ加え密栓して一夜室温で撹拌した。更に、これにトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳＴｆ）１．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）を加え３時間室温で撹拌した。得られた反応液を冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ入れ、これにクロロホルムを加えて反応物を抽出後、炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄した。クロロホルム層を取り出し、これを減圧濃縮して、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを含む黄色シロップを得た。
【００７４】
この黄色シロップを精製することなくモルホリン２０ｍＬに溶かし、室温で２０分間撹拌して黄色シロップ中のＮ−（Ｆｍｏｃ）−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの脱Ｆｍｏｃ化を行った。その後、この溶液にトルエン１００ｍＬを加え、これを減圧濃縮後、アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをクロロホルム中に抽出し、これを水洗後濃縮して淡黄色シロップを得た。この淡黄色シロップをピリジン２０ｍＬに溶解させ、これにラウロイルクロリド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌを加えて一夜室温で撹拌して反応させた。反応液を冷水に注ぎ込み、クロロホルムでＮ−ラウロイル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを抽出し、これを冷希硫酸（０．２Ｍ）、蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム層を脱水処理した後、これを減圧濃縮し上記化合物を含むシロップを得た。このシロップにナトリウムメトキシドを加え、シロップ中のＮ−ラウロイル−アミノエチル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを脱アセチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６０：２５：４）で精製して、Ｎ−ラウロイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを得た。
【００７５】
また、上記ラウロイルクロリドの代わりに、炭素数が８の直鎖脂肪酸の酸塩化物を用いた以外は上記と同様の反応を行い、更に、炭素数１６、２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物についても同様の反応を行い、それぞれの直鎖脂肪酸の酸塩化物に対応するＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをそれぞれ製造した。
【００７６】
上記で得られた４種類のＮ−アシル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて元素分析を行った。結果を以下に示す。
【００７７】
(i)Ｎ−オクタノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が８の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００７８】
【表１】
表１
(ii)Ｎ−ラウロイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８０】
【表２】
表２
(iii)Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が１６の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８２】
【表３】
表３
(iv)Ｎ−エイコサノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド（炭素数が２０の直鎖脂肪酸の酸塩化物を反応させて得られた化合物）
【００８４】
【表４】
表４
また、Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノエチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについては、1Ｈ−ＮＭＲの測定も行った。結果を以下に示す。
δ（２７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ＝９５：５）
０．８９（ｔ,３Ｈ,Ｊ ６．２Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ3）,
１．２２−１．３３（ｍ,２４Ｈ,（ＣＨ2）12ＣＨ3）,
１．５２（ｍ,２Ｈ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
２．１０（ｔ,２Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
４．２５（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．６Ｈｚ,Ｈ−１）,
４．２５（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．６Ｈｚ,Ｈ−１'）
【００８６】
【実施例２】
Ｎ−パルミトイル−アミノエチル−β−Ｄ−チオラクトシド上記実施例１においてアミノエタノールの代わりにシステアミンを用い、更にラウロイルクロリド（炭素数が１２の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌの代わりにパルミトイルクロリド（炭素数が１６の直鎖脂肪酸の酸塩化物）１０ｍｍｏｌを用いた以外は、上記実施例１と同様に反応を行い、Ｎ−パルミトイル−アミノエチル−β−Ｄ−チオラクトシドを得た。
【００８７】
【実施例３】
２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシド
（１）アセトブロモラクトースの合成
上記製造例１と同様にして得られたアセチル−Ｄ−ラクトース３．４ｇを酢酸５０ｍＬ中に溶かし、この溶液を２０℃の水浴中に入れ撹拌しながら、これに２５％臭化水素酢酸溶液３．５ｍＬをゆっくり滴下した。その後これを３時間撹拌して十分に反応させた後、得られた反応液を冷水中に注ぎ込み、更にこれにクロロホルムを加えてアセトブロモ−Ｄ−ラクトースを抽出した。クロロホルム層を取り出し、これを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および蒸留水で洗浄した後、これを減圧濃縮してクロロホルムを除去して、シロップ状のアセトブロモ−Ｄ−ラクトース粗製物を得た。
【００８８】
（２）２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドの合成
２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮＰ）２．０ｇをベンゼン５０ｍＬに懸濁し、これに０．５Ｍナトリウムメトキシドメタノール溶液を１０ｍＬ加えて室温で２時間撹拌した後、４℃で一夜保存した。その後、析出したＨＮＰナトリウム塩の結晶を濾過により取り出し、これを冷メタノールで洗浄した後乾燥した。このＨＮＰナトリウム塩１．２４ｇをアセトンに溶かし、この溶液に、上記（１）で得られたアセトブロモラクトース約３ｍｍｏｌを含むアセトン溶液を加えて１時間撹拌した後、６時間の煮沸還流を行った。得られた反応液に１Ｎ塩酸を加えて酸性にした後、濾過により不溶部を除去し得られた濾液を濃縮してシロップを得た。このシロップに含まれる２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドをナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化した後、エタノールにより２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを結晶化して得た。
【００８９】
上記で得られた２−Ｎ−ヘキサデカノイル−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて、元素分析及び1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。結果を以下に示す。
【００９０】
【表５】
表５
（ＮＭＲデータ）
δ（２７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ＝９５：５）
０．８９（ｔ,３Ｈ,Ｊ ６．６Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ3）,
１．２２−１．４０（ｍ,２４Ｈ,（ＣＨ2）12ＣＨ3）,
１．６６（ｍ,２Ｈ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
２．４８（ｔ,２Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ）,
７．４２（ｄ,１Ｈ,Ｊ ９．２Ｈｚ,フェニル）,
７．９８（ｄｄ,１Ｈ,Ｊ ９．２Ｈｚ,Ｊ ２．６Ｈｚ,フェニル）,
９．０９（ｄ,１Ｈ,Ｊ ２．６Ｈｚ,フェニル）,
４．３２（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．０Ｈｚ,Ｈ−１'）,
５．０８（ｄ,１Ｈ,Ｊ ７．３Ｈｚ,Ｈ−１）
【００９２】
【実施例４】
擬似糖脂質のＥＧＣａｓｅに対する基質としての評価
上記実施例で得られた擬似糖脂質のＥＧＣａｓｅに対する基質としての評価を行った。ＥＧＣａｓｅとしては、ロドコッカス（Rhodococcus sp.）由来のＥＧＣａｓｅ（生化学工業（株）製）、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）由来のＥＧＣａｓｅ（Eur.J.Biochem.205(1992),p729-735,京都大学農学部山本憲二助教授より恵与）、及びヒル（leech）由来のＥＧＣａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。
【００９３】
ロドコッカス由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）中で、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）中で、及びヒル（leech）由来のＥＧＣａｓｅの酵素反応は、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２．５μｇ／μｌタウロデオキシコール酸ナトリウムを含む）中で行った。
【００９４】
アルキルラクトシド、アルキルアミドラクトシド、アルキルアミドチオラクトシド、及びｎ−オクチルチオラクトシドのＥＧＣａｓｅによる加水分解は、基質１ｍＭに適当量の酵素を加え、３７℃で１６時間反応させることにより行った。尚、酵素量は、上記条件で反応を行ったとき、すべての種類の基質を完全に加水分解しない量とした。反応後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ、メルク社製）により反応生成物の分析を行った。糖の発色にはオルシノール−硫酸を用い、必要に応じてクロマトスキャナー（島津製作所製ＣＳ−９０００）を用いて定量を行った。結果を図１に示す。図１に示したグラフの横軸は、アルキルラクトシドのアルキル鎖又はアルキルアミドラクトシドのアシル鎖の炭素数を表す。また、横軸のＳ１６は、Ｃ１６のアルキルアミドチオラクトシドを表す。縦軸は加水分解された基質の割合（％）を示す。
【００９５】
微生物由来のＥＧＣａｓｅを用いた場合には、アルキルラクトシドではＣ１０〜Ｃ１２の鎖長を有するβ−Ｏ−ラクトシドが比較的高い加水分解を受けた。一方、アルキルアミドラクトシドでは全般に加水分解反応を受ける割合が非常に高くなり、中でもＣ１２の鎖長を有するラクトシドが最もよく分解された。すなわち、微生物由来のＥＧＣａｓｅでは、その基質認識の際に少なくともセラミド中のＮ−アシル構造までがその十分な認識に必要であろうことが示唆された。また、加水分解の鎖長依存性にはおそらく、鎖長の短いものでは疎水性が十分でないことが、より長鎖の化合物では溶解性に乏しいことが、各々寄与しているものと考えられる。
【００９６】
また、生体中には存在しないためその基質としての有効性が考えられていなかった、アルキル−α−Ｏ−ラクトシドもβ体に比べると低いもののＥＧＣａｓｅに対する受容性を示し、遊離ラクトースが確認されたことから、ＥＧＣａｓｅの新たな基質特異性が確認された。
【００９７】
これに対し、ｎ−ヘキサデカノイル−２−アミノエチルチオラクトシド及びｎ−オクチルチオラクトシドは、同鎖長のＯ−ラクトシドがＥＧＣａｓｅに対して受容性を有していたのに比べ、非常に弱くしか加水分解を受けなかったが、同鎖長のアルキルラクトシドよりは高い加水分解率を示した。
【００９８】
一方、ヒル由来のＥＧＣａｓｅを用いた場合には、アルキルアミドラクトシドの加水分解率は、アシル鎖がＣ１６及びＣ２０のものについてはアルキルラクトシドよりも低かったが、アシル鎖がＣ８及びＣ１２のものについてはアルキルラクトシドよりも高かった。また、アルキルアミドチオラクトシドは、ヒル由来のＥＧＣａｓｅに対してほとんど受容性を示さなかった。したがって、アルキルアミドチオラクトシドは、ＥＧＣａｓｅの種類によっては基質として使用できるとともに、ＥＧＣａｓｅの種類によっては親和性はあるものの、加水分解は受けにくいと考えられることから阻害剤として使用できることも期待できる。
【００９９】
このように、ヒル由来の酵素は、微生物由来のＥＧＣａｓｅとは全く異なった基質特異性を示すことが、本発明により初めて明らかとなった。従来は、ＥＧＣａｓｅの基質となる糖脂質のアグリコンに必要な構造としては、ただ単にある程度の長さ（Ｃ６）の疎水性構造のみでよいと考えられていたが、本発明により、Ｃ１２程度以上の鎖長が酵素による十分な認識には必要であり、それ以上は長さによって大きな影響がないことが見出された。
【０１００】
以上の結果から、ＥＧＣａｓｅの基質としては、その疎水性構造中にＮ−アシル構造を有する化合物が優れていることが明らかとなった。そこで、Ｎ−アシル構造を持たせたまま発色基質となる擬似糖脂質が得られることを期待して、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドを上記のようにして合成し、ＥＧＣａｓｅの基質としての評価を行った。また、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドについて、上記の各酵素に対する親和性を見積もるために、各酵素反応におけるミカエリス定数（Ｋｍ値）を測定した。酵素反応は、５０μｌ中で３７℃で３０分行った後に、反応液に０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）を５０μｌ加えて酵素反応を停止させた。これにエタノール１００μｌを加えた後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清について波長４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度から酵素の触媒量を算出し、酵素反応の初速度とした。結果を表６に示す。また、文献で報告されているガングリオシド（ＧM1）に対する各種ＥＧＣａｓｅのＫｍ値を同時に示す。
【０１０１】
【表６】
表６
表６に示したように、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドは、用いたすべてのＥＧＣａｓｅに対して、高い受容性を示し、また非常に高い親和性を有することが示唆された。さらに、２−（Ｎ−ヘキサデカノイル）−アミノ−４−ニトロフェニル−Ｏ−β−Ｄ−ラクトシドはＥＧＣａｓｅの酵素反応により加水分解され、ｐ−ニトロフェノール誘導体が遊離して発色し、発色基質として機能し、分光学的手法により簡便にＥＧＣａｓｅ活性を定量することが可能となった。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明により、ＥＧＣａｓｅに対する基質となる新規な擬似糖脂質が得られた。この擬似糖脂質は、各種酵素に対する受容性が従来知られている合成糖脂質であるアルキルラクトシドと異なるので、新規なＥＧＣａｓｅの検索に使用できることが期待できる。また、本発明により得られる発色基質は、加水分解産物の検出を分光学的に簡便に行うことができるので、エンドグリコセラミダーゼの活性測定が容易となる。また、本発明の擬似糖脂質、特に二重結合をアシル基末端に有する擬似糖脂質を、基質としてゲル電気泳動の担体に共有結合させて、酵素の電気泳動を行い基質の分解を測定する方法（Zymography）に使用できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 各種エンドグリコセラミダーゼに対する擬似糖脂質の受容性を示すグラフ図。グラフの横軸は、アルキルラクトシドのアルキル鎖又はアルキルアミドラクトシドのアシル鎖の炭素数を表す。また、横軸のＳ１６は、Ｃ１６のアルキルアミドチオラクトシドを表す。縦軸は加水分解された基質の割合（％）を示す。
Claims (2)
- 下記一般式（１０）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−ラクトシド、一般式（１１）で表されるＮ−アシル−アミノエチル−チオラクトシド及び一般式（１２）で表される２−Ｎ−アシル−アミノ−４−ニトロフェニル−ラクトシドのいずれかである擬似糖脂質。
- 請求項１に記載の擬似糖脂質をエンドグリコセラミダーゼに作用させ、前記擬似糖脂質の分解の程度を測定するエンドグリコセラミダーゼの活性の測定法。
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