JPWO2003087364A1

JPWO2003087364A1 - Novel G protein-coupled receptor and gene thereof

Info

Publication number: JPWO2003087364A1
Application number: JP2003584306A
Authority: JP
Inventors: 哲男大貫; 航司小川; 泰小口; 恵美子細井; 亜以子近田
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2005-08-18
Also published as: WO2003087364A1; AU2003227499A1

Abstract

本発明は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子を提供する。また、新規なリガンド及び作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定方法、及び、リガンド、作用薬等を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。詳細には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する精製された蛋白質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する精製された蛋白質を提供する。The present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein having a lipid peroxidation reaction product as a ligand and a gene thereof. The present invention also provides a novel ligand and agonist (agonist or antagonist) identification method and a pharmaceutical composition containing a ligand, an agonist and the like as active ingredients. Specifically, the purified protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a purified protein having a function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand.

Description

技術分野
本発明は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子に関する。また、これらを用いた医薬品候補化合物の同定方法及び医薬組成物に関する。
背景技術
多くの神経伝達物質、ホルモン、オータコイドなどの生理活性物質は、細胞表面に存在する特異的な受容体蛋白質を介して、生体の機能を調節している。このような受容体の多くは、細胞内に存在する三量体のＧＴＰ結合蛋白質（以下、Ｇ蛋白質と称する）と共役しており、その活性化を通じて情報を細胞内に伝達することが知られている。このことから、これら受容体はＧ蛋白質共役型受容体と総称される。Ｇ蛋白質共役型受容体は、いずれも７個の膜貫通領域を含む共通の構造を有していることが知られている。
Ｇ蛋白質は、α、β及びγサブユニットで構成される三量体であり、基底状態ではこれらサブユニットが会合した不活性型（ＧＤＰ結合型）として存在する。リガンド刺激を受けたＧ蛋白質共役型受容体により、不活性型（ＧＤＰ結合型）Ｇ蛋白質が活性型（ＧＴＰ結合型）へと変換され、ＧＴＰと結合したαサブユニット（Ｇα）とβ／γサブユニット複合体（Ｇβγ）とに解離する。そして、ＧＴＰと結合したＧα（また場合によってはＧβγ）が、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣなどの効果器を制御してシグナルを伝達する。
Ｇ蛋白質はＧαに多様性があり、Ｇαの種類によって異なる効果器を制御する。
一般に、Ｇ蛋白質共役型受容体は特定の種類のＧ蛋白質を活性化し、そのＧ蛋白質により特定の情報を細胞内に伝える。
Ｇ蛋白質共役型受容体としては、これまでに、α−及びβ−アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、エンドセリン受容体、ゴナドトロピン放出因子受容体、Ｈ１−及びＨ２−ヒスタミン受容体、ドーパミン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、ソマトスタチン受容体、プリン受容体などが知られている。
上記のような受容体は、いずれも生理活性物質の標的として、生体内での重要な役割を担っている。さらに、現在までに知られている医薬品の多くが、やはりＧ蛋白質共役型受容体を標的とするリガンド、あるいはアゴニストやアンタゴニストであったという事実も非常に意義深い。
これらのことから、Ｇ蛋白質共役型受容体は、医薬品開発の標的として注目されている。従って、新たなＧ蛋白質共役型受容体を見出すこと、そのリガンドを同定すること、及び、それらのアゴニストやアンタゴニストを同定する方法を見出すことは、新たな医薬品候補化合物の同定につながり、そのような同定や開発が強く望まれている。
しかしながら、これまでにすべてのＧ蛋白質共役型受容体が確認されているわけではなく、未だ、未知の受容体（オーファン受容体）が数多く存在していると考えられる。このため、それらのオーファン受容体の特定とそれに対応するリガンドの探索を行い、その機能解明と利用が切望されている。
近年、生体内で発現しているｃＤＮＡの配列をランダムに解析し、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されてきているが、ＥＳＴ情報の多くは配列情報のみが開示されているにすぎず、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質の探索の分野においても、ＥＳＴ配列から遺伝子の活性や機能を推定することは容易ではない。
一方、生体が酸化ストレスを受けた場合、脂質膜の過酸化反応産物（脂質の過酸化物の分解物）として４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ヒドロキシノネナールまたは４−ヒドロキシノン−２−エナールとも称する）等のアルデヒドが生体内で産生されることが知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：８１−１２８，１９９１）。これらの脂質過酸化反応産物は、生成後にタンパク質と結合することが報告されており、例えば、老化（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１２２０−１２２４，１９９２）、動脈硬化（Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１３７２−１３７６，１９８９）、パーキンソン病（Ｙｏｒｉｔａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２６９６−２７０１，１９９６）、アルツハイマー病（Ｍａｒｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６８：２５５−２６４，１９９７；Ｋｒｕｍａｎ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：５０８９−５１００，１９９７）等の疾患と関係していることが報告されている。しかしながら、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体についてはこれまで報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体及びその遺伝子を提供することにある。また、当該受容体蛋白質を用いたリガンド及び作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定方法及び医薬組成物を提供することにある。さらには、上記以外の目的については以下の記載より明らかである。
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、新しいＧ蛋白質共役型受容体をコードする全長ｃＤＮＡをヒトから単離した。また、この受容体蛋白質を遺伝子組換え技術により細胞中で発現させることに成功した。さらにリガンドの同定を行い、この受容体が脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体であることを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３７）を提供する。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
（３）配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質とその全長にわたり７５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質であり、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
（４）脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、（２）又は（３）に記載の蛋白質。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
（５）脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（２）〜（４）のいずれかに記載の蛋白質。
（６）組換え蛋白質である、（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質。
（７）哺乳動物の蛋白質である、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛋白質。
（８）哺乳動物がヒトである、（７）に記載の蛋白質。
（９）（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を有する単離された核酸。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する単離された核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
（１１）配列番号１の核酸と、その翻訳領域の全長にわたり少なくとも７５％以上の相同性を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
（１２）脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、（１０）又は（１１）に記載の核酸。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
（１３）脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の核酸。
（１４）ＤＮＡである、（９）〜（１３）のいずれかに記載の核酸。
（１５）哺乳動物の核酸である、（９）〜（１４）のいずれかに記載の核酸。
（１６）哺乳動物がヒトである、（１５）に記載の核酸。
（１７）（９）〜（１６）のいずれかに記載の核酸を含む組換えベクター。
（１８）（９）〜（１６）のいずれかに記載の核酸、又は、（１７）に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
（１９）（６）に記載の組換え蛋白質を細胞表面上に発現している、（１８）に記載の細胞。
（２０）（１０）〜（１２）のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
（２１）（１７）に記載の組換えベクターを用いて、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の細胞における機能又は生物学的活性を増強する方法。
（２２）以下の工程を含む、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質の製造方法。
（Ａ）（１８）又は（１９）に記載の細胞を培養する工程、
（Ｂ）培養物から蛋白質を回収する工程。
（２３）（９）〜（１１）のいずれかに記載の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸。
（２４）（２３）に記載のアンチセンス核酸を細胞に導入することからなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
（２５）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質の機能又は生物学的活性を中和する抗体。
（２６）（２５）に記載の抗体と細胞とを接触させることを含んでなる、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
（２７）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質を用いて、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（２８）下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するリガンドを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物と接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質と該試験化合物との特異的結合を検出する工程、
（Ｃ）該蛋白質と試験化合物との特異的結合の有無又は強度を判定する工程。
（２９）下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触せしめる工程、
（Ｂ）細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を検出する工程、及び
（Ｃ）該試験化合物が、細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３０）下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ^＋の濃度変化を測定する工程、
（Ｃ）該変化の測定により、該試験化合物が、細胞内シグナル伝達を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３０）下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物及び所望によりリガンドの存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３１）下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物及び所望によりリガンドの存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３２）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質が、該蛋白質を含む膜画分の形態のもの、又は、該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞の形態のものである（２７）〜（３１）に記載の方法。
（３３）該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞が、該蛋白質をコードする核酸又はこれを含む発現ベクターを導入して該蛋白質を発現させた細胞である（３２）に記載の方法。
（３４）医薬の選別、同定もしくは特徴づけのために使用されるものである、（２７）〜（３１）のいずれか記載の方法。
（３５）リガンドが、４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（２９）〜（３１）のいずれか記載の方法。
（３６）（２９）〜（３１）のいずれか記載の方法により、アゴニスト又はアンタゴニストを同定し、当該アゴニスト又はアンタゴニストを、担体とともに混合することからなる、医薬組成物の製造方法。
（３７）（２９）〜（３１）のいずれか記載の方法により同定されたアンタゴニストを、細胞と接触せしめて、該細胞における脂質過酸化反応産物の受容体の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−１１３８２９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、第１の態様において、以下の蛋白質を提供する。
第１の蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を提供する。このような蛋白質としては、配列番号１で示される当該ｃＤＮＡにコードされる受容体蛋白質（以下、「ＴＧ００３９蛋白質」と称する）のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
第２の蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質を提供する。
このような蛋白質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。ここで、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ）が失われない程度であればよく、通常１〜約８０個、好ましくは１〜約６０個、より好ましくは１〜約４５個、さらに好ましくは１〜約３０個、さらに一層好ましくは１〜約１５個である。また、本発明の蛋白質の具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と比較して１若しくはそれ以上の保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を有する蛋白質が挙げられる。
このような蛋白質には、自然界で発見される変異型蛋白質のほか、人為的に改変した変異型蛋白質、異種生物由来の蛋白質等が含まれる。従って、このような蛋白質には、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の保存的置換変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｖａｒｉａｎｔｓ）及び自然発生対立変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｎｔｓ）が含まれる。
第３の蛋白質としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質とその全長にわたり７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質であり、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質を提供する。
「相同性」とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上の蛋白質（又はポリヌクレオチド）の間の関係であって、蛋白質（又はポリヌクレオチド配列）間の適合によって決定されるような、蛋白質（又はポリヌクレオチド配列）間の配列の相関の程度を意味する。「相同性」は、当該技術分野において公知の方法により容易に決定できる。例えば、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）プログラムを用いて決定することができる。
上記の各種蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体の一種であり、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する。本明細書において、脂質過酸化反応産物とは脂質の過酸化物の分解物などを意味し、これには、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（別称：４−ヒドロキシノネナールまたは４−ヒドロキシノン−２−エナール、以下、４−ＨＮＥと称する）が含まれる。本発明の蛋白質は、脂質過酸化反応産物（４−ＨＮＥ等）と特異的に結合する。そして、これらの特異的結合により、受容体蛋白質は刺激されて細胞内シグナル伝達が誘導される。
また、本発明の受容体蛋白質は、該蛋白質に特異的に結合する上記のような物質により刺激を受けると、Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧ蛋白質を活性化する。例えば、Ｇ蛋白質のαサブユニットに着目すると、本発明の受容体蛋白質は、特異的に結合する物質による刺激を受けるとＧ_ｉα（Ｇ_ｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット、例えばＧ_ｉα１）を活性化型（ＧＴＰ結合能を有する状態）に変換する。そして、かかるＧ蛋白質の活性化を介して細胞内でシグナルを伝える。
従って、本発明の蛋白質は、脂質過酸化反応産物の受容体であり、以下にまとめた（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１以上の機能又は生物学的活性を有する。そして、このことは、本願明細書実施例に記載の通りである。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）としては、４−ＨＮＥなどが挙げられる。
本発明の蛋白質は、哺乳動物、例えば、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物又はヒトに由来するペプチドであってよく、また、合成蛋白質であってもよい。蛋白質の合成は、当該技術分野で公知の常法によって実施することができる。
本発明は、第２の態様において、前記蛋白質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。さらに詳しくは、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの塩基配列を包含する単離された核酸を提供する。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
なお、配列番号１は、ＴＧ００３９蛋白質の遺伝子（以下、「ＴＧ００３９遺伝子」と称する）のヒト由来ｃＤＮＡ（翻訳領域全長を含む）の塩基配列を表すものである。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る」とは、通常、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことによりハイブリダイゼーションを実施できることを意味する。また、「ハイストリンジェントな条件（より高いストリンジェンシーを有する条件）」とは、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できることを意味する。なお、配列番号１で示されるＴＧ００３９遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードするものであればよい。
また、本発明の核酸には、配列番号１で示される塩基配列と、その翻訳領域の全長にわたり、通常約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸をも含まれる。
以上のような遺伝子又は核酸には、自然界で発見されるか、又は、人為的に改変された変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等も含まれる。
本発明の核酸は、例えば、哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として同定を行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上では、ヒト由来のものを用いることが望ましい。
また、本発明の核酸は、配列番号１で表される遺伝子の配列情報を利用して取得することもできる。例えば、配列番号１の配列情報に基づいてプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法を適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得することができる。
具体的には、哺乳動物の細胞や組織から調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーを同定して、全長ｃＤＮＡを取得できる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーを同定することにより、ゲノム遺伝子を単離することができる。また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーを同定することにより、異種生物由来の相同遺伝子（オルソローグ）を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物の蛋白質をコードする翻訳領域を決定でき、取得した蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。
上記のようにして得られる本発明の核酸は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードするものであり、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性を有することは、本願明細書実施例に記載の通りである。
本発明は、第３の態様において、上記蛋白質を産生する方法を提供する。産生する方法は、本発明の核酸を含む組換えベクターを調製し、本発明の核酸又は該組換えベクターで形質転換した細胞を取得し、該細胞を培養し、培養物から蛋白質を回収することによって達成することができる。
上記方法は、具体的には、通常の遺伝子組換え技術により本発明の蛋白質を発現させ生産する方法が挙げられるが、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）の形で発現させ生産する方法も含まれる。
本発明の蛋白質を発現する細胞は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系などが挙げられる。このうち、機能がよく保存された蛋白質を得るためには、昆虫細胞（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＳＦ９、ＳＦ２１等）及び哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。
本発明の蛋白質を発現させるためのプロモーターとしては、哺乳動物細胞系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等、昆虫細胞系の場合、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。
ベクターとしては、哺乳動物細胞系の場合、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、昆虫細胞系の場合、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。
上記発現系で用いる本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるもの）を用いることができるが、これに限定されない。例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したＰＣＲ法や部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６頁、１９８４年）等によって実施できる。
本発明の蛋白質は、上記のような発現ベクターを導入した細胞の培養物中に産生され、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法など）を適宜組合せることによって、分離精製できる。
本発明は、第４の態様において、細胞における本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を増強する方法を提供する。
増強する方法としては、細胞における本発明の蛋白質の発現を高めることによって達成できる。具体的には、上記第３の態様において得られた、組換え発現ベクターを細胞に導入することによって行うことができる。また、本発明の蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸を当技術分野において公知の技術を用いて細胞に直接導入してもよい。
本発明は、第５の態様において、本発明の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸と、それを用いた本発明の蛋白質としての機能又は生物学的活性を抑制する方法を提供する。
例えば、本発明の請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸は、リボザイム、デコイとして使用することもできる。この場合、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸（センス鎖又はアンチセンス鎖）の、通常、連続する１４塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を有するヌクレオチドを用いるのが好ましい。
該アンチセンス核酸は、細胞に導入し、該蛋白質をコードする遺伝子の発現を変調させることによって、本発明の受容体蛋白質としての機能又は生物学的活性を変化（例えば、抑制）することができる。
例えば、アンチセンス核酸は、標的核酸配列を含む細胞に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などのＤＮＡトランスフェクション法、又はウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法などの当該技術分野で公知の方法を用いて導入することによって、本発明の蛋白質としての機能又は生物学的活性を変調（例えば、抑制）することができる。例えば、適切なレトロウイルスベクターを用いて該オリゴヌクレオチドを発現するベクターを調製し、その後、該発現ベクターを細胞とｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入すればよい。
また、該オリゴヌクレオチド又はその相補物をプローブとして用いることによって、本発明の遺伝子を検出することもできる。
本発明は、第６の態様において、本発明の蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質の機能又は生物学的活性を中和する抗体、及び、該抗体を用いて本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法を提供する。
本発明の蛋白質を認識し、特異的に結合する抗体は、本発明の蛋白質、又はこれと免疫学的同等性を有する蛋白質若しくはペプチド、例えば、蛋白質の断片又は部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて取得することができる。ここで、免役学的同等性を有するとは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。また、抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作製できる。
上記で得られた抗体を用いて、通常の免疫化学的方法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｓａｙ法など）により、本発明の蛋白質の細胞中又は組織中などにおける発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより本発明の蛋白質の精製を実施することができる。
また、本発明の中和抗体と細胞とを接触させることによって、本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制することができる。例えば、本発明の中和抗体を免疫原性アジュバント等の不活性成分又は治療的使用のためにさらなる有効成分と、安定化剤及び賦形剤とともに組み合わせ、濾過滅菌後、凍結乾燥物、又は安定化水性調製物中の貯蔵物として得ることができる。被験者へ投与する場合には、例えば、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などの当該技術分野において公知である方法により行い得る。投与量は、患者、投与方法に応じて、当業者であれば適当な投与量を適宜選択し得る。
本発明の蛋白質は、前記のように以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される機能又は生物学的活性を有する。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）には４−ＨＮＥが含まれ、細胞内シグナル伝達には、Ｃａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化及びＫ^＋の濃度変化等が含まれる。
本発明の蛋白質（受容体）は、脂質過酸化反応産物と特異的に結合し、その結合により蛋白質が刺激され、Ｇ蛋白質を活性化し、その活性化を介して細胞内にシグナル伝達が誘導される。
「Ｇ蛋白質を活性化し、その活性化を介して」とは、Ｇ蛋白質を活性型（ＧＴＰ型）へと変換し、Ｇ蛋白質を構成するα、β及びγサブユニットをαサブユニット（以下、Ｇαと称する）とβ／γサブユニット複合体（以下、Ｇβγと称する）とに解離し、Ｇαがアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣなどの効果器を制御してシグナルを細胞内に伝達することを意味する。また、Ｇαとしては、Ｇｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット、例えば、Ｇｉα１が挙げられる。
（ｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、次の工程を行うことによって達成できる。
（Ａ）本発明の蛋白質と検出可能に標識されたリガンドとを接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質とリガンドとの特異的結合の有無又は強度を検出する工程。
かかる結合の検出には、例えば、検出可能な標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付したリガンドを用い、この標識を測定することにより実施できる。また、その際、標識を付したリガンドとともに、非標識のリガンドを混合して用いる通常の競合アッセイにより特異的結合を検出してもよい。
（ｉｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、次の工程を行うことによって達成できる。
（Ａ）本発明の蛋白質とリガンド（アゴニストとして作用するリガンド）とを接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ^＋の濃度変化を測定する工程。
本発明の蛋白質をより低いレベルで発現している（又は発現していない）細胞を対照として用い、このような対照細胞における細胞内シグナル伝達のレベルと比較して、それよりも細胞内シグナル伝達のレベルが高ければ、その程度に応じ（ｉｉ）の機能又は生物学的活性を有すると認められる。
細胞内シグナル伝達の検出の具体的な方法については、例えば、文献〔Ｃｈｅｎらの方法、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２６巻、第３４９−３５４頁、１９９５年（Ｃａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化）；Ｇｒａｍｉｎｓｋｉらの方法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、第５９５７−５９６４頁、１９９３年（ホスホリパーゼＣの活性化）；Ｓａｋｕｒａｉらの方法、Ｃｅｌｌ、第９２巻、第５７３−５８５頁、１９９８年（Ｃａ^２＋の濃度変化）；Ｈｏｌｌｏｐｅｔｅｒらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第４０９巻、第２０２−２０７頁、２００１年（Ｋ^＋の濃度変化）；Ｔａｔｅｍｏｔｏらの方法、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２５１巻、第４７１−４７６頁、１９９８年（ｐＨの変化）；Ｈｉｎｕｍａらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第３９３巻、第２７２−２７３頁、１９９８年（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｒｅｌｅａｓｉｎｇ）；特開平９−２６８号公報など〕に記載された方法に準じて行うことができる。
（ｉｉｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（Ａ）本発明の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）の存在下又は非存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識を測定する工程、
（Ｄ）該検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合の存在又はレベルを検出する工程、
（Ｅ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）の存在下又は非存在下における該結合の有無又は強度を比較することにより、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化を判定する工程。
標識したＧＴＰ又はそのアナログには、例えば、ＧＴＰγＳ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））などの分解されにくいＧＴＰアナログを利用することができる。脂質過酸化反応産物の非存在下での結合レベルと比較して、脂質過酸化反応産物の存在下での結合レベルの方がより高ければ、その程度に応じ（ｉｉｉ）の機能又は生物学的活性があるものと認められる。
ここで、Ｇｉα及びその遺伝子については、既にアミノ酸配列及び塩基配列が知られている〔ヒトＧｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）／Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年：ヒトＧｉα１／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＦ０５５０１３、ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｐ０４８９８：等〕。従って、ＧｉαをコードするＤＮＡは、開示されている前記の既知配列情報を利用して、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法）プラークハイブリダイゼーション法又はこれらを適宜組合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得できる。ＧｉαをコードするＤＮＡを、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの下流に結合し、それを適当なプロモータを含むベクターに組込んで、融合蛋白質を発現させるためのベクターを得ることができる。その融合蛋白質の発現ベクターを、細胞に導入して、融合蛋白質を発現させることができる。
本発明は、第７の態様において、本発明の蛋白質に対するリガンドを同定するための方法を提供する。
ここで、「リガンド」とは、受容体蛋白質に特異的に結合する化合物を意味する。リガンドには、天然の化合物及び人工的に合成された化合物の両方が含まれる。
なお、リガンドには下記のアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。また、本方法で用いる本発明の蛋白質には、該蛋白質を含む膜画分の形態のもの、又は、該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞の形態のものをも含む。
リガンドの同定は、具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物と接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質と該試験化合物との特異的結合を検出する工程、
（Ｃ）該蛋白質と試験化合物との結合能力の有無又は強度を判定する工程。
かかる特異的結合の検出は、例えば、検出可能な標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付した既知リガンド化合物を、非標識の試験化合物とともに混合して用いる通常の競合アッセイ法などにより実施できる。試験化合物には特に制限はなく、低分子化合物、ペプチドなどが挙げられ、また、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。特異的結合能を有する試験化合物（リガンド）は、作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）である可能性が高い。
本発明は、第８の態様において、本発明の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法を提供する。
ここで、「アゴニスト」とは、受容体蛋白質と特異的に結合することなどにより該受容体蛋白質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物を意味する。また、「アンタゴニスト」とは、受容体蛋白質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物の作用に対して、これを抑制する能力を有する化合物を意味する。
アゴニスト又はアンタゴニストの同定は、例えば、以下のようにして実施できる。
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）と接触せしめる工程、
（Ｂ）細胞内シグナル伝達（例えば、Ｃａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、及び、Ｋ^＋の濃度変化等）を検出するか、又は、Ｇ蛋白質（Ｇ_１ファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット等）の活性化を検出する工程、及び
（Ｃ）該試験化合物が、細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
具体的には、次のような方法を実施することができる。
１．細胞内シグナル伝達の検出による同定
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）と接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ^２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ^＋の濃度変化を測定する工程、
（Ｃ）該変化の測定により、該試験化合物が、細胞内シグナル伝達を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
２．Ｇ蛋白質の活性化の検出による同定
（Ａ）本発明の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）の存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
試験化合物の能力を決定するにあたっては、適切な対照をとることが望ましい。このような対照としては、試験化合物の非存在下での検出・試験、本発明の受容体蛋白質を発現していないか、あるいは同受容体蛋白質の発現レベルがより少ない細胞を用いた検出・試験があげられる。さらに正確な決定のためにこれら対照を複数組合せてもよい。
前記方法などにより、アンタゴニストとして同定された化合物は、（本発明の蛋白質を発現している細胞）と接触せしめることにより、該細胞における脂質過酸化反応産物の受容体の生物学的機能又は活性を抑制することができる。
また、本発明の蛋白實（脂質過酸化反応産物の受容体）に対するアンタゴニストは、医薬の有効成分として使用できることが期待される。従って、前記方法などにより、本発明の蛋白質（脂質過酸化反応産物の受容体）に対するアンタゴニストとして同定された化合物は、医薬の製造のために使用できる。医薬の製造においては、慣用の担体とともに混合して医薬組成物を製造することができ、かかる組成物を医薬として販売することができる。
医薬として用いる際．投与方法は特に限定されず、一般的な経口もしくは非経口的な方法（経口、静脈内、筋肉内、皮下など）を適用すればよい。また，必要に応じては、投与方法に応じた不活性な担体と共に、慣用の医薬製剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等）として製剤化して用いればよい。例えば、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤，充填剤、滑沢剤などの賦活剤あるいは希釈剤とともに化合物を用い、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、一般的な投与量、例えば１日当たり、経口投与の場合は、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合には、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。
リガンド、アゴニスト又はアンタゴニストの同定のために使用する本発明の蛋白質は、該蛋白質を含む膜画分の形態、あるいは、該蛋白質を細胞表面上に発現している細胞の形態等で用いることができる。
受容体蛋白質若しくは蛋白質を細胞表面上に発現している細胞としては、該受容体蛋白質若しくは蛋白質を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた細胞などを用いることができ、例えば、該受容体蛋白質若しくは蛋白質コードする核酸を含む組換えベクターを導入した細胞などを用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、外来受容体蛋白質を、その機能を損なうことなく細胞膜上に発現し得る細胞（哺乳類の細胞、昆虫細胞など）を使用できる。また、宿主細胞としては、組換えベクターを導入する前の細胞それ自体は、対象の受容体蛋白質又は蛋白質を発現していないか、低いレベルでのみ発現している細胞を用いることが望ましい。
該蛋白質を含む膜画分は、該蛋白質又は該蛋白質を発現している細胞を破砕した後、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力を利用した分画法を用いて、調製できる。例えば、細胞破砕液を、低速（約５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清について、さらに高速（約１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常約３０〜１２０分程度遠心し、得られた沈殿画分を、膜画分として用いる。
本発明のリガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの化合物は脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の活性化を誘導又は抑制する作用を有するので、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性が関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の有効成分となり得る。
本発明は、第９の態様において、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性が関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
第８の態様によって得られる化合物を有効成分として含有する医薬組成物を得るための工程としては、以下のような常法により製剤化することができる。例えば、有効量のリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストとして確認された化合物又はその薬理的に許容される塩と、薬理学的に許容され得る担体とを混合する。次いで、投与形態に応じた剤型とする。本発明で用いられる医薬品組成物の投与形態には、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投与、脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、経鼻粘膜投与、経腸投与、局所投与、舌下投与、或いは経直腸投与が挙げられるが、これに限定されるものではない。
経口投与に用いる組成物としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、及び散剤などの固体剤型、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液剤などの液体剤型が含まれる。非経口投与に用いる場合には、無菌溶液剤、懸濁液剤、乳剤等の剤型が含まれる。また、上記担体としては、例えば、糖類、デンプン類、脂肪酸、タルク、植物油、ガム、グリコール類、生理食塩水、緩衝食塩水、等が挙げられる。
以下に、本発明の上記の同定方法により確認された、本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質のリガンド（アゴニスト）、４−ＨＮＥ（４−ヒドロキシ−２−ノネナール）について説明する。
本発明の蛋白質（受容体）のアゴニストである４−ＨＮＥは、生体が酸化ストレスを受けた場合、脂質過酸化反応産物として生体内で産生されることが知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：８１−１２８，１９９１）。
そして、４−ＨＮＥやその他の脂質過酸化反応産物は、例えば、以下の疾患、老化（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１２２０−１２２４，１９９２）、動脈硬化（Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１３７２−１３７６，１９８９）、パーキンソン病（Ｙｏｒｉｔａｋａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：２６９６−２７０１，１９９６）、アルツハイマー病（Ｍａｒｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６８：２５５−２６４，１９９７；Ｋｒｕｍａｎ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：５０８９−５１００，１９９７）等と関係していることが報告されている。
従って、上記同定方法によって得られた、本発明の蛋白質（受容体）のアゴニスト、アンタゴニスト、抗体等を有効成分として含有する医薬組成物は、老化、動脈硬化、パーキンソン病又はアルツハイマー病等の疾患の治療又は予防に有効であると期待される。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
［実施例１］ヒトＴＧ００３９遺伝子のｃＤＮＡの単離
（１）ヒトプリン受容体Ｐ２Ｙ５（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｐ４３６５７）、Ｐ２Ｙ７（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｑ１５７２２）及びＰ２Ｙ９（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｑ９９６７７）のアミノ酸配列をクエリー配列とし、ホモロジー検索法としてｔｂｌａｓｔｎ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、第４０３−４１０頁、１９９０年）を用いて、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のヒトＥＳＴデータベースに対する検索を行った。その結果、ホモロジーの高いＥＳＴクローンとして「ＩＭＡＧＥ；６８２９４２」（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＡ２１０７３９）を見出した。このＥＳＴクローンの塩基配列中には一つの大きなオープンリーディングフレームが存在すると推定された。
次に、ＮＣＢＩのヒトゲノムデータベースに対して、前記ＡＡ２１０７３９配列でｂｌａｓｔｎ検索（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、第４０３−４１０頁、１９９０年）を行った結果、このＥＳＴは、その塩基配列からヒトＧ蛋白質共役型受容体遺伝子がコードされていることが推定されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＦ０００５４５）の一部であることが判明した。
（２）上記（１）で得られたＡＦ０００５４５の塩基配列情報をもとにプライマーを設計し、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により、翻訳領域全長を含むｃＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、以下のように行った。
ＰＣＲの鋳型としては、ヒトゲノムＤＮＡ（商品名「ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ」；クロンテック社製）を用いた。センスプライマーとしては、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、アンチセンスプライマーとしては、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。なお、これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の両端に制限酵素認識部位（ＫｐｎＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
これらのプライマー及び鋳型ＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ反応液（５０μｌ）を調製し、ＰＣＲ〔条件：９５℃ １分、（９５℃ ３０秒→６６℃ ３分）×３５回、６６℃ ３分〕を実施した。
ＰＣＲ反応液組成：
鋳型ＤＮＡ１μｌ
滅菌水４０μｌ
ＰＣＲ用緩衝液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、クロンテック社製）５μｌ
デオキシヌクレオチド溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、各１０ｍＭ）１μｌ
ポリメラーゼ溶液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ、クロンテック社製）１μｌ
センスプライマー（１０μＭ）１μｌ
アンチセンスプライマー（１０μＭ）１μｌ
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドを切り出して、約１，０００ｂｐのｃＤＮＡ断片を精製取得した。これを、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを用いて、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（Ｌｉ−ＣＯＲＬＩＣ−４２００Ｌ（Ｓ）−２ＤＮＡアナリシスシステム、アロカ社製）を用い、ダイデオキシ法（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ、ＵＳＢ社製）により決定した。その結果、配列番号１に示した塩基配列（１，０３８ｂｐ）を取得した。この塩基配列がコードしていると推定されるＧ蛋白質共役型受容体の遺伝子をＴＧ００３９遺伝子と称することにした。このクローン化されたＴＧ００３９遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩのヒトゲノムデータベース中のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＦ０００５４５の塩基配列と比較すると、１塩基の相違が見られたが、これは、遺伝的多型性のため、若しくはＰＣＲの誤りのためと考えられた。
また、かくして得られた配列番号１で表されるＴＧ００３９遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列（３３９アミノ酸残基）は配列番号２に示した通りであった。配列番号２で表されるアミノ酸について、ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測を行った結果、Ｇ蛋白質共役型受容体に特徴的である７回膜貫通領域が推定された。
図１に、前記ＴＧ００３９遺伝子の塩基配列及び該配列に対応するアミノ酸配列とともに、その膜貫通領域（下線部）を示す。
［実施例２］ＴＧ００３９遺伝子の発現分布
ヒトの各種組織・細胞におけるＴＧ００３９遺伝子の発現分布を、ドットブロット解析により調べた。ドットブロットは、ヒト組織由来及びヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ（ナイロンメンブレンにドットされたもの）（ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｒｒａｙ、クロンテック社製）及びＲＩ標識プローブを用いて行った。メンブレンには、図２に示した各種ヒト組織由来及びヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ〔ポリ（Ａ）ＲＮＡ〕が吸着固定されている。
ＲＩ標識プローブは、以下のように調製したものを用いた。すなわち、前記実施例１の（２）項で得たｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを鋳型にしてＰＣＲを行った。その際、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により約５６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＴＧ００３９遺伝子の翻訳領域を含むｃＤＮＡ断片）を精製・取得した。このｃＤＮＡ断片を鋳型とし、ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ヌクレオチド混液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むラベリング用キット（Ｐｒｉｍｅ−ａ−ＧｅｎｅＬａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベリングを行った後、ゲルろ過で精製し、ＲＩ標識プローブを調製した。
ドットブロットのハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。ｍＲＮＡの固定されたメンブレンを、溶液Ｉ〔ＳａｌｍｏｎＴｅｓｔｅｓＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６０μｌを９７℃で５分間処理後、氷中で冷却し、これに６０℃のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）１５ｍｌを加えて調製したもの〕中で、６８℃、３０分間プレインキュベートした。ついで、このメンブレンを、標識プローブ含有ハイブリダイゼーション溶液〔前記ＲＩ標識プローブ２０μｌ、ｈｕｍａｎＣＯＴ−１ＤＮＡ（１μｇ／μｌ：Ｒｏｃｈｅ社製）３０μｌ、ＳａｌｍｏｎＴｅｓｔｅｓＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６μｌ、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）５０μｌ、及びＮｕｃｌｅａｓｅＦｒｅｅＨ２０（プロメガ社製）８４μｌを加えて、２００μｌの溶液を調製し、これを９７℃で５分間処理後、６８℃で３０分間インキュベートし、さらに前記溶液Ｉ５ｍｌを加えて調製したもの〕中で、６５℃、１２時間ハイブリダイズさせた。ついで、メンブレンを、１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて、６５℃、２０分間、５回、プレ洗浄した後、さらに、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて５５℃、２０分間、２回洗浄した。
イメージアナライザー（Ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ２０００、フジフィルム社製）を用いてハイブリダイゼーションのシグナルを検出した結果を図２に示す。図２から明らかなように、リンパ節、末梢血白血球、脾臓、虫垂、回盲腸、胸腺、肺及びＤａｕｄｉ細胞由来のｍＲＮＡで強いシグナルが見られた。これらの結果から、ＴＧ００３９遺伝子は、リンパ節、末梢血白血球、脾臓、虫垂、回盲腸、胸腺、肺及びＤａｕｄｉ細胞において比較的高発現していると考えられた。
［実施例３］ＴＧ００３９蛋白質のリガンド同定
ＴＧ００３９蛋白質は、前記実施例１の結果から、Ｇ蛋白質共役型受容体であると推定された。そこで、ＴＧ００３９蛋白質とＧ蛋白質の融合蛋白質を含む膜画分を用い、以下のようにして、ＧＴＰγＳ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））とのリガンド依存的な結合を検出する方法〔Ｗｅｎｚｅｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５８巻、第９５４−９６６頁、２０００年；Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年〕により、リガンドの同定を行った。
（１）融合蛋白質を発現させるためのプラスミドの調製
以下、（イ）〜（ニ）のようにして、ＴＧ００３９蛋白質とＧ蛋白質〔Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇ_ｑα、又はＧ_ｓαＬ〕との融合蛋白質を発現させるためのプラスミドを調製した。融合蛋白質の概略図は図３に示した。ここで、Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）は、Ｇ_ｉα１蛋白質の３５１番目のシステイン残基をイソロイシン残基に変換した変異型Ｇ_ｉα１蛋白質を意味する。
（イ）ＴＧ００３９遺伝子ｃＤＮＡの調製
前記実施例１の（２）項で得られたＴＧ００３９遺伝子ｃＤＮＡ（翻訳領域全長を含む）を含むプラスミドを鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーはＴＧ００３９遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物として、ＴＧ００３９蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ（終止コドンを除く）を含み、その両端に制限酵素認識部位（Ｎ末端にＸｈｏＩ部位、Ｃ末端にＣｐｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるよう設計されている。
かくして得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ＰＣＲ産物クローニング用ベクターシステム）（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＣｐｏＩで処理して、生じた約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
（ロ）Ｇ蛋白質（Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ））との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト脳由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡＢｒａｉｎ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_{ｉα１−１}）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_{ｉα１−２}）としては、各々、配列番号９及び配列番号１０に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、Ｇ_ｉα１蛋白質をコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＦ０５５０１３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｉα１蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_{ｉα１−３}）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_{ｉα１−４}）としては、各々、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）（Ｇ_ｉα１蛋白質の３５１番目のシステイン残基がイソロイシン残基に置換された変異型Ｇ_ｉα１蛋白質）の全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
（ハ）Ｇ蛋白質（Ｇ_ｑα）との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト前立腺由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡＰｒｏｓｔａｔｅ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｑα−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｑα−２）としては、各々、配列番号１３及び配列番号１４に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、Ｇ_ｑαをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｕ４３０８３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｑαの全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_ｑα−３）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_ｑα−４）としては、各々、配列番号１５及び配列番号１６に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇ_ｑαの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇｑαを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｑαを得た。
（ニ）Ｇ蛋白質（Ｇ_ｓαＬ）との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト骨髄由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡＢｏｎｅｍａｒｒｏｗ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧ_{ｓαＬ−１}）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧ_{ｓαＬ−２}）としては、各々、配列番号１７及び配列番号１８に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、Ｇ_ｓαＬをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｘ０４４０８）を元に設計されたものであり、ＰＣＲ産物としてＧ_ｓαＬの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＸｂａＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｂａＩで処理し、生じた約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇ_ｓαＬを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｓαＬを得た。
（２）融合蛋白質を含む膜画分の調製
前記（１）の（ロ）〜（ニ）で得られた３種の発現用プラスミドは、図３（概略図）で示したように、ＴＧ００３９蛋白質のＣ末端に付加されたリンカー配列（−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−）を介して、ＴＧ００３９蛋白質（全長）とＧ蛋白質〔Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇ_ｑα、又はＧ_ｓαＬ〕が連結した構造の融合蛋白質を発現するプラスミドである。
これら融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、ｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｑα、又はｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇ_ｓαＬを、以下のようにして、昆虫細胞内で発現させ、融合蛋白質を含む膜画分を調製した。
まず、昆虫細胞Ｓｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＳＦ９）（ファーミンジェン社製）をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約６０％コンフルエントとなるように、１．５ｍｌの培地〔１０％牛胎仔血清、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンを含むＧｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍ（ｐＨ６．２：ライフテックオリエンタル社製）〕中、２７℃、１５分間インキュベートした。
培地を取り除き、トランスフェクション用緩衝液（ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＡ、ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えた後、予め調製しておいたＤＮＡ溶液〔融合蛋白質発現用プラスミド１μｇ、ＬｉｎｅａｒｉｚｅｄＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＢａｃｕｌｏｖｉｌｕｓＤＮＡ（ファーミンジェン社製）０．１２５μｇ、滅菌水２５μｌ中で混和し、２５℃で１５分間インキュベートした後、ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＢ（ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えたもの〕４００μｌを滴下した。
これを２７℃で４時間培養した後、培養液を除き、培地１．２ｍｌを加えて２７℃で５日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、上清をウイルス液Ｉとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約３０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液Ｉ（１００μｌ）と培地１．２ｍｌを加えて２７℃で４日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液ＩＩとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩ（５００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液ＩＩＩとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩＩ（１００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた細胞を冷却したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で洗浄後、冷却した溶解緩衝液〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、及び２μｇ／ｍｌアプロチニン〕３．６ｍｌに懸濁し、テフロンホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕液を遠心分離（６００×ｇ、１０分間）し、得られた上清をさらに遠心分離（５０，０００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿物を冷却した反応緩衝液〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕４５０μｌに、テフロンホモジナイザーを用いて懸濁して、融合蛋白質を発現した膜画分を得た。
（３）融合蛋白質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの結合試験
前記（２）で得た膜画分（４５０μｌ）を反応緩衝液（７．５４ｍｌ）に懸濁し、これにＧＤＰ（１０ｍＭ）１０μＬを加えた。この溶液１６０μｌに試験検体２０μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした後、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（５ｎＭ，５ｎＣｉ／μｌ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）２０μｌを加え、反応を開始した。３０℃で１時間インキュベーションした後、ガラスフィルター（ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｂ、パッカード社製）を用いてろ過することで反応を停止した。フィルターを、冷却した反応緩衝液２００μｌで３回洗浄した後、フィルター上の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ量（膜画分との結合量）を液体シンチレーション測定法によって測定した。こうして測定した［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合量から、非特異的結合量（１０μＭＧＴＰγＳ存在下で測定した結合量）を差し引き、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量を求めた。
核酸、アミノ酸、ペプチド関連化合物、組織抽出物及び脂質関連化合物約３７０種を試験検体として検定した。その結果を図４に示す。ＴＧ００３９蛋白質とＧ_ｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合、４−ＨＮＥを添加することによって、濃度依存的に［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量が増加した。
一方、ＴＧ００３９蛋白質とＧｑαとの融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合、及び、ＴＧ００３９蛋白質とＧｓαＬとの融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合には、これら化合物による特異的結合量の増加は、認められなかった。
これらの結果から、ＴＧ００３９蛋白質は、Ｇｉα１蛋白質と共役するタイプのＧ蛋白質共役型受容体であると考えられた。また、４−ＨＮＥがそのアゴニスト（リガンド）として作用することが明らかとなった。すなわち、ＴＧ００３９蛋白質は、４−ＨＮＥをアゴニストとする脂質の過酸化反応産物の受容体であると考えられた。
産業上の利用の可能性
本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子は、細胞内情報伝達のメカニズム研究のために有用である。また、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体に関する疾患に対する治療薬の標的分子となり得る。
さらに、本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子を利用した作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定、同定及び特徴付けの方法は、新しい医薬の研究開発のために有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列表フリーテキスト
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧ００３９蛋白質のアミノ酸配列、塩基配列及び推測される７回膜貫通領域（下線部）を示した図である。
図２は、ヒトの各組織又は細胞におけるＴＧ００３９遺伝子の発現分布（ドットブロットの結果）を示した図である。丸印は、ｍＲＮＡレベルで遺伝子の発現が認められた組織又は細胞を示す。
図３は、ＴＧ００３９蛋白質と各種Ｇ蛋白質との融合蛋白質の構造の概略を示した模式図である。
図４は、ＴＧ００３９蛋白質と各種Ｇ蛋白質との融合蛋白質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する４−ＨＮＥの影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（％ｏｆｃｏｎｔｒｏｌ）で表している。
また、図４中、「○ Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示し、「△ Ｇｑα」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｑαとの融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示し、「□ ＧｓαＬ」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｓαＬとの融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示す。Technical field
The present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein having a lipid peroxidation reaction product as a ligand and a gene thereof. Moreover, it is related with the identification method and pharmaceutical composition of a pharmaceutical candidate compound using these.
Background art
Many physiologically active substances such as neurotransmitters, hormones, and otacoids regulate the functions of living bodies through specific receptor proteins present on the cell surface. Many of these receptors are conjugated to trimeric GTP-binding proteins (hereinafter referred to as G proteins) present in cells, and are known to transmit information into cells through their activation. ing. Therefore, these receptors are collectively referred to as G protein-coupled receptors. It is known that all G protein-coupled receptors have a common structure including seven transmembrane regions.
The G protein is a trimer composed of α, β and γ subunits, and exists in an inactive form (GDP binding type) in which these subunits are associated in the ground state. An inactive (GDP-bound) G protein is converted to an active (GTP-bound) G protein by a ligand-stimulated G protein-coupled receptor, and α subunit (Gα) and β / γ bound to GTP. Dissociates into subunit complex (Gβγ). Then, Gα (or Gβγ in some cases) bound to GTP controls an effector such as adenylate cyclase or phospholipase C and transmits a signal.
G protein has diversity in Gα and controls different effectors depending on the type of Gα.
In general, a G protein-coupled receptor activates a specific type of G protein, and transmits specific information into cells by the G protein.
Examples of G protein-coupled receptors include α- and β-adrenergic receptors, muscarinic acetylcholine receptors, adenosine receptors, angiotensin receptors, endothelin receptors, gonadotropin-releasing factor receptors, H1- and H2 so far. -Histamine receptors, dopamine receptors, metabotropic glutamate receptors, somatostatin receptors, purine receptors and the like are known.
Any of the receptors as described above plays an important role in vivo as a target of a physiologically active substance. Furthermore, the fact that many of the pharmaceuticals known to date have been ligands, agonists or antagonists that also target G protein-coupled receptors is also very significant.
For these reasons, G protein-coupled receptors are attracting attention as targets for drug development. Therefore, finding new G protein-coupled receptors, identifying their ligands, and finding ways to identify their agonists and antagonists lead to the identification of new drug candidate compounds, such as Identification and development are highly desired.
However, not all G protein-coupled receptors have been confirmed so far, and it is thought that there are still many unknown receptors (orphan receptors). Therefore, the identification of these orphan receptors and the search for ligands corresponding to them are eagerly desired to elucidate and utilize their functions.
In recent years, the sequence of cDNA expressed in vivo is randomly analyzed, and the obtained cDNA fragment sequence has been registered in the database as an Expressed Sequence Tag (EST) and has been published. Only sequence information is disclosed, and it is not easy to estimate the activity and function of a gene from an EST sequence in the field of searching for G protein-coupled receptor protein.
On the other hand, when the living body is subjected to oxidative stress, 4-hydroxy-2-nonenal (4-hydroxynonenal or 4-hydroxynon-2-enal) is used as a peroxidation reaction product of lipid membrane (degradation product of lipid peroxide). It is also known that aldehydes such as Esterbauer, H., et al., Free Radical Biology & Medicine, 11: 81-128, 1991). These lipid peroxidation products have been reported to bind to proteins after production, such as aging (Stadtman, ER, Science, 257: 1212-1224, 1992), arteriosclerosis (Palinski, W S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. -2701, 1996), Alzheimer's disease (Mark, RJ, et al., J. Neurochem., 68: 255-264, 1997; Kruman, I., et al., J. Neurosci., 17: 5089). -5100, 1997) etc. It has been reported. However, no G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand has been reported so far.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide a novel G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand and a gene thereof. Another object of the present invention is to provide a method for identifying a ligand and an agonist (agonist or antagonist) and a pharmaceutical composition using the receptor protein. Further, other objects than the above will be apparent from the following description.
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have isolated a full-length cDNA encoding a new G protein-coupled receptor from humans. Moreover, this receptor protein has been successfully expressed in cells by a gene recombination technique. Further, the ligand was identified, and the receptor was found to be a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, and the present invention was completed.
That is, the present invention provides the following (1) to (37).
(1) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(2) G protein coupled type having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand A protein having a function or biological activity as a receptor.
(3) a protein having 75% or more of amino acid sequence homology over the entire length of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand as a G protein-coupled receptor A protein having a function or biological activity.
(4) The function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand is one or more selected from the following (i), (ii) and (iii) The protein according to (2) or (3).
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand.
(Iii) Activation of G protein based on stimulation by ligand.
(5) The protein according to any one of (2) to (4), wherein the lipid peroxidation reaction product is 4-hydroxy-2-nonenal.
(6) The protein according to any one of (1) to (5), which is a recombinant protein.
(7) The protein according to any one of (1) to (6), which is a mammalian protein.
(8) The protein according to (7), wherein the mammal is a human.
(9) An isolated nucleic acid having a base sequence encoding the protein according to any one of (1) to (3).
(10) An isolated nucleic acid having the following base sequence (a) or (b):
(A) The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) G protein-coupled type that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand An isolated nucleic acid encoding a protein having a function or biological activity as a receptor.
(11) Function or biology as a G protein-coupled receptor having at least 75% homology with the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 over its entire translation region and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand Isolated nucleic acid encoding a protein having pharmacological activity.
(12) The function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand is one or more selected from the following (i), (ii) and (iii): The nucleic acid according to (10) or (11).
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand.
(Iii) Activation of G protein based on stimulation by ligand.
(13) The nucleic acid according to any one of (10) to (12), wherein the lipid peroxidation reaction product is 4-hydroxy-2-nonenal.
(14) The nucleic acid according to any one of (9) to (13), which is DNA.
(15) The nucleic acid according to any one of (9) to (14), which is a mammalian nucleic acid.
(16) The nucleic acid according to (15), wherein the mammal is a human.
(17) A recombinant vector comprising the nucleic acid according to any one of (9) to (16).
(18) A cell transformed with the nucleic acid according to any one of (9) to (16) or the recombinant vector according to (17).
(19) The cell according to (18), wherein the recombinant protein according to (6) is expressed on the cell surface.
(20) A polypeptide encoded by the nucleic acid according to any one of (10) to (12).
(21) A method for enhancing the function or biological activity in a cell of a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, using the recombinant vector according to (17).
(22) A method for producing a protein having a function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, comprising the following steps:
(A) a step of culturing the cell according to (18) or (19),
(B) A step of recovering the protein from the culture.
(23) An antisense nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid according to any one of (9) to (11) and capable of suppressing the expression of the nucleic acid.
(24) A method for suppressing the function or biological activity of the protein according to any one of (1) to (3), which comprises introducing the antisense nucleic acid according to (23) into a cell.
(25) An antibody that specifically binds to the protein according to any one of (1) to (8) and neutralizes the function or biological activity of the protein.
(26) A method for suppressing the function or biological activity of the protein according to any one of (1) to (8), which comprises bringing the antibody according to (25) into contact with a cell.
(27) A method for identifying a ligand, agonist or antagonist for the protein according to any one of (1) to (8), using the protein according to any one of (1) to (8).
(28) A method for identifying a ligand for the protein according to any one of (1) to (8), comprising the following steps.
(A) contacting the protein with a test compound;
(B) detecting specific binding between the protein and the test compound;
(C) A step of determining the presence or absence or strength of specific binding between the protein and the test compound.
(29) A method for identifying an agonist or antagonist for the protein according to any one of (1) to (8), comprising the following steps.
(A) contacting the protein with a test compound and optionally a ligand;
(B) detecting intracellular signal transduction or G protein activation; and
(C) A step of determining whether or not the test compound has the ability or the ability to induce or suppress intracellular signal transduction or G protein activation.
(30) A method for identifying an agonist or antagonist for the protein according to any one of (1) to (8), comprising the following steps.
(A) contacting the protein with a test compound and optionally a ligand;
(B) Intracellular Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change or K ⁺ Measuring the concentration change of
(C) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress intracellular signaling by measuring the change.
(30) A method for identifying an agonist or antagonist for the protein according to any one of (1) to (8), comprising the following steps.
(A) a step of preparing a membrane fraction from a cell in which a fusion protein of the protein according to any one of (1) to (8) and an α subunit of a G protein belonging to the Gi subfamily is expressed on the cell membrane;
(B) contacting the membrane fraction with detectably labeled GTP or an analog thereof in the presence of a test compound and optionally a ligand;
(C) detecting the binding between the membrane fraction and GTP or an analog thereof by measuring a detectable label;
(D) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress the activation of the G protein by detecting the binding.
(31) A method for identifying an agonist or antagonist for the protein according to any one of (1) to (8), comprising the following steps.
(A) a step of preparing a membrane fraction from a cell in which a fusion protein of the protein according to any one of (1) to (8) and an α subunit of a G protein belonging to the Gi subfamily is expressed on the cell membrane;
(B) contacting the membrane fraction with detectably labeled GTP or an analog thereof in the presence of a test compound and optionally a ligand;
(C) detecting the binding between the membrane fraction and GTP or an analog thereof by measuring a detectable label;
(D) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress the activation of the G protein by detecting the binding.
(32) The protein according to any one of (1) to (8) is in the form of a membrane fraction containing the protein, or in the form of a cell in which the protein is expressed on the cell surface. The method according to any one of (27) to (31).
(33) The method according to (32), wherein the cell in which the protein is expressed on the cell surface is a cell in which a nucleic acid encoding the protein or an expression vector containing the protein is introduced to express the protein.
(34) The method according to any one of (27) to (31), which is used for selection, identification or characterization of a medicine.
(35) The method according to any one of (29) to (31), wherein the ligand is 4-hydroxy-2-nonenal.
(36) A method for producing a pharmaceutical composition, comprising identifying an agonist or antagonist by the method according to any one of (29) to (31), and mixing the agonist or antagonist together with a carrier.
(37) An antagonist identified by the method according to any one of (29) to (31) is brought into contact with a cell to suppress the function or biological activity of a receptor for a lipid peroxidation product in the cell. Method.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2002-113829, which is the basis of the priority of the present application.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the first aspect, the present invention provides the following proteins.
As the first protein, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is provided. Examples of such a protein include those having the amino acid sequence of the receptor protein encoded by the cDNA represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “TG0039 protein”).
The second protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and uses a lipid peroxidation reaction product as a ligand. Provided is a protein having a function or biological activity as a G protein-coupled receptor.
Examples of such proteins include those consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Here, amino acid deletion, substitution or addition may be performed so long as the function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand is not lost, Usually, it is 1 to about 80, preferably 1 to about 60, more preferably 1 to about 45, still more preferably 1 to about 30, and still more preferably 1 to about 15. Specific examples of the protein of the present invention include a protein having one or more conservative amino acid substitutions compared to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Such proteins include mutant proteins found in nature, artificially modified mutant proteins, proteins derived from different organisms, and the like. Accordingly, such proteins include conservative substitution variants and naturally occurring allelic variants of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
The third protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and its entire length of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably Provided is a protein having a homology of about 95% or more of amino acid sequence and having a function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand.
“Homology” is a relationship between two or more proteins (or polynucleotides) determined by comparing sequences, as is known in the art, wherein the protein (or polynucleotide sequence) ) Means the degree of sequence correlation between proteins (or polynucleotide sequences) as determined by the fit between them. “Homology” can be readily determined by methods known in the art. For example, it can be determined using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al.
The various proteins described above are a kind of G protein-coupled receptor, and have a function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand. In the present specification, the lipid peroxidation reaction product means a decomposition product of lipid peroxide and the like, and includes 4-hydroxy-2-nonenal (also known as 4-hydroxynonenal or 4-hydroxynon-2). -Enal, hereinafter referred to as 4-HNE). The protein of the present invention specifically binds to a lipid peroxidation reaction product (such as 4-HNE). These specific bindings stimulate the receptor protein and induce intracellular signaling.
In addition, when the receptor protein of the present invention is stimulated by the above-described substance that specifically binds to the protein, _i Activates G proteins belonging to the subfamily. For example, paying attention to the α subunit of G protein, the receptor protein of the present invention is stimulated by a substance that specifically binds to G protein. _iα (G _i Α subunit of G protein belonging to subfamily, eg G _iα1 ) Into an activated form (a state having GTP binding ability). A signal is transmitted in the cell through activation of the G protein.
Therefore, the protein of the present invention is a receptor for a lipid peroxidation reaction product and has one or more functions or biological activities (i) to (iii) summarized below. This is as described in the examples of the present specification.
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist).
(Iii) G protein activation based on stimulation by a ligand (ligand that acts as an agonist).
Here, examples of the ligand (ligand acting as an agonist) include 4-HNE.
The protein of the present invention may be a peptide derived from a mammal, for example, a non-human animal such as a dog, cow, horse, goat, sheep, monkey, pig, rabbit, rat and mouse, or a human, or a synthetic protein. It may be. Protein synthesis can be performed by conventional methods known in the art.
In the second aspect, the present invention provides a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the protein. More specifically, an isolated nucleic acid comprising any of the following base sequences (a) or (b) is provided.
(A) The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) Function or biological function as a G protein-coupled receptor that hybridizes with a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has a lipid peroxidation reaction product as a ligand An isolated nucleic acid encoding a protein having activity.
SEQ ID NO: 1 represents the base sequence of human-derived cDNA (including the entire translation region) of the TG0039 protein gene (hereinafter referred to as “TG0039 gene”).
Here, “can hybridize under stringent conditions” means that hybridization is usually performed in a hybridization solution having a salt concentration of 6 × SSC or equivalent at a temperature of 50 to 60 ° C. for about 16 hours. Perform preliminary washing with 6 × SSC or a solution with a salt concentration equivalent to this as necessary, and then wash with 1 × SSC or a solution with a salt concentration equivalent to this to perform hybridization. It means that it can be implemented. In addition, “high stringent conditions (conditions having higher stringency)” means that the washing can be performed in a solution having a salt concentration of 0.1 × SSC or equivalent thereto. . The nucleic acid that hybridizes with the TG0039 gene represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions has a function or biological activity as a G protein-coupled receptor receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand. Anything that encodes a protein may be used.
In addition, the nucleic acid of the present invention generally has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the entire length of the translation region, usually about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, more preferably Also included are nucleic acids having 90% or more, more preferably 95% or more homology.
Such genes or nucleic acids as described above include mutant genes discovered in nature or artificially modified, homologous genes derived from different organisms, and the like.
The nucleic acid of the present invention can be isolated and obtained, for example, by identifying a mammalian tissue or cell as a gene source. Mammals include non-human animals such as dogs, cows, horses, goats, sheep, monkeys, pigs, rabbits, rats and mice, as well as humans. Of these, it is desirable to use human-derived ones for use in research and development of human therapeutics.
Moreover, the nucleic acid of the present invention can also be obtained by using the sequence information of the gene represented by SEQ ID NO: 1. For example, a primer or probe is designed based on the sequence information of SEQ ID NO: 1, and a PCR (polymerase chain reaction) method using these, colony hybridization method, plaque hybridization method is appropriately combined and selected from a DNA library can do.
Specifically, cDNA is synthesized from mRNA prepared from mammalian cells and tissues, and a cDNA fragment is obtained by PCR using this as a template. Using the obtained cDNA as a probe, a cDNA library can be identified by colony hybridization method or plaque hybridization method to obtain full-length cDNA. Moreover, a genomic gene can be isolated by identifying a genomic DNA library. In addition, by identifying a DNA library of another mammal, a homologous gene (ortholog) derived from a heterologous organism can be isolated.
DNA libraries such as cDNA libraries and genomic DNA libraries are published in, for example, “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). ). Alternatively, if there is a commercially available library, it may be used.
By determining the base sequence of the obtained cDNA, the translation region encoding the protein of the gene product can be determined, and the amino acid sequence of the acquired protein can be obtained.
The nucleic acid of the present invention obtained as described above encodes a G protein-coupled receptor protein having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, and a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand. It has a body function or biological activity as described in the examples of the present specification.
In the third aspect, the present invention provides a method for producing the protein. The production method comprises preparing a recombinant vector containing the nucleic acid of the present invention, obtaining a cell transformed with the nucleic acid of the present invention or the recombinant vector, culturing the cell, and recovering a protein from the culture. Can be achieved.
Specific examples of the above method include a method of expressing and producing the protein of the present invention by ordinary gene recombination techniques, but it is expressed and produced in the form of a fusion protein with other proteins and peptides. The method of doing is also included.
A cell expressing the protein of the present invention can be obtained, for example, as follows. First, the DNA encoding the protein of the present invention is inserted into a vector in a form linked to the downstream of an appropriate promoter to construct an expression vector. Subsequently, the obtained expression vector is introduced into a host cell.
Examples of the expression system (host-vector system) include bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems. Among them, in order to obtain a protein having a well-preserved function, insect cells (Spodoptera frugiperda SF9, SF21, etc.) and mammalian cells (monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, human HeLa cells, etc.) are used as hosts. It is preferable to use it.
As a promoter for expressing the protein of the present invention, SV40 promoter, LTR promoter, elongation 1α promoter, etc. can be used in mammalian cell systems, and polyhedrin promoter can be used in insect cell systems.
As a vector, a retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector or the like can be used in the case of a mammalian cell system, and a baculovirus vector or the like can be used in the case of an insect cell system.
As the DNA encoding the protein of the present invention used in the above expression system, cDNA corresponding to mRNA existing in nature (for example, one consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) can be used, but is not limited thereto. Not. For example, DNA corresponding to the amino acid sequence of the protein of the present invention can be designed and used. In this case, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid are known, and the selection of codons to be used may be arbitrary. For example, considering the frequency of codon usage of the host used for expression, the expression efficiency can be improved. High arrays can be designed. DNA having the designed base sequence can be obtained by chemical synthesis of DNA, fragmentation and binding of the cDNA, partial modification of the base sequence, and the like. Artificial base sequence partial modification and mutagenesis can be performed by PCR or site-specific mutagenesis (Mark specific et al., Proceedings of National) using primers comprising synthetic oligonucleotides encoding the desired modification. Academy of Sciences, Vol. 81, 5562-5666, 1984).
The protein of the present invention is produced in a culture of cells into which an expression vector as described above has been introduced, and is purified by known purification methods (salting out with inorganic salts, fractional precipitation with an organic solvent, ion exchange resin column chromatography, affinity, etc. Column chromatography, gel filtration method and the like) can be separated and purified.
In a fourth aspect, the present invention provides a method for enhancing the function or biological activity of the protein of the present invention in a cell.
As a method of enhancing, it can be achieved by increasing the expression of the protein of the present invention in cells. Specifically, it can be performed by introducing the recombinant expression vector obtained in the third aspect into cells. In addition, a nucleic acid having a base sequence encoding the protein of the present invention may be directly introduced into a cell using a technique known in the art.
In the fifth aspect, the present invention provides an antisense nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid of the present invention and capable of suppressing the expression of the nucleic acid, and a function as a protein of the present invention using the same. Alternatively, a method for inhibiting biological activity is provided.
For example, an antisense nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid according to any one of claims 9 to 11 of the present invention and capable of suppressing the expression of the nucleic acid is used as a ribozyme or decoy. You can also. In this case, for example, it is preferable to use a nucleotide having a partial sequence of 14 bases or more in succession, or a complementary sequence thereof, of the nucleic acid (sense strand or antisense strand) comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
The antisense nucleic acid can be introduced into a cell and can modulate (for example, suppress) the function or biological activity as the receptor protein of the present invention by modulating the expression of the gene encoding the protein. .
For example, antisense nucleic acids can be introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by DNA transfection methods such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, microinjection method, or the use of gene transfer vectors such as viruses. The function or biological activity as the protein of the present invention can be modulated (for example, suppressed) by introduction using a method known in the art such as. For example, by preparing a vector that expresses the oligonucleotide using an appropriate retroviral vector, and then introducing the expression vector into a cell containing the target nucleic acid sequence by contacting the cell with the cell in vivo or ex vivo. Good.
The gene of the present invention can also be detected by using the oligonucleotide or its complement as a probe.
In the sixth aspect, the present invention relates to an antibody that specifically binds to the protein of the present invention and neutralizes the function or biological activity of the protein, and the function of the protein of the present invention using the antibody. A method of inhibiting biological activity is provided.
The antibody that recognizes and specifically binds to the protein of the present invention is an antigen of the protein of the present invention, or a protein or peptide having immunological equivalence to the protein, such as a synthetic peptide having a fragment or partial sequence of the protein. Can be used as Here, having immunological equivalence means that, for example, a cross-reaction occurs with an antibody against the protein of the present invention. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
Polyclonal antibodies can be produced by the usual method of inoculating a host animal (for example, a rat or rabbit) with an antigen and recovering immune serum. The monoclonal antibody can be produced by a technique such as a normal hybridoma method. In addition, a humanized monoclonal antibody or the like can be prepared by modifying the gene of the monoclonal antibody.
Using the antibody obtained above, the expression of the protein of the present invention in a cell or tissue can be detected by an ordinary immunochemical method (such as immunochemical assay). Alternatively, the protein of the present invention can be purified by affinity chromatography using an antibody.
Moreover, the function or biological activity of the protein of this invention can be suppressed by making the neutralizing antibody of this invention and a cell contact. For example, the neutralizing antibody of the present invention may be combined with an inactive ingredient such as an immunogenic adjuvant or a further active ingredient for therapeutic use, together with stabilizers and excipients, after sterilization by filtration, lyophilized or stable It can be obtained as a stock in a hydrous preparation. When administered to a subject, it can be performed by methods known in the art such as subcutaneous injection, intraarterial injection, intravenous injection and the like. A person skilled in the art can appropriately select an appropriate dose according to the patient and administration method.
As described above, the protein of the present invention has a function or biological activity selected from the following (i), (ii) and (iii).
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand (ligand acting as an agonist).
(Iii) G protein activation based on stimulation by a ligand (ligand that acts as an agonist).
Here, ligands (ligands that act as agonists) include 4-HNE, and intracellular signaling involves Ca. ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change and K ⁺ Change in the density of the liquid crystal.
The protein (receptor) of the present invention specifically binds to a lipid peroxidation reaction product, the protein is stimulated by the binding, the G protein is activated, and signal transduction is induced in the cell through the activation. The
“Activating the G protein and through its activation” means that the G protein is converted into an active form (GTP type) and the α, β and γ subunits constituting the G protein are changed to the α subunit (hereinafter referred to as “G subunit”). Gα) and β / γ subunit complex (hereinafter referred to as Gβγ), which means that Gα controls effectors such as adenylate cyclase and phospholipase C to transmit signals into cells. To do. In addition, examples of Gα include α subunits of G proteins belonging to the Gi subfamily, such as Giα1.
The function or biological activity detection method (i) can be achieved, for example, by performing the following steps.
(A) contacting the protein of the present invention with a detectably labeled ligand;
(B) A step of detecting the presence or absence or strength of specific binding between the protein and the ligand.
Such binding can be detected by, for example, using a ligand with a detectable label (eg, RI label, fluorescent label, etc.) and measuring this label. At that time, specific binding may be detected by a usual competitive assay using a non-labeled ligand mixed with a labeled ligand.
The method of detecting the function or biological activity of (ii) can be achieved, for example, by performing the following steps.
(A) contacting the protein of the present invention with a ligand (a ligand that acts as an agonist);
(B) Intracellular Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change or K ⁺ The process of measuring the concentration change.
Cells that express (or do not express) the proteins of the invention at lower levels are used as controls, and intracellular signaling is greater than that compared to the level of intracellular signaling in such control cells. If the level of is high, it is recognized that it has the function or biological activity of (ii) depending on its level.
For specific methods for detecting intracellular signal transduction, for example, literature [Chen et al., Analytical Biochemistry, Vol. 226, pp. 349-354, 1995 (Ca2 + concentration change, cAMP concentration change); Graminski et al. Biol. Chem. 268, 5957-5964, 1993 (activation of phospholipase C); Method of Sakurai et al., Cell 92, 573-585, 1998 (Ca ²⁺ Concentration change); Method of Hollopeter et al., Nature, 409, 202-207, 2001 (K ⁺ Concentration change); Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 471-476, 1998 (pH change); Hinuma et al., Nature, 393, 272-273, 1998 (arachidonic acid metabolite releasing); JP-A-9-268 Etc.] can be carried out according to the method described in the Japanese Patent Publication.
The method of detecting the function or biological activity of (iii) can be performed, for example, as follows.
(A) a step of preparing a membrane fraction from cells in which a fusion protein of the protein of the present invention and the α subunit of the G protein belonging to the Gi subfamily is expressed on the cell membrane;
(B) contacting the membrane fraction with detectably labeled GTP or an analog thereof in the presence or absence of a ligand (ligand that acts as an agonist);
(C) measuring a detectable label;
(D) detecting the presence or level of binding between the membrane fraction and GTP or an analog thereof by measuring the detectable label;
(E) By comparing the presence or absence or strength of the binding in the presence or absence of a ligand (ligand acting as an agonist), activation of G protein based on stimulation by the ligand (ligand acting as an agonist) is determined. Process.
As the labeled GTP or an analog thereof, for example, a GTP analog that is hardly decomposed such as GTPγS (guanosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)) can be used. If the level of binding in the presence of lipid peroxidation product is higher compared to the level of binding in the absence of lipid peroxidation product, depending on its extent (iii) function or biological It is recognized that there is activity.
Here, the amino acid sequence and base sequence of Giα and its gene are already known [human Giα1 (351Cys → Ile) / Bahia et al., Biochemistry, 37, 11555-11562, 1998: human Giα1. / Genbank / EMBL accession no. AF055013, PIR / SWISS-PROT accession no. P04898: etc.]. Therefore, the DNA encoding Giα can be obtained by using the known sequence information disclosed above, PCR (polymerase chain reaction) method, colony hybridization method) plaque hybridization method, or a combination thereof as appropriate. Can be selected and obtained from the rally. A DNA for expressing the fusion protein can be obtained by binding the DNA encoding Giα downstream of the DNA encoding the polypeptide of the present invention and incorporating it into a vector containing an appropriate promoter. The fusion protein expression vector can be introduced into cells to express the fusion protein.
In a seventh aspect, the present invention provides a method for identifying a ligand for the protein of the present invention.
As used herein, “ligand” means a compound that specifically binds to a receptor protein. Ligand includes both natural and artificially synthesized compounds.
The ligand may include the following agonists or antagonists. Further, the protein of the present invention used in the present method includes a membrane fraction containing the protein or a cell in which the protein is expressed on the cell surface.
Specifically, for example, the ligand can be identified as follows.
(A) contacting the protein of the present invention with a test compound;
(B) detecting specific binding between the protein and the test compound;
(C) A step of determining the presence or absence or strength of the binding ability between the protein and the test compound.
Such specific binding is detected by, for example, a conventional competitive assay method in which a known ligand compound having a detectable label (eg, RI label, fluorescent label, etc.) is mixed with an unlabeled test compound. it can. There are no particular limitations on the test compound, and examples include low-molecular compounds and peptides, and they may be artificially synthesized or naturally occurring. A test compound (ligand) having specific binding ability is likely to be an agonist (agonist or antagonist).
In the eighth aspect, the present invention provides a method for identifying an agonist or antagonist for the protein of the present invention.
Here, the “agonist” means a compound having the ability to stimulate the receptor protein by specifically binding to the receptor protein and induce intracellular signal transduction. In addition, “antagonist” means a compound having the ability to suppress the action of a compound having the ability to stimulate a receptor protein to induce intracellular signal transduction.
Identification of an agonist or antagonist can be performed, for example, as follows.
(A) contacting the protein of the present invention with a test compound and optionally a ligand (preferably a ligand that acts as an agonist);
(B) Intracellular signal transduction (eg, Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change, and K ⁺ Change in the concentration of G) (G) (G ₁ Detecting the activation of a G protein α subunit belonging to the family), and
(C) A step of determining whether or not the test compound has the ability or the ability to induce or suppress intracellular signal transduction or G protein activation.
Specifically, the following method can be implemented.
1. Identification by detection of intracellular signaling
(A) contacting the protein of the present invention with a test compound and optionally a ligand (preferably a ligand that acts as an agonist),
(B) Intracellular Ca ²⁺ Concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change or K ⁺ Measuring the concentration change of
(C) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress intracellular signaling by measuring the change.
2. Identification by detection of G protein activation
(A) a step of preparing a membrane fraction from cells in which a fusion protein of the protein of the present invention and the α subunit of the G protein belonging to the Gi subfamily is expressed on the cell membrane;
(B) contacting the membrane fraction with detectably labeled GTP or an analog thereof in the presence of a test compound and optionally a ligand (preferably a ligand that acts as an agonist);
(C) detecting the binding between the membrane fraction and GTP or an analog thereof by measuring a detectable label;
(D) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress the activation of the G protein by detecting the binding.
Appropriate controls should be taken in determining the ability of the test compound. Such controls include detection and testing in the absence of the test compound, detection and testing using cells that do not express the receptor protein of the present invention or have a lower level of expression of the receptor protein. Can be given. A plurality of these controls may be combined for more accurate determination.
A compound identified as an antagonist by the above method or the like is brought into contact with (a cell expressing the protein of the present invention) to thereby improve the biological function or activity of the receptor of the lipid peroxidation product in the cell. Can be suppressed.
In addition, it is expected that the antagonist for protein koji (receptor of lipid peroxidation reaction product) of the present invention can be used as an active ingredient of a medicine. Therefore, a compound identified as an antagonist for the protein of the present invention (receptor for lipid peroxidation reaction product) by the above-described method or the like can be used for the manufacture of a medicament. In the production of a medicine, it can be mixed with a conventional carrier to produce a pharmaceutical composition, and the composition can be sold as a medicine.
When used as a medicine. The administration method is not particularly limited, and a general oral or parenteral method (oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.) may be applied. If necessary, it may be formulated and used as a conventional pharmaceutical preparation (tablet, granule, capsule, powder, injection, inhalant, etc.) together with an inert carrier according to the administration method. For example, a compound can be used together with an activator or diluent such as a binder, a disintegrant, a bulking agent, a filler, a lubricant, and the like that are acceptable in general medicine, and can be formulated by a conventional method.
The dose varies depending on the administration method, patient age, body weight, and condition, but a general dose, for example, 1 to 300 mg / kg for oral administration per day, or for parenteral administration, It is set in the range of 0.01 to 50 mg / kg.
The protein of the present invention used for identification of a ligand, agonist or antagonist can be used in the form of a membrane fraction containing the protein, or in the form of a cell expressing the protein on the cell surface. .
As a cell expressing the receptor protein or protein on the cell surface, a cell in which the receptor protein or protein is overexpressed can be used. For example, a cell encoding the receptor protein or protein is used. Cells into which a recombinant vector containing a nucleic acid has been introduced can be used.
As a host cell into which the recombinant vector is introduced, cells (mammalian cells, insect cells, etc.) that can express the foreign receptor protein on the cell membrane without impairing its function can be used. In addition, as a host cell, it is desirable to use a cell that does not express the target receptor protein or protein, or that is expressed only at a low level, before introducing the recombinant vector.
The membrane fraction containing the protein is obtained by crushing the protein or cells expressing the protein, and then using a fractionation method utilizing centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method, Can be prepared. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (about 500 to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (about 15000 to 30000 rpm) for about 30 to 120 minutes. Then, the obtained precipitate fraction is used as a membrane fraction.
Since the ligand, agonist and antagonist compounds of the present invention have the action of inducing or suppressing the activation of G protein-coupled receptors having lipid peroxidation reaction products as ligands, G proteins having lipid peroxidation reaction products as ligands It can be an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with the function or biological activity of a conjugated receptor.
In a ninth aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with the function or biological activity of a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand.
As a process for obtaining a pharmaceutical composition containing the compound obtained by the eighth aspect as an active ingredient, it can be formulated by the following conventional method. For example, an effective amount of a compound identified as a ligand, agonist or antagonist, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmacologically acceptable carrier are mixed. Then, it is set as the dosage form according to a dosage form. The dosage form of the pharmaceutical composition used in the present invention includes oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intraarterial administration, intramedullary administration, intrathecal administration, intraventricular administration, transdermal administration, subcutaneous administration, peritoneal administration. Examples include, but are not limited to, internal administration, nasal mucosal administration, enteral administration, topical administration, sublingual administration, or rectal administration.
Compositions used for oral administration include solid dosage forms such as tablets, granules, capsules, pills, and powders, and liquid dosage forms such as solutions, syrups, elixirs, and suspensions. When used for parenteral administration, dosage forms such as sterile solutions, suspensions and emulsions are included. Examples of the carrier include sugars, starches, fatty acids, talc, vegetable oils, gums, glycols, physiological saline, buffered saline, and the like.
Hereinafter, a ligand (agonist) of a G protein-coupled receptor protein having the lipid peroxidation reaction product of the present invention as a ligand, confirmed by the above identification method of the present invention, 4-HNE (4-hydroxy-2- (Nonenal) will be explained.
4-HNE, which is an agonist of the protein (receptor) of the present invention, is known to be produced in vivo as a lipid peroxidation product when the organism is subjected to oxidative stress (Esterbauer, H.,). et al., Free Radical Biology & Medicine, 11: 81-128, 1991).
And 4-HNE and other lipid peroxidation reaction products are, for example, the following diseases, aging (Stadtman, ER, Science, 257: 1212-1224, 1992), arteriosclerosis (Palinski, W., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1371-2376, 1989), Parkinson's disease (Yoritaka, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2696-2701, 1996). Alzheimer's disease (Mark, RJ, et al., J. Neurochem., 68: 255-264, 1997; Kruman, I., et al., J. Neurosci., 17: 5089-5100, 1997). It is reported that it is related to etc.
Accordingly, the pharmaceutical composition containing the protein (receptor) agonist, antagonist, antibody, etc. of the present invention obtained by the above identification method as an active ingredient is used for diseases such as aging, arteriosclerosis, Parkinson's disease or Alzheimer's disease. Expected to be effective for treatment or prevention.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, these Examples do not restrict | limit this invention.
In the following examples, unless otherwise specified, each operation is “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Published in the year), or when using commercially available reagents and kits, they were used according to the instructions for commercial products.
[Example 1] Isolation of cDNA of human TG0039 gene
(1) Human purine receptors P2Y5 (PIR / SWISS-PROT accession no. P43657), P2Y7 (PIR / SWISS-PROT accession no. Q15722) and P2Y9 (PIR / SWISS-PROT accession no. And a search for NCBI (National Center for Biotechnology Information) human EST database using tblastn (Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) as a homology search method. Went. As a result, “IMAGE; 682942” (GenBank / EMBL accession no. AA210739) was found as an EST clone having high homology. It was estimated that there was one large open reading frame in the base sequence of this EST clone.
Next, a blastn search (Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) was performed on the NCBI human genome database using the AA210739 sequence. From the nucleotide sequence, it was found to be a part of the sequence (GenBank / EMBL accession no. AF000545) that is estimated to encode the human G protein-coupled receptor gene.
(2) Primers were designed based on the AF000545 base sequence information obtained in (1) above, and cDNA containing the entire translation region was obtained by polymerase chain reaction (PCR). PCR was performed as follows.
As a PCR template, human genomic DNA (trade name “Human Genomic DNA”; manufactured by Clontech) was used. An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used as the sense primer, and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was used as the antisense primer. These primers are designed so that DNA fragments with restriction enzyme recognition sites (KpnI site and HindIII site) added to both ends of the PCR product can be obtained.
A PCR reaction solution (50 μl) containing these primers and template DNA was prepared, and PCR [conditions: 95 ° C. 1 minute, (95 ° C. 30 seconds → 66 ° C. 3 minutes) × 35 times, 66 ° C. 3 minutes] ] Was carried out.
PCR reaction solution composition:
Template DNA 1 μl
40 μl of sterilized water
Buffer solution for PCR (Advantage 2 PCR Buffer, Clontech) 5 μl
Deoxynucleotide solution (dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 10 mM each) 1 μl
Polymerase solution (Advantage 2 Polymerase Mix, manufactured by Clontech) 1 μl
1 μl of sense primer (10 μM)
Antisense primer (10 μM) 1 μl
The obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, the band was cut out, and a cDNA fragment of about 1,000 bp was purified and obtained. This was linked to a vector plasmid (pGEM-T Easy, manufactured by Promega), and the nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using the resulting plasmid. The nucleotide sequence was determined by the dideoxy method (Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit, manufactured by USB) using an automatic DNA sequencer (Li-COR LIC-4200L (S) -2 DNA analysis system, manufactured by Aloka). As a result, the base sequence (1,038 bp) shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. The G protein-coupled receptor gene presumed to be encoded by this base sequence was designated as TG0039 gene. The base sequence of the cloned TG0039 gene was determined from GenBank / EMBL accession no. When compared with the base sequence of AF000545, a single base difference was observed, which was thought to be due to genetic polymorphism or PCR error.
The amino acid sequence (339 amino acid residues) corresponding to the base sequence of the TG0039 gene represented by SEQ ID NO: 1 thus obtained was as shown in SEQ ID NO: 2. As a result of predicting the transmembrane region by SOSUI for the amino acid represented by SEQ ID NO: 2, a 7-transmembrane region characteristic of the G protein-coupled receptor was estimated.
FIG. 1 shows the transmembrane region (underlined part) together with the base sequence of the TG0039 gene and the amino acid sequence corresponding to the sequence.
[Example 2] Expression distribution of TG0039 gene
The expression distribution of the TG0039 gene in various human tissues and cells was examined by dot blot analysis. The dot blot was performed using human tissue-derived and human cultured cell-derived mRNA (dots on a nylon membrane) (Multiple Tissue Expression Array, manufactured by Clontech) and an RI-labeled probe. On the membrane, various human tissue-derived and human cultured cell-derived mRNAs [poly (A) RNA] shown in FIG. 2 are adsorbed and immobilized.
The RI-labeled probe used was prepared as follows. That is, PCR was carried out using the plasmid containing the cDNA fragment obtained in (2) of Example 1 as a template. At that time, synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were used as the sense primer and the antisense primer, respectively. About 560 bp DNA fragment (cDNA fragment containing the translation region of TG0039 gene) was purified and obtained from the obtained PCR product by agarose gel electrophoresis. Using this cDNA fragment as a template, a labeling kit (Prime-a-Gene Labeling Prosymsing Prosthesis), including a random primer (random hexanucleonucleotides), a nucleotide mixture (dATP, dGTP and dTTP) and DNA polymerase I (Large (Klenow) Fragment) Manufactured) and [α-32P] dCTP, followed by purification by gel filtration to prepare an RI-labeled probe.
Hybridization of the dot blot was performed as follows. The membrane on which the mRNA was immobilized was treated with 160 μl of Solution I [Salmon Tests DNA (9.4 μg / μl: manufactured by SIGMA) at 97 ° C. for 5 minutes, cooled in ice, and then at 60 ° C. Express Hybridization Solution (Clontech). (Prepared by adding 15 ml), and pre-incubating at 68 ° C. for 30 minutes. Subsequently, this membrane was treated with a labeled probe-containing hybridization solution [20 μl of the RI-labeled probe, 30 μl of human COT-1 DNA (1 μg / μl: manufactured by Roche), 16 μl of Salmon Testes DNA (9.4 μg / μl: manufactured by SIGMA). , 20 × SSC (3 M sodium chloride, 300 mM sodium citrate, pH 7.0) 50 μl and Nuclease Free H20 (Promega) 84 μl were prepared to prepare a 200 μl solution, which was treated at 97 ° C. for 5 minutes. Incubated at 68 ° C. for 30 minutes, and further prepared by adding 5 ml of the above solution I], the mixture was hybridized at 65 ° C. for 12 hours. Subsequently, the membrane was pre-washed with 2 × SSC (300 mM sodium chloride, 30 mM sodium citrate, pH 7.0) containing 1% SDS at 65 ° C. for 20 minutes, 5 times, and then 0.5%. The plate was washed twice with 0.1 × SSC (15 mM sodium chloride, 1.5 mM sodium citrate, pH 7.0) containing SDS at 55 ° C. for 20 minutes.
FIG. 2 shows the results of detection of hybridization signals using an image analyzer (Bio-imaging Analysis System 2000, manufactured by Fuji Film). As is clear from FIG. 2, strong signals were seen in mRNAs derived from lymph nodes, peripheral blood leukocytes, spleen, appendix, ileum, thymus, lung and Daudi cells. From these results, the TG0039 gene was considered to be relatively highly expressed in lymph nodes, peripheral blood leukocytes, spleen, appendix, ileocecum, thymus, lung, and Daudi cells.
[Example 3] Ligand identification of TG0039 protein
The TG0039 protein was estimated to be a G protein-coupled receptor from the results of Example 1 above. Thus, using a membrane fraction containing a fusion protein of TG0039 protein and G protein, ligand-dependent binding to GTPγS (guanosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)) is detected as follows. [Wenzel-Seifert et al., Mol. Pharmacol. 58, 954-966, 2000; Bahia et al., Biochemistry, 37, 11555-11562, 1998].
(1) Preparation of plasmid for expressing fusion protein
Hereinafter, TG0039 protein and G protein [G _iα1 (351Cys → Ile), G _qα Or G _sαL A plasmid for expressing the fusion protein was prepared. A schematic diagram of the fusion protein is shown in FIG. Where G _iα1 (351Cys → Ile) is G _iα1 Mutant G obtained by converting 351st cysteine residue of protein to isoleucine residue _iα1 Means protein.
(B) Preparation of TG0039 gene cDNA
PCR was performed using the plasmid containing the TG0039 gene cDNA (including the entire translation region) obtained in Example (2) of Example 1 as a template. At that time, synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were used as the sense primer and the antisense primer, respectively. These primers were designed based on the cDNA base sequence (SEQ ID NO: 1) of the TG0039 gene. The PCR product contains a cDNA encoding the full length of the TG0039 protein (excluding the stop codon) and recognizes restriction enzymes at both ends. It is designed to obtain a DNA fragment to which a site (XhoI site at the N-terminus and CpoI and HindIII sites at the C-terminus) is added.
The PCR product thus obtained was ligated to a vector plasmid (vector system for PCR product cloning) (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega), and the resulting plasmid was treated with restriction enzymes NotI and CpoI. An approximately 1,000 bp DNA fragment was recovered.
(B) G protein (G _iα1 Preparation of plasmid for fusion protein expression with (351Cys → Ile))
PCR was performed using cDNA derived from human brain (Marathon-Ready cDNA Brain, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _iα1-1 ) And antisense primer (primer G _iα1-2 ) Were used synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.
These primers are G _iα1 Designed based on the known base sequence of cDNA encoding protein (Genbank / EMBL accession no. AF055013). _iα1 It is designed to obtain cDNA that encodes the full length of the protein.
Subsequently, a second PCR was performed using the product obtained by the PCR as a template. At that time, sense primer (primer G _iα1-3 ) And antisense primer (primer G _iα1-4 ), Synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were used.
These primers can be used as PCR products as G _iα1 (351Cys → Ile) (G _iα1 Mutant G in which the 351st cysteine residue of the protein is replaced with an isoleucine residue _iα1 It is designed so as to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full length of (protein) and having restriction enzyme recognition sites (CpoI site and BamHI site) added to both ends thereof.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). The obtained plasmid was treated with restriction enzymes NotI and BamHI, and the resulting DNA fragment of about 1,100 bp was inserted into the NotI / BamHI site of baculovirus vector plasmid pVL1392 (manufactured by Pharmingen) to obtain plasmid pVL1392 / G _iα1 (351 Cys → Ile) was obtained.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid, and the fusion protein expression plasmid pVL1392 / TG0039-G _iα1 (351 Cys → Ile) was obtained.
(C) G protein (G _qα Of plasmid for fusion protein expression with
PCR was performed using human prostate-derived cDNA (Marathon-Ready cDNA Prostate, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _qα-1 ) And antisense primer (primer G _qα-2 ), Synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 were used. These primers are G _qα Designed based on the known nucleotide sequence (Genbank / EMBL accession no. U43083) of cDNA encoding _qα It is designed so that cDNA encoding the full length of can be obtained.
Subsequently, a second PCR was performed using the product obtained by the PCR as a template. At that time, sense primer (primer G _qα-3 ) And antisense primer (primer G _qα-4 ), Synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 were used. These primers can be used as PCR products as G _qα It is designed to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full length of, and to which restriction enzyme recognition sites (CpoI site and BamHI site) are added at both ends.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). The obtained plasmid was treated with restriction enzymes NotI and BamHI, and the resulting DNA fragment of about 1,100 bp was inserted into the NotI / BamHI site of baculovirus vector plasmid pVL1392 to obtain plasmid pVL1392 / Gqα.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid, and the fusion protein expression plasmid pVL1392 / TG0039-G _qα Got.
(D) G protein (G _sαL Of plasmid for fusion protein expression with
PCR was carried out using human bone marrow-derived cDNA (Marathon-Ready cDNA Bone marlow, manufactured by Clontech) as a template. At that time, sense primer (primer G _sαL-1 ) And antisense primer (primer G _sαL-2 ) Were used synthetic oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively.
These primers are G _sαL Designed based on the known nucleotide sequence of cDNA encoding (Genbank / EMBL accession no. X04408), _sαL It is designed to obtain a DNA fragment containing a cDNA encoding the full-length of DNA and having restriction enzyme recognition sites (CpoI site and XbaI site) added to both ends thereof.
The obtained PCR product was ligated to a vector plasmid (pGEM-T Easy Vector, manufactured by Promega). The obtained plasmid was treated with restriction enzymes NotI and XbaI, and the resulting DNA fragment of about 1,200 bp was inserted into the NotI / XbaI site of baculovirus vector plasmid pVL1392 (manufactured by Pharmingen) to obtain plasmid pVL1392 / G _sαL Got.
The DNA fragment obtained in (a) above was inserted into the restriction enzyme NotI / CpoI site of this plasmid, and the fusion protein expression plasmid pVL1392 / TG0039-G _sαL Got.
(2) Preparation of membrane fraction containing fusion protein
As shown in FIG. 3 (schematic diagram), the three expression plasmids obtained in (b) to (d) of (1) are linked to a linker sequence (-Gly added to the C-terminus of the TG0039 protein. TG0039 protein (full length) and G protein [G _iα1 (351Cys → Ile), G _qα Or G _sαL ] Is a plasmid that expresses a fusion protein having a structure linked to each other.
Plasmid pVL1392 / TG0039-G for expression of these fusion proteins _iα1 (351Cys → Ile), pVL1392 / TG0039-G _qα Or pVL1392 / TG0039-G _sαL Was expressed in insect cells as follows, and a membrane fraction containing the fusion protein was prepared.
First, 1.5 ml of a medium [10% fetal calf serum, 0.1 mg] was prepared so that the insect cell Sf9 (Spodoptera frugiperda SF9) (manufactured by Farmingen) was about 60% confluent in a collagen-coated 3 cm petri dish. / Ml streptomycin, and Grace's Insect Cell Culture Medium (pH 6.2: manufactured by Lifetech Oriental) containing 100 units / ml penicillin] was incubated at 27 ° C. for 15 minutes.
The medium was removed, 375 μl of transfection buffer (Transfection Buffer A, manufactured by Pharmingen) was added, and then a DNA solution prepared in advance (1 μg of plasmid for fusion protein expression, Linearized BaculoGold Baculovirus DNA (Farmingen) (Made by Co., Ltd.) 0.125 μg, mixed in 25 μl of sterilized water, incubated at 25 ° C. for 15 minutes, and then added with 375 μl of Transfection Buffer B (manufactured by Pharmingen)].
After culturing this at 27 ° C. for 4 hours, the culture solution was removed, 1.2 ml of medium was added, and the mixture was cultured at 27 ° C. for 5 days. The obtained culture solution was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution I.
Sf9 cells were seeded in a collagen-coated 3 cm petri dish so as to be about 30% confluent, and the virus solution I (100 μl) obtained above and 1.2 ml of the medium were added and cultured at 27 ° C. for 4 days. The obtained culture solution was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution II.
Sf9 cells were seeded in a 10 cm Petri dish treated with collagen so as to be about 70% confluent, and the virus solution II (500 μl) obtained above and 12 ml of the medium were added and cultured at 27 ° C. for 4 days. The culture solution thus obtained was centrifuged (1,000 × g, 5 minutes), and the supernatant was recovered as virus solution III.
Sf9 cells were seeded in a 10 cm Petri dish treated with collagen so as to be about 70% confluent, virus solution III (100 μl) obtained above and 12 ml of medium were added, and cultured at 27 ° C. for 4 days. The cells thus obtained were washed with cooled PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4), and then cooled lysis buffer [20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg. / Ml pepstatin, 10 μg / ml leupeptin, and 2 μg / ml aprotinin] was suspended in 3.6 ml, and the cells were disrupted using a Teflon homogenizer. The cell lysate was centrifuged (600 × g, 10 minutes), and the resulting supernatant was further centrifuged (50,000 × g, 20 minutes). The obtained precipitate was suspended in 450 μl of a cooled reaction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride) using a Teflon homogenizer, and a membrane fraction expressing the fusion protein was obtained. Obtained.
(3) Binding test between membrane fraction containing fusion protein and GTPγS
The membrane fraction (450 μl) obtained in (2) above was suspended in a reaction buffer (7.54 ml), and 10 μL of GDP (10 mM) was added thereto. After adding 20 μl of test sample to 160 μl of this solution and incubating at 30 ° C. for 10 minutes, [ ³⁵ 20 μl of S] GTPγS (5 nM, 5 nCi / μl: Amersham Pharmacia Biotech) was added to initiate the reaction. After incubation at 30 ° C. for 1 hour, the reaction was stopped by filtration using a glass filter (UniFilter-96GF / B, Packard). The filter was washed 3 times with 200 μl of chilled reaction buffer and ³⁵ The amount of S] GTPγS (the amount bound to the membrane fraction) was measured by a liquid scintillation measurement method. Measured in this way [ ³⁵ Subtract the amount of non-specific binding (the amount of binding measured in the presence of 10 μM GTPγS) from the amount of S] GTPγS binding, ³⁵ The specific binding amount of S] GTPγS was determined.
About 370 nucleic acids, amino acids, peptide-related compounds, tissue extracts and lipid-related compounds were assayed as test specimens. The result is shown in FIG. TG0039 protein and G _iα1 When a membrane fraction containing a fusion protein with (351Cys → Ile) is used, by adding 4-HNE, the concentration depends on [ ³⁵ The specific binding amount of S] GTPγS increased.
On the other hand, when the membrane fraction containing the fusion protein of TG0039 protein and Gqα is used, and when the membrane fraction containing the fusion protein of TG0039 protein and GsαL is used, the specific binding amount by these compounds is increased. There was no increase.
From these results, it was considered that the TG0039 protein is a G protein-coupled receptor that is coupled to the Giα1 protein. It was also revealed that 4-HNE acts as its agonist (ligand). That is, the TG0039 protein was considered to be a receptor for lipid peroxidation products using 4-HNE as an agonist.
Industrial applicability
The G protein-coupled receptor protein having the lipid peroxidation product of the present invention as a ligand and its gene are useful for studying the mechanism of intracellular signal transduction. In addition, it can be a target molecule of a therapeutic drug for a disease related to a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand.
Furthermore, the method for identification, identification and characterization of an agonist (agonist or antagonist) using the G protein-coupled receptor protein having the lipid peroxidation reaction product of the present invention as a ligand and its gene is used for research and development of new drugs. Useful for.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
Sequence listing free text
Sequence number 3: Synthetic DNA
Sequence number 4: Synthetic DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 6: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 9: synthetic DNA
SEQ ID NO: 10: synthetic DNA
SEQ ID NO: 11: synthetic DNA
SEQ ID NO: 12: synthetic DNA
SEQ ID NO: 13: synthetic DNA
SEQ ID NO: 14: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 15: synthetic DNA
SEQ ID NO: 16: synthetic DNA
Sequence number 17: Synthetic DNA
Sequence number 18: Synthetic DNA
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing the amino acid sequence, base sequence, and presumed seven-transmembrane region (underlined portion) of TG0039 protein.
FIG. 2 is a diagram showing the expression distribution (result of dot blot) of the TG0039 gene in each human tissue or cell. Circles indicate tissues or cells in which gene expression was observed at the mRNA level.
FIG. 3 is a schematic diagram showing an outline of the structure of a fusion protein of the TG0039 protein and various G proteins.
FIG. 4 is a graph showing the influence of 4-HNE on the specific binding amount between GTPγS and a membrane fraction containing a fusion protein of TG0039 protein and various G proteins. The specific binding amount is expressed as a relative value (% of control) with respect to the binding amount at the time when the test substance is not added as a control.
In FIG. 4, “◯ Giα1 (351Cys → Ile)” indicates the test result in the membrane fraction containing the fusion protein of TG0039 protein and Giα1 (351Cys → Ile), and “ΔGqα” indicates the TG0039 protein. The test result in the membrane fraction containing the fusion protein with Gqα is shown, and “□ GsαL” shows the test result in the membrane fraction containing the fusion protein of TG0039 protein and GsαL.

Claims

A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

As a G protein-coupled receptor having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand A protein having the function or biological activity of

Function or organism as a G protein-coupled receptor having a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a protein having a homology of 75% or more of the amino acid sequence over its entire length and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand Protein with biological activity.

The function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand is one or more selected from the following (i), (ii) and (iii): Item 4. The protein according to Item 2 or 3.
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand.
(Iii) Activation of G protein based on stimulation by ligand.

The protein according to any one of claims 2 to 4, wherein the lipid peroxidation reaction product is 4-hydroxy-2-nonenal.

The protein according to any one of claims 1 to 5, which is a recombinant protein.

The protein according to any one of claims 1 to 6, which is a mammalian protein.

The protein according to claim 7, wherein the mammal is a human.

An isolated nucleic acid having a base sequence encoding the protein according to any one of claims 1 to 3.

An isolated nucleic acid having the following base sequence (a) or (b):
(A) The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) G protein-coupled type that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a lipid peroxidation reaction product as a ligand An isolated nucleic acid encoding a protein having a function or biological activity as a receptor.

A function or biological activity as a G protein-coupled receptor having at least 75% homology with the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 over its entire translation region and having a lipid peroxidation product as a ligand An isolated nucleic acid encoding a protein having the same.

The function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand is one or more selected from the following (i), (ii) and (iii): Item 11. The nucleic acid according to Item 10 or 11.
(I) Specific binding to a ligand.
(Ii) Induction of intracellular signal transduction based on stimulation by a ligand.
(Iii) Activation of G protein based on stimulation by ligand.

The nucleic acid according to any one of claims 10 to 12, wherein the lipid peroxidation reaction product is 4-hydroxy-2-nonenal.

The nucleic acid according to any one of claims 9 to 13, which is DNA.

The nucleic acid according to any one of claims 9 to 14, which is a mammalian nucleic acid.

16. The nucleic acid according to claim 15, wherein the mammal is a human.

A recombinant vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 9 to 16.

A cell transformed with the nucleic acid according to any one of claims 9 to 16, or the recombinant vector according to claim 17.

The cell according to claim 18, wherein the recombinant protein according to claim 6 is expressed on the cell surface.

A polypeptide encoded by the nucleic acid of any one of claims 10-12.

A method for enhancing the function or biological activity in a cell of a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, using the recombinant vector according to claim 17.

A method for producing a protein having a function or biological activity as a G protein-coupled receptor having a lipid peroxidation reaction product as a ligand, comprising the following steps:
(A) a step of culturing the cell according to claim 18 or 19,
(B) A step of recovering the protein from the culture.

The antisense nucleic acid which has a base sequence complementary to the nucleic acid of any one of Claims 9-11, and can suppress the expression of this nucleic acid.

The method of suppressing the function or biological activity of the protein of any one of Claims 1-3 which consists of introduce | transducing the antisense nucleic acid of Claim 23 to a cell.

An antibody that specifically binds to the protein according to any one of claims 1 to 8, and neutralizes the function or biological activity of the protein.

The method of suppressing the function or biological activity of the protein of any one of Claims 1-8 which comprises making the antibody of Claim 25 and a cell contact.

A method for identifying a ligand, agonist or antagonist for the protein according to any one of claims 1 to 8, using the protein according to any one of claims 1 to 8.

The method to identify the ligand with respect to the protein of any one of Claims 1-8 including the following process.
(A) contacting the protein with a test compound;
(B) detecting specific binding between the protein and the test compound;
(C) A step of determining the presence or absence or strength of specific binding between the protein and the test compound.

The method to identify the agonist or antagonist with respect to the protein of any one of Claims 1-8 including the following process.
(A) contacting the protein with a test compound and optionally a ligand;
(B) detecting intracellular signal transduction or G protein activation, and (C) determining whether or not the test compound has the ability to induce or suppress intracellular signal transduction or G protein activation. Process.

The method to identify the agonist or antagonist with respect to the protein of any one of Claims 1-8 including the following process.
(A) contacting the protein with a test compound and optionally a ligand;
(B) a step of measuring intracellular Ca ²⁺ concentration change, cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change or K ⁺ concentration change,
(C) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress intracellular signaling by measuring the change.

The method to identify the agonist or antagonist with respect to the protein of any one of Claims 1-8 including the following process.
(A) a step of preparing a membrane fraction from a cell in which a fusion protein of the protein according to any one of claims 1 to 8 and an α subunit of a G protein belonging to the Gi subfamily is expressed on the cell membrane;
(B) contacting the membrane fraction with detectably labeled GTP or an analog thereof in the presence of a test compound and optionally a ligand;
(C) detecting the binding between the membrane fraction and GTP or an analog thereof by measuring a detectable label;
(D) A step of determining the presence or strength of the ability of the test compound to induce or suppress the activation of the G protein by detecting the binding.

The protein according to any one of claims 1 to 8, wherein the protein is in the form of a membrane fraction containing the protein, or in the form of a cell in which the protein is expressed on the cell surface. The method according to any one of 27 to 31.

The method according to claim 32, wherein the cell in which the protein is expressed on the cell surface is a cell in which the protein is expressed by introducing a nucleic acid encoding the protein or an expression vector containing the nucleic acid.

32. The method according to any one of claims 27 to 31, wherein the method is used for selection, identification or characterization of a medicament.

32. A method according to any one of claims 29 to 31, wherein the ligand is 4-hydroxy-2-nonenal.

A method for producing a pharmaceutical composition, comprising identifying an agonist or antagonist by the method according to any one of claims 29 to 31, and mixing the agonist or antagonist together with a carrier.

32. A method of inhibiting the function or biological activity of a receptor for a lipid peroxidation product in a cell by bringing the antagonist identified by the method according to any one of claims 29 to 31 into contact with the cell.