JP3971801B2

JP3971801B2 - Antitumor anthracycline disaccharide

Info

Publication number: JP3971801B2
Application number: JP53767897A
Authority: JP
Inventors: コロンボ，アンナ・ルイザ; リボーラ，ジヨバンニ; フエデーリ，ロレーナ・ルイザ; インベンテイソラーリ，アウグスト; パベジ，アンドレア; リパモンテイ，マリナ
Original assignee: ミニステロ・デルユニベルシータ・エ・デラ・リチエルカ・シエンテイフイカ・エ・テクノロジカ
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2017-04-11
Also published as: DE19781703B4; JP2000508546A; WO1997040057A1; GB2328688B; GB2328688A; DE19781703T1; GB2328688A8; ITMI960819A0; ITMI960819A1; GB9823306D0; IT1282379B1

Description

本発明は、新規な抗腫瘍性アントラサイクリン二糖類、その製造及び該二糖を含有する医薬調整物に関する。これらのアントラサイクリン類は、抗腫瘍剤として有用であり、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対して活性である。
本発明の目的とする化合物は、以下の式：

（式中、Rは、
（Ｉ）COCH₃＝4'-O-バンコサミニルダウノマイシン、
（II）CHOHCH₃＝4'-O-バンコサミニル 13-ジヒドロダウノマイシン、
（III）COCH₂OH＝4'-O-バンコサミニルドキソルビシン
を表す）を有すると報告されている。
アントラサイクリン（Ｉ）（式中、R＝COCH₃である）の二糖類は、窒素、炭素及び無機塩などの同化可能な源を含有する液体基質中、好気性条件下で、Streptomyces種の培地の発酵を企図する、微生物学的方法により製造することができる。当該Streptomyces種は、本出願人の株バンクでは番号15105と同定され、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の国際的な受託機関の資格を獲得した、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ），Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germanyに、1996年３月20日に寄託され、番号10632号を受けた。
（Ｉ）は、本発明に記載された方法に従い、同一ブロス培地から得られる。
式（Ｉ）の化合物（式中、R＝COCH₃である）は、好適な化学反応により、式（II）の化合物（式中、R＝CHOHCH₃である）及び式（III）の化合物（式中、R＝COCH₂OHである）に転換させることができる。
微生物の特性
顕微鏡的特徴
増殖性菌糸体（vegetative mycelium）は、種々の長さで、直径0.5〜0.9ミクロンの分岐菌糸から形成されており、該菌糸体から誘導される好気性菌糸体は、直径0.9〜1.2ミクロンの、壊れやすい蛇行性の長く柔軟な菌糸から形成されている。
胞子形成は非常に少なく、短鎖で、フック（hook）の状態で停止する。胞子は卵形で寸法は、0.8〜1.1×1.9〜2.2ミクロンである。走査電子顕微鏡による測定では、胞子は、平滑面を有している。
肉眼的特性
株15105の培地特性を表１に示す。生長は、有機及び合成培地のいずれに於いても通常良好である。生長過程を、28℃で14日間培養後に測定した。

株15105の生化学的及び生理学的特徴を表２及び３に報告する。
40℃を超える温度では、生長は全く観察されなかった。
株15105の同定及び分類
株15105により示される全ての特性は、Streptomyces種に関してWaksman及びHenriciにより報告されているものと明瞭に対応した。

試験で使用した培地は、1%K₂HPO₄を補った酵母窒素ベース（Difco製）であった。

株の生長で使用した培地は、ISP3（Difco製）であった。酵素活性の測定には、菌糸体の水中懸濁液を使用した。
発酵
25℃〜33℃の温度範囲、４日〜７日の時間で、撹拌液相中で発酵を実施することができる。培地は、炭素、窒素及び無機塩から構成することができる。炭素源としては、スターチ、デキストリン、グリコース、グリセリン、マンニトール及びマルトースが挙げられる；窒素源としては、コーンスティープリカー（cornsteep liquor）、大豆粉、ドライイースト、ペプトン及びカゼインが挙げられる。硝酸アンモニウム及び硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を使用しても良好な結果が得られる。製造に使用した無機塩は、培地の機能に依存して変動し得る。種々のタイプの粉または発酵の残渣を含む複合培地では、炭酸カルシウムまたはリン酸カルシウムを添加するのが有用である。発酵は、ビーカー中及び種々の容量の発酵器中で実施することができる。
分析方法
発酵ブロスからの抽出物、粗生成物、クロマトグラフィーカラムからの画分及び化学反応から誘導されたサンプルを、クロロホルム：メタノール：酢酸：水80:20:14:6の混合物中で展開させた、薄層クロマトグラフィー（TLC プレート 60-F-254 Merck）により測定する。化合物（Ｉ）、（II）及び（III）は、各々、0.25、0.15及び0.12のクロマトグラフィーRfを示す。
（Ｉ）、（II）及び（III）の穏和な酸加水分解から得られたサンプルを、同一溶離液を使用してTLCにより測定すると、各々、ダウノマイシン（IV）、13-ジヒドロダウノマイシン（V）及びドキソルビシン（VI）であると同一の、クロマトグラフィーのRf0.5、0.4及び0.35の位置に赤い点が現れる。
n-プロパノール：水：酢酸エチル：30%水酸化アンモニウム（70:30:10:10）の混合物中で展開し、次いで硫酸で検出後、TLCにより測定した水溶性残渣は、バンコサミン（VII）のRfと同一のRf0.55の点を示す。
（Ｉ）、（II）及び（III）の強い酸加水分解により得られた有機抽出物を、クロロホルム：アセトン4:1の混合物を溶離液として使用するTLCにより分析し、ダウノマイシノン（VIII）、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）及びアドリアマイシノン（X）のRfと各々同一である、クロマトグラフィーRf0.5、0.11及び0.15の赤い点を示す。
上記の如くTLCで分析した水溶性残渣中に、Rf0.45のダウノサミン（XI）及びバンコサミンの存在が知見される。
アントラサイクリン成分の総含量をダウノマイシンの特異的な強度をリファレンスとして使用して、495nmで分光光度計で測定する。
発酵から粗生成物の取得
発酵段階の終了時、新規化合物（Ｉ）は、主にブロス濾液中に含まれ、これは、n-ブタノールなどの水に非混和性溶媒でアルカリ性環境で抽出することができる。有機相から、この化合物は、酸性の水中に再抽出することができ、例えば、n-ヘキサンなどの弱い極性溶媒を添加して、アルコール、例えば、n-プロパノールの存在下で濃縮後、他のグリコシド化アントラサイクリン類を一緒に含有する化合物（Ｉ）を含有する粗な赤い沈殿物が得られる。
精製工程
（Ｉ）の連続化学形質転換により得られた化合物（II）及び（III）並びに化合物（Ｉ）を含有する、発酵後に得られた粗な生成物の精製は、例えば、Lichroprep RP-（8）（Merck製）の逆相クロマトグラフィーカラムを使用して実施することができる。精製すべき生成物を含有する水溶液は、水とトリフルオロ酢酸などの酸の酸性にしたアセトニトリルなどの有機溶媒との混合溶離液を使用するクロマトグラフィーにかけて精製することができる。カラムから集め、プールし、次いで濃縮した画分を凍結乾燥することができる。
これらの方法により、本発明の目的物の純粋なサンプルの、新規アントラキノン性二糖類4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）、4'-O-バンコサミニル13-ジヒドロダウノマイシン（II）及び4'-O-バンコサミニルドキソルビシン（III）が得られた。
（Ｉ）、（II）、（III）の物理化学的特性
トリフルオロ酢酸塩の形態で凍結乾燥した赤い生成物として得られた新規化合物（Ｉ）、（II）及び（III）は、水、ジオキサン及びアルコールに溶解性であるが、クロロホルム、エチルエーテル及びn-ヘキサンに不溶性である。
物理化学的特性を表４及び５にまとめる。

化学シフトは、テトラメチルシランを参照として値（ppm）として表現している。
構造のデルシデーション（delucidation）
（Ｉ）、（II）及び（III）の穏和な酸加水分解により、各々ダウノマイシン（IV）、13-ジヒドロダウノマイシン（V）、ドキソルビシン（VI）及びバンコサミン（VII）が得られる。
（Ｉ）、（II）及び（III）の強い酸加水分解により、赤いアグリコン類、ダウノマイシノン（VIII）、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）、アドリアマイシノン（X）、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VIII）が各々得られる。
分解によって得られた生成物のスペクトルデータを元にして、本出願人は、化合物（Ｉ）、（II）及び（III）が、公知のアントラサイクリン類の新規二糖類、各々、4'位置で糖アミンバンコサミンと結合した、各々ダウノマイシン、13-ジヒドロダウノマイシン及びドキソルビシンであると結論付けた。
本発明で提案する化学構造をスキームＩに報告する。

生物学的活性
a）抗菌活性
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の最小阻害濃度MICを、寒天中の表示希釈率方法を使用して数種類の微生物に関して測定した。その結果を表６に示す。

b）抗腫瘍活性
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の細胞毒性を、ドキソルビシンに対して感受性または耐性であるLoVo細胞（LoVo/Dxr）でin vitroで試験し、その結果を表７に示す。

4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の抗白血病活性を、L1210マウス腹水白血病に対しin vivoで試験し、その結果を表８に示す。

L1210マウス腹水白血病に対するネズミにおけるin vivoで試験した生成物（Ｉ）は、表８に示されているような低い毒性のダウノルビシンの活性と匹敵する活性を有することが明らかになった。
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、本願を限定するものではない。
実施例１
Streptomyces種15105の培養菌を、CZY寒天培地（3%蔗糖；0.4%酵母抽出物；0.3% NaNO₃；0.1% K₂HPO₄；0.05% MgSO₄.7H₂；0.05% KCl；0.001% FeSO₄.7H₂O； 2% 寒天；脱イオン水100ml； pH 6.7；120℃で20分間の滅菌）上で28℃で12日間生長させた。
このようにして得られた培養菌の胞子を集め、以下の培地：1%カゼイン；2%デキストリン；1%コーンスティープリカー；0.1%（NH₄）₂SO₄；0.01% K₂HPO₄；0.5% CaCO₃；100ml 脱イオン水の30mlを含有する300mlフラスコ中に懸濁させた。
120℃で20分間、滅菌した。滅菌後のpHは、6.8〜7.0の範囲で変動する。接種したフラスコを回転振盪器上で、28℃で２日間、280rpmで7cm偏心で撹拌した。上記培地の2mlに等しい量を、以下の培地：6%スターチ；1.8% コーンスティープリカー；0.1% 酵母抽出物；0.25% NaCl；0.3% CaCO₃；0.001% FeSO₄.7H₂O；0.001% ZnSO₄.7H₂O；0.001% CuSO₄.5H₂O；100ml 脱イオン水の30mlを含有する300mlフラスコ中に接種した。120℃で20分間滅菌した。フラスコを、28℃で７日間、回転振盪器上で280rpmで7cm偏心で培養した。
実施例２
実施例１に従って、アセトニトリル（１リットル）を補ったブロス培地（20リットル）をセライトを使用して濾過した。濾液を真空下、濃縮（６リットル）し、n-ブタノール（2×500ml）でpH8.2で抽出した。化合物（Ｉ）及び他のアントラサイクリンを含有する有機相に、HClの酸性水（100ml pH2.5）を添加し、続いて、エチルエーテル（２リットル）及びn-ヘキサン（２リットル）を添加した。振盪後、水性相を分離し、真空下濃縮し、n-プロパノールで小容量とし、分光光度計で滴定し、２当量のメタノール性HCl及び過剰のn-へキサンを補って、粗な赤い沈殿物の形成を誘導した。沈澱を濾過により集め、真空乾燥させた（600mg）。
TLCにより調べると、新規化合物（Ｉ）と他のグリコシド化アントラサイクリンが含有されていた。
実施例３
実施例２により得られた（Ｉ）を含有する粗な沈澱を小容量の水：アセトニトリル（9:1）に溶解させ、Lichroprep RP-8カラム（310-25mm）上でクロマトグラフィーにかけた。トリフルオロ酢酸でpH3に調節した水：アセトニトリル（8:2）の混合物で溶離を実施した。集めた画分をTLCで分析し、単一のスポットを含むものをプールし、これを真空濃縮して、凍結乾燥させた。
赤い凍結乾燥生成物75mgが得られ、この特性を表４及び５に示す。
0.1N酢酸水溶液（0.2ml）を添加した後、ジオキサン（0.5ml）中に溶解させたアリコート（6mg）を85℃に１時間加熱した。水で希釈した反応混合物をクロロホルムでpH8.2で抽出し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させて、小容量になるまで濃縮し、滴定し、メタノール性HCl１当量を補った。沈澱が形成し、これを集め、乾燥させ（3mg）、TLCで分析すると、純正サンプルと比較してダウノマイシン（IV）であることが同定された。残りの水性相は、TLCで純正サンプルと直接比較して同定された、アミノ糖バンコサミン（VII）を含有していた。
別のアリコート（6mg）を0.2N HCl（2ml）に溶解させ、100℃に１時間加熱した。赤い沈澱を濾過により集め、水で洗浄し、乾燥させ（2mg）、TLC分析すると、純正サンプルと直接比較することによりダウノマイシノン（VIII）であることが同定された。
TLCにより分析した水性残渣は、純正サンプルと直接比較することにより、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VII）であると同定された２種類のアミノ糖類を含有していた。
発酵により得られた生成物は、4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）であることが同定された。
実施例４
実施例２により得られた純粋な4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）のサンプル（8mg）を水（0.8ml）中に溶解させ、NaHCO₃水溶液でpH9に調節し、NaBH₄（0.6mg）を補い、周囲温度に５分間保持した。メタノール数滴及び0.05N HClを添加してpH4.5にした後、溶液を実施例３に記載のように、RP-8上のクロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥後、表４にその特性が記載されている新規な赤い生成物を得た。
実施例３に記載のように穏和な酸加水分解にかけたアリコートから、13-ジヒドロダウノマイシン（V）及びバンコサミン（VII）が得られ、これらは、TLC下、純正サンプルと直接比較して同定した。
実施例３に記載のように強い酸加水分解にかけたアリコートから、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VIII）が、TLC下、純正サンプルとの比較により同定された。
（Ｉ）の化学的形質転換によってこのように得られた新規生成物は、4'-O-バンコサミニル 13-ジヒドロダウノマイシン（II）と同定された。
実施例５
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）（15mg）を無水メタノール：ジオキサン1:3混合物に溶解させ、エチルオルトギ酸エステル（0.05ml）を補った。15分後、溶液を5℃に冷却し、Br₂（5%CHCl₃中0.15ml）、HCl（メタノール0.02ml中2.5M）を補い、一晩4℃に保持した。
n-ヘキサン5容量を添加すると、赤い沈澱が得られ、これをアセトン（1ml）中に溶解させ、0.25M HBr 水溶液（1ml）を添加し、4℃で一晩放置した。
この溶液を1M NaCOOH水溶液でpH4.3にし、次いで周囲温度で2日間磁気撹拌して保持し、次いで実施例３に記載の如くRP-8カラムのクロマトグラフィーにかけた。
凍結乾燥後に、その特性が表４に記載されている、新規赤い生成物が得られた（6mg）。
実施例３に記載の如く穏和な酸加水分解にかけたアリコートから、ドキソルビシン及びバンコサミンが各々得られ、これをTLCで、純正サンプルと直接比較して同定した。
実施例３に記載の如く強い酸加水分解にかけたアリコートから、TLCで、アドリアマイシノン（X）、バンコサミン（VIII）及びダウノサミン（XI）が、各々、純正サンプルと比較することにより同定された。
（Ｉ）の化学的形質転換によってこのように得られた新規生成物は、4'-O-バンコサミニルドキソルビシン（III）であることが同定された。The present invention relates to a novel antineoplastic anthracycline disaccharide, its production and a pharmaceutical preparation containing the disaccharide. These anthracyclines are useful as antitumor agents and are active against gram positive and gram negative bacteria.
The compounds of interest of the present invention have the following formula:

(Where R is
(I) COCH ₃ = 4′-O-vancosaminyl daunomycin,
_{(II) CHOHCH 3 = 4'-} O- Bankosaminiru 13 dihydro Dow actinomycin,
(III) represents COCH ₂ OH = 4′-O-vancosaminyl doxorubicin).
The disaccharide of anthracycline (I), where R = COCH ₃ , is a medium of Streptomyces species under aerobic conditions in a liquid substrate containing assimilable sources such as nitrogen, carbon and inorganic salts. Can be produced by a microbiological process that contemplates the fermentation of The Streptomyces species, identified as number 15105 in Applicant's stock bank, has acquired the qualification of the international contracting body of the Budapest Treaty for the international recognition of the deposit of microorganisms in the patent procedure, DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen It was deposited with the und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany on March 20, 1996 and received number 10632.
(I) is obtained from the same broth medium according to the method described in the present invention.
The compound of formula (I) (wherein R = COCH ₃ ) is converted into a compound of formula (II) (wherein R = CHOHCH ₃ ) and a compound of formula (III) by a suitable chemical reaction ( Where R = COCH ₂ OH).
Characteristics of microorganisms
Microscopic features The vegetative mycelium is formed from branched mycelium of various lengths and diameters from 0.5 to 0.9 microns, and the aerobic mycelium derived from the mycelium is: It is made of fragile, serpentine, long and flexible mycelium with a diameter of 0.9-1.2 microns.
Sporulation is very low, short chain, stops in a hooked state. The spores are oval and the dimensions are 0.8-1.1 × 1.9-2.2 microns. In the measurement by a scanning electron microscope, the spore has a smooth surface.
Macroscopic characteristics The medium characteristics of strain 15105 are shown in Table 1. Growth is usually good in both organic and synthetic media. The growth process was measured after 14 days of culture at 28 ° C.

The biochemical and physiological characteristics of strain 15105 are reported in Tables 2 and 3.
At temperatures above 40 ° C, no growth was observed.
Identification and classification of strain 15105 All the characteristics exhibited by strain 15105 corresponded clearly to those reported by Waksman and Henrici for Streptomyces species.

The medium used in the test was a yeast nitrogen base (Difco) supplemented with 1% K ₂ HPO ₄ .

The medium used for the growth of the strain was ISP3 (Difco). For measuring enzyme activity, a mycelium suspension in water was used.
fermentation
The fermentation can be carried out in the stirred liquid phase at a temperature range of 25 ° C. to 33 ° C. for a time of 4 to 7 days. The medium can be composed of carbon, nitrogen and inorganic salts. Carbon sources include starch, dextrin, glycolose, glycerin, mannitol and maltose; nitrogen sources include cornsteep liquor, soy flour, dry yeast, peptone and casein. Good results are also obtained using ammonium salts such as ammonium nitrate and ammonium sulfate. The inorganic salt used in the manufacture can vary depending on the function of the medium. In complex media containing various types of flour or fermentation residues, it is useful to add calcium carbonate or calcium phosphate. Fermentation can be carried out in beakers and in various volumes of fermenters.
Analytical methods Extracts from fermentation broth, crude products, fractions from chromatography columns and samples derived from chemical reactions were mixed in chloroform: methanol: acetic acid: water 80: 20: 14: 6 Measured by thin layer chromatography (TLC plate 60-F-254 Merck) developed in. Compounds (I), (II) and (III) show chromatographic Rf of 0.25, 0.15 and 0.12, respectively.
Samples obtained from mild acid hydrolysis of (I), (II) and (III) were measured by TLC using the same eluent, respectively, daunomycin (IV), 13-dihydrodaunomycin (V) And red dots appear at chromatographic Rf 0.5, 0.4, and 0.35 positions, which are identical to doxorubicin (VI).
After developing in a mixture of n-propanol: water: ethyl acetate: 30% ammonium hydroxide (70: 30: 10: 10) and then detecting with sulfuric acid, the water-soluble residue as measured by TLC is that of vancosamine (VII) Rf0.55 point identical to Rf is shown.
Organic extracts obtained by strong acid hydrolysis of (I), (II) and (III) were analyzed by TLC using a chloroform: acetone 4: 1 mixture as the eluent, and daunomycinone (VIII), 13 -Chromatographic Rf 0.5, 0.11 and 0.15 red dots, identical to the Rf of dihydrodaunomycinone (IX) and adriamycinone (X), respectively.
In the water-soluble residue analyzed by TLC as described above, the presence of daunosamine (XI) of Rf 0.45 and vancosamine is found.
The total content of anthracycline components is measured with a spectrophotometer at 495 nm using the specific intensity of daunomycin as a reference.
At the end of the acquisition <br/> fermentation stage of the crude product from the fermentation, novel compound (I) is mainly contained in the broth filtrate, which is an alkaline environment immiscible solvent in water, such as n- butanol Can be extracted. From the organic phase, this compound can be re-extracted into acidic water, eg after adding a weak polar solvent such as n-hexane and concentrating in the presence of an alcohol such as n-propanol A crude red precipitate containing compound (I) containing glycosidated anthracyclines together is obtained.
Purification of the crude product obtained after fermentation containing compounds (II) and (III) and compound (I) obtained by continuous chemical transformation in the purification step (I) can be carried out, for example, by Lichroprep RP- ( 8) Can be performed using a reverse phase chromatography column (Merck). The aqueous solution containing the product to be purified can be purified by chromatography using a mixed eluent of water and an organic solvent such as acetonitrile acidified with an acid such as trifluoroacetic acid. Fractions collected from the column, pooled and then concentrated can be lyophilized.
By these methods, pure anthraquinone disaccharides 4'-O-vancosaminyl daunomycin (I), 4'-O-vancosaminyl 13-dihydrodaunomycin (II) and 4 ' -O-Bancosaminyl doxorubicin (III) was obtained.
Physicochemical properties of (I), (II), (III) Novel compounds (I), (II) and (III) obtained as red products lyophilized in the form of trifluoroacetate Is soluble in water, dioxane and alcohol, but insoluble in chloroform, ethyl ether and n-hexane.
The physicochemical properties are summarized in Tables 4 and 5.

Chemical shifts are expressed as values (ppm) with reference to tetramethylsilane.
Structural delucidation
Mild acid hydrolysis of (I), (II) and (III) yields daunomycin (IV), 13-dihydrodaunomycin (V), doxorubicin (VI) and vancosamine (VII), respectively.
Due to the strong acid hydrolysis of (I), (II) and (III), red aglycones, daunomycinone (VIII), 13-dihydrodaunomycinone (IX), adriamycinone (X), daunosamine (XI) and Each of vancosamine (VIII) is obtained.
Based on the spectral data of the product obtained by decomposition, Applicants have determined that compounds (I), (II) and (III) are known disaccharides of known anthracyclines, each in the 4 ′ position. It was concluded that they were daunomycin, 13-dihydrodaunomycin and doxorubicin, respectively, conjugated with the sugar amine vancosamine.
The chemical structure proposed in the present invention is reported in Scheme I.

Biological activity
a) Antibacterial activity
The minimum inhibitory concentration MIC of 4′-O-vancosaminyl daunomycin (I) was determined for several microorganisms using the indicated dilution ratio method in agar. The results are shown in Table 6.

b) Antitumor activity
The cytotoxicity of 4'-O-vancosaminyl daunomycin (I) was tested in vitro on LoVo cells (LoVo / Dxr) that are sensitive or resistant to doxorubicin and the results are shown in Table 7.

The anti-leukemic activity of 4′-O-vancosaminyl daunomycin (I) was tested in vivo against L1210 mouse ascites leukemia, and the results are shown in Table 8.

The product (I) tested in vivo in mice against L1210 mouse ascites leukemia was found to have an activity comparable to that of low toxicity daunorubicin as shown in Table 8.
The following examples illustrate the present invention and are not intended to limit the present application.
Example 1
The culture of Streptomyces species 15105, CZY agar medium (3% sucrose; 0.4% yeast _{extract; 0.3% NaNO 3; 0.1%} K 2 HPO 4; 0.05% MgSO 4 .7H 2; 0.05% KCl; 0.001% FeSO 4 .7H ₂ O; 2% agar; 100 ml of deionized water; pH 6.7; sterilized at 120 ° C. for 20 minutes) and grown at 28 ° C. for 12 days.
The culture spores thus obtained were collected and the following medium: 1% casein; 2% dextrin; 1% corn steep liquor; 0.1% (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0.01% K ₂ HPO ₄ ; 0.5 % CaCO ₃ ; suspended in a 300 ml flask containing 30 ml of 100 ml deionized water.
Sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. The pH after sterilization varies between 6.8 and 7.0. The inoculated flask was agitated on a rotary shaker at 28 ° C. for 2 days at 280 rpm with 7 cm eccentricity. The amount equal to 2ml of the medium, the following medium: 6% starch; 1.8% corn steep liquor; 0.1% yeast extract; 0.25% NaCl; 0.3% CaCO 3; 0.001% FeSO 4 .7H 2 O; 0.001% ZnSO were inoculated into 300ml flasks containing 100 ml 30 ml of deionized _{_{water; 4 .7H 2 O; 0.001%}} CuSO 4 .5H 2 O. Sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. The flasks were incubated for 7 days at 28 ° C. with 7 cm eccentricity at 280 rpm on a rotary shaker.
Example 2
According to Example 1, broth medium (20 liters) supplemented with acetonitrile (1 liter) was filtered using celite. The filtrate was concentrated (6 liters) under vacuum and extracted with n-butanol (2 × 500 ml) at pH 8.2. To the organic phase containing compound (I) and other anthracyclines was added HCl acidic water (100 ml pH 2.5) followed by ethyl ether (2 liters) and n-hexane (2 liters). . After shaking, the aqueous phase is separated, concentrated in vacuo, made up to a small volume with n-propanol, titrated with a spectrophotometer and supplemented with 2 equivalents of methanolic HCl and excess n-hexane to give a crude red precipitate. Induced product formation. The precipitate was collected by filtration and dried in vacuo (600 mg).
When examined by TLC, it contained novel compound (I) and other glycosidated anthracyclines.
Example 3
The crude precipitate containing (I) obtained according to Example 2 was dissolved in a small volume of water: acetonitrile (9: 1) and chromatographed on a Lichroprep RP-8 column (310-25 mm). Elution was performed with a mixture of water: acetonitrile (8: 2) adjusted to pH 3 with trifluoroacetic acid. The collected fractions were analyzed by TLC and those containing a single spot were pooled and concentrated in vacuo and lyophilized.
75 mg of red lyophilized product is obtained, the properties of which are shown in Tables 4 and 5.
After addition of 0.1N aqueous acetic acid (0.2 ml), an aliquot (6 mg) dissolved in dioxane (0.5 ml) was heated to 85 ° C. for 1 hour. The reaction mixture diluted with water was extracted with chloroform at pH 8.2 and the organic phase was dried over sodium sulfate, concentrated to a small volume and titrated to make up for 1 equivalent of methanolic HCl. A precipitate formed and was collected, dried (3 mg) and analyzed by TLC and identified as daunomycin (IV) compared to the pure sample. The remaining aqueous phase contained the amino sugar vancosamine (VII), identified by direct TLC comparison with a genuine sample.
Another aliquot (6 mg) was dissolved in 0.2N HCl (2 ml) and heated to 100 ° C. for 1 hour. The red precipitate was collected by filtration, washed with water, dried (2 mg), and analyzed by TLC and identified as daunomycinone (VIII) by direct comparison with the genuine sample.
The aqueous residue analyzed by TLC contained two amino sugars identified as daunosamine (XI) and vancosamine (VII) by direct comparison with genuine samples.
The product obtained by fermentation was identified as 4'-O-vancosaminyl daunomycin (I).
Example 4
A sample of pure 4′-O-vancosaminyl daunomycin (I) obtained according to Example 2 (8 mg) was dissolved in water (0.8 ml), adjusted to pH 9 with aqueous NaHCO ₃ solution, and NaBH ₄ (0.6 mg) was supplemented and held at ambient temperature for 5 minutes. After adding a few drops of methanol and 0.05N HCl to pH 4.5, the solution is chromatographed on RP-8 as described in Example 3 and after lyophilization the properties are listed in Table 4. A new red product is obtained.
Aliquots subjected to mild acid hydrolysis as described in Example 3 yielded 13-dihydrodaunomycin (V) and vancosamine (VII), which were identified by direct comparison with genuine samples under TLC.
From aliquots subjected to strong acid hydrolysis as described in Example 3, 13-dihydrodaunomycinone (IX), daunosamine (XI) and vancosamine (VIII) were identified by comparison with genuine samples under TLC. It was.
The new product thus obtained by chemical transformation of (I) was identified as 4'-O-vancosaminyl 13-dihydrodaunomycin (II).
Example 5
4′-O-vancosaminyl daunomycin (I) (15 mg) was dissolved in an anhydrous methanol: dioxane 1: 3 mixture and supplemented with ethyl orthoformate (0.05 ml). After 15 minutes, the solution was cooled to 5 ° C. The, Br ₂ (in 5% CHCl ₃ 0.15ml), supplement HCl (in methanol 0.02 ml 2.5M), it was held overnight 4 ° C..
Upon addition of 5 volumes of n-hexane, a red precipitate was obtained, which was dissolved in acetone (1 ml), 0.25 M HBr aqueous solution (1 ml) was added and left at 4 ° C. overnight.
This solution was brought to pH 4.3 with 1M aqueous NaCOOH solution, then kept magnetically stirred for 2 days at ambient temperature and then chromatographed on an RP-8 column as described in Example 3.
After lyophilization, a new red product was obtained (6 mg) whose properties are listed in Table 4.
Doxorubicin and vancosamine were each obtained from aliquots subjected to mild acid hydrolysis as described in Example 3, which were identified by direct TLC comparison with genuine samples.
From aliquots subjected to strong acid hydrolysis as described in Example 3, adriamycinone (X), vancosamine (VIII) and daunosamine (XI) were each identified by comparison with genuine samples in TLC.
The new product thus obtained by chemical transformation of (I) was identified as 4′-O-vancosaminyl doxorubicin (III).

Claims

Formula (I):

Compound 4′-O-vancosaminyl daunorubicin (wherein R represents a —COCH ₃ group) and pharmaceutically acceptable addition salts thereof.

Existence of a Streptomyces microorganism deposited with DSMZ under accession number 10632, nutrient liquid medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen, under aerobic conditions, comprising performing the fermentation in claim 1 Fermentation process for producing the antibiotic of formula (I) as described .

In the presence of Streptomyces microorganisms deposited at DSMZ as accession number 10632 in a nutrient liquid medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen at temperatures between 25 ° C. and 37 ° C. under aerobic conditions. A fermentation process for producing an antibiotic of formula (I) according to claim 1, comprising carrying out fermentation for a period of 7 days.

The process according to claim 2 or 3, wherein the fermentation is carried out in the presence of a mineral salt.

A fermentation process for producing a compound of formula (I) according to claim 2 or 3 comprising purification of the antibiotic and / or production of a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A therapeutic composition comprising a compound according to claim 1 together with a pharmaceutically acceptable carrier.