JP3949111B2 - Novel G protein-coupled receptor and gene thereof - Google Patents

Description

５−オキソ−ＥＴＥは、アラキドン酸から５−ＨＥＴＥを経由して合成され、強力な抗酸球、好中球の走化因子であることが知られている（Ｓｃｈｗｅｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１５０２９−１５０３６頁、１９９５年、Ｇｕｉｌｂｅｒｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１巻、第９７−１０４頁、１９９９年）。また、５−オキソ−ＥＴＥは、動物レベルでも好酸球の遊走を誘導することが知られている（Ｓｔａｍａｔｉｏｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１０２巻、第２１６５−２１７２頁、１９９８年）。さ（Ｓｔａｍａｔｉｏｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１０２巻、第２１６５−２１７２頁、１９９８年）。さらに、この作用は、未同定のＧタンパク質共役型受容体を介した作用であることが推定されている（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６４巻、第３３４５−３３５２頁、２０００年）。
したがって、本発明の新規Ｇタンパク質共役型受容体のアンタゴニストは、抗酸球が関与する喘息などのアレルギーや炎症の治療薬として有用である可能性がある。
アラキドン酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンの生合成中間体であり、また、５−ＨＰＥＴＥは、アラキドン酸からロイコトリエンへの生合成の中間体であることが知られている。
５−ｏｘｏＥＴＥや５−ＨＥＴＥは、前立腺ガンや乳がん細胞、肺癌、膵臓癌、中皮腫の成長因子であるとともに、維持因子でもあり、その合成を阻害するとアポトーシスを引き起こすことが知られている（Ｇｈｏｓｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２３５巻、第４１８−４２３頁、１９９７年、Ｇｈｏｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻、第１３１８２−１３１８７頁、１９９８年、Ａｖｉｓら、ＦＡＳＥＢＪ．、第１５巻、第２００７−２００９頁、２００１年、Ａｖｉｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第９７巻、第８０６−８１３頁、１９９６年、Ｄｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２６１巻、第２１８−２２３頁、１９９９年、Ｒｏｍａｎｏら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、第１５巻、第２３２６−２３３６頁、２００１年）。
したがって、本発明の新規Ｇタンパク質共役型受容体のアンタゴニストは、上記のガンに対する抗ガン剤となる可能性がある。
また、本発明の受容体タンパク質は、リガンド（アゴニスト）により刺激を受けると、Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質を活性化する。αサブユニットに着目すると、本発明の受容体タンパク質は、リガンド（アゴニスト）による刺激を受けるとＧ_ｉα（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質のαサブユニット、例えばＧ_ｉα１）を活性化型（ＧＴＰ結合能を有する状態）に変換する。そして、かかるＧタンパク質の活性化を介して細胞内でシグナルを伝えることができる。
上記の通り、本発明の受容体タンパク質（ポリペプチド）は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の機能を有するものである。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達（Ｃａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、Ｋ^＋の濃度変化など）の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧタンパク質（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質のαサブユニット）の活性化。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）としては、例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、及び５，８，１１−エイコサトリイン酸等のエイコサノイドが挙げられ、これらのうち、５−オキソ−ＥＴＥがとりわけ好適な例として挙げられる。
本発明において「リガンド」とは、受容体タンパク質に特異的に結合することができる化合物を意味する。リガンドには、天然の化合物および人工的に合成された化合物の両方が含まれる。
本発明において「アゴニスト」とは、受容体タンパク質と特異的に結合することなどにより該受容体タンパク質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物を意味する。また、本発明において「アンタゴニスト」とは、受容体タンパク質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物の作用に対して、これを抑制する能力を有する化合物を意味する。
本発明のタンパク質またはポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、エイコサノイド受容体としての機能（生物学的活性；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が失われない程度であればよく、通常１〜約８０個、好ましくは１〜約６０個、より好ましくは１〜約４５個、さらに好ましくは１〜約３０個、さらに一層好ましくは１〜約１５個である。
すなわち、本発明のタンパク質またはポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して１もしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を有するポリペプチドが挙げられる。
このようなタンパク質またはポリペプチドには、自然界で発見される変異型タンパク質またはポリペプチドのほか、人為的に改変した変異タンパク質またはポリペプチド、異種生物由来のタンパク質またはポリペプチド等が含まれる。
すなわち、このようなタンパク質またはポリペプチドには、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの保存的置換変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ）および自然発生対立変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）が含まれる。
このようなタンパク質またはポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、通常約７５％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９５％以上のアミノ酸レベルのホモロジーを有する。
本発明の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）としては、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸を含むものが挙げられる。また、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下（より好ましくはハイストリンジェントな条件下）でハイブリダイズし得る核酸またはその相補物（すなわち相補的配列を有する核酸）を含むものが挙げられる。このようなハイブリダイズし得る核酸は、エイコサノイド受容体としての機能（生物学的活性）を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするものであればよい。
このような核酸は、配列番号１で示される塩基配列と、通常約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上のホモロジーを有する。このような遺伝子又は核酸としては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子（オルソローグ）等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、通常、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中において、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションさせ、必要に応じ、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄し、そして１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄することをいう。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）とは、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことをいう。
配列のホモロジーは、例えば、ブラスト法（Ｂｌａｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５号、４０３−４１０頁、１９９０年）など慣用の方法を用いて解析できる。
本発明の核酸は、哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源としてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上では、ヒト由来のものを用いることが望ましい。
本発明の核酸は、本明細書中に開示された配列情報（後記配列表の配列番号１）を利用して取得することができる。例えば、開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法を適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得することができる。
例えば、哺乳動物の細胞や組織から調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして全長ｃＤＮＡを取得することができる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム遺伝子を単離することもできる。また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異種生物由来の相同遺伝子（オルソローグ）を単離することもできる。
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物のタンパク質をコードする翻訳領域を決定することができ、このタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、通常の遺伝子組換え技術により過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させることによって生産することができる。また、他のタンパク質やペプチドとの融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の形で発現させ生産することもできる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた細胞は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
この発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系などが挙げられる。このうち、機能がよく保存されたタンパク質を得るためには、昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９、ＳＦ２１等）および哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。
本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、哺乳動物細胞系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等、昆虫細胞系の場合、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。
この発現系に用いるベクターとしては、哺乳動物細胞系の場合には、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、昆虫細胞系の場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるもの）を用いることができるが、これに限定されない。目的とするタンパク質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、突然変異導入を、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したＰＣＲ法や部位特異的突然変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６頁、１９８４年）等によって行うことができる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドを、発現ベクターを導入した細胞の培養物などから、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法など）を適宜組合せることによって、分離精製することができる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させることにより、細胞における該タンパク質またはポリペプチドの機能又は活性を高める（増強させる）ことができる。
本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）またはその相補物を、本発明の遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができる。また、この核酸またはその相補物を、遺伝子の発現を変調（例えば抑制）させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドや、リボザイム、デコイとして使用することもできる。このような核酸としては、例えば、配列番号１示される塩基配列からなる核酸（センス鎖またはアンチセンス鎖）の、原則として連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を有するヌクレオチドを用いることができる。
本発明のタンパク質もしくはポリペプチド、またはこれと免疫学的同等性を有するタンパク質もしくはペプチド（タンパク質の断片または部分配列を有する合成ペプチド等）を抗原として用いて、本発明のタンパク質もしくはポリペプチドを認識する抗体を取得することができる。免役学的同等性を有するとは、例えば本発明のタンパク質もしくはポリペプチドに対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により調製することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により調製することができる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を調製することができる。
上記で得られた抗体を用いて、通常の免疫化学的方法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙ法など）により、本発明のタンパク質もしくはポリペプチドの細胞中又は組織中などにおける発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより本発明のタンパク質もしくはポリペプチドを精製することができる。また、中和抗体を用いて、本発明のタンパク質またはポリペプチドの機能または活性を変調させる（例えば抑制させる）ことができる。
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドは、エイコサノイド受容体としての機能または活性（生物学的活性）を有する。かかる機能または活性としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧタンパク質〔より詳細には、Ｇ_ｉα（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質のαサブユニット、例えばＧ_ｉα１など）〕の活性化。
ここでリガンド（アゴニストとして作用するリガンド）としては、エイコサノイド（例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、および５，８，１１−エイコサトリイン酸など）が挙げられる。
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドのかかる機能または活性を、例えば、以下のようにして検出することができる。
前記（ｉ）の機能または活性の検出方法
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチド（これを含む膜画分の形態、あるいは、これを細胞表面上に発現している細胞の形態のもの等）を、リガンド〔エイコサノイド、例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、および５，８，１１−エイコサトリイン酸〕と接触せしめ、両者の特異的結合を検出する。かかる結合の検出には、例えば、標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付したリガンドを用いることができる。標識を付したリガンドとともに、非標識リガンドを混合して用いる通常の競合アッセイにより特異的結合を検出することができる。
前記（ｉｉ）の機能または活性の検出方法
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドを細胞表面に発現している細胞を、リガンド〔エイコサノイド（例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、および５，８，１１−エイコサトリイン酸等のアゴニストとして作用するもの）と接触せしめ、誘導される細胞内シグナル伝達（例えば、Ｃａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、Ｋ^＋の濃度変化など）を検出する。本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドを、より低いレベルで発現している（または発現していない）細胞を対照として用い、このような対照細胞における細胞内シグナル伝達のレベルと比較して、それよりも細胞内シグナル伝達のレベルが高ければ、その程度に応じ（ｉｉ）の機能または活性を有すると認められる。
細胞内シグナル伝達の検出の具体的な方法については、例えば、文献〔Ｃｈｅｎらの方法、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２６巻、第３４９−３５４頁、１９９５年（Ｃａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化）； Ｇｒａｍｉｎｓｋｉらの方法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、第５９５７−５９６４頁、１９９３年（ホスホリパーゼＣの活性化）； Ｓａｋｕｒａｉらの方法、Ｃｅｌｌ、第９２巻、第５７３−５８５頁、１９９８年（Ｃａ^２＋の濃度変化）； Ｈｏｌｌｏｐｅｔｅｒらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第４０９巻、第２０２−２０７頁、２００１年（Ｋ^＋の濃度変化）； Ｔａｔｅｍｏｔｏらの方法、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２５１巻、第４７１−４７６頁、１９９８年（ｐＨの変化）； Ｈｉｎｕｍａらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第３９３巻、第２７２−２７３頁、１９９８年（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）；特開平９−２６８号公報など〕に記載された方法に準じて行うことができる。
前記（ｉｉｉ）の機能または活性の検出方法
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドとＧ_ｉα（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質のαサブユニット、例えばＧ_ｉα１）との融合タンパク質を細胞膜上に発現させた細胞から、膜画分を調製する。この膜画分を、リガンド〔エイコサノイド（例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、および５，８，１１−エイコサトリイン酸等のアゴニストとして作用するもの〕の存在下および非存在下で、標識したＧＴＰまたはそのアナログ〔例えば、ＧＴＰγＳ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））など分解されにくいＧＴＰアナログ〕と接触せしめる。その後、標識したＧＴＰまたはそのアナログの膜画分への結合を検出する。リガンドの非存在下での結合レベルと比較して、リガンドの存在下での結合レベルの方がより高ければ、その程度に応じ前記（ｉｉｉ）の機能または活性があるものと認められる。
ここで、Ｇ_ｉα（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧタンパク質のαサブユニット、例えばＧ_ｉα１）及びその遺伝子については、既にアミノ酸配列および塩基配列が知られている〔ヒトＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）／Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年：ヒトＧ_ｉα１／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦＯ５５０１３、ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＰＯ４８９８：等〕。
従って、Ｇ_ｉαをコードするＤＮＡを、開示された既知配列情報を利用して、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはこれらを適宜組合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得することができる。Ｇ_ｉαをコードするＤＮＡを、本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡの下流に結合し、それを適当なプロモータを含むベクターに組込んで、融合タンパク質を発現させるためのベクターを得ることができる。そして、その融合タンパク質の発現ベクターを、細胞に導入して、融合タンパク質を発現させることができる。
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドを、これに対するリガンドまたは作用薬（アゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニング又は同定のために使用することができる。
本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドに対するリガンドまたは作用薬（アゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニングまたは同定方法は、本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチド（これを含む膜画分の形態、あるいは、これを細胞表面上に発現している細胞の形態のもの等）を試験化合物と接触せしめる工程；及び該試験化合物の存在下における（１）該受容体タンパク質もしくはポリペプチドと試験化合物との特異的結合、（２）細胞内シグナル伝達、または（３）Ｇタンパク質（Ｇ_ｉα）の活性化を検出する工程を含む方法を用いて実施することができる。
より詳細には、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングまたは同定方法は、各々、以下のように実施することができる。
（Ａ）リガンドのスクリーニングまたは同定方法
（１）本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチド（これを含む膜画分の形態、あるいは、これを細胞表面上に発現している細胞の形態のもの等）を試験化合物と接触せしめ、（２）本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドと試験化合物との特異的結合を検出し、（３）試験化合物が該受容体タンパク質もしくはポリペプチドと結合する能力を有するか否か、または該能力の強さを決定することにより実施できる。
かかる特異的結合の検出は、例えば、標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付した既知リガンドを、非標識の試験化合物とともに混合して用いる通常の競合アッセイ法などにより実施することができる。
特異的結合能を有する試験化合物（リガンド）は、作用薬（アゴニストまたはアンタゴニスト）である可能性が高い。
（Ｂ）アゴニストのスクリーニングまたは同定方法
（１）本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチド（これを含む膜画分の形態、あるいは、これを細胞表面上に発現している細胞の形態等）を試験化合物と接触せしめ、（２）該試験化合物の存在下において、細胞内シグナル伝達またはＧタンパク質（Ｇ_ｉα）の活性化を検出し、（３）該試験化合物が、該受容体タンパク質もしくはポリペプチドの刺激に基づいて、細胞内シグナル伝達またはＧタンパク質の活性化を誘導する能力の有するか否か、または該能力の強さを決定することにより実施できる。
細胞内シグナル伝達（例えば、Ｃａ^２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、Ｋ^＋の濃度変化など）の検出、あるいは、Ｇタンパク質（Ｇ_ｉα）の活性化を、前記と同様の方法を用いて検出することができる。
（Ｃ）アンタゴニストのスクリーニングまたは同定方法
（１）本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチド（これを含む膜画分の形態、あるいは、これを細胞表面上に発現している細胞の形態等）を試験化合物およびリガンド（好ましくは、アゴニストとして作用するリガンド）と接触せしめ、（２）本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドの機能または活性を検出し、（３）該試験化合物が、本発明の受容体タンパク質もしくはポリペプチドの機能もしくは活性を抑制する能力を有するか否か、または該能力の強さを決定することにより実施できる。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）としては、例えば、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、及び５，８，１１−エイコサトリイン酸等のエイコサノイドが挙げられ、これらのうち、５−オキソ−ＥＴＥがとりわけ好適な例として挙げられる。
また、本発明のタンパク質もしくはポリペプチドの機能または活性としては、前記（ｉ）（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）、すなわち
（ｉ）リガンドとの特異的結合、
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達又は
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧタンパク質の活性化が挙げられる。
これら機能または活性の検出は、例えば、リガンド（好ましくは、アゴニストとして作用するリガンド）とともに試験化合物を添加もしくは非添加するほかは、前記と同様の方法を適用することにより実施できる。
試験化合物の能力を決定するにあたっては、適切な対照をとることが望ましい。このような対照としては、試験化合物の非存在下での検出・試験、本発明の受容体タンパク質を発現していないか、あるいは同受容体タンパク質の発現レベルがより少ない細胞を用いた検出・試験があげられる。さらに正確な決定のためにこれらの対照を複数組合せてもよい。
前記方法などにより、アンタゴニストとして選別又は同定された化合物は、これを本発明のポリペプチドを発現している細胞と接触せしめることにより、該細胞における該ポリペプチド（エイコサノイド受容体）の機能又は活性を抑制することができる。
また、本発明のポリペプチド（エイコサノイド受容体）に対するアンタゴニストは、医薬の有効成分として使用できることが期待される。従って、前記方法などにより、本発明のポリペプチド（エイコサノイド受容体）に対するアンタゴニストとして選別又は同定された化合物は、医薬の製造のために使用できる。医薬の製造においては、慣用の担体とともに混合して医薬組成物を製造することができ、かかる組成物を医薬として販売することができる。
医薬として用いる際、投与方法は特に限定されず、一般的な経口もしくは非経口的な方法（経口、静脈内、筋肉内、皮下など）を適用すればよい。また、必要に応じては、投与方法に応じた不活性な担体と共に、慣用の医薬製剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等）として製剤化して用いればよい。例えば、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、滑沢剤などの賦活剤あるいは希釈剤とともに化合物を用い、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、一般的な投与量、例えば１日当たり、経口投与の場合は、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合には、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。
リガンドまたは作用薬のスクリーニング又は同定のために使用する受容体タンパク質もしくはポリペプチドは、受容体タンパク質もしくはポリペプチドを含む膜画分の形態、あるいは、受容体タンパク質もしくはポリペプチドを細胞表面上に発現している細胞の形態等で用いることができる。
受容体タンパク質もしくはポリペプチドを細胞表面上に発現している細胞としては、該受容体タンパク質もしくはポリペプチドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた細胞などを用いることができ、例えば、該受容体タンパク質もしくはポリペプチドコードする核酸を含む組換えベクターを導入した細胞などを用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、外来受容体タンパク質を、その機能を損なうことなく細胞膜上に発現し得る細胞（哺乳類の細胞、昆虫細胞など）を使用できる。また、宿主細胞としては、組換えベクターを導入する前の細胞それ自体は、対象の受容体タンパク質またはポリペプチドを発現していないか、低いレベルでのみ発現している細胞を用いることが望ましい。
該受容体タンパク質もしくはポリペプチドを含む膜画分は、受容体タンパク質もしくはポリペプチドを発現している細胞を破砕した後、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力を利用した分画法を用いて、調製できる。例えば、細胞破砕液を、低速（約５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清について、さらに高速（約１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常約３０〜１２０分程度遠心し、得られた沈殿画分を、膜画分として用いる。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
実施例
実施例１ ヒトＴＧ１０１９の単離
（１）ペプチドをリガンドとするＧタンパク質共役型受容体６２個のアミノ酸配列をアライメントし、これらＧタンパク質共役型受容体間でよく保存されているアミノ酸配列（配列番号３）を求めた。この配列（配列番号３）をクエリー配列として、ホモロジー検索法としてｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、第４０３−４１０頁、１９９０年）を用いてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＨｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓデータベースを検索した。その結果、クローンＡＣ０１３３９６．３中にホモロジーの高い配列（配列番号４）が見出された。ＡＣ０１３３９６．３の配列を用い、この配列（配列番号４）を含むオープンリーディングフレーム（配列番号５）を推測した。このオープンリーディングフレームにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列についてＨＭＭＴＯＰ（膜タンパク質判別および膜貫通ヘリックス予測システム）（Ｔｕｓｎａｄｙ ＧＥら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２８３巻、第４８９−５０６頁、１９９８年）を用いた膜貫通領域の予測および、既知Ｇタンパク質共役型受容体とのホモロジー解析などを行った。その結果、配列番号５に示される塩基配列は、新規Ｇタンパク質共役型受容体の全長をコードするものであることが推測された。
（２）上記（１）のＡＣ０１３３９６．３の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、配列番号５を含むＤＮＡをＰＣＲによって取得した。
ヒトｃＤＮＡライブラリ（商品名「Ｈｕｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ」；クロンテック社製）を用い、１回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマーとしては、配列番号６に示す塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド（ＡＣ０１３３９６．３の第９７７３５〜９７７６０番目の塩基を含む領域に対応するプライマー）を用い、アンチセンスプライマーとしては、配列番号７に示す塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド（ＡＣ０１３３９６．３の第９６２９９〜９６３２４番目の塩基を含む領域に対応するプライマー）を用いた。これらプライマー及び鋳型ｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応液（２５μｌ）〔組成： 鋳型ｃＤＮＡ（商品名「Ｈｕｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ」、クロンテック社製）１μｌ、滅菌水１８．５μｌ、ＰＣＲ用緩衝液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、クロンテック社製）２．５μｌ、デオキシヌクレオチド溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、各１０ｍＭ）０．５μｌ、ポリメラーゼ溶液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｌｅｒａｓｅ Ｍｉｘ、クロンテック社製）０．５μｌ、センスプライマー（１０μＭ）１．０μｌ、アンチセンスプライマー（１０μＭ）１．０μｌ〕を調製し、ＰＣＲ〔条件：９４℃、３０秒、（９４℃ ３０秒→６４℃ ３０秒→７２℃ ２．５分）×３０回、７２℃ ２．５分〕を実施した。ついで、前記で得られたＰＣＲ反応液１μｌを鋳型として用い、２回目のＰＣＲを行った。その際、ＰＣＲの反応液組成および反応条件は前記同様とした。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドを切り出して、配列番号５を含むｃＤＮＡ断片（約１５００ｂｐ）を精製取得した。これを、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを用いて、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、配列番号１に示した塩基配列（１４６２ｂｐ）を得た。
配列番号１の中には、１つのオープンリーディングフレームが同定された。これにコードされるタンパク質（ＴＧ１０１９タンパク質と称する）のアミノ酸配列（４２３アミノ酸残基）は配列番号２に示した通りであった。配列番号２について、ＨＭＭＴＯＰによる膜貫通領域の予測および、既知Ｇタンパク質共役型受容体とのホモロジー解析を行った。その結果、ＴＧ１０１９タンパク質は、新規なＧ蛋白共役型受容体であると推定され、前記で得られたｃＤＮＡ（１４６２ｂｐ）は、ＴＧ１０１９タンパク質の遺伝子（ＴＧ１０１９遺伝子と称する）の翻訳領域全長を含むｃＤＮＡであると考えられた。図１には、それら塩基配列及びアミノ酸配列とともに、膜貫通領域（下線部）を示した。
配列番号１のＤＮＡ塩基配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されたヒトゲノムＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣＯ１３３９６（ｖｅｒ３））と比較したところ、４塩基の相違が認められた。相違する塩基は、配列番号１における第４８７番目（Ｇ⇔Ａ）、７７１番目（Ｇ⇔Ａ）、１０２２番目（Ｃ⇔Ａ）及び１０３８番目（Ｇ⇔Ａ）の塩基であった。
これら塩基の相違に伴ない、当該ＤＮＡにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列にも３アミノ酸残基の相違が生じ、相違する残基は、配列番号２における第１５０番目（Ｇｌｙ⇔Ａｓｐ）、２４５番目（Ｇｌｕ⇔Ｌｙｓ）及び３３４番目（Ａｌａ⇔Ｔｈｒ）〕の残基であった。
そこで、ヒトｃＤＮＡライブラリー（商品名：Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ，ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｓｐｌｅｅｎ； Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を鋳型としてＰＣＲ（独立に２回）を行なって、前記の相違が見られた塩基を含むＡｐａＩ断片を取得して、複数クローンについて塩基配列を解析した。
その結果、配列番号１における１０２２番目の塩基の相違（Ｃ⇔Ａ）は、遺伝子多型（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）によるものと考えられ、自然発生対立変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）に由来すると考えられた。この塩基配列の相違によって、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列上の相違は生じない。
一方、配列番号１における第４８７番目（Ｇ⇔Ａ）、７７１番目（Ｇ⇔Ａ）及び１０３８番目（Ｇ⇔Ａ）の塩基における相違は、ＰＣＲエラーによるものと考えられ、これらについては、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣＯ１３３９６（ｖｅｒ３）の配列が正しいと考えられた。
すなわち、これらのＰＣＲエラー等を修正した塩基配列は、配列番号１における第４８７番目、７７１番目、１０２２番目及び１０３８番目の塩基が「Ａ」（アデニン）であると考えられ、修正後の塩基配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２における第１５０番目、２４５番目及び３３４番目のアミノ酸残基が各々Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒであると考えられた。
ＰＣＲエラー修正後の塩基配列を後記配列表の配列番号２０に、それにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２１に各々示した。
実施例２ ＴＧ１０１９遺伝子の発現分布
ヒトの各種組織や細胞におけるＴＧ１０１９遺伝子発現分布を、ドットブロット解析により調べた。ドットブロットは、ヒト組織由来およびヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ（ナイロンメンブレンにドットされたもの）（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ、クロンテック社製）およびＲＩ標識プローブを用いて行った。メンブレンには、図２に示した各種ヒト組織由来およびヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ〔ポリ（Ａ）ＲＮＡ〕がドット（吸着固定）されている。
ＲＩ標識プローブは、以下のように調製したものを用いた。すなわち、前記実施例１の（２）項で得たｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動により約１５００ｂｐのＤＮＡ断片（ＴＧ１０１９遺伝子の翻訳領域全長を含むｃＤＮＡ断片）を精製・取得した。このｃＤＮＡ断片を鋳型とし、ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ヌクレオチド混液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むラベリング用キット（Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）と［α^−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベリングを行った後、ゲルろ過で精製し、ＲＩ標識プローブを調製した。
ドットブロットのハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。
ｍＲＮＡの固定されたメンブレンを、溶液Ｉ〔Ｓａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ ＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６０μｌを９７℃で５分間処理後、氷中で冷却し、これに６０℃のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）１５ｍｌを加えて調製したもの〕中で、６８℃、３０分間プレインキュベートした。
ついで、このメンブレンを、標識プローブ含有ハイブリダイゼーション溶液〔前記ＲＩ標識プローブ２０μｌ、ヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡ（１μｇ／μｌ：Ｒｏｃｈｅ社製）３０μｌ、サケ精巣ＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６μｌ、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）５０μｌ、及びヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ（プロメガ社製）８４μｌを加えて、２００μｌの溶液を調製し、これを９７℃で５分間処理後、６８℃で３０分間インキュベートし、さらに５ｍｌの前記溶液Ｉを加えて調製したもの〕中で、６５℃、１２時間ハイブリダイズさせた。ついで、メンブレンを、１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて、６５℃、２０分間、５回、プレ洗浄した後、さらに、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて５５℃、２０分間、２回洗浄した。
イメージアナライザー（Ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ２０００、フジフィルム社製）を用いてハイブリダイゼーションのシグナルを検出した結果、試験に供したほぼ全ての組織のｍＲＮＡでシグナルが見られた。シグナルが見られた組織の中では、肝臓、腎臓、末梢白血球及び脾臓で比較的強いシグナルが見られた。これらの結果から、ＴＧ１０１９遺伝子は、多くの組織で発現しており、その中でも肝臓、腎臓、末梢白血球及び脾臓での発現が比較的高いと考えられた。
実施例３ ＴＧ１０１９タンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体）のリガンド同定
ＴＧ１０１９タンパク質は、前記実施例１の通り、Ｇタンパク質共役型受容体であると推定された。そこで、ＴＧ１０１９タンパク質とＧタンパク質の融合タンパク質を含む膜画分を用い、以下のようにして、ＧＴＰγＳ（グアノシン ５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））とのリガンド依存的な結合を検出する方法〔Ｗｅｎｚｅｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５８巻、第９５４−９６６頁、２０００年； Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年〕により、リガンドの同定を行った。
（１）融合タンパク質を発現させるためのプラスミドの調製
以下、（イ）〜（ニ）のようにして、ＴＧ１０１９タンパク質とＧタンパク質〔Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇ_ｑα、又はＧ_ｓαＬ〕との融合タンパク質を発現させるためのプラスミドを調製した。また、融合タンパク質の概略図を図３に示した。ここで、Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）は、Ｇ_ｉα１タンパク質の３５１番目のシステイン残基をイソロイシン残基に変換した変異型Ｇ_ｉα１タンパク質を意味する。
（イ）ＴＧ１０１９遺伝子ｃＤＮＡの調製
前記実施例１の（２）項で得られたＴＧ１０１９遺伝子ｃＤＮＡ（翻訳領域全長を含む）を含むプラスミドを鋳型として用い、ＰＣＲを行った。
その際、センスプライマー（プライマーＴＧ１０１９−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＴＧ１０１９−２）としては、各々、配列番号８および配列番号９に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーはＴＧ１０１９遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物として、ＴＧ１０１９タンパク質の全長をコードするｃＤＮＡ（終止コドンを除く）を含み、その両端に制限酵素認識部位（Ｎ末端にＢｇｌＩＩ部位、Ｃ末端にＣｐｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるよう設計されている。
かくして、得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ＰＣＲ産物クローニング用ベクターシステム）（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＣｐｏＩで処理して、生じた約１３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
（ロ）Ｇタンパク質（Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ））との融合タンパク質発現用プラスミドの調製
ヒト脳由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ Ｂｒａｉｎ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｉα１−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｉα１−２）としては、各々、配列番号１０および配列番号１１に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、Ｇ_ｉα１タンパク質をコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦＯ５５０１３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｉα１タンパク質の全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｉα１−３）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｉα１−４）としては、各々、配列番号１２および配列番号１３に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）（Ｇ_ｉα１タンパク質の３５１番目のシステイン残基がイソロイシン残基に置換された変異型Ｇ_ｉα１タンパク質）の全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合タンパク質発現用プラスミド ｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
（ハ）Ｇタンパク質（Ｇ_ｑα）との融合タンパク質発現用プラスミドの調製
ヒト前立腺由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｑα−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｑα−２）としては、各々、配列番号１４および配列番号１５に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、Ｇ_ｑαをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｕ４３０８３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｑαの全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｑα−３）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｑα−４）としては、各々、配列番号１６および配列番号１７に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇ_ｑαの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇ_ｑαを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合タンパク質発現用プラスミド ｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−Ｇ_ｑαを得た。
（ニ）Ｇタンパク質（Ｇ_ｓαＬ）との融合タンパク質発現用プラスミドの調製
ヒト骨髄由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｓαＬ−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｓαＬ−２）としては、各々、配列番号１８および配列番号１９に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、Ｇ_ｓαＬをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＸＯ４４０８）を元に設計されたものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｓαＬの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位およびＸｂａＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｂａＩで処理し、生じた約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇ_ｓαＬを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合タンパク質発現用プラスミド ｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−ＧｓαＬを得た。
（２）融合タンパク質を含む膜画分の調製
前記（１）の（ロ）〜（ニ）で得られた３種の発現用プラスミドは、図３（概略図）で示したように、ＴＧ１０１９タンパク質のＣ末端に付加されたリンカー配列（−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−）を介して、ＴＧ１０１９タンパク質（全長）とＧタンパク質〔Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇ_ｑα又はＧ_ｓαＬ〕が連結した構造の融合タンパク質を発現するプラスミドである。
これら融合タンパク質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、ｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−Ｇ_ｑα又はｐＶＬ１３９２／ＴＧ１０１９−Ｇ_ｓαＬを、以下のようにして、昆虫細胞内で発現させ、融合タンパク質を含む膜画分を調製した。
まず、昆虫細胞 Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９）（ファーミンジェン社製）をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約６０％コンフルエントとなるように、１．５ｍｌの培地〔１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ｐＨ６．２：ライフテックオリエンタル社製）］中で２７℃で１５分間インキュベートした。
培地を取り除き、トランスフェクション用緩衝液（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ、ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えた後、予め調製しておいたＤＮＡ溶液〔融合タンパク質発現用プラスミド１μｇ、Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｌｕｓ ＤＮＡ（ファーミンジェン社製）０．１２５μｇ、滅菌水２５μｌ中で混和し、２５℃で１５分間インキュベートした後、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えたもの〕４００μｌを滴下した。
これを２７℃で４時間培養した後、培養液を除き、培地１．２ｍｌを加えて２７℃で５日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、上清をウイルス液Ｉとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約３０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液Ｉ（１００μｌ）と培地１．２ｍｌを加えて２７℃で４日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液１１として回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩ（５００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液ＩＩＩとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩＩ（１００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた細胞を冷却したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水，ｐＨ７．４）で洗浄後、冷却した溶解緩衝液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および２μｇ／ｍｌアプロチニン〕３．６ｍｌに懸濁し、テフロンホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕液を遠心分離（６００×ｇ、１０分間）し、得られた上清をさらに遠心分離（５０，０００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿物を冷却した反応緩衝液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕４５０μｌに、テフロンホモジナイザーを用いて懸濁して、融合タンパク質を発現した膜画分を得た。
（３）融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの結合試験
前記（２）で得た膜画分（４５０μｌ）を反応緩衝液（７．５４ｍｌ）に懸濁し、これにＧＤＰ（１０ｍＭ）１０μｌを加えた。この溶液１６０μｌに試験検体２０μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした後、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（５ｎＭ，５ｎＣｉ／μｌ：アマシャム ファルマシア バイオテク社製）２０μｌを加え、反応を開始した。３０℃で１時間インキュベーションした後、ガラスフィルター（ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｂ、パッカード社製）を用いてろ過することで反応を停止した。フィルターを、冷却した反応緩衝液２００μｌで３回洗浄した後、フィルター上の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ量（膜画分との結合量）を液体シンチレーション測定法によって測定した。こうして測定した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合量から、非特異的結合量（１０μＭＧＴＰγＳ存在下で測定した結合量）を差し引き、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量を求めた。
核酸、アミノ酸、ペプチド関連化合物、組織抽出物および脂質関連化合物約３７０種を試験検体として検定した。その結果（図４）、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分を用いた場合、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥおよび５，８，１１−エイコサトリイン酸を添加することによって濃度依存的に［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量が増加した。
ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分を用いた場合には、これら化合物による特異的結合量の増加は、認められなかった。一方、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分を用いた場合は、５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥにて特異的結合量が増加したが、Ｇ_ｉαにおける場合と比較するとその増加量は小さいものであった。
これらの結果から、ＴＧ１０１９タンパク質は、Ｇ_ｉα１あるいはＧ_ｑαタンパク質と共役するタイプのＧタンパク質共役型受容体であると考えられた。また、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸、５−ＨＥＴＥおよび５，８，１１−エイコサトリイン酸がそのリガンド（アゴニスト）として作用することが明らかとなった。
すなわち、ＴＧ１０１９タンパク質は、５−オキソ−ＥＴＥ、５−ＨＰＥＴＥ、アラキドン酸、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−トリエン酸、５−ＨＥＴｒＥ、エイコサ−５，８−ジエン酸、５−ＨＥＴＥ、および５，８，１１−エイコサトリイン酸をリガンド（アゴニスト）とするエイコサノイドの受容体であると考えられた。
実施例４ ＴＧ１０１９タンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体）のアンタゴニストの同定
５−オキソ−ＥＴＥ（アゴニストとして作用するリガンド）及び試験化合物の存在下、５−オキソ−ＥＴＥ刺激に基づくＴＧ１０１９タンパク質のＧタンパク質活性化作用を検出し、試験化合物の拮抗作用を調べた。
Ｇタンパク質活性化の検出は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧｉα１との融合タンパク質を含む膜画分および標識ＧＴＰγＳを用いて、前記実施例３の（３）と同様にして実施した。
すなわち、ＴＧ１０１９タンパク質とＧｉα１との融合タンパク質を含む膜画分（４５０μｌ）を反応液（７．５４ｍｌ）に懸濁し、これにＧＤＰ（１０ｍＭ）１０μｌを加えた。この溶液１６０μｌに、５−オキソ−ＥＴＥ（最終濃度０．１μＭ）及び各種濃度の試験化合物（０Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−５Ｍ）を添加して、３０℃で１０分間インキュベーションした。（５−オキソ−ＥＴＥ及び試験化合物の合計液量：２０μｌ）
これに〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ ２０μｌを加えて反応を開始し、３０℃で１時間インキュベーションした後、ガラスフィルターでろ過することにより反応を停止した。
フィルター上の〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ量（膜画分との結合量）を液体シンチレーションにより測定し、測定した〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ量から、非特異的結合量（１０μＭＧＴＰγＳ存在下で測定した時の結合量）を差引き、特異的結合量を求めた。
その結果、種々のポリ不飽和脂肪酸化合物は、５−オキソ−ＥＴＥ刺激に基づくＴＧ１０１９タンパク質のＧタンパク質活性化作用を抑制し、拮抗作用を示すことがわかった。
このように、ＴＧ１０１９タンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体）のアンタゴニストとして作用するものとして同定されたこれら化合物及びそのＩＣ５０値を下記表２に示した。

実施例５ ＴＧ１０１９タンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体）のＣＨＯ細胞中での発現と機能の確認
以下のようにして、ＴＧ１０１９タンパク質発現用ベクターをＣＨＯ細胞に一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）に導入して組換え型ＴＧ１０１９タンパク質を発現させ、この細胞を用いてＴＧ１０１９タンパク質のエイコサノイド受容体としての機能を確認した。
まず、前記実施例１（１）（イ）で得たＴＧ１０１９タンパク質全長をコードするＤＮＡを、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３．１（発現ベクター、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＮｏｔＩ認識部位にサブクローニングし、ＴＧ１０１９タンパク質の発現用ベクタープラスミド ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＧ１０１９ を得た。
ＣＨＯ細胞（１ｘ１０^６細胞）を、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で、３７℃２０時間培養した。この細胞を用い、プラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＧ１０１９、又は対照としてベクターｐｃＤＮＡ３．１）（５μｇ）およびトランスフェクション用試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加してトランスフェクションを実施し、２４時間培養した。百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）で前処理する場合は、２０時間培養後に、百日咳毒素（１００ｎｇ）を添加して引き続き４時間培養した。
培養後の細胞を回収・洗浄し、ロリプラム（２５ｍＭ）を含むＫＲＨ緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４）に懸濁して３７℃、３０分インキュベートした後、９６穴プレートに接種（５−７．５ｘ１０^４細胞／９０μｌ／ウエル）した。
ついで、フォルスコリン（１μＭ）及び５−オキソ−ＥＴＥ（最終濃度０Ｍ又は１０^−１１〜１０^−５Ｍ）を含むＫＲＨ緩衝液（９０μｌ／ウエル）を添加し、室温で１０分インキュベートした後、細胞を溶解させてｃＡＭＰ産生量を測定した。
ｃＡＭＰ産生量は、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製のｃＡＭＰエンザイム・イムノアッセイ・システムを用いて測定した。
その結果、ベクターのみ導入した細胞では、フォルスコリン刺激時のｃＡＭＰ産生は、５−オキソ−ＥＴＥの添加によって変化しなかった。一方、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＧ１０１９を導入してＴＧ１０１９タンパク質を発現させた細胞では、フォルスコリン刺激時のｃＡＭＰ産生は、５−オキソ−ＥＴＥの添加によって濃度依存的に抑制された。
また、ＴＧ１０１９タンパク質を発現させた細胞を、感受性のＧ蛋白質を不活化させる百日咳毒素で前処理した場合には、５−オキソ−ＥＴＥ添加によるｃＡＭＰ産生の抑制は見られなかった。
これらの結果から、ＴＧ１０１９タンパク質は、５−オキソ−ＥＴＥをリガンド（アゴニストとして作用するリガンド）とするエイコサノイド受容体であり、Ｇｉ（アデニレートシクラーゼ抑制性のＧ蛋白質）と共役するＧ蛋白質共役型受容体であることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明の受容体タンパク質及びその遺伝子は、細胞内情報伝達のメカニズム研究のために有用である。また、新たな疾患に対する治療薬の標的分子となり得る。
また、本発明の受容体タンパク質及びその遺伝子を利用した作用薬（アゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニング、同定および特徴付けの方法は、新しい医薬の研究開発のために有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧ１０１９のアミノ酸配列、塩基配列及び推測される７回膜貫通領域（下線部）を示した図である。
図２は、ヒトの各組織又は細胞におけるＴＧ１０１９遺伝子の発現分布（ドットブロットの結果）を示した図である。
図３は、ＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質の構造の概略を示した模式図である。
図４Ａは、５−オキソ−ＥＴＥを試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｂは、５−ＨＰＥＴＥを試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｃは、アラキドン酸を試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｄは、エイコサ−５Ｚ−８Ｚ−１１Ｚ−トリエン酸を試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｅは、５−ＨＥＴｒＥを試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｆは、エイコサ−５Ｚ，８Ｚ−ジエン酸を試験化合物として用いたときのＴＧＴ０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｇは、５−ＨＥＴＥを試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。
図４Ｈは、５，８，１１−エイコサトリイン酸（ＥＴＩ）を試験化合物として用いたときのＴＧ１０１９タンパク質と各種Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する各種試験物質の影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（コントロールの％）で表している。「 ○ Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 △ Ｇ_ｑα 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｑαとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。「 □ Ｇ_ｓαＬ 」は、ＴＧ１０１９タンパク質とＧ_ｓαＬとの融合タンパク質を含む膜画分における試験結果を示す。Technical field
The present invention relates to a novel receptor (eicosanoid receptor) protein and a gene thereof. Moreover, it is related with the screening method of the pharmaceutical candidate compound using these.
Background art
Many physiologically active substances such as neurotransmitters, hormones, and otacoids regulate the functions of living bodies through specific receptor proteins present on the cell surface. Many of these receptors are coupled to trimeric GTP-binding proteins (hereinafter referred to as G proteins) present in cells, and are known to transmit information into cells through their activation. ing. Therefore, these receptors are collectively referred to as G protein-coupled receptors. It is known that all G protein-coupled receptors have a common structure including seven transmembrane regions.
The G protein is a trimer composed of α, β, and γ subunits, and exists in an inactive form (GDP binding type) in which these subunits are associated in the ground state. An inactive type (GDP-binding type) G protein is converted into an active type (GTP-binding type) by a G protein-coupled receptor stimulated by a ligand, and an α subunit (Gα) and β / γ bound to GTP. Dissociates into subunit complex (Gβγ). Then, Gα (or Gβγ in some cases) bound to GTP controls an effector such as adenylate cyclase or phospholipase C and transmits a signal.
In addition, G proteins, particularly Gα, are diverse and are known to control effectors that vary depending on the type of Gα. In general, G protein-coupled receptors activate a specific type of G protein. And transmits specific information into the cell using the G protein.
As G protein-coupled receptors, α- and β-adrenergic receptors, muscarinic acetylcholine receptors, adenosine receptors, angiotensin receptors, endothelin receptors, gonadotropin-releasing factor receptors, H1- and H2 have been used so far. -Histamine receptors, dopamine receptors, metabotropic glutamate receptors, somatostatin receptors, etc. are known.
All of them play an important role in vivo as targets of physiologically active substances. Furthermore, the fact that many of the pharmaceuticals known to date have been ligands, agonists or antagonists that also target G protein-coupled receptors is also very significant.
For these reasons, G protein-coupled receptors are attracting attention as targets for drug development. Finding new G protein-coupled receptors, identifying their ligands, and finding ways to screen or identify their agonists and antagonists lead to the screening of new drug candidate compounds, It is desired.
Regarding the eicosanoid receptor, the following is known. The generic names of eicosanoids include prostaglandins, prostacyclins, thromboxanes, leukotrienes, and eicosatetraenoic acids such as 5-oxo-ETE and 5-HETE. To date, prostaglandin EP1, EP2, EP3, EP4, F2α receptor, prostacyclin PI2 receptor, thromboxanthin TA2 receptor, leukotriene B4 receptor have been reported as receptors having eicosanoid as a ligand. G protein coupled receptor (Narumiya et al., Physiol. Rev., 79, 1193-1226, 1999, Mohammed Akbar et al., J. Biol. Chem., 271, 18363-18367, 1996). However, a receptor having eicosatetraenoic acid or eicosatrienoic acid as a ligand such as 5-oxo-ETE found in the present invention has not been reported so far.
An object of the present invention is to provide a novel G protein-coupled receptor and its gene. More specifically, it is to provide a novel eicosanoid receptor and its gene.
It is another object of the present invention to provide a method for screening, identifying and characterizing a ligand and an agonist (agonist or antagonist) for the receptor protein. Further, other purposes than the above will be apparent from the following description.
Summary of the Invention
The present inventors isolated a full-length cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor from humans. Moreover, this receptor protein was successfully expressed in cells by genetic recombination technology. Furthermore, the ligand for this receptor was identified, and this receptor was found to be an eicosanoid receptor, and the present invention was completed.
That is, the present invention relates to a polypeptide selected from the following (A), (B) and (C), which has a function or activity as an eicosanoid receptor.
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 21.
(B) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 21.
(C) A polypeptide encoded by a nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 20, or a complement thereof.
The present invention also relates to a nucleic acid encoding the polypeptide.
The present invention also relates to a recombinant vector containing the nucleic acid and a host cell.
The present invention also relates to a method for detecting the function or activity of the polypeptide using the polypeptide. The present invention also relates to a method of using these to modulate (enhance or suppress) the function or activity of the polypeptide.
Furthermore, the present invention also relates to a screening method or identification method of a ligand or an agonist (agonist or antagonist) of the polypeptide using these.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
SEQ ID NO: 1 in the sequence listing below represents the nucleotide sequence of a human-derived cDNA (including the entire translation region) of a gene (referred to as TG1019 gene) of a receptor protein (referred to as TG1019 protein) isolated by the inventors. . SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of the receptor protein (TG1019 protein) encoded by the cDNA.
The receptor protein of the present invention is a G protein-coupled receptor protein and has a function (biological activity) as an eicosanoid receptor. Therefore, the receptor protein of the present invention specifically binds to eicosanoids. Then, the specific binding between the eicosanoid and the receptor protein of the present invention stimulates the receptor protein and induces intracellular signal transduction.
The eicosanoid which is a ligand of the receptor protein of the present invention refers to a substance derived from a fatty acid having 20 carbon atoms such as eicosanoic acid, preferably an unsaturated fatty acid at the 8-position. More specifically, 5-oxo-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid (abbreviated as 5-oxo-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetranoic acid, 5-oxo-ETE), 5-hydro Peroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z-tetraenoic acid (abbreviated as 5-hydroperoxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z-tetraenoic acid, 5-HPETE), arachidonic acid (arachidonic acid or eicosa-5Z, 11Z, 11Z) , 14Z-tetraenoic acid), eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid (eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienic acid), 5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z-trienoic acid 5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z-tetraenoic acid, abbreviated as 5-HETrE), eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid (eicosa-5Z, 8Z-dienic acid), 5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z , 14Z-tetraenoic acid (5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z-tetraenoic acid, abbreviated as 5-HETE), 5,8,11-eicosatriic acid (5,8,11-eicosatrynoic acid), etc. Say. The synthesis route diagram of the ligand is shown in Table 1 below.

5-Oxo-ETE is synthesized from arachidonic acid via 5-HETE and is known to be a potent antiacidophilic, neutrophil chemotactic factor (Schwenk et al., J. Biol. Chem. 270, 15029-15036, 1995, Guilbert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 21, 97-104, 1999). 5-oxo-ETE is also known to induce eosinophil migration at the animal level (Stamatiou et al., J. Clin. Invest., 102, 2165-2172, 1998). . (Stamatiou et al., J. Clin. Invest., 102, 2165-2172, 1998). Furthermore, this action is presumed to be an action via an unidentified G protein-coupled receptor (O'Flaherty et al., J. Immunol., 164, 3345-3352, 2000). ).
Therefore, the novel G protein-coupled receptor antagonist of the present invention may be useful as a therapeutic agent for allergies and inflammation such as asthma in which anti-acid spheres are involved.
Arachidonic acid is a biosynthetic intermediate for prostaglandins and leukotrienes, and 5-HPETE is known to be an intermediate for biosynthesis of arachidonic acid to leukotrienes.
5-oxoETE and 5-HETE are growth factors for prostate cancer, breast cancer cells, lung cancer, pancreatic cancer, and mesothelioma, as well as maintenance factors, and are known to cause apoptosis when their synthesis is inhibited ( Ghosh et al., Biochem. Biophys.Res. Commun., 235, 418-423, 1997, Ghosh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13182-13187, 1998. , Avis et al., FASEB J., 15, 2007-2009, 2001, Avis et al., J. Clin. Invest., 97, 806-813, 1996, Ding et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 218-223 In 1999, Romano et al., FASEB J., Vol. 15, pp. 2326-2336, 2001).
Therefore, the novel G protein-coupled receptor antagonist of the present invention may be an anticancer agent against the above-mentioned cancer.
In addition, when the receptor protein of the present invention is stimulated by a ligand (agonist), _i Activates G proteins belonging to the subfamily. Focusing on the α subunit, when the receptor protein of the present invention is stimulated by a ligand (agonist), G _iα (G _i Α subunit of G protein belonging to subfamily, eg G _iα1 ) Into an activated form (a state having GTP binding ability). A signal can be transmitted in the cell through activation of the G protein.
As described above, the receptor protein (polypeptide) of the present invention has the following functions (i) to (iii).
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist) (Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change, K ⁺ Induction).
(Iii) G protein based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist) (G _i Activation of α subunit of G protein belonging to subfamily.
Here, as the ligand (ligand acting as an agonist), for example, 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z- Examples include eicosanoids such as dienoic acid, 5-HETE, and 5,8,11-eicosatriic acid, among which 5-oxo-ETE is a particularly preferred example.
In the present invention, “ligand” means a compound capable of specifically binding to a receptor protein. Ligand includes both natural and artificially synthesized compounds.
In the present invention, the “agonist” means a compound having the ability to stimulate the receptor protein by specifically binding to the receptor protein and induce intracellular signal transduction. In the present invention, “antagonist” means a compound having the ability to suppress the action of a compound having the ability to stimulate receptor protein and induce intracellular signal transduction.
Examples of the protein or polypeptide of the present invention include those consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. In addition, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. The amino acid deletion, substitution or addition may be performed so long as the function as an eicosanoid receptor (biological activity) is not lost, usually 1 to about 80, preferably 1 to about 60, More preferably 1 to about 45, still more preferably 1 to about 30, and still more preferably 1 to about 15.
That is, the protein or polypeptide of the present invention includes one or more conservatives as compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Examples include polypeptides having amino acid substitutions (conservative amino acid subscriptions).
Such proteins or polypeptides include mutant proteins or polypeptides found in nature, artificially modified mutant proteins or polypeptides, proteins or polypeptides derived from heterologous organisms, and the like.
That is, such proteins or polypeptides include conservative substitution variants and naturally occurring allelic variants of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. .
Such a protein or polypeptide is usually about 75% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2. Preferably it has about 95% or more amino acid level homology.
Examples of the nucleic acid (DNA or RNA) of the present invention include those containing a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, a nucleic acid that can hybridize with a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions (more preferably under highly stringent conditions) or a complement thereof (that is, a nucleic acid having a complementary sequence) Including. Such a hybridizable nucleic acid only needs to encode a protein or polypeptide having a function (biological activity) as an eicosanoid receptor.
Such a nucleic acid is usually about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 95% with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Has the above homology. Examples of such genes or nucleic acids include mutant genes found in nature, artificially modified mutant genes, and homologous genes (orthologues) derived from different organisms.
In the present invention, hybridization under stringent conditions is usually performed by hybridization in a hybridization solution having a salt concentration of 6 × SSC or equivalent at a temperature of 50 to 60 ° C. for about 16 hours. If necessary, it is pre-washed with a solution of 6 × SSC or a salt concentration equivalent thereto, and washed in a solution of 1 × SSC or a salt concentration equivalent thereto. Further, the condition having higher stringency (high stringency condition) means that the washing is performed in a solution having a salt concentration of 0.1 × SSC or equivalent thereto.
The sequence homology can be analyzed by using a conventional method such as a blast method (Blast Method, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990).
The nucleic acid of the present invention can be isolated and obtained by screening using mammalian tissue or cells as a gene source. Mammals include humans, as well as non-human animals such as dogs, cows, horses, goats, sheep, monkeys, pigs, rabbits, rats and mice. Of these, it is desirable to use human-derived ones for use in research and development of human therapeutics.
The nucleic acid of the present invention can be obtained by utilizing the sequence information disclosed in this specification (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later). For example, primers and probes are designed based on the disclosed nucleotide sequence information, and selected from a DNA library by appropriately combining PCR (polymerase chain reaction) method, colony hybridization method, and plaque hybridization method・ Can be acquired.
For example, cDNA is synthesized from mRNA prepared from mammalian cells and tissues, and a cDNA fragment is obtained by PCR using this as a template. Using the obtained cDNA as a probe, a cDNA library can be screened by colony hybridization or plaque hybridization, and full-length cDNA can be obtained. A genomic gene can also be isolated by screening a genomic DNA library. In addition, homologous genes (orthologues) derived from heterologous organisms can be isolated by screening DNA libraries of other mammals.
DNA libraries such as cDNA libraries and genomic DNA libraries are published in, for example, “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). ). Alternatively, if there is a commercially available library, it may be used.
By determining the base sequence of the obtained cDNA, the translation region encoding the protein of the gene product can be determined, and the amino acid sequence of this protein can be obtained.
The protein or polypeptide of the present invention can be produced by overexpression using conventional gene recombination techniques. It can also be expressed and produced in the form of a fusion protein with other proteins or peptides.
A cell in which the protein or polypeptide of the present invention is overexpressed can be obtained, for example, as follows. First, a DNA encoding the protein or polypeptide of the present invention is inserted into a vector in a form linked to the downstream of an appropriate promoter to construct an expression vector. Subsequently, the obtained expression vector is introduced into a host cell.
Examples of this expression system (host-vector system) include bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems. Among these, in order to obtain a protein having a well-preserved function, insect cells (Spodoptera frugiperda SF9, SF21, etc.) and mammalian cells (monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, human HeLa cells, etc.) are used as hosts. It is preferable to use it.
As a promoter for expressing the protein or polypeptide of the present invention, SV40 promoter, LTR promoter, elongation 1α promoter or the like is used in the case of a mammalian cell system, and polyhedrin promoter or the like is used in the case of an insect cell system. it can.
As a vector used for this expression system, a retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector or the like is used in the case of a mammalian cell system, and a baculovirus vector or the like is used in the case of an insect cell system. be able to.
As DNA encoding the protein or polypeptide of the present invention, cDNA corresponding to mRNA existing in nature (for example, one consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) can be used, but is not limited thereto. A DNA corresponding to the amino acid sequence of the target protein can also be designed and used. In this case, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid are known, and the selection of codons to be used may be arbitrary. For example, considering the frequency of codon usage of the host used for expression, the expression efficiency can be improved. High arrays can be designed. DNA having the designed base sequence can be obtained by chemical synthesis of DNA, fragmentation and binding of the cDNA, partial modification of the base sequence, and the like. Artificial base sequence partial modification and mutation introduction are performed by PCR or site-specific mutagenesis (Mark specific et al., Proceedings) using a primer comprising a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification. of National Academy of Sciences, 81, 5562-5666, 1984).
The protein or polypeptide of the present invention can be purified from a culture of a cell into which an expression vector has been introduced, by known purification methods (salting out with inorganic salts, fractional precipitation with an organic solvent, ion exchange resin column chromatography, affinity column chromatography). , Gel filtration method, etc.) can be separated and purified by an appropriate combination.
By overexpression of the protein or polypeptide of the present invention, the function or activity of the protein or polypeptide in the cell can be increased (enhanced).
A nucleic acid (oligonucleotide or polynucleotide) that hybridizes with the nucleic acid of the present invention under stringent conditions or its complement can be used as a probe for detecting the gene of the present invention. In addition, this nucleic acid or its complement can also be used as, for example, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, or a decoy in order to modulate (for example, suppress) gene expression. As such a nucleic acid, for example, a nucleotide having a continuous partial sequence of 14 bases or more or its complementary sequence of a nucleic acid (sense strand or antisense strand) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used. be able to.
Recognizing the protein or polypeptide of the present invention using the protein or polypeptide of the present invention, or a protein or peptide having immunological equivalence to the protein or polypeptide (such as a synthetic peptide having a protein fragment or partial sequence) as an antigen Antibodies can be obtained. Having immunological equivalence means, for example, that it causes a cross reaction with an antibody against the protein or polypeptide of the present invention.
Polyclonal antibodies can be prepared by the usual method of inoculating a host animal (eg, rat or rabbit) with an antigen and recovering immune serum. Monoclonal antibodies can be prepared by techniques such as ordinary hybridoma methods. In addition, humanized monoclonal antibodies and the like can be prepared by modifying the gene of the monoclonal antibody.
Using the antibody obtained above, the expression of the protein or polypeptide of the present invention in a cell or tissue can be detected by an ordinary immunochemical method (such as immunochemical assay). Alternatively, the protein or polypeptide of the present invention can be purified by affinity chromatography using an antibody. In addition, neutralizing antibodies can be used to modulate (eg, suppress) the function or activity of the protein or polypeptide of the invention.
The receptor protein or polypeptide of the present invention has a function or activity (biological activity) as an eicosanoid receptor. Examples of such functions or activities include the following.
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist).
(Iii) G protein based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist) [more specifically, G protein _iα (G _i Α subunit of G protein belonging to subfamily, eg G _iα1 Etc))) activation.
Here, as ligands (ligands acting as agonists), eicosanoids (for example, 5-oxo-ETE, 5-HPPEE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z) -Dienoic acid, 5-HETE, and 5,8,11-eicosatriic acid, etc.).
Such a function or activity of the receptor protein or polypeptide of the present invention can be detected, for example, as follows.
Method for detecting function or activity of (i) above
The receptor protein or polypeptide of the present invention (in the form of a membrane fraction containing the same or in the form of cells expressing this on the cell surface, etc.) is bound to a ligand [eicosanoid such as 5-oxo- ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid, 5-HETE, and 5,8,11-eicosatriic acid] Contact and detect specific binding of both. For detection of such binding, for example, a ligand with a label (for example, RI label, fluorescent label, etc.) can be used. Specific binding can be detected by a conventional competitive assay using a mixture of unlabeled ligand together with labeled ligand.
Method for detecting function or activity of (ii)
Cells expressing the receptor protein or polypeptide of the present invention on the cell surface are labeled with ligands [eicosanoids (eg, 5-oxo-ETE, 5-HPTEE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, In contact with and induce induced intracellular signaling (eg, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid, 5-HETE, and 5,8,11-eicosatriic acid, etc.) Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change, K ⁺ , Etc.). A cell expressing (or not expressing) a receptor protein or polypeptide of the invention at a lower level is used as a control and compared to the level of intracellular signaling in such a control cell, If the level of intracellular signal transduction is higher than that, it is recognized that it has the function or activity (ii) depending on its level.
Specific methods for detecting intracellular signal transduction are described in, for example, the literature [Chen et al., Analytical Biochemistry, Vol. 226, pages 349-354, 1995 (Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change); Graminski et al. Biol. Chem. 268, 5957-5964, 1993 (activation of phospholipase C); Method of Sakurai et al., Cell 92, 573-585, 1998 (Ca ²⁺ Concentration change); Method of Hollopeter et al., Nature, 409, 202-207, 2001 (K ⁺ Concentration change); Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 471-476, 1998 (pH change); Hinuma et al., Nature, 393, 272-273, 1998 (arachidonic acid metabolite releasing); JP-A-9-268 Etc.] can be carried out according to the method described in the Japanese Patent Publication.
Method for detecting function or activity of (iii)
The receptor protein or polypeptide of the present invention and G _iα (G _i Α subunit of G protein belonging to subfamily, eg G _iα1 Membrane fraction is prepared from the cells in which the fusion protein is expressed on the cell membrane. This membrane fraction was converted into a ligand [eicosanoid (eg, 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid, 5 In the presence and absence of -HETE, and those acting as agonists such as 5,8,11-eicosatriic acid] or the like [eg GTPγS (guanosine 5′-O— (3 -GTP analogs that are not easily degraded, such as thiotriphosphate)), and then detecting the binding of the labeled GTP or analog thereof to the membrane fraction, as compared to the level of binding in the absence of ligand. If the level of binding in the presence of the ligand is higher, it is recognized that the function or activity of (iii) is present depending on the level. It is.
Where G _iα (G _i Α subunit of G protein belonging to subfamily, eg G _iα1 ) And its gene, the amino acid sequence and base sequence are already known [human G _iα1 (351 Cys → Ile) / Bahia et al., Biochemistry, 37, 11555-11562, 1998: Human G _iα1 / Genbank / EMBL accession no. AFO55013, PIR / SWISS-PROT accession no. PO4898: etc.].
Therefore, G _iα DNA that encodes is selected from a DNA library using the disclosed known sequence information, PCR (polymerase chain reaction) method, colony hybridization method, plaque hybridization method or a combination thereof as appropriate. be able to. G _iα Is bound downstream of the DNA encoding the receptor protein or polypeptide of the present invention and incorporated into a vector containing an appropriate promoter to obtain a vector for expressing the fusion protein. it can. Then, the fusion protein expression vector can be introduced into cells to express the fusion protein.
The receptor protein or polypeptide of the present invention can be used for screening or identification of a ligand or agonist (agonist or antagonist) thereto.
The method for screening or identifying a ligand or an agonist (agonist or antagonist) for the receptor protein or polypeptide of the present invention comprises the receptor protein or polypeptide of the present invention (form of a membrane fraction containing the same or cell Contacting the test compound with a test compound; and (1) specific binding of the receptor protein or polypeptide to the test compound in the presence of the test compound ( 2) intracellular signaling, or (3) G protein (G _iα ) In the method of detecting activation.
In more detail, the screening or identification method of a ligand, an agonist, and an antagonist can each be implemented as follows.
(A) Ligand screening or identification method
(1) The receptor protein or polypeptide of the present invention (in the form of a membrane fraction containing the same or in the form of cells expressing this on the cell surface, etc.) is contacted with a test compound (2 ) Detecting the specific binding between the receptor protein or polypeptide of the present invention and the test compound, (3) whether or not the test compound has the ability to bind to the receptor protein or polypeptide, or the strength of the ability This can be done by determining the length.
Such specific binding can be detected, for example, by a conventional competitive assay method in which a known ligand with a label (for example, RI label, fluorescent label, etc.) is mixed with an unlabeled test compound. .
A test compound (ligand) having specific binding ability is likely to be an agonist (agonist or antagonist).
(B) Agonist screening or identification method
(1) contacting the receptor protein or polypeptide of the present invention (the form of a membrane fraction containing the same or the form of cells expressing the same on the cell surface) with a test compound, (2) In the presence of a test compound, intracellular signaling or G protein (G _iα Whether (3) the test compound has the ability to induce intracellular signaling or G protein activation based on stimulation of the receptor protein or polypeptide, or This can be done by determining the strength of the ability.
Intracellular signaling (eg, Ca ²⁺ Or change in cAMP concentration, activation of phospholipase C, change in pH, K ⁺ Concentration change) or G protein (G _iα ) Can be detected using the same method as described above.
(C) Method for screening or identifying antagonist
(1) The receptor protein or polypeptide of the present invention (the form of a membrane fraction containing the same or the form of a cell expressing the same on the cell surface) is used as a test compound and a ligand (preferably an agonist). (2) detecting the function or activity of the receptor protein or polypeptide of the present invention, and (3) the test compound determines the function or activity of the receptor protein or polypeptide of the present invention. This can be done by determining whether or not the ability to suppress or the strength of the ability.
Here, as the ligand (ligand acting as an agonist), for example, 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z- Examples include eicosanoids such as dienoic acid, 5-HETE, and 5,8,11-eicosatriic acid, among which 5-oxo-ETE is a particularly preferred example.
The function or activity of the protein or polypeptide of the present invention includes the above (i) (ii) or (iii), that is,
(I) specific binding to a ligand;
(Ii) intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist) or
(Iii) G protein activation based on stimulation by a ligand (ligand that acts as an agonist) can be mentioned.
Detection of these functions or activities can be carried out, for example, by applying the same method as described above except that a test compound is added or not added together with a ligand (preferably a ligand that acts as an agonist).
Appropriate controls should be taken in determining the ability of the test compound. Such controls include detection / test in the absence of test compound, detection / test using cells that do not express the receptor protein of the present invention or have a lower level of expression of the receptor protein. Is given. A plurality of these controls may be combined for more accurate determination.
A compound selected or identified as an antagonist by the above-mentioned method or the like is brought into contact with a cell expressing the polypeptide of the present invention, thereby bringing the function or activity of the polypeptide (eicosanoid receptor) into the cell. Can be suppressed.
Moreover, the antagonist with respect to the polypeptide (eicosanoid receptor) of this invention is anticipated that it can be used as an active ingredient of a pharmaceutical. Therefore, a compound selected or identified as an antagonist for the polypeptide (eicosanoid receptor) of the present invention by the above method or the like can be used for the manufacture of a medicament. In the production of a medicine, it can be mixed with a conventional carrier to produce a pharmaceutical composition, and the composition can be sold as a medicine.
When used as a medicine, the administration method is not particularly limited, and a general oral or parenteral method (oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.) may be applied. If necessary, it may be formulated and used as a conventional pharmaceutical preparation (tablet, granule, capsule, powder, injection, inhalant, etc.) together with an inert carrier according to the administration method. For example, a compound can be used together with an activator or diluent such as a binder, a disintegrant, a bulking agent, a filler, a lubricant, and the like that are acceptable in general medicine, and can be formulated by a conventional method.
The dose varies depending on the administration method, patient age, body weight, and condition, but a general dose, for example, 1 to 300 mg / kg for oral administration per day, or for parenteral administration, It is set in the range of 0.01 to 50 mg / kg.
The receptor protein or polypeptide used for screening or identification of a ligand or agonist is in the form of a membrane fraction containing the receptor protein or polypeptide, or the receptor protein or polypeptide expressed on the cell surface. It can be used in the form of a living cell.
As a cell expressing the receptor protein or polypeptide on the cell surface, a cell in which the receptor protein or polypeptide is overexpressed can be used. For example, the receptor protein or polypeptide can be used. Cells into which a recombinant vector containing a peptide-encoding nucleic acid has been introduced can be used.
As a host cell into which a recombinant vector is introduced, cells (mammalian cells, insect cells, etc.) that can express a foreign receptor protein on the cell membrane without impairing its function can be used. In addition, as a host cell, it is desirable to use a cell that does not express the target receptor protein or polypeptide or that is expressed only at a low level before introducing the recombinant vector.
The membrane fraction containing the receptor protein or polypeptide is obtained by crushing cells expressing the receptor protein or polypeptide and then using centrifugal force such as differential centrifugation or density gradient centrifugation. It can be prepared using a drawing method. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (about 500 to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (about 15000 to 30000 rpm) for about 30 to 120 minutes. Then, the obtained precipitate fraction is used as a membrane fraction.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, these Examples do not restrict | limit this invention.
In the following Examples, unless otherwise specified, “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Published in the year), or when using commercially available reagents and kits, they were used according to the instructions for commercial products.
Example
Example 1 Isolation of human TG1019
(1) The amino acid sequences of 62 G protein-coupled receptors having peptides as ligands were aligned, and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) well conserved among these G protein-coupled receptors was determined. NCBI (National Center for) using this sequence (SEQ ID NO: 3) as a query sequence and tblastn (Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) as a homology search method. Biotechnology Information) High-Throughput Genomic Sequences database was searched. As a result, a highly homologous sequence (SEQ ID NO: 4) was found in clone AC013396.3. Using the sequence of AC013396.3, an open reading frame (SEQ ID NO: 5) containing this sequence (SEQ ID NO: 4) was deduced. HMMTOP (membrane protein discrimination and transmembrane helix prediction system) (Tusnady GE et al., J. Mol. Biol., 283, 489-506, 1998) ) Was used to predict the transmembrane region and homology analysis with known G protein-coupled receptors. As a result, it was speculated that the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 encodes the full length of the novel G protein-coupled receptor.
(2) Primers were designed based on the base sequence of AC013396.3 in (1) above, and DNA containing SEQ ID NO: 5 was obtained by PCR.
A first PCR was performed using a human cDNA library (trade name “Human Universal QUICK-Clone cDNA”; manufactured by Clontech). At that time, as a sense primer, a synthetic oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (a primer corresponding to the region containing the 97735th to 97760th bases of AC013396.3) was used, and as an antisense primer, a sequence was used. A synthetic oligonucleotide (primer corresponding to the region containing the 96299th to 96324th bases of AC013396.3) having the base sequence shown in No. 7 was used. PCR reaction solution (25 μl) containing these primers and template cDNA [Composition: Template cDNA (trade name “Human Universal QUICK-Clone cDNA”, manufactured by Clontech) 1 μl, sterile water 18.5 μl, PCR buffer (Advantage 2 PCR Buffer, Clontech) 2.5 μl, Deoxynucleotide solution (dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 10 mM each) 0.5 μl, Polymerase solution (Advantage 2 Polymerase Mix, Clontech) 0.5 μl, Sense primer (10 μM) 1.0 μl, antisense primer (10 μM) 1.0 μl], and PCR [conditions: 94 ° C., 30 seconds, (94 ° C. 30 seconds → 64 ° C. 30 seconds → 72 ° C. 2.5 minutes) × 30 times, 72 ° C .5 minutes] was carried out. Next, a second PCR was performed using 1 μl of the PCR reaction solution obtained above as a template. At that time, the PCR reaction solution composition and reaction conditions were the same as described above. The obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, the band was cut out, and a cDNA fragment containing SEQ ID NO: 5 (about 1500 bp) was purified and obtained. This was linked to a vector plasmid (pGEM-T Easy, manufactured by Promega), and the nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using the resulting plasmid. As a result, the base sequence (1462 bp) shown in SEQ ID NO: 1 was obtained.
Within SEQ ID NO: 1 an open reading frame was identified. The amino acid sequence (423 amino acid residues) of the protein encoded thereby (referred to as TG1019 protein) was as shown in SEQ ID NO: 2. For SEQ ID NO: 2, a transmembrane region was predicted by HMMTOP and homology analysis with a known G protein-coupled receptor was performed. As a result, TG1019 protein is presumed to be a novel G protein-coupled receptor, and the cDNA (1462 bp) obtained above is a cDNA containing the entire translation region of the gene for TG1019 protein (referred to as TG1019 gene). It was thought that there was. FIG. 1 shows a transmembrane region (underlined portion) together with the base sequence and amino acid sequence.
When the DNA base sequence of SEQ ID NO: 1 was compared with a human genomic DNA sequence registered in Genbank (Genbank Accession No. ACO13396 (ver3)), a difference of 4 bases was observed. The different bases were the 487th (G⇔A), 771th (G⇔A), 1022th (C⇔A) and 1038th (G⇔A) bases in SEQ ID NO: 1.
With these base differences, a difference of 3 amino acid residues also occurs in the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA, and the different residues are the 150th position (GlyｌAsp) in SEQ ID NO: 2, 245 (Glu⇔Lys) and 334th (Ala⇔Thr)] residues.
Accordingly, PCR (independently twice) was performed using a human cDNA library (trade name: Marathon Ready cDNA library, human fetal splene; manufactured by Clonetech) as a template, and an ApaI fragment containing the base in which the above difference was found was obtained. Obtained and analyzed the base sequence of multiple clones.
As a result, the 1022 base difference (C⇔A) in SEQ ID NO: 1 was considered to be due to a nucleotide polymorphism, and was thought to be derived from a naturally occurring allelic variant. . This difference in the base sequence does not cause a difference in the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
On the other hand, the differences in the 487th (G⇔A), 771th (G⇔A) and 1038th (G⇔A) bases in SEQ ID NO: 1 are considered to be due to PCR errors, and for these, Genbank Accession No. The sequence of ACO13396 (ver3) was considered correct.
That is, the base sequence in which these PCR errors and the like are corrected is considered that the 487th, 771st, 1022nd and 1038th bases in SEQ ID NO: 1 are “A” (adenine). As for the amino acid sequence of the polypeptide encoded by (2), the 150th, 245th and 334th amino acid residues in SEQ ID NO: 2 were considered to be Asp, Lys and Thr, respectively.
The base sequence after correcting the PCR error is shown in SEQ ID NO: 20 in the Sequence Listing, and the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 21.
Example 2 TG1019 gene expression distribution
The distribution of TG1019 gene expression in various human tissues and cells was examined by dot blot analysis. Dot blotting was performed using human tissue-derived and human cultured cell-derived mRNA (dots on a nylon membrane) (Multiple Tissue Expression Array, manufactured by Clontech) and an RI-labeled probe. On the membrane, various human tissue-derived and human cultured cell-derived mRNAs [poly (A) RNA] shown in FIG. 2 are dotted (adsorbed and fixed).
The RI-labeled probe used was prepared as follows. That is, after treating the plasmid containing the cDNA fragment obtained in section (2) of Example 1 with the restriction enzyme NotI, a DNA fragment of about 1500 bp (cDNA fragment containing the entire translation region of the TG1019 gene) by agarose gel electrophoresis. Was purified and obtained. Using this cDNA fragment as a template, a labeling kit (Prime-a-Gene Labeling Prosym.), Including a random primer (random hexanucleonucleotides), a nucleotide mixture (dATP, dGTP and dTTP) and DNA polymerase I (Large (Klenow) Fragment) Made) and [α ^-32 After labeling with P] dCTP, it was purified by gel filtration to prepare an RI-labeled probe.
Hybridization of the dot blot was performed as follows.
The membrane on which the mRNA was immobilized was treated with 160 μl of Solution I [Salmon Tests DNA (9.4 μg / μl: manufactured by SIGMA) at 97 ° C. for 5 minutes, cooled in ice, and then expressed at 60 ° C. Express Hyb hybridization Solution ( (Prepared by adding 15 ml of Clontech)] and preincubating for 30 minutes at 68 ° C.
Subsequently, this membrane was mixed with a labeled probe-containing hybridization solution [20 μl of the above-mentioned RI-labeled probe, human COT-1 DNA (1 μg / μl: manufactured by Roche)], salmon testis DNA (9.4 μg / μl: manufactured by SIGMA) 16 μl. , 20 × SSC (3M sodium chloride, 300 mM sodium citrate, pH 7.0) 50 μl, and nuclease-free H 2 O (Promega) 84 μl were prepared to prepare a 200 μl solution, which was treated at 97 ° C. for 5 minutes. Incubated at 68 ° C. for 30 minutes, and further prepared by adding 5 ml of the solution I], the mixture was hybridized at 65 ° C. for 12 hours. Next, the membrane was pre-washed with 2 × SSC containing 1% SDS (300 mM sodium chloride, 30 mM sodium citrate, pH 7.0) at 65 ° C. for 20 minutes 5 times, and then 0.5%. The plate was washed twice with 0.1 × SSC (15 mM sodium chloride, 1.5 mM sodium citrate, pH 7.0) containing SDS at 55 ° C. for 20 minutes.
As a result of detecting a hybridization signal using an image analyzer (Bio-imaging Analysis System 2000, manufactured by Fuji Film), a signal was observed in mRNA of almost all tissues subjected to the test. Among the tissues where signals were observed, relatively strong signals were observed in the liver, kidney, peripheral leukocytes and spleen. From these results, it was considered that the TG1019 gene is expressed in many tissues, among which the expression in the liver, kidney, peripheral leukocytes and spleen is relatively high.
Example 3 Ligand Identification of TG1019 Protein (G Protein Coupled Receptor)
TG1019 protein was presumed to be a G protein-coupled receptor as in Example 1. Therefore, using a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and G protein, ligand-dependent binding to GTPγS (guanosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)) is detected as follows. [Wenzel-Seifert et al., Mol. Pharmacol. 58, 954-966, 2000; Bahia et al., Biochemistry, 37, 11555-11562, 1998].
(1) Preparation of plasmid for expressing fusion protein
Hereinafter, TG1019 protein and G protein [G _iα1 (351Cys → Ile), G _qα Or G _sαL A plasmid for expressing the fusion protein was prepared. A schematic diagram of the fusion protein is shown in FIG. Where G _iα1 (351Cys → Ile) is G _iα1 Mutant G obtained by converting 351st cysteine residue of protein to isoleucine residue _iα1 Means protein.
(A) Preparation of TG1019 gene cDNA
PCR was performed using the plasmid containing the TG1019 gene cDNA (including the entire translation region) obtained in the item (2) of Example 1 as a template.
At that time, as the sense primer (primer TG1019-1) and the antisense primer (primer TG1019-2), synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively, were used.
These primers are designed based on the cDNA base sequence (SEQ ID NO: 1) of the TG1019 gene. The PCR product contains cDNA encoding the full length of the TG1019 protein (excluding the stop codon) and recognizes restriction enzymes at both ends. It is designed to obtain a DNA fragment to which a site (BglII site at the N-terminus and CpoI and HindIII sites at the C-terminus) is added.
Thus, the obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (vector system for PCR product cloning) (pGEM-T Easy Vector, Promega), and the obtained plasmid was treated with restriction enzymes NotI and CpoI. The resulting DNA fragment of about 1300 bp was recovered.
(B) G protein (G _iα1 Preparation of plasmid for fusion protein expression with (351Cys → Ile))
PCR was performed using cDNA derived from human brain (Marathon-Ready cDNA Brain, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _iα1 -1) and antisense primer (primer G _iα1 -2) were synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively.
These primers are G _iα1 Designed based on the known base sequence of cDNA encoding protein (Genbank / EMBL accession no. AFO55013). _iα1 It is designed to obtain cDNA that encodes the full length of the protein.
Subsequently, a second PCR was performed using the product obtained by the PCR as a template. At that time, sense primer (primer G _iα1 -3) and antisense primer (primer G _iα1 As for -4), synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, respectively, were used.
These primers can be used as PCR products as G _iα1 (351Cys → Ile) (G _iα1 Mutant G in which the 351st cysteine residue of the protein is replaced with an isoleucine residue _iα1 It is designed so as to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full length of (protein) and having restriction enzyme recognition sites (CpoI site and BamHI site) added to both ends thereof.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). This plasmid was treated with restriction enzymes NotI and BamHI, and the resulting DNA fragment of about 1100 bp was inserted into the NotI / BamHI site of baculovirus vector plasmid pVL1392 (manufactured by Pharmingen) to obtain plasmid pVL1392 / G. _iα1 (351 Cys → Ile) was obtained.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid, and the plasmid for fusion protein expression pVL1392 / TG1019-G _iα1 (351 Cys → Ile) was obtained.
(C) G protein (G _qα Preparation of fusion protein expression plasmid with
PCR was performed using human prostate-derived cDNA (Marathon-Ready cDNA Prostate, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _qα -1) and antisense primer (primer G _qα -2) were synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, respectively. These primers are G _qα Was designed based on the known base sequence of cDNA encoding (Genbank / EMBL accession no. U43083). _qα It is designed so that cDNA encoding the full length of can be obtained.
Subsequently, a second PCR was performed using the product obtained by the PCR as a template. At that time, sense primer (primer G _qα -3) and antisense primer (primer G _qα As for -4), synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 were used. These primers can be used as PCR products as G _qα It is designed to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full length of, and having restriction enzyme recognition sites (CpoI site and BamHI site) added to both ends thereof.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). The resulting plasmid was treated with restriction enzymes NotI and BamHI, and the resulting DNA fragment of about 1100 bp was inserted into the NotI / BamHI site of the baculovirus vector plasmid pVL1392 to obtain plasmid pVL1392 / G. _qα Got.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid, and the plasmid for fusion protein expression pVL1392 / TG1019-G _qα Got.
(D) G protein (G _sαL Preparation of fusion protein expression plasmid with
PCR was carried out using human bone marrow-derived cDNA (Marathon-Ready cDNA Bone marlow, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _sαL -1) and antisense primer (primer G _sαL -2), synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 were used.
These primers are G _sαL Designed based on the known nucleotide sequence of the cDNA coding for (Genbank / EMBL accession no. XO4408). _sαL It is designed to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full-length of DNA and having restriction enzyme recognition sites (CpoI site and XbaI site) added to both ends thereof.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). The obtained plasmid was treated with restriction enzymes NotI and XbaI, and the resulting DNA fragment of about 1200 bp was inserted into the NotI / XbaI site of baculovirus vector plasmid pVL1392 (manufactured by Pharmingen) to obtain plasmid pVL1392 / G. _sαL Got.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid to obtain a fusion protein expression plasmid pVL1392 / TG1019-GsαL.
(2) Preparation of membrane fraction containing fusion protein
As shown in FIG. 3 (schematic diagram), the three expression plasmids obtained in (b) to (d) of (1) above are linker sequences (-Gly added to the C-terminus of the TG1019 protein. TG1019 protein (full length) and G protein [G _iα1 (351Cys → Ile), G _qα Or G _sαL ] Is a plasmid that expresses a fusion protein having a linked structure.
These fusion protein expression plasmids pVL1392 / TG1019-G _iα1 (351Cys → Ile), pVL1392 / TG1019-G _qα Or pVL1392 / TG1019-G _sαL Was expressed in insect cells as follows, and a membrane fraction containing the fusion protein was prepared.
First, 1.5 ml of medium [10% fetal calf serum, 0.1 mg] was prepared so that insect cell Sf9 (Spodoptera frugiperda SF9) (manufactured by Farmingen) was about 60% confluent in a collagen-coated 3 cm petri dish. Incubation was carried out at 27 ° C. for 15 minutes in Grace's Insect Cell Culture Medium (pH 6.2: manufactured by Lifetech Oriental) containing / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin.
The medium was removed, 375 μl of transfection buffer (Transfection Buffer A, Pharmingen) was added, and a DNA solution prepared beforehand (1 μg of plasmid for fusion protein expression, Linearized BaculoGold Baculovirus DNA (Farmingen) (Made by Co., Ltd.) 0.125 μg, mixed in 25 μl of sterilized water, incubated at 25 ° C. for 15 minutes, and then added with 375 μl of Transfection Buffer B (manufactured by Pharmingen)].
After culturing this at 27 ° C. for 4 hours, the culture solution was removed, 1.2 ml of medium was added, and the mixture was cultured at 27 ° C. for 5 days. The obtained culture solution was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution I.
Sf9 cells were seeded in a collagen-coated 3 cm petri dish so as to be about 30% confluent, and the virus solution I (100 μl) obtained above and 1.2 ml of the medium were added and cultured at 27 ° C. for 4 days. The obtained culture solution was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution 11.
Sf9 cells were seeded in a 10 cm Petri dish treated with collagen so as to be about 70% confluent, and the virus solution II (500 μl) obtained above and 12 ml of the medium were added and cultured at 27 ° C. for 4 days. The culture solution thus obtained was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution III.
Sf9 cells were seeded in a 10 cm Petri dish treated with collagen so as to be about 70% confluent, virus solution III (100 μl) obtained above and 12 ml of medium were added, and cultured at 27 ° C. for 4 days. The cells thus obtained were washed with chilled PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) and then cooled lysis buffer [20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2 mM phenylmethyl fluoride. Sulfonyl, 10 μg / ml pepstatin, 10 μg / ml leupeptin, and 2 μg / ml aprotinin] were suspended in 3.6 ml, and the cells were disrupted using a Teflon homogenizer. The cell lysate was centrifuged (600 × g, 10 minutes), and the resulting supernatant was further centrifuged (50,000 × g, 20 minutes). The resulting precipitate was suspended in 450 μl of a cooled reaction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride) using a Teflon homogenizer, and a membrane fraction expressing the fusion protein was obtained. Obtained.
(3) Binding test between membrane fraction containing fusion protein and GTPγS
The membrane fraction (450 μl) obtained in (2) above was suspended in a reaction buffer (7.54 ml), and 10 μl of GDP (10 mM) was added thereto. After adding 20 μl of test sample to 160 μl of this solution and incubating at 30 ° C. for 10 minutes, [ ³⁵ 20 μl of S] GTPγS (5 nM, 5 nCi / μl: Amersham Pharmacia Biotech) was added to initiate the reaction. After incubation at 30 ° C. for 1 hour, the reaction was stopped by filtration using a glass filter (UniFilter-96GF / B, Packard). The filter was washed 3 times with 200 μl of chilled reaction buffer and then on the filter [ ³⁵ The amount of S] GTPγS (the amount bound to the membrane fraction) was measured by a liquid scintillation measurement method. The amount of non-specific binding (the amount of binding measured in the presence of 10 μM GTPγS) is subtracted from the amount of [35S] GTPγS binding thus measured, ³⁵ The specific binding amount of S] GTPγS was determined.
About 370 nucleic acids, amino acids, peptide related compounds, tissue extracts and lipid related compounds were tested as test specimens. As a result (FIG. 4), TG1019 protein and G _iα1 When a membrane fraction containing a fusion protein with (351Cys → Ile) is used, 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z , 8Z-dienoic acid, 5-HETE and 5,8,11-eicosatriic acid in a concentration-dependent manner [ ³⁵ The specific binding amount of S] GTPγS increased.
TG1019 protein and G _sαL When the membrane fraction containing the fusion protein was used, an increase in the specific binding amount by these compounds was not observed. On the other hand, TG1019 protein and G _qα In the case of using a membrane fraction containing a fusion protein, the specific binding amount increased with 5 (S) -HPETE. _iα The amount of increase was small compared to the case of.
From these results, TG1019 protein is _iα1 Or G _qα It was thought to be a type of G protein-coupled receptor that conjugated to proteins. Also, 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid, 5-HETE and 5,8,11-eico It became clear that satriic acid acts as its ligand (agonist).
That is, TG1019 protein comprises 5-oxo-ETE, 5-HPETE, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z, 11Z-trienoic acid, 5-HETrE, eicosa-5,8-dienoic acid, 5-HETE, and 5, It was considered to be an eicosanoid receptor having 8,11-eicosatriic acid as a ligand (agonist).
Example 4 Identification of antagonist of TG1019 protein (G protein-coupled receptor)
In the presence of 5-oxo-ETE (ligand acting as an agonist) and a test compound, the G protein activation effect of TG1019 protein based on 5-oxo-ETE stimulation was detected, and the antagonistic action of the test compound was examined.
Detection of G protein activation was carried out in the same manner as (3) of Example 3 above using a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and Giα1 and labeled GTPγS.
That is, a membrane fraction (450 μl) containing a fusion protein of TG1019 protein and Giα1 was suspended in a reaction solution (7.54 ml), and 10 μl of GDP (10 mM) was added thereto. To 160 μl of this solution, 5-oxo-ETE (final concentration 0.1 μM) and various concentrations of test compounds (0 M, 10 ^-7 M-10 ^-5 M) was added and incubated at 30 ° C. for 10 minutes. (Total solution volume of 5-oxo-ETE and test compound: 20 μl)
to this〔 ³⁵ The reaction was started by adding 20 μl of S] GTPγS, incubated at 30 ° C. for 1 hour, and then filtered through a glass filter to stop the reaction.
On the filter ³⁵ The amount of S] GTPγS (the amount bound to the membrane fraction) was measured by liquid scintillation and measured [ ³⁵ The amount of non-specific binding (the amount of binding when measured in the presence of 10 μM GTPγS) was subtracted from the amount of S] GTPγS to determine the amount of specific binding.
As a result, it was found that various polyunsaturated fatty acid compounds suppress the G protein activation action of TG1019 protein based on 5-oxo-ETE stimulation and show an antagonistic action.
Thus, these compounds identified as acting as antagonists of TG1019 protein (G protein-coupled receptor) and their IC50 values are shown in Table 2 below.

Example 5 Confirmation of expression and function of TG1019 protein (G protein-coupled receptor) in CHO cells
In the following manner, a TG1019 protein expression vector is transiently introduced into CHO cells to express recombinant TG1019 protein, and the function of TG1019 protein as an eicosanoid receptor is confirmed using these cells. did.
First, the DNA encoding the full length of the TG1019 protein obtained in Example 1 (1) (a) was subcloned into the NotI recognition site of the vector plasmid pcDNA3.1 (expression vector, manufactured by Invitrogen) for expression of the TG1019 protein. The vector plasmid pcDNA3.1-TG1019 was obtained.
CHO cells (1x10 ⁶ Cells) was cultured in DMEM / F-12 medium containing 10% fetal bovine serum for 20 hours at 37 ° C. Using this cell, plasmid DNA (pcDNA3.1-TG1019, or vector pcDNA3.1 as a control) (5 μg) and a transfection reagent (LipofectAMINE, manufactured by Invitrogen) were added, and transfection was performed for 24 hours. did. In the case of pretreatment with pertussis toxin, pertussis toxin (100 ng) was added after culturing for 20 hours, followed by culturing for 4 hours.
The cultured cells were collected and washed, suspended in KRH buffer (Krebs-Ringer Hepes buffer, pH 7.4) containing rolipram (25 mM), incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then inoculated into a 96-well plate (5 -7.5x10 ⁴ Cells / 90 μl / well).
Then forskolin (1 μM) and 5-oxo-ETE (final concentration 0 M or 10 ^-11 -10 ^-5 KRH buffer (90 μl / well) containing M) was added and incubated at room temperature for 10 minutes, and then the cells were lysed and the amount of cAMP produced was measured.
The amount of cAMP produced was measured using a cAMP enzyme immunoassay system manufactured by Amersham Biosciences.
As a result, in cells into which only the vector was introduced, cAMP production upon forskolin stimulation did not change with the addition of 5-oxo-ETE. On the other hand, in cells in which pcDNA3.1-TG1019 was introduced to express TG1019 protein, cAMP production upon forskolin stimulation was suppressed in a concentration-dependent manner by the addition of 5-oxo-ETE.
In addition, when cells expressing TG1019 protein were pretreated with pertussis toxin that inactivates sensitive G protein, suppression of cAMP production by addition of 5-oxo-ETE was not observed.
From these results, TG1019 protein is an eicosanoid receptor using 5-oxo-ETE as a ligand (ligand that acts as an agonist), and is a G protein-coupled type that is coupled to Gi (adenylate cyclase-inhibitory G protein). Confirmed to be a receptor.
Industrial applicability
The receptor protein and its gene of the present invention are useful for studying the mechanism of intracellular signal transduction. It can also be a target molecule for therapeutics for new diseases.
In addition, the screening, identification and characterization methods of agonists (agonists or antagonists) using the receptor protein of the present invention and its gene are useful for research and development of new drugs.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the amino acid sequence, base sequence, and presumed seven-transmembrane region (underlined portion) of TG1019.
FIG. 2 is a view showing the expression distribution (result of dot blot) of TG1019 gene in each human tissue or cell.
FIG. 3 is a schematic diagram showing an outline of the structure of a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins.
FIG. 4A is a graph showing the influence of various test substances on the specific binding amount between GTPγS and a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins when 5-oxo-ETE is used as a test compound. It is. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4B is a diagram showing the influence of various test substances on the specific binding amount of a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins and GTPγS when 5-HPETE is used as a test compound. . The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4C is a graph showing the influence of various test substances on the specific binding amount between GTPγS and a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins when arachidonic acid is used as a test compound. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4D shows various test substances with respect to specific binding amounts of a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins and GTPγS when eicosa-5Z-8Z-11Z-trienoic acid is used as a test compound. It is the figure which showed the influence. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4E is a graph showing the influence of various test substances on the specific binding amount between a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins and GTPγS when 5-HETrE is used as a test compound. . The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4F shows the effect of various test substances on the specific binding amount between GTPγS and a membrane fraction containing a fusion protein of TGT019 protein and various G proteins when eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid is used as a test compound. FIG. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4G is a diagram showing the influence of various test substances on the specific binding amount of a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins and GTPγS when 5-HETE is used as a test compound. . The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.
FIG. 4H shows various amounts of specific binding amounts of a membrane fraction containing a fusion protein of TG1019 protein and various G proteins and GTPγS when 5,8,11-eicosatriic acid (ETI) is used as a test compound. It is the figure which showed the influence of the test substance. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control. 「○ G _iα1 (351Cys → Ile) ”refers to TG1019 protein and G _iα1 The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with (351Cys → Ile) is shown. 「△ G _qα "Is the TG1019 protein and G _qα The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown. 「□ G _sαL "Is the TG1019 protein and G _sαL The test result in the membrane fraction containing a fusion protein is shown.

Claims (8)

A polypeptide having a function or activity as an eicosanoid receptor,
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 21; or
(B) a method for screening or identifying an antagonist for a polypeptide encoded by a nucleic acid which can hybridize under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 20, or a complement thereof. The following steps (1) to (3) , wherein the ligand is an eicosanoid:
(1) contacting the polypeptide with a test compound and a ligand;
(2) detecting the function or activity of the polypeptide; and (3) determining whether or not the test compound has the ability to suppress the function or activity of the polypeptide, or the strength of the ability. A method comprising; The method according to claim 1, wherein the function or activity of the polypeptide is selected from the following (i), (ii) and (iii).
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on ligand stimulation.
(Iii) Activation of G protein based on stimulation by ligand. Intracellular signaling, change in concentration of Ca ^2+, changes in the concentration of cAMP, activation of phospholipase C, Method ranging second claim of claim is selected from changed and K ⁺ concentration change of pH. The method according to claim 2 , wherein the activation of the G protein is the activation of the α subunit of the G protein belonging to the Gi subfamily. The eicosanoid is 5-oxo-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid, 5 (S) -hydroperoxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z-tetraenoic acid, arachidonic acid, eicosa-5Z, 8Z. , 11Z-trienoic acid, 5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z-trienoic acid, eicosa-5Z, 8Z-dienoic acid, 5-hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z-tetraenoic acid and 5,8 5. The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the method is selected from the group consisting of 11-eicosatriic acid. The polypeptide according to any one of claims 1 to 5 , wherein the polypeptide is in the form of a membrane fraction containing the polypeptide or in the form of a cell in which the polypeptide is expressed on the cell surface. The method described in the paragraph. Cells expressing the polypeptide on the cell surface, the claims 6 Claims for introducing an expression vector comprising a nucleic acid or which encodes a polypeptide is a cell overexpressing the polypeptide the method of. The method according to any one of claims 1 to 7 , which is used for selection, identification or characterization of a medicine.

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