JP3892497B2

JP3892497B2 - Method for producing eicosapentaenoic acid ester

Info

Publication number: JP3892497B2
Application number: JP16473396A
Authority: JP
Inventors: 雅生中楯; 陽一赤塚; 真由美香島; 宏樹栗山; 孝夫牧野
Original assignee: タマ生化学株式会社
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2016-06-25
Also published as: JPH107618A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
魚油等の天然油脂にはエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという）が含まれている。これらの油脂からエイコサペンタエン酸を直接分離するのは困難であるため、油脂を予め低級アルコールでエステル化して脂肪酸エステル混合物とした後、この混合物からＥＰＡをそれらのエステルとして分離する試みがなされている。このような脂肪酸エステル混合物から、エイコサペンタエン酸のエステルを濃縮する方法として、尿素付加−蒸留法（特開昭57-187397 号公報）、蒸留−尿素付加法（特開昭58-8037 号公報）、蒸留−吸着樹脂法（特開平2-258742号公報）、硝酸銀法（特開平4-103558号公報）などが提案されている。しかし、尿素付加−蒸留法によれば飽和の脂肪酸は除去できるが、オクタデカテトラエン酸（数字記号 18:4 ）、アラキドン酸（数字記号 20:4ω6 ）、エイコサテトラエン酸（数字記号 20:4ω3 ）等のＥＰＡ以外の高度不飽和脂肪酸のエステルが多量に残留するという問題がある。蒸留−尿素付加法によれば、長時間高真空および高温にする必要があるために、高温加熱によって重合物が増加したり、二重結合の異性化が生ずる等の問題がある。また、蒸留−吸着樹脂法によれば、蒸留工程でＥＰＡ含量を60重量％以上にしておかないと吸着樹脂処理工程での操作が煩雑になり、しかも収率が低下する等の問題がある。さらに硝酸銀法においては銀化合物の回収が困難であることなど、工業的見地からの問題が多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＥＰＡ低級アルコールエステルおよびそれ以外の高度不飽和脂肪酸低級アルコールエステルを含む脂肪酸低級アルコールエステル混合物からＥＰＡ低級アルコールエステルを製造する方法であって、蒸留時間の短縮により脂肪酸の変性を抑制し、オクタデカテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸等の高度不飽和脂肪酸低級アルコールエステルを除去して、効率よく選択的に高純度のＥＰＡ低級アルコールエステルを製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵素法を主体として蒸留法、尿素付加法および吸着樹脂法を組み合わせることにより、効率良くＥＰＡ低級アルコールエステルを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明は、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む脂肪酸低級アルコールエステル混合物を真空蒸留してエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む留分を採取し、該留分を尿素処理することによりエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを濃縮し、次いでその濃縮物を微生物由来のリパーゼおよび界面活性剤と混合して加水分解処理し、続いてその処理物をスチレンジビニルベンゼン重合体を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において原料となる脂肪酸低級アルコールエステル混合物は、ＥＰＡをグリセリドとして含有する油脂を低級アルコールでエステル化したものである。脂肪酸低級アルコールエステル混合物は、油脂に、例えば、水酸化カリウム等の塩基性化合物や硫酸等の酸性化合物の低級アルコール溶液を添加して反応させ、次いで水洗によりグリセリンを除去することにより得られる。油脂としては、ＥＰＡグリセリドの含有割合が高い油脂（例えば、15重量％以上）が好ましい。ＥＰＡグリセリドの含有割合が高い油脂としてはイワシ油、オキアミ油等の魚油が挙げられる。油脂をエステル化する低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
【０００７】
次に上記原料を真空蒸留して、ＥＰＡ低級アルコールエステル留分を採取する。真空蒸留により、原料に含まれる酵素反応の効率を低下させる低級脂肪酸低級アルコールエステルが除かれる。真空蒸留における圧力は、２Torr以下、好ましくは 0.5Torr以下である。また、真空蒸留は、 140〜190 ℃の範囲で行うのが好ましい。真空蒸留は、ＥＰＡ低級アルコールエステルの含有割合が好ましくは30〜50重量％、より好ましくは40〜50重量％であり、ドコサヘキサエン酸低級アルコールエステルの含有割合が好ましくは10重量％以下、より好ましくは５重量％以下の留分が得られるまで行う。
【０００８】
真空蒸留後、採取されたＥＰＡ低級アルコールエステルを含む留分を尿素で処理する。尿素処理は、飽和脂肪酸低級アルコールエステルの分離除去のために行うものである。尿素処理は、常法（J. Radell, J. W. Connolly, L. D. Yuhas, J. Org. Chem., 26, 2022(1961))により行うことができる。例えば、尿素を低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール）に50〜60℃で溶解させ、その溶液に上記留分を加えて混合する。この場合、尿素は上記留分１重量部当たり１〜２重量部の範囲で用いるのが好ましい。また、低級アルコールは上記留分１重量部当たり２〜５重量部とするのが好ましい。混合後、尿素処理液を冷却して尿素付加物の結晶を析出させる。冷却温度は低いほうが都合がよく、通常、25℃以下、好ましくは５〜20℃である。析出した尿素付加物を濾別し、濾液を濃縮する。この濾液にヘキサン等の非極性溶媒を加えて抽出を行う。非極性溶媒相を水で洗浄後、該溶媒を留去する。このようにして、ＥＰＡ低級アルコールエステルを含む高度不飽和脂肪酸エステルの濃縮物が得られる。得られた濃縮物中の高度不飽和脂肪酸エステルの含有割合は、通常70重量％以上である。尚、本発明において、高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという）とは、１分子当たり20個以上の炭素原子を有し、３個以上の二重結合を有する脂肪酸をいう。また、該濃縮物中には、通常、ＥＰＡエステルが60重量％以上、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという）エステルが15重量％以下、オクタデカテトラエン酸エステルが５重量％以下、アラキドン酸エステルが５重量％以下、エイコサテトラエン酸エステルが５重量％以下含まれる。
【０００９】
続いて、上記濃縮物をリパーゼおよび界面活性剤と混合して加水分解を行う。この加水分解は、次の工程のスチレン−ジビニルベンゼン重合体を用いたクロマトグラフィーでは除去し難いオクタデカテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸およびＤＨＡの含有割合を低減するためのものである。
【００１０】
前記濃縮物のリパーゼおよび界面活性剤による加水分解処理は、水中で濃縮物、リパーゼおよび界面活性剤を混合することにより行う。これらの混合の順序は特に制限はないが、界面活性剤は予め濃縮物に溶解しておくのが好ましい。加水分解反応は、静置でも進行するが、攪拌下で反応させるとより効率的である。水の添加量は、濃縮物１重量部当たり 0.5〜10重量部が好ましく、２〜５重量部がより好ましい。また、反応は、好ましくはpH 4.0〜9.0 で行う。pH調節には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いると効果的である。反応温度は35〜45℃が好ましい。また、リパーゼによる加水分解性を高めるため、塩化カルシウム、水酸化カルシウム等のカルシウム塩の添加が効果的である。カルシウム塩の添加量は、濃縮物１重量部当たり、0.02〜0.1 重量部が好ましい。
【００１１】
リパーゼとしては、市販のもの（例えば、商品名リパーゼＱＬ、名糖産業社製）を用いることができ、例えば、キャンディダ属、リゾプス属、ムコール属、またはアルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼが挙げられる。本発明においては、特に、アルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼが効率よく使用できる点で好ましい。リパーゼの添加量は、脂肪酸エステルの加水分解活性の単位Ｕ（ユニット）で示した場合、濃縮物１ｇ当たり１〜7500Ｕが好ましく、 200〜2000Ｕがより好ましい。
【００１２】
界面活性剤は、反応の促進及び選択性向上のために添加される。界面活性剤としては、エーテル型、エステル型、アミノ酸型誘導体等の界面活性剤が挙げられる。エーテル型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等が挙げられる。エステル型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等が挙げられる。アミノ酸誘導体型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレングリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル等が挙げられる。これらの中で好ましいものは、ＥＰＡ低級アルコールエステル以外の脂肪酸低級アルコールエステルへの酵素の選択性がさらに期待できるという点で、ポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。界面活性剤の添加量は、濃縮物１重量部当たり0.01〜0.2 重量部が好ましく、0.03〜0.1 重量部がより好ましい。
【００１３】
加水分解反応終了後、常法にしたがって脱酸を行うことによりＰＵＦＡ低級アルコールエステル含有割合の高い処理物が得られる。該処理物中のＰＵＦＡエステル含有割合は、通常、90重量％以上である。また、この処理物中には、通常、ＥＰＡエステルが70重量％以上、ＤＨＡエステルが15重量％以下、オクタデカテトラエン酸エステルが１重量％以下、エイコサテトラエン酸エステルが３重量％以下、アラキドン酸エステルが３重量％以下含まれる。
【００１４】
得られた加水分解処理物を、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体である非極性多孔性ポリマーを素材とする吸着樹脂を担体として充填したクロマトグラフィーのカラムに負荷し処理を行う。
吸着樹脂としては、市販のものを使用することができ、例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオンHP-20 、HP-20SS 、MCIGELCHP-20P 、セパビーズ SP-20SS、SP-825、SP-850、およびSP-207、並びにロームアンドハース社製のアンバーライト XAD-4等が挙げられる。
【００１５】
溶離剤としては、水を１〜50容量％含有した親水性極性溶媒またはこの親水性極性溶媒を非極性溶媒で飽和させたものを用いる。親水性極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メチルエチルケトンおよびホルムアミドが好ましいが、沸点が低いこと、価格が安いこと、極性が大きいことなどからメタノールを使用することがより好ましい。非極性溶媒としては、例えば、n-ヘキサン、n-ペンタン、n-ヘプタン、n-オクタン、イソオクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、メチルエーテル、エチルエーテル、トルエンなど挙げられるが、成分分離、沸点が低いことなどからn-ヘキサンおよびn-ペンタンが好ましい。
【００１６】
このカラムクロマトグラフィー処理により、純度の高いＥＰＡ低級アルコールエステルが得られる。このＥＰＡエステルの純度は、通常、90重量％以上である。また、このＥＰＡエステルに不純物として含まれるＤＨＡエステルの含有割合はほぼ０重量％であり、エイコサテトラエン酸エステルの含有割合は３重量％以下であり、アラキドン酸エステルの含有割合は３重量％以下であり、オクタデカテトラエン酸エステルの含有割合は１重量％以下である。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
〔実施例１〕
(1) 原料の調製
イワシ油１kgに１％水酸化カリウム／エタノール溶液１Ｌを加え、窒素気流中40℃で30分間攪拌した。次いで２％硫酸／エタノール溶液を添加して中和した。その後エタノールを留去して、濃縮物を温水で洗浄した。このようにして脂肪酸エチルエステル混合物1.05kgが得られた。この混合物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００１９】
(2) 真空蒸留
上記工程(1) で調製した脂肪酸エチルエステル混合物をディクソンパッキング（東京特殊金網株式会社製）の入った充填塔を装着した蒸留器を用いて、平均蒸留温度 170℃、平均操作圧力 0.4Torrで真空蒸留した。このようにしてＥＰＡエチルエステル含有脂肪酸エチルエステル留分30ｇが得られた。この留分には、ＥＰＡエチルエステル35.5重量％、ＤＨＡエチルエステル 8.0重量％が含まれていた。この留分の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２０】
(3) 尿素処理
上記工程(2) で得られた留分を、メタノール 1.5Ｌに尿素 450ｇを溶解させた溶液（50〜60℃）に滴下し、その後20℃まで冷却した。次いで、析出した尿素付加体を濾別し、濾液を濃縮した。濃縮物にヘキサン１Ｌを加えて抽出を行った後、温水で洗浄した。次いでヘキサン相を濃縮した。このようにしてＰＵＦＡエチルエステル濃縮物 150ｇが得られた。この濃縮物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２１】
(4) リパーゼおよび界面活性剤処理
上記工程(3) で得られた濃縮物にポリオキシエチレンラウリルエーテルを９ｇ添加して溶解した。その溶液を、蒸留水 450mlに塩化カルシウム12ｇおよびアルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼ（名糖産業社製） 150,000 Uを溶解した水溶液と混合し、40℃で14時間反応させて加水分解を行った。次いで、反応液にヘキサン 500ml及び５％水酸化ナトリウム水溶液 200mlを添加、攪拌し、静置後下層を除去し、上層を水洗して濃縮した。このようにして、ＰＵＦＡエチルエステル処理物 105ｇが得られた。この処理物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２２】
(5) カラムクロマトグラフィーによる精製
上記工程(4) で得られたＰＵＦＡエチルエステル処理物を、吸着樹脂であるスチレンジビニルベンゼン重合体HP-20SS （三菱化学製） 2.5Ｌが充填されたカラムに負荷した。溶離剤としては、メタノールと水の混合溶媒（メタノール：水＝９：１）を用いた。ＥＰＡエチルエステル画分を採取し、溶離剤を除去した。このようにして、ＥＰＡエチルエステル精製物41ｇが得られた。この精製物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２３】
〔比較例１〕
工程(4) を行わなかった以外は実施例１と同様の方法でＰＵＦＡエチルエステル精製物23ｇを得た。工程(1) 、(2) 、(3) および(5) における、各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度のＥＰＡ低級アルコールエステルを製造することができ、しかも効率的かつ選択的に製造することができるので生産性が向上する。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a process for producing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester.
[0002]
[Prior art]
Natural fats and oils such as fish oil contain eicosapentaenoic acid (hereinafter referred to as EPA). Since it is difficult to separate eicosapentaenoic acid directly from these fats and oils, attempts have been made to separate EPA from these mixtures after esterifying the fats and oils beforehand with a lower alcohol to form a fatty acid ester mixture. . As a method for concentrating an ester of eicosapentaenoic acid from such a fatty acid ester mixture, urea addition-distillation method (Japanese Patent Laid-Open No. 57-187397), distillation-urea addition method (Japanese Patent Laid-Open No. 58-8037) The distillation-adsorption resin method (JP-A-2-258742) and the silver nitrate method (JP-A-4-103558) have been proposed. However, the urea addition-distillation method can remove saturated fatty acids, but octadecatetraenoic acid (numeric symbol 18: 4), arachidonic acid (numeric symbol 20: 4ω6), eicosatetraenoic acid (numeric symbol 20 : 4ω3) and other highly unsaturated fatty acid esters other than EPA remain. According to the distillation-urea addition method, since it is necessary to maintain a high vacuum and a high temperature for a long time, there are problems such as an increase in a polymer by high temperature heating and isomerization of double bonds. Further, according to the distillation-adsorption resin method, there is a problem that the operation in the adsorption resin treatment process becomes complicated and the yield is lowered unless the EPA content is set to 60% by weight or more in the distillation process. Furthermore, in the silver nitrate method, there are many problems from an industrial point of view, such as difficulty in recovering silver compounds.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is a method for producing an EPA lower alcohol ester from a mixture of fatty acid lower alcohol esters containing EPA lower alcohol ester and other highly unsaturated fatty acid lower alcohol esters, wherein the fatty acid is modified by shortening the distillation time. Provided is a method for efficiently and selectively producing a high-purity EPA lower alcohol ester by suppressing and removing highly unsaturated fatty acid lower alcohol esters such as octadecatetraenoic acid, arachidonic acid, and eicosatetraenoic acid. There is.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have produced an EPA lower alcohol ester efficiently by combining the distillation method, urea addition method, and adsorption resin method mainly using the enzyme method. The present invention has been completed successfully.
[0005]
The present invention relates to an eicosapentaenoic acid lower alcohol obtained by vacuum distillation of a fatty acid lower alcohol ester mixture containing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester, collecting a fraction containing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester, and treating the fraction with urea. The ester is concentrated, and then the concentrate is mixed with a microbial lipase and a surfactant, hydrolyzed, and then the treated product is purified by column chromatography using a styrenedivinylbenzene polymer. And a process for producing a lower alcohol ester of eicosapentaenoic acid.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The fatty acid lower alcohol ester mixture used as a raw material in the present invention is obtained by esterifying an oil containing EPA as a glyceride with a lower alcohol. The fatty acid lower alcohol ester mixture is obtained by adding and reacting a lower alcohol solution of a basic compound such as potassium hydroxide or an acidic compound such as sulfuric acid to the oil and fat, and then removing glycerin by washing with water. As fats and oils, fats and oils with high content of EPA glycerides (for example, 15% by weight or more) are preferable. Examples of oils and fats having a high content of EPA glycerides include fish oils such as sardine oil and krill oil. Examples of lower alcohols that esterify fats and oils include methanol, ethanol, and propanol.
[0007]
Next, the raw material is vacuum distilled to collect an EPA lower alcohol ester fraction. Vacuum distillation removes lower fatty acid and lower alcohol esters that reduce the efficiency of the enzymatic reaction contained in the raw material. The pressure in vacuum distillation is 2 Torr or less, preferably 0.5 Torr or less. Moreover, it is preferable to perform vacuum distillation in the range of 140-190 degreeC. In vacuum distillation, the content of EPA lower alcohol ester is preferably 30 to 50% by weight, more preferably 40 to 50% by weight, and the content of docosahexaenoic acid lower alcohol ester is preferably 10% by weight or less, more preferably Continue until a fraction of 5% by weight or less is obtained.
[0008]
After vacuum distillation, the collected fraction containing EPA lower alcohol ester is treated with urea. The urea treatment is performed for separating and removing the saturated fatty acid lower alcohol ester. The urea treatment can be performed by a conventional method (J. Radell, JW Connolly, LD Yuhas, J. Org. Chem., 26, 2022 (1961)). For example, urea is dissolved in a lower alcohol (eg, methanol, ethanol) at 50 to 60 ° C., and the above fraction is added to the solution and mixed. In this case, urea is preferably used in the range of 1 to 2 parts by weight per 1 part by weight of the fraction. The lower alcohol is preferably 2 to 5 parts by weight per 1 part by weight of the above fraction. After mixing, the urea treatment liquid is cooled to precipitate crystals of the urea adduct. It is convenient that the cooling temperature is low, and it is usually 25 ° C. or lower, preferably 5 to 20 ° C. The precipitated urea adduct is filtered off and the filtrate is concentrated. The filtrate is extracted by adding a nonpolar solvent such as hexane. After washing the nonpolar solvent phase with water, the solvent is distilled off. In this way, a concentrate of highly unsaturated fatty acid ester containing EPA lower alcohol ester is obtained. The content of the highly unsaturated fatty acid ester in the obtained concentrate is usually 70% by weight or more. In the present invention, a highly unsaturated fatty acid (hereinafter referred to as PUFA) refers to a fatty acid having 20 or more carbon atoms per molecule and having 3 or more double bonds. Further, the concentrate usually contains 60% by weight or more of EPA ester, 15% by weight or less of docosahexaenoic acid (hereinafter referred to as DHA), 5% by weight or less of octadecatetraenoic acid ester, and arachidonic acid ester. 5% by weight or less and 5% by weight or less of eicosatetraenoic acid ester are contained.
[0009]
Subsequently, the concentrate is hydrolyzed by mixing with lipase and a surfactant. This hydrolysis is intended to reduce the content of octadecatetraenoic acid, arachidonic acid, eicosatetraenoic acid and DHA, which are difficult to remove by chromatography using a styrene-divinylbenzene polymer in the next step. is there.
[0010]
The hydrolysis treatment of the concentrate with a lipase and a surfactant is performed by mixing the concentrate, the lipase and the surfactant in water. The order of mixing is not particularly limited, but the surfactant is preferably dissolved in the concentrate in advance. The hydrolysis reaction proceeds even when it is allowed to stand, but it is more efficient if the reaction is carried out with stirring. The amount of water added is preferably 0.5 to 10 parts by weight, more preferably 2 to 5 parts by weight per part by weight of the concentrate. The reaction is preferably performed at pH 4.0 to 9.0. For pH adjustment, it is effective to use an aqueous solution of a basic compound such as sodium hydroxide or potassium hydroxide. The reaction temperature is preferably 35 to 45 ° C. Moreover, in order to improve the hydrolyzability by a lipase, addition of calcium salts, such as calcium chloride and calcium hydroxide, is effective. The amount of calcium salt added is preferably 0.02 to 0.1 parts by weight per part by weight of the concentrate.
[0011]
As the lipase, a commercially available product (for example, trade name lipase QL, manufactured by Meisei Sangyo Co., Ltd.) can be used. It is done. In the present invention, a lipase derived from a microorganism belonging to the genus Alkagenes is particularly preferable in that it can be used efficiently. The amount of lipase added is preferably 1 to 7500 U, more preferably 200 to 2000 U, per gram of the concentrate when expressed in units U of fatty acid ester hydrolysis activity.
[0012]
Surfactants are added to accelerate the reaction and improve selectivity. Examples of the surfactant include ether type, ester type, amino acid type derivative and the like. Examples of the ether type surfactant include polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene octyl phenyl ether, and the like. Examples of the ester type surfactant include polyoxyethylene sorbitan monolaurate and polyoxyethylene sorbitan monooleate. Examples of the amino acid derivative-type surfactant include polyoxyethylene glyceryl pyroglutamic acid isostearic acid diester. Among these, polyoxyethylene lauryl ether and polyoxyethylene sorbitan monolaurate are preferable in that the selectivity of the enzyme to fatty acid lower alcohol esters other than EPA lower alcohol esters can be further expected. The addition amount of the surfactant is preferably 0.01 to 0.2 parts by weight, more preferably 0.03 to 0.1 parts by weight per part by weight of the concentrate.
[0013]
After completion of the hydrolysis reaction, a treated product having a high PUFA lower alcohol ester content can be obtained by deoxidization according to a conventional method. The PUFA ester content in the treated product is usually 90% by weight or more. Also, in this treated product, EPA ester is usually 70% by weight or more, DHA ester is 15% by weight or less, octadecatetraenoic acid ester is 1% by weight or less, and eicosatetraenoic acid ester is 3% by weight or less. And 3% by weight or less of arachidonic acid ester.
[0014]
The obtained hydrolyzed product is loaded onto a chromatography column packed with an adsorbent resin made of a nonpolar porous polymer, which is a copolymer of styrene and divinylbenzene, as a carrier.
Commercially available resins can be used as the adsorption resin, for example, Diaion HP-20, HP-20SS, MCIGELCHP-20P, Sepabeads SP-20SS, SP-825, SP-850 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation. , And SP-207, and Amberlite XAD-4 manufactured by Rohm and Haas.
[0015]
As an eluent, a hydrophilic polar solvent containing 1 to 50% by volume of water or a saturated polar solvent with a nonpolar solvent is used. As the hydrophilic polar solvent, for example, methanol, ethanol, propanol, acetone, acetonitrile, dioxane, methyl ethyl ketone, and formamide are preferable. However, methanol is used because of its low boiling point, low price, and high polarity. More preferred. Nonpolar solvents include, for example, n-hexane, n-pentane, n-heptane, n-octane, isooctane, cyclopentane, cyclohexane, methyl ether, ethyl ether, toluene, etc., but component separation and low boiling point From the above, n-hexane and n-pentane are preferred.
[0016]
By this column chromatography treatment, a high purity EPA lower alcohol ester is obtained. The purity of this EPA ester is usually 90% by weight or more. The content of DHA ester contained as an impurity in this EPA ester is almost 0% by weight, the content of eicosatetraenoic acid ester is 3% by weight or less, and the content of arachidonic acid ester is 3% by weight. The content of octadecatetraenoic acid ester is 1% by weight or less.
[0017]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0018]
[Example 1]
(1) Preparation of raw material 1 L of 1% potassium hydroxide / ethanol solution was added to 1 kg of sardine oil, and stirred at 40 ° C. for 30 minutes in a nitrogen stream. Then, 2% sulfuric acid / ethanol solution was added for neutralization. Thereafter, ethanol was distilled off and the concentrate was washed with warm water. In this way, 1.05 kg of a fatty acid ethyl ester mixture was obtained. Table 1 shows the content of each PUFA ester in the mixture.
[0019]
(2) Vacuum distillation The fatty acid ethyl ester mixture prepared in the above step (1) was averaged at an average distillation temperature of 170 ° C using a distiller equipped with a packed tower containing Dixon Packing (manufactured by Tokyo Special Wire Mesh Co., Ltd.). Vacuum distillation was performed at a pressure of 0.4 Torr. In this way, 30 g of an EPA ethyl ester-containing fatty acid ethyl ester fraction was obtained. This fraction contained 35.5% by weight of EPA ethyl ester and 8.0% by weight of DHA ethyl ester. Table 1 shows the content of each PUFA ester in this fraction.
[0020]
(3) Urea treatment The fraction obtained in the above step (2) was added dropwise to a solution (50-60 ° C) in which 450 g of urea was dissolved in 1.5 L of methanol, and then cooled to 20 ° C. Next, the precipitated urea adduct was filtered off, and the filtrate was concentrated. The concentrate was extracted by adding 1 L of hexane, and then washed with warm water. The hexane phase was then concentrated. In this way, 150 g of PUFA ethyl ester concentrate was obtained. Table 1 shows the content of each PUFA ester in the concentrate.
[0021]
(4) Treatment with lipase and surfactant 9 g of polyoxyethylene lauryl ether was added to the concentrate obtained in the above step (3) and dissolved. The solution was mixed with an aqueous solution in which 12 g of calcium chloride and 150,000 U of a microorganism belonging to the genus Alkagenes were dissolved in 450 ml of distilled water and reacted at 40 ° C. for 14 hours for hydrolysis. . Next, 500 ml of hexane and 200 ml of 5% aqueous sodium hydroxide solution were added to the reaction solution, stirred, allowed to stand, the lower layer was removed, and the upper layer was washed with water and concentrated. In this way, 105 g of a PUFA ethyl ester treated product was obtained. Table 1 shows the content of each PUFA ester in the treated product.
[0022]
(5) Purification by column chromatography The PUFA ethyl ester treated product obtained in the above step (4) is loaded onto a column packed with 2.5 L of styrene divinylbenzene polymer HP-20SS (Mitsubishi Chemical) as an adsorbent resin. did. As an eluent, a mixed solvent of methanol and water (methanol: water = 9: 1) was used. The EPA ethyl ester fraction was collected and the eluent was removed. In this way, 41 g of purified EPA ethyl ester was obtained. Table 1 shows the content of each PUFA ester in the purified product.
[0023]
[Comparative Example 1]
23 g of purified PUFA ethyl ester was obtained in the same manner as in Example 1 except that Step (4) was not performed. Table 1 shows the content of each PUFA ester in the steps (1), (2), (3) and (5).
[0024]
[Table 1]

[0025]
【The invention's effect】
According to the present invention, high-purity EPA lower alcohol ester can be produced, and it can be produced efficiently and selectively, so that productivity is improved.

Claims

The fatty acid lower alcohol ester mixture containing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester is vacuum distilled to collect a fraction containing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester, and the fraction is concentrated with euresa pentaenoic acid lower alcohol ester by urea treatment. Then, the concentrate is mixed with a microorganism-derived lipase and a surfactant, hydrolyzed, and then the treated product is purified by column chromatography using a styrenedivinylbenzene polymer. A method for producing icosapentaenoic acid lower alcohol ester.

Vacuum distillation of the fatty acid lower alcohol ester mixture is carried out until a fraction having a content of eicosapentaenoic acid lower alcohol ester of 30 to 50% by weight and a content of docosahexaenoic acid lower alcohol ester of 10% by weight or less is obtained. The manufacturing method of the eicosapentaenoic-acid lower alcohol ester of Claim 1.

The method for producing eicosapentaenoic acid lower alcohol ester according to claim 1 or 2, wherein the surfactant is of an ether type, an ester type or an amino acid derivative.

The method for producing an eicosapentaenoic acid lower alcohol ester according to any one of claims 1 to 3, wherein the microorganism-derived lipase is derived from a microorganism belonging to the genus Candida, Rhizopus, Mucor or Alkaligenes.