JP3972194B2 - 電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 - Google Patents
電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3972194B2 JP3972194B2 JP2002265220A JP2002265220A JP3972194B2 JP 3972194 B2 JP3972194 B2 JP 3972194B2 JP 2002265220 A JP2002265220 A JP 2002265220A JP 2002265220 A JP2002265220 A JP 2002265220A JP 3972194 B2 JP3972194 B2 JP 3972194B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrophoresis
- reagent
- gel
- buffer
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動法は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸などの生体分子の分離分析を、泳動漕、泳動用板、バッファー槽及びパワーサプライなどからなる簡便な装置により、容易に行うことができるため、今日広く使用されている。また、蛍光検出を基本にした自動装置を利用することもできる。更に、本法のひとつの重要な適用として、核酸フラグメントの分離が挙げられ、核酸フラグメントの分離を主な目的とした多数の電気泳動用装置が、商品として入手可能である。
【０００３】
電気泳動法には、多孔性ゲル媒体を用いるゲル電気泳動法と溶液中にて泳動をおこなうフリーフロー電気泳動法があるが、利用状況はゲル電気泳動法が大勢を占める。
【０００４】
ゲル電気泳動法による分子の分離は、異なる分子の電荷密度の差異および多孔性ゲル媒体のふるい効果に基づく。ふるいの程度は、ゲルの孔サイズが移動分子のサイズにどの程度適合しているかに依存する。電気泳動用ゲルは、ゲルの孔を形成する架橋ポリマー分子のネットワークからなる。ゲルの分離の性能は、とりわけ、ネットワークの孔がいかに大きく、いかに均質に分散しているかに依存する。該孔の大きさおよび分散は、ゲルの乾燥固体含量、架橋剤の含量および架橋の開始の方法に依存する。
【０００５】
ゲル電気泳動法には、異なるタイプのゲル物質、例えば、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミド等が使用されている。
【０００６】
特に、ポリアクリルアミドゲルは、次のような良好な品質を有していることから、広く使用されている。即ち、ポリアクリルアミドは、広範囲の孔サイズを有し、再現可能な方法で製造できる。また、ポリアクリルアミドゲルは、化学的に不活性であり、広範囲のｐＨおよび温度で安定であり、透明である。
【０００７】
ポリアクリルアミドに基づくゲルは、アクリルアミドのようなモノオレフィニックモノマーと、メチレンビスアクリルアミドのような２官能性モノマーとの重合及び架橋により製造する。重合及び架橋は、化学的に、例えば、過硫酸ナトリウムまたは過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミンにより、または光化学的に開始できる。
【０００８】
このように、電気泳動法による生体分子、特に核酸の分離は、利便性が高いという長所をいかして広く普及している方法ではあるが、その分離能力には限界がある。すなわち、分子の電荷密度の差異およびゲルのふるい効果だけでは、構造的性質の差異の検出が困難な場合がある。
【０００９】
例えば、電気泳動法により、１塩基または２塩基以上の遺伝子変異を検出するためには、同じ塩基数であるが塩基配列の異なる核酸フラグメントを、塩基配列の変異による遺伝子の一次構造や二次構造の違いを泳動距離の差として検出する必要がある。このような場合、従来は、通常、目的遺伝子に対し適当な化学修飾（例えば、ＧＣクランプ）をおこなったり、精密な温度調整や濃度勾配を持たせた変性剤（例えば、尿素、尿素とホルムアミドの併用）入り電気泳動ゲルが必要であるなどの問題点がある。
【００１０】
上記問題点が解消され、電気泳動法における核酸の分離能力の改善が為されることにより、種々の基礎研究分野、例えば、遺伝子解析、遺伝子診断等への応用、その関連産業分野への応用が可能となる。
【００１１】
このような背景から、簡便な電気泳動法を基盤とし、生体分子の分離能力を改善した方法の開発が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、電気泳動法において、核酸等の生体分子の分離能力を向上せしめることができる電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、簡便な方法で、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出を可能とする核酸の分離方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記従来技術の問題点を解消し、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、電気泳動用試薬として、ポリアミン錯体を用いることによって、電気泳動法において、核酸などの生体分子の分離能力を向上せしめることができること、これにより核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出が可能となること等を見出した。本発明は、かかる新知見に基づいて、完成されたものである。
【００１５】
本発明は、下記に示す、電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法に係るものである。
【００１６】
１．ポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬。
【００１７】
２．ポリアミン錯体が、環状ポリアミン錯体である上記項１に記載の電気泳動用試薬。
【００１８】
３．ポリアミン錯体が、ポリアミン亜鉛錯体である上記項１に記載の電気泳動用試薬。
【００１９】
４．環状ポリアミン錯体が、環状テトラアミン亜鉛錯体である上記項２に記載の電気泳動用試薬。
【００２０】
５．環状テトラアミン亜鉛錯体が、下記構造式（１）で表される硝酸塩である上記項４に記載の電気泳動用試薬。
【００２１】
【化２】
【００２２】
６．電気泳動用ゲルに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２３】
７．電気泳動用バッファーに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２４】
８．電気泳動用サンプルに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２５】
９．上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用ゲルを含有することを特徴とする電気泳動用ゲル組成物。
【００２６】
１０．上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用バッファーを含有することを特徴とする電気泳動用バッファー組成物。
【００２７】
１１．上記項９に記載の電気泳動用ゲル組成物を使用して電気泳動することを特徴とする核酸の分離方法。
【００２８】
１２．同一塩基数の複数の核酸混合物をサンプルとする上記項１１に記載の核酸の分離方法。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、電気泳動法において、分離用試薬として添加することにより、サンプル中の核酸などの生体分子の分離能力を顕著に向上せしめることができる。
【００３０】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、ポリアミン錯体のみからなっていてもよいし、電気泳動用ゲルに含ませた形態、電気泳動用バッファーに含ませた形態、電気泳動用サンプルに含ませた形態等の形態であってもよい。
【００３１】
本発明で用いられるポリアミン錯体としては、生体分子に対して何らかの結合能を有するものであればよく、特に制限されない。生体分子に対する結合能としては、例えば、核酸塩基との結合能、核酸のリン酸基との結合能、タンパク質のカルボン酸基やシスティン基との結合能、リン酸化タンパク質のリン酸基との結合能等が挙げられる。また、生体分子との結合は、可逆的結合であることが好ましい。
【００３２】
ポリアミン錯体を形成するポリアミンとしては、例えば、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン等の鎖状ポリアミン；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、１，５，９−トリアザシクロドデカン等の環状ポリアミン等が挙げられ、錯体としては、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト、マンガン、マグネシウム等の金属の錯体が挙げられる。
【００３３】
上記ポリアミン錯体としては、環状ポリアミン錯体、ポリアミン亜鉛錯体等であるのが好ましい。
【００３４】
また、上記環状ポリアミン錯体としては、具体的には、例えば、環状トリアミン錯体、環状テトラアミン錯体、環状ペンタアミン錯体等が挙げられる。環状ポリアミン錯体としては、環状テトラアミン錯体が好ましく、環状テトラアミン亜鉛錯体がより好ましい。更には、前記構造式（１）で表される環状テトラアミン亜鉛錯体硝酸塩が特に好ましい。
【００３５】
また、上記構造式（１）以外の環状ポリアミン錯体の具体例としては、次の化合物等を例示することができる。
【００３６】
【化３】
【００３７】
前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能である。例えば、市販の１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（サイクレン）と硝酸亜鉛六水塩を原料として、次のようにして合成することができる。即ち、硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）とサイクレンをエタノール等の溶媒に加え溶解する。その溶液をマグネティックスターラーなどで撹拌しながら加温処理する。これを濾紙等で濾過した溶液をロータリーエバポレーターなどを用いてゆっくり濃縮する。この濃縮により、無色プリズム結晶が析出するので、室温で１〜数時間放置した後、グラスフィルターなどを用いてその結晶を濾取し、減圧加熱乾燥すると、構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体であるサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩が高収率で得られる。構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、分解点２５０℃以上を示す。
【００３８】
前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、中性乃至弱アルカリ性条件下において、遺伝子の塩基のひとつであるチミンと結合するという性質を有している。この環状テトラアミン亜鉛錯体が一本鎖遺伝子のチミン部分に結合すると、その部分はプラス電荷を持つ亜鉛錯体がぶら下がった構造をとると予想される。このプラス電荷付与と立体障害により一本鎖遺伝子の電気泳動距離は短くなると考えられる。また、この環状テトラアミン亜鉛錯体が二本鎖遺伝子のチミン部分に結合した場合、その結合部分は遺伝子の二重らせん構造がほぐれて膨らんだ二次構造（二本鎖遺伝子のバルブ構造）となると予想される。プラス電荷を持つ亜鉛錯体の結合とバルブ構造は、電気泳動距離を短くする結果をもたらすと考えられる。
【００３９】
したがって、例えば、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出をする場合には、変異体遺伝子とオリジナル遺伝子のそれぞれの電気泳動距離を比較するだけで、チミンの数が変化した遺伝子変異の検出（例えば、AT→GC、GC→AT）が可能となる。さらに、二本鎖の塩基の配列が互いの鎖で置き換わった場合（例えば、AT→TA、GC→CG）、バルブ形成にあまり差があらわれないので、変異体遺伝子とオリジナル遺伝子を混合した状態で加熱（一本鎖への解離）と冷却（アニーリング）を行う。それにより、ミスマッチ（AG、TG、AC、TC）部分をもつ二本鎖遺伝子を形成させる。ミスマッチ部分をもつ二本鎖遺伝子は、錯体によるバルブ構造形成が容易に起き大きなバルブを形成するため、オリジナル遺伝子より泳動距離は短くなる。このような化学原理に基づいて、最適な電気泳動条件を確立することによって、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出を好適に行うことができる。
【００４０】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、ポリアミン錯体のみからなっていてもよいし、電気泳動用ゲルに含ませた形態、電気泳動用バッファーに含ませた形態、電気泳動用サンプルに含ませた形態等であってもよい。
【００４１】
また、電気泳動用ゲルに含ませた形態の場合、上記ポリアミン錯体である電気泳動用試薬及び電気泳動用ゲルを含有する電気泳動用ゲル組成物であってもよい。電気泳動用ゲル組成物におけるゲル物質としては、例えば、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース等を挙げることができる。
【００４２】
また、電気泳動用バッファーに含ませた形態の場合、上記ポリアミン錯体である電気泳動用試薬及び電気泳動用バッファーを含有する電気泳動用バッファー組成物であってもよい。電気泳動用バッファー組成物におけるバッファーとしては、例えば、トリス−塩酸バッファー、トリス−ホウ酸バッファー、トリス−酢酸バッファー、トリス−リン酸バッファー等を挙げることができる。
【００４３】
上記の各電気泳動用試薬又は各電気泳動用組成物において、ポリアミン錯体の使用濃度は特に限定されないが、通常、１〜１００ｍＭ程度、特に２〜１０ｍＭ程度の範囲とすることが好ましい。
【００４４】
本発明の上記の電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物は、一般的なゲル電気泳動法において、好ましく用いられる。特に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、より好ましく用いられる。
【００４５】
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの濃度としては、５〜２０％（W/V）、特に６〜１５％（W/V）の範囲とすることが好ましい。
【００４６】
また、電気泳動装置としては、泳動漕、泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、ペリスタポンプ等よりなる一般的なものが使用でき、市販のどのような機種でも良い。
【００４７】
本発明の核酸の分離方法は、上記電気泳動用ゲル組成物を使用して電気泳動する分離方法である。この場合の電気泳動法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であるのが、特に好ましい。
【００４８】
本発明の核酸の分離方法においては、同一塩基数の複数の核酸混合物をサンプルとする場合にも、混合物中の各核酸を分離することができる。
【００４９】
即ち、複数の核酸を含む混合物をサンプルとし、同一の塩基数であってもその塩基配列のチミン含量が異なる核酸の電場における移動度を有意に変動せしめ得るポリアミン錯体、例えば前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体を含有するゲル中にて電気泳動することにより、混合物中の各核酸を好適に分離することができる。
【００５０】
本発明の電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物を用いたゲル電気泳動法や、本発明の核酸の分離方法は、室温、好ましくは１５〜３５℃程度において、汎用型の電気泳動装置と安全で安価な電気泳動用試薬を用いて、容易に行うことができる。
【００５１】
上記ゲル電気泳動法及び核酸の分離方法において、サンプル（検体）としては、解析対象となるものであれば特に制限はないが、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ペプチド、タンパク質、それらの混合物、又は細菌、始原菌、酵母、カビ、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、植物組織、動物組織、血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料から調製されたサンプル、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の産物、核酸を酵素処理した反応溶液などが好ましく使用される。ＰＣＲの産物としては、例えば、細胞よりゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としたＰＣＲにより増幅したＤＮＡ等が好ましく使用される。
【００５２】
また、サンプルを電気泳動法に供する前に、前処理をおこなってもよい。このような前処理としては、例えば核酸とタンパク質が共存する試料において、タンパク質を有機溶媒処理にて予め除去するなどの処理が挙げられる。
【００５３】
【実施例】
以下、製造例、実施例及び比較例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明する。但し、本発明は、各例により、限定されるものではない。
【００５４】
実施例及び比較例において使用した電気泳動器具及び試薬は、次の通りである。
【００５５】
(1)電気泳動システム
泳動装置（泳動層、泳動用ガラス板、スペーサー、コーム、クリップを含む）は、ATTO社の汎用型電気泳動システム「AE-6500」を使用した。パワーサプライはファルマシアバイオテク社の「ESP3500」を、ペリスタポンプはIWAKI社の「PST-050」を、それぞれ使用した。
【００５６】
(2)ゲル調整用試薬と泳動用試薬
３０％（w/v）アクリルアミド溶液：アクリルアミド２９ｇ、N,N'-メチレンビスアクリルアミド１ｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとしたもの、
１０％（w/v）過硫酸アンモニウム溶液（用時調製）、及び
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）。
【００５７】
泳動用バッファー：トリスヒドロキシアミノメタン（Tris）１０．８ｇ、ホウ酸（Borate）５．５ｇを水５０ｍＬに溶解して、２０倍濃縮液を得た。これを用時希釈して総容量を１リットルとして用いた（濃度：９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）。
【００５８】
色素溶液：６０％（w/v）グリセロール、０．２×泳動用バッファー、０．０２％（w/v）ブロモフェノールブルー、０．０２％（w/v）キシレンシアノールＦＦ。
【００５９】
エチジウムブロマイド染色液：１０μｇ/mLになるように水に溶解する。
【００６０】
製造例１ サイクレン亜鉛錯体硝酸塩の合成
硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）０．１０ｍｍｏｌ（２９．７ｇ）とサイクレン０．１０ｍｍｏｌ（１７．２ｇ）を２５０ｍＬのエタノールに加え溶解した。その溶液をマグネティックスターラーで撹拌しながら７０℃で３０分間加温した。これを濾紙で濾過した溶液をロータリーエバポレーターを用いて約５０ｍＬまでゆっくり濃縮した。その濃縮により、無色プリズム結晶が析出した。室温で１時間放置した後，グラスフィルターでその結晶を濾取し、５０℃、５ｍｍＨｇで減圧加熱乾燥することにより、構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体であるサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩が、収率９２％（収量３３．２ｇ）で得られた。この化合物の分析結果は、下記の通りである。
【００６１】
元素分析をした結果、理論値はC8H20N6O6Zn:C,26.57;H,5.57;N,23.24であり、実測値はC,26.61;H,5.60;N,23.28であった。
【００６２】
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果は、δ＝2.80（8H,m），2.94（8H,m）であった。
【００６３】
13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果は、δ＝46.6であった。
【００６４】
赤外線分析の主要吸収体の測定結果は、ＩＲ（ｃｍ-1）：3177, 2918, 1482, 1444, 1384(NO3 -), 1279, 1092, 1010, 993, 806であった。
【００６５】
実施例及び比較例において行った電気泳動法は、次の通りである。
【００６６】
製造例１で得たサイクレン亜鉛錯体（硝酸塩）１．９６ｇを９．７５ｍＬの蒸留水に溶解し、０．２５ｍＬの１０Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．９とし、５００ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を調製した。陰極用泳動バッファーとしては、前記泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いた。陽極用泳動バッファーとしては、前記泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）に１／１００容量の５００ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を加えて得た５ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を、用いた。
【００６７】
ガラス板をエタノールでよくみがき、メーカーの製品プロトコールに従ってセット後、ゲル溶液を流し込み、すぐにコームを挿し、ゲル溶液が固化したらクリップを外し、コームを抜いた。泳動バッファーとゲルの下端の間に空気が入らないように注意しながら、陽極バッファーを注いだ泳動槽にゲルをセットした。ゲル板を固定し、陰極バッファーを注いだ後、試料溝を注射針を用いて陰極バッファーでよく洗浄し、ただちに試料を色素溶液３μＬに溶解した試料液を添加した。２００Ｖ定電圧で９０分から１２０分（分離したいＤＮＡの長さによって調節する）通電した。サイクレン亜鉛錯体を含む陽極バッファーは局所的なｐＨの変動を起こすことがあるので、陽極槽内のバッファーはペリスタポンプで循回した。泳動終了後はエチジウムブロマイド染色液に約１５分浸した後、ＵＶ照射下で写真撮影した。使用したサイクレン亜鉛錯体（５ｍＭ）のゲル溶液の組成を、表１に示した。
【００６８】
【表１】
【００６９】
実施例１
上記表１のサイクレン亜鉛錯体入りの８％（w/v）又は１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、前記陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーを用いて、２００Ｖ定電圧で９０分間又は１２０分間電気泳動をおこなった。
【００７０】
試料は、次の様に調製したものを用いた。まず、ターゲットＤＮＡはラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子（DDBJデータベースに登録；accession No.M26643）の野生型、およびヌクレオチド１１６２〜１７８２の６２１ｂｐの間に部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子を用いた。各ＤＮＡの５４１〜６２１の塩基配列を図１に示す。図１において、Ｎｏ．１の塩基配列は、野生型の塩基配列を、Ｎｏ．２〜１５の塩基配列は、変異型の塩基配列を、それぞれ示す。また、図１中、長方形の枠で囲んだ部分が変異部分である。
【００７１】
これらの遺伝子断片は、promega社のpGEM-T-Easyベクターに挿入した。各断片を挿入したpGEM-T-EasyベクターＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマーオリゴヌクレオチド１（配列番号：１）とプライマーオリゴヌクレオチド２（配列番号：２）（各０．６μＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各６５μＭ）、２．５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Thermoprime plus；Advanced biotechnologies, UK）とその専用バッファーを加えて全量を５０μｌとした。ミネラルオイルを重層し、「サーマルサイクラー」（MJ research Inc., model PTC-150）にセットし、[９５℃３分、６０℃１分、７２℃１分]を１サイクル、[９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分]を２９サイクル、及び７２℃３分のプログラムでＰＣＲを行った。
【００７２】
増幅したＤＮＡはエタノール沈澱によって精製した。制限酵素Msp I(New England Biolab社)で、６２１ｂｐのＰＣＲ断片を完全消化処理し、目的の変異を含むＤＮＡ断片の大きさを１５１ｂｐとした。この際、２６２ｂｐ及び２０８ｂｐのＤＮＡ断片も生成した。反応後はエタノール沈澱によって精製し、色素溶液に溶解した。
【００７３】
各試料ＤＮＡ２０ｎｇをサンプルスロットに入れ、電気泳動を行った。
【００７４】
電気泳動の結果を図２に示す。図２の（ａ）は１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用いて、２００Ｖ定電圧で１２０分間電気泳動を行った場合の結果を、（ｂ）は８％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用いて、２００Ｖ定電圧で９０分間電気泳動を行った場合の結果を、それぞれ示す。
【００７５】
図２より、Ｎｏ．１の１５１塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（１５１塩基対）のＤＮＡフラグメントとが、電気泳動により分離可能であることが分かる。
【００７６】
比較例１
表１の１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルにおいて、サイクレン亜鉛錯体を入れない以外は、同じ組成の１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーとして泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いて、２００Ｖ定電圧で４０分間電気泳動をおこなった。試料は、実施例１と同じものを用いた。
【００７７】
結果を図３に示す。図３より、Ｎｏ．１の１５１塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（１５１塩基対）のＤＮＡフラグメントとを、既存の電気泳動法により分離することが不可能であることが分かる。
【００７８】
実施例２
上記表１のサイクレン亜鉛錯体入りの１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、前記陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーを用いて、２００Ｖ定電圧で１１０分間電気泳動をおこなった。
【００７９】
試料は、次の様に調製したものを用いた。まず、ターゲットＤＮＡはラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子（DDBJデータベースに登録；accession No.M26643）の野生型、およびヌクレオチド１１６２〜１７８２の６２１ｂｐの間に部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子を用いた。各ＤＮＡの塩基配列を図１に示す。図１において、Ｎｏ．１の塩基配列は、野生型の塩基配列を、Ｎｏ．２〜１５の塩基配列は、変異型の塩基配列を、それぞれ示す。また、図１中、長方形の枠で囲んだ部分が変異部分である。
【００８０】
これらの遺伝子断片は、promega社のpGEM-T-Easyベクターに挿入した。各断片を挿入したpGEM-T-EasyベクターＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマーオリゴヌクレオチド１（配列番号：１）とプライマーオリゴヌクレオチド２（配列番号：２）（各０．６μＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各６５μＭ）、２．５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Thermoprime plus；Advanced biotechnologies, UK）とその専用バッファーを加えて全量を５０μｌとした。ミネラルオイルを重層し、「サーマルサイクラー」（MJ research Inc., model PTC-150）にセットし、[９５℃３分、６０℃１分、７２℃１分]を１サイクル、[９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分]を２９サイクル、及び７２℃３分のプログラムでＰＣＲを行った。
【００８１】
増幅したＤＮＡはエタノール沈澱によって精製した。制限酵素Alu I(New England Biolab 社)で、 ６２１ｂｐのＰＣＲ断片を完全消化処理し,目的の変異を含むＤＮＡ断片の大きさを９９ｂｐとした。この際、１７７ｂｐ、１５８ｂｐ、６３ｂｐ及び６１ｂｐのＤＮＡ断片も生成した。反応後はエタノール沈澱によって精製し、色素溶液に溶解した。
【００８２】
各試料ＤＮＡ２０ｎｇをサンプルスロットに入れ、電気泳動を行った。
【００８３】
電気泳動の結果を図４に示す。図４より、Ｎｏ．１の９９塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（９９塩基対）のＤＮＡフラグメントとが、電気泳動により分離可能であることが分かる。
【００８４】
比較例２
表１の１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルにおいて、サイクレン亜鉛錯体を入れない以外は、同じ組成の１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーとして泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いて、２００Ｖ定電圧で８０分間電気泳動をおこなった。試料は、実施例２と同じものを用いた。
【００８５】
結果を図５に示す。図５の（ａ）は、図１のＮｏ．１の野生型の塩基配列及びＮｏ．２〜１５の変異型塩基配列についての結果を、（ｂ）はＮｏ．１の配列とＮｏ．２〜１５の配列との混合物についての結果を、それぞれ示す。
【００８６】
図５より、１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（９９塩基対）のＤＮＡは、既存の電気泳動法により分離することが不可能であることが分かる。
【００８７】
【発明の効果】
本発明の環状テトラアミン亜鉛錯体、電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物によれば、タンパク質、ペプチド、核酸などの生体分子の分離、分析を、簡便かつ低コストで行うことが可能となる。
【００８８】
また、本発明の核酸の分離方法によれば、核酸、特に核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出が、簡便かつ低コストで、可能となる高い分離能力を有する電気泳動法に基づく、分離方法が可能となる。
【００８９】
さらに、本発明を用いることにより、高い分離能力を有する電気泳動法の基礎研究分野及び産業分野への応用が可能となる。また、本発明は手法が簡潔であるため、各種自動分析装置への適用も容易であり、多数の検体処理にも適している。
【００９０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子の野生型、及びこれに部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子の各ＤＮＡの塩基配列の一部を示すものである。
【図２】図２は、実施例１における電気泳動の結果を示すものである。
【図３】図３は、比較例１における電気泳動の結果を示すものである。
【図４】図４は、実施例２における電気泳動の結果を示すものである。
【図５】図５は、比較例２における電気泳動の結果を示すものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動法は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸などの生体分子の分離分析を、泳動漕、泳動用板、バッファー槽及びパワーサプライなどからなる簡便な装置により、容易に行うことができるため、今日広く使用されている。また、蛍光検出を基本にした自動装置を利用することもできる。更に、本法のひとつの重要な適用として、核酸フラグメントの分離が挙げられ、核酸フラグメントの分離を主な目的とした多数の電気泳動用装置が、商品として入手可能である。
【０００３】
電気泳動法には、多孔性ゲル媒体を用いるゲル電気泳動法と溶液中にて泳動をおこなうフリーフロー電気泳動法があるが、利用状況はゲル電気泳動法が大勢を占める。
【０００４】
ゲル電気泳動法による分子の分離は、異なる分子の電荷密度の差異および多孔性ゲル媒体のふるい効果に基づく。ふるいの程度は、ゲルの孔サイズが移動分子のサイズにどの程度適合しているかに依存する。電気泳動用ゲルは、ゲルの孔を形成する架橋ポリマー分子のネットワークからなる。ゲルの分離の性能は、とりわけ、ネットワークの孔がいかに大きく、いかに均質に分散しているかに依存する。該孔の大きさおよび分散は、ゲルの乾燥固体含量、架橋剤の含量および架橋の開始の方法に依存する。
【０００５】
ゲル電気泳動法には、異なるタイプのゲル物質、例えば、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミド等が使用されている。
【０００６】
特に、ポリアクリルアミドゲルは、次のような良好な品質を有していることから、広く使用されている。即ち、ポリアクリルアミドは、広範囲の孔サイズを有し、再現可能な方法で製造できる。また、ポリアクリルアミドゲルは、化学的に不活性であり、広範囲のｐＨおよび温度で安定であり、透明である。
【０００７】
ポリアクリルアミドに基づくゲルは、アクリルアミドのようなモノオレフィニックモノマーと、メチレンビスアクリルアミドのような２官能性モノマーとの重合及び架橋により製造する。重合及び架橋は、化学的に、例えば、過硫酸ナトリウムまたは過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミンにより、または光化学的に開始できる。
【０００８】
このように、電気泳動法による生体分子、特に核酸の分離は、利便性が高いという長所をいかして広く普及している方法ではあるが、その分離能力には限界がある。すなわち、分子の電荷密度の差異およびゲルのふるい効果だけでは、構造的性質の差異の検出が困難な場合がある。
【０００９】
例えば、電気泳動法により、１塩基または２塩基以上の遺伝子変異を検出するためには、同じ塩基数であるが塩基配列の異なる核酸フラグメントを、塩基配列の変異による遺伝子の一次構造や二次構造の違いを泳動距離の差として検出する必要がある。このような場合、従来は、通常、目的遺伝子に対し適当な化学修飾（例えば、ＧＣクランプ）をおこなったり、精密な温度調整や濃度勾配を持たせた変性剤（例えば、尿素、尿素とホルムアミドの併用）入り電気泳動ゲルが必要であるなどの問題点がある。
【００１０】
上記問題点が解消され、電気泳動法における核酸の分離能力の改善が為されることにより、種々の基礎研究分野、例えば、遺伝子解析、遺伝子診断等への応用、その関連産業分野への応用が可能となる。
【００１１】
このような背景から、簡便な電気泳動法を基盤とし、生体分子の分離能力を改善した方法の開発が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、電気泳動法において、核酸等の生体分子の分離能力を向上せしめることができる電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、簡便な方法で、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出を可能とする核酸の分離方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記従来技術の問題点を解消し、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、電気泳動用試薬として、ポリアミン錯体を用いることによって、電気泳動法において、核酸などの生体分子の分離能力を向上せしめることができること、これにより核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出が可能となること等を見出した。本発明は、かかる新知見に基づいて、完成されたものである。
【００１５】
本発明は、下記に示す、電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法に係るものである。
【００１６】
１．ポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬。
【００１７】
２．ポリアミン錯体が、環状ポリアミン錯体である上記項１に記載の電気泳動用試薬。
【００１８】
３．ポリアミン錯体が、ポリアミン亜鉛錯体である上記項１に記載の電気泳動用試薬。
【００１９】
４．環状ポリアミン錯体が、環状テトラアミン亜鉛錯体である上記項２に記載の電気泳動用試薬。
【００２０】
５．環状テトラアミン亜鉛錯体が、下記構造式（１）で表される硝酸塩である上記項４に記載の電気泳動用試薬。
【００２１】
【化２】
６．電気泳動用ゲルに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２３】
７．電気泳動用バッファーに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２４】
８．電気泳動用サンプルに含ませた形態である上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【００２５】
９．上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用ゲルを含有することを特徴とする電気泳動用ゲル組成物。
【００２６】
１０．上記項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用バッファーを含有することを特徴とする電気泳動用バッファー組成物。
【００２７】
１１．上記項９に記載の電気泳動用ゲル組成物を使用して電気泳動することを特徴とする核酸の分離方法。
【００２８】
１２．同一塩基数の複数の核酸混合物をサンプルとする上記項１１に記載の核酸の分離方法。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、電気泳動法において、分離用試薬として添加することにより、サンプル中の核酸などの生体分子の分離能力を顕著に向上せしめることができる。
【００３０】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、ポリアミン錯体のみからなっていてもよいし、電気泳動用ゲルに含ませた形態、電気泳動用バッファーに含ませた形態、電気泳動用サンプルに含ませた形態等の形態であってもよい。
【００３１】
本発明で用いられるポリアミン錯体としては、生体分子に対して何らかの結合能を有するものであればよく、特に制限されない。生体分子に対する結合能としては、例えば、核酸塩基との結合能、核酸のリン酸基との結合能、タンパク質のカルボン酸基やシスティン基との結合能、リン酸化タンパク質のリン酸基との結合能等が挙げられる。また、生体分子との結合は、可逆的結合であることが好ましい。
【００３２】
ポリアミン錯体を形成するポリアミンとしては、例えば、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン等の鎖状ポリアミン；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、１，５，９−トリアザシクロドデカン等の環状ポリアミン等が挙げられ、錯体としては、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト、マンガン、マグネシウム等の金属の錯体が挙げられる。
【００３３】
上記ポリアミン錯体としては、環状ポリアミン錯体、ポリアミン亜鉛錯体等であるのが好ましい。
【００３４】
また、上記環状ポリアミン錯体としては、具体的には、例えば、環状トリアミン錯体、環状テトラアミン錯体、環状ペンタアミン錯体等が挙げられる。環状ポリアミン錯体としては、環状テトラアミン錯体が好ましく、環状テトラアミン亜鉛錯体がより好ましい。更には、前記構造式（１）で表される環状テトラアミン亜鉛錯体硝酸塩が特に好ましい。
【００３５】
また、上記構造式（１）以外の環状ポリアミン錯体の具体例としては、次の化合物等を例示することができる。
【００３６】
【化３】
前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能である。例えば、市販の１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（サイクレン）と硝酸亜鉛六水塩を原料として、次のようにして合成することができる。即ち、硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）とサイクレンをエタノール等の溶媒に加え溶解する。その溶液をマグネティックスターラーなどで撹拌しながら加温処理する。これを濾紙等で濾過した溶液をロータリーエバポレーターなどを用いてゆっくり濃縮する。この濃縮により、無色プリズム結晶が析出するので、室温で１〜数時間放置した後、グラスフィルターなどを用いてその結晶を濾取し、減圧加熱乾燥すると、構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体であるサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩が高収率で得られる。構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、分解点２５０℃以上を示す。
【００３８】
前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、中性乃至弱アルカリ性条件下において、遺伝子の塩基のひとつであるチミンと結合するという性質を有している。この環状テトラアミン亜鉛錯体が一本鎖遺伝子のチミン部分に結合すると、その部分はプラス電荷を持つ亜鉛錯体がぶら下がった構造をとると予想される。このプラス電荷付与と立体障害により一本鎖遺伝子の電気泳動距離は短くなると考えられる。また、この環状テトラアミン亜鉛錯体が二本鎖遺伝子のチミン部分に結合した場合、その結合部分は遺伝子の二重らせん構造がほぐれて膨らんだ二次構造（二本鎖遺伝子のバルブ構造）となると予想される。プラス電荷を持つ亜鉛錯体の結合とバルブ構造は、電気泳動距離を短くする結果をもたらすと考えられる。
【００３９】
したがって、例えば、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出をする場合には、変異体遺伝子とオリジナル遺伝子のそれぞれの電気泳動距離を比較するだけで、チミンの数が変化した遺伝子変異の検出（例えば、AT→GC、GC→AT）が可能となる。さらに、二本鎖の塩基の配列が互いの鎖で置き換わった場合（例えば、AT→TA、GC→CG）、バルブ形成にあまり差があらわれないので、変異体遺伝子とオリジナル遺伝子を混合した状態で加熱（一本鎖への解離）と冷却（アニーリング）を行う。それにより、ミスマッチ（AG、TG、AC、TC）部分をもつ二本鎖遺伝子を形成させる。ミスマッチ部分をもつ二本鎖遺伝子は、錯体によるバルブ構造形成が容易に起き大きなバルブを形成するため、オリジナル遺伝子より泳動距離は短くなる。このような化学原理に基づいて、最適な電気泳動条件を確立することによって、核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出を好適に行うことができる。
【００４０】
本発明のポリアミン錯体を含有する電気泳動用試薬は、ポリアミン錯体のみからなっていてもよいし、電気泳動用ゲルに含ませた形態、電気泳動用バッファーに含ませた形態、電気泳動用サンプルに含ませた形態等であってもよい。
【００４１】
また、電気泳動用ゲルに含ませた形態の場合、上記ポリアミン錯体である電気泳動用試薬及び電気泳動用ゲルを含有する電気泳動用ゲル組成物であってもよい。電気泳動用ゲル組成物におけるゲル物質としては、例えば、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース等を挙げることができる。
【００４２】
また、電気泳動用バッファーに含ませた形態の場合、上記ポリアミン錯体である電気泳動用試薬及び電気泳動用バッファーを含有する電気泳動用バッファー組成物であってもよい。電気泳動用バッファー組成物におけるバッファーとしては、例えば、トリス−塩酸バッファー、トリス−ホウ酸バッファー、トリス−酢酸バッファー、トリス−リン酸バッファー等を挙げることができる。
【００４３】
上記の各電気泳動用試薬又は各電気泳動用組成物において、ポリアミン錯体の使用濃度は特に限定されないが、通常、１〜１００ｍＭ程度、特に２〜１０ｍＭ程度の範囲とすることが好ましい。
【００４４】
本発明の上記の電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物は、一般的なゲル電気泳動法において、好ましく用いられる。特に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、より好ましく用いられる。
【００４５】
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの濃度としては、５〜２０％（W/V）、特に６〜１５％（W/V）の範囲とすることが好ましい。
【００４６】
また、電気泳動装置としては、泳動漕、泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、ペリスタポンプ等よりなる一般的なものが使用でき、市販のどのような機種でも良い。
【００４７】
本発明の核酸の分離方法は、上記電気泳動用ゲル組成物を使用して電気泳動する分離方法である。この場合の電気泳動法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であるのが、特に好ましい。
【００４８】
本発明の核酸の分離方法においては、同一塩基数の複数の核酸混合物をサンプルとする場合にも、混合物中の各核酸を分離することができる。
【００４９】
即ち、複数の核酸を含む混合物をサンプルとし、同一の塩基数であってもその塩基配列のチミン含量が異なる核酸の電場における移動度を有意に変動せしめ得るポリアミン錯体、例えば前記構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体を含有するゲル中にて電気泳動することにより、混合物中の各核酸を好適に分離することができる。
【００５０】
本発明の電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物を用いたゲル電気泳動法や、本発明の核酸の分離方法は、室温、好ましくは１５〜３５℃程度において、汎用型の電気泳動装置と安全で安価な電気泳動用試薬を用いて、容易に行うことができる。
【００５１】
上記ゲル電気泳動法及び核酸の分離方法において、サンプル（検体）としては、解析対象となるものであれば特に制限はないが、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ペプチド、タンパク質、それらの混合物、又は細菌、始原菌、酵母、カビ、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、植物組織、動物組織、血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料から調製されたサンプル、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の産物、核酸を酵素処理した反応溶液などが好ましく使用される。ＰＣＲの産物としては、例えば、細胞よりゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としたＰＣＲにより増幅したＤＮＡ等が好ましく使用される。
【００５２】
また、サンプルを電気泳動法に供する前に、前処理をおこなってもよい。このような前処理としては、例えば核酸とタンパク質が共存する試料において、タンパク質を有機溶媒処理にて予め除去するなどの処理が挙げられる。
【００５３】
【実施例】
以下、製造例、実施例及び比較例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明する。但し、本発明は、各例により、限定されるものではない。
【００５４】
実施例及び比較例において使用した電気泳動器具及び試薬は、次の通りである。
【００５５】
(1)電気泳動システム
泳動装置（泳動層、泳動用ガラス板、スペーサー、コーム、クリップを含む）は、ATTO社の汎用型電気泳動システム「AE-6500」を使用した。パワーサプライはファルマシアバイオテク社の「ESP3500」を、ペリスタポンプはIWAKI社の「PST-050」を、それぞれ使用した。
【００５６】
(2)ゲル調整用試薬と泳動用試薬
３０％（w/v）アクリルアミド溶液：アクリルアミド２９ｇ、N,N'-メチレンビスアクリルアミド１ｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとしたもの、
１０％（w/v）過硫酸アンモニウム溶液（用時調製）、及び
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）。
【００５７】
泳動用バッファー：トリスヒドロキシアミノメタン（Tris）１０．８ｇ、ホウ酸（Borate）５．５ｇを水５０ｍＬに溶解して、２０倍濃縮液を得た。これを用時希釈して総容量を１リットルとして用いた（濃度：９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）。
【００５８】
色素溶液：６０％（w/v）グリセロール、０．２×泳動用バッファー、０．０２％（w/v）ブロモフェノールブルー、０．０２％（w/v）キシレンシアノールＦＦ。
【００５９】
エチジウムブロマイド染色液：１０μｇ/mLになるように水に溶解する。
【００６０】
製造例１ サイクレン亜鉛錯体硝酸塩の合成
硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）０．１０ｍｍｏｌ（２９．７ｇ）とサイクレン０．１０ｍｍｏｌ（１７．２ｇ）を２５０ｍＬのエタノールに加え溶解した。その溶液をマグネティックスターラーで撹拌しながら７０℃で３０分間加温した。これを濾紙で濾過した溶液をロータリーエバポレーターを用いて約５０ｍＬまでゆっくり濃縮した。その濃縮により、無色プリズム結晶が析出した。室温で１時間放置した後，グラスフィルターでその結晶を濾取し、５０℃、５ｍｍＨｇで減圧加熱乾燥することにより、構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体であるサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩が、収率９２％（収量３３．２ｇ）で得られた。この化合物の分析結果は、下記の通りである。
【００６１】
元素分析をした結果、理論値はC8H20N6O6Zn:C,26.57;H,5.57;N,23.24であり、実測値はC,26.61;H,5.60;N,23.28であった。
【００６２】
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果は、δ＝2.80（8H,m），2.94（8H,m）であった。
【００６３】
13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果は、δ＝46.6であった。
【００６４】
赤外線分析の主要吸収体の測定結果は、ＩＲ（ｃｍ-1）：3177, 2918, 1482, 1444, 1384(NO3 -), 1279, 1092, 1010, 993, 806であった。
【００６５】
実施例及び比較例において行った電気泳動法は、次の通りである。
【００６６】
製造例１で得たサイクレン亜鉛錯体（硝酸塩）１．９６ｇを９．７５ｍＬの蒸留水に溶解し、０．２５ｍＬの１０Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．９とし、５００ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を調製した。陰極用泳動バッファーとしては、前記泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いた。陽極用泳動バッファーとしては、前記泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）に１／１００容量の５００ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を加えて得た５ｍＭサイクレン亜鉛錯体溶液を、用いた。
【００６７】
ガラス板をエタノールでよくみがき、メーカーの製品プロトコールに従ってセット後、ゲル溶液を流し込み、すぐにコームを挿し、ゲル溶液が固化したらクリップを外し、コームを抜いた。泳動バッファーとゲルの下端の間に空気が入らないように注意しながら、陽極バッファーを注いだ泳動槽にゲルをセットした。ゲル板を固定し、陰極バッファーを注いだ後、試料溝を注射針を用いて陰極バッファーでよく洗浄し、ただちに試料を色素溶液３μＬに溶解した試料液を添加した。２００Ｖ定電圧で９０分から１２０分（分離したいＤＮＡの長さによって調節する）通電した。サイクレン亜鉛錯体を含む陽極バッファーは局所的なｐＨの変動を起こすことがあるので、陽極槽内のバッファーはペリスタポンプで循回した。泳動終了後はエチジウムブロマイド染色液に約１５分浸した後、ＵＶ照射下で写真撮影した。使用したサイクレン亜鉛錯体（５ｍＭ）のゲル溶液の組成を、表１に示した。
【００６８】
【表１】
実施例１
上記表１のサイクレン亜鉛錯体入りの８％（w/v）又は１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、前記陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーを用いて、２００Ｖ定電圧で９０分間又は１２０分間電気泳動をおこなった。
【００７０】
試料は、次の様に調製したものを用いた。まず、ターゲットＤＮＡはラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子（DDBJデータベースに登録；accession No.M26643）の野生型、およびヌクレオチド１１６２〜１７８２の６２１ｂｐの間に部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子を用いた。各ＤＮＡの５４１〜６２１の塩基配列を図１に示す。図１において、Ｎｏ．１の塩基配列は、野生型の塩基配列を、Ｎｏ．２〜１５の塩基配列は、変異型の塩基配列を、それぞれ示す。また、図１中、長方形の枠で囲んだ部分が変異部分である。
【００７１】
これらの遺伝子断片は、promega社のpGEM-T-Easyベクターに挿入した。各断片を挿入したpGEM-T-EasyベクターＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマーオリゴヌクレオチド１（配列番号：１）とプライマーオリゴヌクレオチド２（配列番号：２）（各０．６μＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各６５μＭ）、２．５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Thermoprime plus；Advanced biotechnologies, UK）とその専用バッファーを加えて全量を５０μｌとした。ミネラルオイルを重層し、「サーマルサイクラー」（MJ research Inc., model PTC-150）にセットし、[９５℃３分、６０℃１分、７２℃１分]を１サイクル、[９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分]を２９サイクル、及び７２℃３分のプログラムでＰＣＲを行った。
【００７２】
増幅したＤＮＡはエタノール沈澱によって精製した。制限酵素Msp I(New England Biolab社)で、６２１ｂｐのＰＣＲ断片を完全消化処理し、目的の変異を含むＤＮＡ断片の大きさを１５１ｂｐとした。この際、２６２ｂｐ及び２０８ｂｐのＤＮＡ断片も生成した。反応後はエタノール沈澱によって精製し、色素溶液に溶解した。
【００７３】
各試料ＤＮＡ２０ｎｇをサンプルスロットに入れ、電気泳動を行った。
【００７４】
電気泳動の結果を図２に示す。図２の（ａ）は１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用いて、２００Ｖ定電圧で１２０分間電気泳動を行った場合の結果を、（ｂ）は８％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用いて、２００Ｖ定電圧で９０分間電気泳動を行った場合の結果を、それぞれ示す。
【００７５】
図２より、Ｎｏ．１の１５１塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（１５１塩基対）のＤＮＡフラグメントとが、電気泳動により分離可能であることが分かる。
【００７６】
比較例１
表１の１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルにおいて、サイクレン亜鉛錯体を入れない以外は、同じ組成の１０％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーとして泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いて、２００Ｖ定電圧で４０分間電気泳動をおこなった。試料は、実施例１と同じものを用いた。
【００７７】
結果を図３に示す。図３より、Ｎｏ．１の１５１塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（１５１塩基対）のＤＮＡフラグメントとを、既存の電気泳動法により分離することが不可能であることが分かる。
【００７８】
実施例２
上記表１のサイクレン亜鉛錯体入りの１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、前記陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーを用いて、２００Ｖ定電圧で１１０分間電気泳動をおこなった。
【００７９】
試料は、次の様に調製したものを用いた。まず、ターゲットＤＮＡはラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子（DDBJデータベースに登録；accession No.M26643）の野生型、およびヌクレオチド１１６２〜１７８２の６２１ｂｐの間に部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子を用いた。各ＤＮＡの塩基配列を図１に示す。図１において、Ｎｏ．１の塩基配列は、野生型の塩基配列を、Ｎｏ．２〜１５の塩基配列は、変異型の塩基配列を、それぞれ示す。また、図１中、長方形の枠で囲んだ部分が変異部分である。
【００８０】
これらの遺伝子断片は、promega社のpGEM-T-Easyベクターに挿入した。各断片を挿入したpGEM-T-EasyベクターＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマーオリゴヌクレオチド１（配列番号：１）とプライマーオリゴヌクレオチド２（配列番号：２）（各０．６μＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各６５μＭ）、２．５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Thermoprime plus；Advanced biotechnologies, UK）とその専用バッファーを加えて全量を５０μｌとした。ミネラルオイルを重層し、「サーマルサイクラー」（MJ research Inc., model PTC-150）にセットし、[９５℃３分、６０℃１分、７２℃１分]を１サイクル、[９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分]を２９サイクル、及び７２℃３分のプログラムでＰＣＲを行った。
【００８１】
増幅したＤＮＡはエタノール沈澱によって精製した。制限酵素Alu I(New England Biolab 社)で、 ６２１ｂｐのＰＣＲ断片を完全消化処理し,目的の変異を含むＤＮＡ断片の大きさを９９ｂｐとした。この際、１７７ｂｐ、１５８ｂｐ、６３ｂｐ及び６１ｂｐのＤＮＡ断片も生成した。反応後はエタノール沈澱によって精製し、色素溶液に溶解した。
【００８２】
各試料ＤＮＡ２０ｎｇをサンプルスロットに入れ、電気泳動を行った。
【００８３】
電気泳動の結果を図４に示す。図４より、Ｎｏ．１の９９塩基対の塩基配列のＤＮＡフラグメントと、Ｎｏ．２〜１５の１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（９９塩基対）のＤＮＡフラグメントとが、電気泳動により分離可能であることが分かる。
【００８４】
比較例２
表１の１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルにおいて、サイクレン亜鉛錯体を入れない以外は、同じ組成の１２％（w/v）ポリアクリルアミドゲルを用い、陽極用泳動バッファー及び陰極用泳動バッファーとして泳動用バッファー（９０ｍＭ Tris−９０ｍＭ Borate）を用いて、２００Ｖ定電圧で８０分間電気泳動をおこなった。試料は、実施例２と同じものを用いた。
【００８５】
結果を図５に示す。図５の（ａ）は、図１のＮｏ．１の野生型の塩基配列及びＮｏ．２〜１５の変異型塩基配列についての結果を、（ｂ）はＮｏ．１の配列とＮｏ．２〜１５の配列との混合物についての結果を、それぞれ示す。
【００８６】
図５より、１〜７箇所の変異を有する同一サイズ（９９塩基対）のＤＮＡは、既存の電気泳動法により分離することが不可能であることが分かる。
【００８７】
【発明の効果】
本発明の環状テトラアミン亜鉛錯体、電気泳動用試薬及び電気泳動用組成物によれば、タンパク質、ペプチド、核酸などの生体分子の分離、分析を、簡便かつ低コストで行うことが可能となる。
【００８８】
また、本発明の核酸の分離方法によれば、核酸、特に核酸フラグメントの１塩基または２塩基以上の変異の検出が、簡便かつ低コストで、可能となる高い分離能力を有する電気泳動法に基づく、分離方法が可能となる。
【００８９】
さらに、本発明を用いることにより、高い分離能力を有する電気泳動法の基礎研究分野及び産業分野への応用が可能となる。また、本発明は手法が簡潔であるため、各種自動分析装置への適用も容易であり、多数の検体処理にも適している。
【００９０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラットの電位依存性骨格筋ナトリウムチャネルa-サブユニット遺伝子の野生型、及びこれに部位特異的変異処理をほどこした１４種類の変異遺伝子の各ＤＮＡの塩基配列の一部を示すものである。
【図２】図２は、実施例１における電気泳動の結果を示すものである。
【図３】図３は、比較例１における電気泳動の結果を示すものである。
【図４】図４は、実施例２における電気泳動の結果を示すものである。
【図５】図５は、比較例２における電気泳動の結果を示すものである。
Claims (8)
- 下記構造式（１）で表される環状テトラアミン亜鉛錯体硝酸塩を含有する核酸の電気泳動用試薬。
- 電気泳動用ゲルに含ませた形態である請求項１に記載の電気泳動用試薬。
- 電気泳動用バッファーに含ませた形態である請求項１に記載の電気泳動用試薬。
- 電気泳動用サンプルに含ませた形態である請求項１に記載の電気泳動用試薬。
- 請求項１に記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用ゲルを含有することを特徴とする核酸の電気泳動用ゲル組成物。
- 請求項１に記載の電気泳動用試薬及び電気泳動用バッファーを含有することを特徴とする核酸の電気泳動用バッファー組成物。
- 請求項５に記載の電気泳動用ゲル組成物を使用して電気泳動することを特徴とする核酸の分離方法。
- 同一塩基数の複数の核酸混合物をサンプルとする請求項７に記載の核酸の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002265220A JP3972194B2 (ja) | 2002-09-11 | 2002-09-11 | 電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002265220A JP3972194B2 (ja) | 2002-09-11 | 2002-09-11 | 電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004101409A JP2004101409A (ja) | 2004-04-02 |
| JP3972194B2 true JP3972194B2 (ja) | 2007-09-05 |
Family
ID=32264419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002265220A Expired - Fee Related JP3972194B2 (ja) | 2002-09-11 | 2002-09-11 | 電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3972194B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7804592B2 (en) | 2003-10-16 | 2010-09-28 | Nard Institute, Ltd. | Method for measuring a surface plasmon resonance and noble metal compound used for the same |
| CN100595573C (zh) * | 2003-10-16 | 2010-03-24 | 株式会社纳德研究所 | 表面等离子共振的测定方法及用于该方法的贵金属化合物 |
-
2002
- 2002-09-11 JP JP2002265220A patent/JP3972194B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004101409A (ja) | 2004-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101963462B1 (ko) | 재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법 | |
| JP4276301B2 (ja) | 固定化プローブを用いる、分子の電気泳動分析 | |
| KR100510606B1 (ko) | 상호작용 분자의 해리 방법 | |
| US6511831B1 (en) | Electrical integrated nucleic acid isolation, purification and detection | |
| US20150219596A1 (en) | Enrichment of nucleic acid targets | |
| US5059294A (en) | Method for separating nucleic acids and nucleic acid probes | |
| US7285199B2 (en) | Apparatus and method for electrophoretic microspot concentration | |
| JP2002537781A (ja) | 固定化捕捉プローブを有する生化学的精製装置およびその使用 | |
| EP1411340A2 (en) | Biochemical purification devices with immobilized capture probes and their uses | |
| US11898196B2 (en) | Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins | |
| US11795497B2 (en) | Enrichment of nucleic acid targets | |
| JP3124969B2 (ja) | 温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置 | |
| CA2920523A1 (en) | Sensor growth controller | |
| Jiang et al. | A DNA-modified hydrogel for simultaneous purification, concentration and detection of targeted cfDNA in human serum | |
| JP3972194B2 (ja) | 電気泳動用試薬、電気泳動用組成物及び核酸の分離方法 | |
| US7049070B2 (en) | Materials and methods for detection and characterization of nucleic acid sequence variability | |
| JP7443554B2 (ja) | 試料分析のための装置及び方法 | |
| US9340835B2 (en) | Method for separating homoduplexed and heteroduplexed nucleic acids | |
| RU123960U1 (ru) | Прибор для вертикального электрофореза нуклеиновых кислот и белков в градиентных гелях | |
| Pandey | Techniques in Life Science | |
| KR20160097881A (ko) | 금나노입자 및 자성비드입자를 이용한 비-증폭 dna 검출방법 | |
| EP1694862A1 (en) | Methods and compositions for assaying mutations in nucleic acids and their uses in diagnosis of genetic diseases and cancers | |
| CN116698944A (zh) | 一种基于靶标诱导mof生长策略的超灵敏电化学传感器及其构建与应用 | |
| Trnkova et al. | Single strand conformation polymorphism of oligonucleotides in their isolation by means of magnetic micro particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050310 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070126 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070207 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070406 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070509 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070529 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100622 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100622 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110622 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120622 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130622 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130622 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |