JP3959186B2 - ヘリコバクター・パイロリの型分類方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ヘリコバクター・パイロリは胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の原因菌として知られ、さらに最近、ヘリコバクター・パイロリが胃癌の発生にも深く関わっていることがわかってきた。
【0003】
ヘリコバクター・パイロリの遺伝子型は複数存在することが知られており、従来より、PCRによりヘリコバクター・パイロリの遺伝子断片を増幅し、その増幅断片を制限酵素で消化してその切断パターンを調べる方法(PCR-RFLP)により、ヘリコバクター・パイロリの型分類が行なわれている。
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、従来のPCR-RFLPによる型分類方法は、疾患との関連性がなく、臨床上は意味のないものであった。
【0005】
従って、本発明の目的は、胃癌や、萎縮性胃炎を引き起こすか否かを予測することに役立つ、ヘリコバクター・パイロリの新規な型分類方法を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子中の特定の領域を含む核酸断片を増幅し、Alu I で消化してその切断パターンにより型分類を行なうと、特定の型のものしか胃癌や萎縮性胃炎にならないことを見出し本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の1007ntと1008ntの間を第1切断部位、1189ntと1190ntの間を第2切断部位、1228ntと1229ntの間を第3切断部位及び1326ntと1327ntの間を第4切断部位とした場合、これら4箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅し、制限酵素Alu Iで消化し、その切断パターンに基づき、第2及び第4切断部位で切断されるA1型、第2、第3及び第4切断部位で切断されるA2型、第1、第2及び第4切断部位で切断されるA3型並びに第1、第2、第3及び第4切断部位で切断されるA4型に分類することから成る、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法であって、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号1に示す塩基配列の第1番目のヌクレオチドを基準として表したものである、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法を提供する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、先ず、上記4箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅する。なお、切断断片の検出を容易にするため、核酸断片中の第1切断部位の上流及び第4切断部位の下流がそれぞれ50bp以上であることが好ましい。すなわち、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の958nt〜1376ntの領域を含む核酸断片を増幅することが好ましい。vacA遺伝子の塩基配列は公知であり、標準的なvacA遺伝子の塩基配列を図1(ただし、1nt〜2500nt)及び配列表の配列番号1に示す。なお、958ntとは、図1に示すvacA遺伝子の塩基配列の5'末端から第958番目のヌクレオチドという意味であり、同様に、1376ntは、図1に示すvacA遺伝子の塩基配列の5'末端から第1376番目のヌクレオチドという意味である( 以下、同様に表記する) 。568ntと569ntの間にAlu I 切断部位が存在するので、核酸断片の5'末端は568ntよりも下流にあることが好ましく、また、1443ntと1444ntの間にもAlu I 切断部位が存在するので、核酸断片の3'末端は1444ntよりも上流にあることが好ましい。なお、核酸断片の5'末端が569ntより上流であっても、5'末端から568ntまでの断片が判定に影響のないサイズのものであるならば、核酸断片の5'末端が569ntよりも上流であっても構わない。同様に、核酸断片の3'末端が1443ntより下流であっても、1444ntから3'末端までの断片が判定に影響のないサイズのものであるならば、核酸断片の3'末端が1443ntよりも下流であっても構わない。なお、切断パターンを明瞭に区別するために、増幅する核酸断片は、その5'末端から1007ntまでの距離(5'末端が569ntよりも上流にある場合には569ntから1007ntまでの距離、すなわち439bp)と1327ntから3'末端までの距離(3'末端が1443ntよりも下流にある場合には1327ntから1443ntまでの距離、すなわち、117bp)が好ましくは10bp以上、さらに好ましくは30bp以上異なる。同様の理由により、他の各核酸断片のサイズもそれ自身以外の核酸断片と10bp以上異なることが好ましいが、例えば下記実施例に示す場合のように、2つの核酸断片の大きさにほとんど差のない場合(下記実施例では98bpと101bpの核酸断片が現れる)であっても、型分類に支障を生じない場合には問題はない。
【0009】
核酸断片を増幅する方法はこの分野において周知であり、代表的な方法としてPCRを挙げることができる。PCRを行なうための試薬及び装置は市販されているので、それらを用いて容易に核酸を増幅することができる。なお、プライマーは、上記の条件を満たす核酸断片を増幅するように設定される。上記のようにヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の塩基配列は公知であるので、核酸増幅に用いるプライマーは容易に設定することができる。
【0010】
本発明の方法では、上記した4箇所の切断部位における切断の有無により、ヘリコバクター・パイロリを4つの型に分類する。すなわち、下記表1に示すように分類する。
【0011】
【表1】
【0012】
下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法により型分類すると、各型と、それが検出される臨床症状とは下記表2に示す関係を有する。
【0013】
【表2】
【0014】
表2に示されるように、本発明の方法により分類された型と、臨床症状との間には関連があるので、本発明の方法によって型を決定することにより、上記疾病の診断を行なうことができ、また、将来的に胃癌及び前癌状態と言われる萎縮性胃炎のような重大な疾患に発展する可能性を予測することができる。
【0015】
Alu I 消化により、上記の各切断部位で切断されるか否かは、増幅した核酸断片をAlu I で消化し、それによって生じる切断断片のサイズを例えば電気泳動等により測定することにより容易に決定することができる。なお、各切断部位における切断の有無を調べることができる方法であれば、どのような方法でも採用することができ、電気泳動に限定されないことは言うまでもない。
【0016】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0017】
消化器疾患を有する患者55名の胃液からヘリコバクター・パイロリを分離し、常法により培養した。ヘリコバクター・パイロリ培養陽性の培地から市販の核酸抽出試薬であるSepaGene( 三光純薬) を用いてDNA抽出を行なった。抽出DNAを50μlの緩衝液に溶解し、10μlをPCR反応系に用いた。PCR反応は、市販のPCRキット及びサーマルサイクラー( 商品名) を用いて、94℃1分間、50℃1分間、72℃1分間のサイクルを35回繰り返した。なお、プライマーセットはフォワード側がVA1-F (5' atggaaatacaacaaacaca 3', 797-816 nt)、リバース側がVA1-RR (5' ctccagaacccacacgatt 3', 1427-1409 nt)(Cover TL et al., JBC 269(14), 10566-10573 (1994))であった。なお、これらのプライマーがハイブリダイズする領域が図1中に四角で囲まれている。また、増幅領域中のAlu I 部位が図1中に黒塗りの下向き三角形により示されている。増幅産物10μlを常法に従いアガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射下で631bpのバンドを確認した。更に、増幅産物10μlに反応用緩衝液10μl及び制限酵素Alu I 10単位を加え、37℃、60分インキュベートを行なった。消化産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下でバンドを検出、検出バンドをパターンにより分類した。
【0018】
なお、本実施例では、増幅断片が797ntから1427ntまでの631bpの領域であるので、各型における切断断片サイズは下記表3に示す通りであり、また、その電気泳動パターンは図2に示すようになる。
【0019】
【表3】
【0020】
上記方法により、消化器疾患を有する患者55名からのヘリコバクター・パイロリを分類したところ、遺伝子型と疾患との関係は下記表4に示す通りであった。
【0021】
【表4】
【0022】
表4に示されるように、胃癌及び前癌状態といわれる萎縮性胃炎の症例はA2及びA4のみに分類された。
【0023】
【発明の効果】
本発明により、臨床症状と関連したヘリコバクター・パイロリの型分類方法が初めて提供された。本発明の方法により型分類を行なうと、将来的に胃癌及び萎縮性胃炎のような重大な疾患に発展する可能性を予測することができる。
【0024】
【配列表】
【0026】
【0027】
【図面の簡単な説明】
【図1】ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の標準的な塩基配列並びに本発明における第1〜第4切断部位の位置及び本発明の実施例で用いたPCR用プライマーの位置を示す図である。
【図2】本発明の実施例において得られたAlu I 切断電気泳動パターンの模式図である。
Claims (2)
- ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の1007ntと1008ntの間を第1切断部位、1189ntと1190ntの間を第2切断部位、1228ntと1229ntの間を第3切断部位及び1326ntと1327ntの間を第4切断部位とした場合、これら4箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅し、制限酵素Alu Iで消化し、その切断パターンに基づき、第2及び第4切断部位で切断されるA1型、第2、第3及び第4切断部位で切断されるA2型、第1、第2及び第4切断部位で切断されるA3型並びに第1、第2、第3及び第4切断部位で切断されるA4型に分類することから成る、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法であって、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号1に示す塩基配列の第1番目のヌクレオチドを基準として表したものである、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法。
- ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の958nt〜1376ntの領域を含み、その5'末端が568ntよりも下流でその3'末端が1444ntよりも上流にある核酸断片であって、その5'末端から1007ntまでの距離と1327ntから3'末端までの距離が10bp以上異なる核酸断片を増幅し、増幅断片を制限酵素Alu Iで消化し、電気泳動によりその切断パターンを調べることから成り、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号1に示す塩基配列の第1番目のヌクレオチドを基準として表したものである、請求項1記載の方法。
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- 1998-09-09 JP JP27256298A patent/JP3959186B2/ja not_active Expired - Lifetime
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