JP3734905B2

JP3734905B2 - Method for purifying omega-3 polyunsaturated fatty acids

Info

Publication number: JP3734905B2
Application number: JP33834496A
Authority: JP
Inventors: 一輝丸山; 茂森山; 嘉男富永; 耿雄杉原; 裕司島田
Original assignee: 大阪市; マルハ株式会社
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 2006-01-11
Anticipated expiration: 2016-12-18
Also published as: JPH10176182A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸を高収率かつ高純度に精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高度不飽和脂肪酸の有する生理活性作用が注目されている。特に、エイコサペンタエン酸（以下、EPAと称する。）やドコサヘキサエン酸（以下、DHAと称する。）は、動脈硬化症、血栓症などの成人病に対する予防効果や制癌作用、学習能の増強作用などの多くの生理活性作用を有していることが知られている。そして、その利用法について様々な検討がなされている。
【０００３】
EPAやDHAを主体とした高度不飽和脂肪酸を精製する方法としては、例えば(1) クロマトグラフィーによる方法、(2) 液−液分配による方法、(3) 低温溶剤分別結晶化法、(4) 尿素付加による方法、(5) 二重結合への付加物による方法、(6) 蒸留による方法、およびこれらを組合せた方法が知られている。
【０００４】
しかし、前記(2) 〜(5) の方法においては、溶剤を使用しなければならず、溶剤の除去工程が必要となるため、工程が煩雑である。また、(1) の方法では高純度の精製はできるが、溶剤及びカラムを使用する必要があり、製造コストが掛かり過ぎてしまうため、事業的に採算が合わない。さらに、(6) の方法においては、処理コストは比較的安価であるが、目的とする画分の回収率はあまり高いものではない。
したがって、コストの低い処理方法を用いて高収率で高純度にまで精製できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
高度不飽和脂肪酸を精製する方法としては、これまでに常温、常圧下で反応が進行するリパーゼを用いた方法が注目されている。リパーゼによる高度不飽和脂肪酸の精製法には、油脂をリパーゼで加水分解し未分解のグリセリド画分中に濃縮する方法（選択的加水分解反応）、あるいは高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸混合物とアルコールとからなる反応混液にリパーゼを作用させ、高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸をエステル化し、高度不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸画分中に精製する方法（選択的エステル化反応）等が知られている。
【０００６】
医薬品原料として高度不飽和脂肪酸を高純度に精製する場合には、後者の方が有効であり、これまでにω-6系脂肪酸のγ−リノレン酸を濃縮する方法として、ボラージオイル（γ−リノレン酸含量25％）の脂肪酸混合物からゲオトリカム属の糸状菌が生産するリパーゼを用いて、低級アルコールとn-ヘキサンを加えた反応混液中で遊離脂肪酸画分中にγ−リノレン酸を70%の濃度まで精製する方法が知られている（JAOCS,Vol.71,no.6,p563（1994)、JAOCS,Vol.72,no.4,p417（1995))。
【０００７】
また、DHAを濃縮する方法としては、魚油（EPA11%、DHA含量8%）の脂肪酸混合物を尿素付加法によりDHA27%（EPA27%）に濃縮した脂肪酸混合物及びそのメチルエステル体と低級アルコールとからなる反応混液に、n-ヘキサンを加えた系でリゾムコール属の微生物が生産するリパーゼを用いてエステル化反応（この場合は、メチルエステルとアルコールとの間のアシドリシス反応も進行している。）することにより、遊離脂肪酸画分中にDHAを72%まで濃縮する方法も知られている（JAOCS,Vol.66,no.8,p1120(1989))。
【０００８】
しかし、これらの方法はいずれも反応混液（重量）に対して10〜20倍量（容量）に相当する多量のヘキサンを使用するため、油脂が劣化するのみならず、実生産の際のタンク容量が莫大となり、更には有機溶媒の除去に多大なコストが掛かってしまう。よって、油脂の劣化を防止し、製造コストを下げるためにも有機溶媒を含まない簡便かつ温和な条件下での反応系の確立が望まれている。
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂の加水分解法については、油脂を劣化させることなく分解できる適当な工業的方法は未だ見出されていない。
【０００９】
飽和脂肪酸や１価不飽和脂肪酸の加水分解には、一般に無触媒の高圧加水分解（〜50atm）やアルカリ触媒を用いた中圧加水分解（〜10atm）による化学的な方法が採用されているが、高度不飽和脂肪酸の場合は、酸化安定性の問題からこのような過酷な条件下で分解することはできない。そのため、実験室で行われているケン化分解法を選択せざるを得ない。しかし、ケン化分解法では、油脂に対して多量なアルコール、苛性ソーダ、酸、水等が必要となり、アルカリ性下での加熱処理で油脂の劣化を招くとともに、工業スケールとなると反応タンクが大掛りになるという問題点があり、さらには使用したアルコールの回収や排水処理の問題が生じ、工程が煩雑になってしまうという欠点があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行ない、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂を穏和な条件下で加水分解し、効率的に遊離の高度不飽和脂肪酸を得る方法を検討した結果、高分解能を有するリパーゼを用いて加水分解反応を行なうと、有機溶媒や多量の水を使用することなく、簡便な工程で脂肪酸画分が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂をリパーゼを用いて加水分解し、得られる脂肪酸の混合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を含まない反応系で直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させることを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂をリパーゼを用いて加水分解し、得られる脂肪酸の混合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を含まない反応系で直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させ、得られる反応産物から脂肪酸混合物を分画し、前記選択的エステル化反応に用いたリパーゼを用いて再度直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させることを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法である。
【００１４】
ここで、加水分解に用いられるリパーゼとしては、シュードモナス属又はキャンディダ属に属する微生物、例えばシュードモナス・フルオレッセンス、キャンディダ・シリンドラシエ等が産生するリパーゼが挙げられ、選択的エステル化反応に用いられるリパーゼとしては、リゾプス属、リゾムコール属、フミコーラ属又はフザリウム属に属する微生物が産生するリパーゼが挙げられる。また、ω−３系高度不飽和脂肪酸（例えばドコサヘキサエン酸）を含有する油脂としては、例えば魚油が挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明は、前記精製方法により得られるω−３系高度不飽和脂肪酸をカラムクロマトグラフィーを用いて分取することを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
リパーゼを用いて油脂を加水分解して得られた脂肪酸画分中の脂肪酸組成は、ケン化による加水分解で得られた脂肪酸画分とよく似た脂肪酸組成を有するが、本発明者は、リパーゼの性質をうまく選択すれば、ケン化分解で得られる脂肪酸組成に比べ、若干EPA含量の低い脂肪酸画分が得られることを見出した。選択的エステル化反応を用いてDHAを高純度に精製する場合、初発のEPAが少ない脂肪酸原料を使用することが好ましく、リパーゼによる加水分解で得られる脂肪酸画分を選択的エステル化反応の原料とすることは、DHAの高純度精製には非常に有効な方法である。
【００１７】
本発明の高度不飽和脂肪酸の精製方法は、まず、リパーゼを用いて油脂を加水分解し、得られる脂肪酸混合物を、リパーゼを用いて選択的エステル化反応を行うことを特徴とする。なお、選択的エステル化反応は、有機溶媒の存在しない反応系で行われる。ここで、本発明における「有機溶媒」とは、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒（アルコールを除く）をいい、「有機溶媒を含まない反応系」とは、脂肪酸、直鎖高級アルコール、水、酵素等で構成される反応系をいう。
【００１８】
本発明に用いられる高度不飽和脂肪酸を含有する油脂としては、魚油、例えば、マグロ若しくはカツオの頭部から抽出されるもの、イワシ、サバ、サンマ若しくはアジの全魚体から抽出されるもの、又はイカ若くはタラの肝臓から抽出される肝油等がEPA、DHAを多く含むために好ましい。魚油の抽出方法としては、マグロ若しくはカツオの頭部、イワシ、サバ、サンマ若しくはアジの全魚体、又はイカ若しくはタラの肝臓を採取し、これを煮取り抽出、溶剤抽出、圧搾抽出する方法等が挙げられる。
【００１９】
高度不飽和脂肪酸としてはω−３系系高度不飽和脂肪酸が挙げられ、該脂肪酸は、少なくとも４〜６個の二重結合を有し、鎖式構造のメチル基末端から３番目の位置から二重結合が始まっているものをいい、例えばEPAやDHA等が挙げられる。
【００２０】
前記抽出した魚油をリパーゼを用いて加水分解し、脂肪酸の混合物を得る。リパーゼとしては、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）が生産するリパーゼ（天野製薬（株）製のリパーゼAK）又はシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.)が生産するリパーゼ（昭和電工（株）のLiposam）、あるいはキャンディダ（Candida)属に属する微生物、好ましくはキャンディダ・シリンドラシエ(Candida cylindracea) 等が生産するリパーゼ（名糖産業製のリパーゼOF）等が挙げられる。これらのリパーゼの使用形態はそのままでもよいが、固定化剤（例えば、アクリル樹脂、イオン交換樹脂、セライトやセラミックス担体等）に固定したリパーゼを使用してもよく、特に限定されるものではない。加水分解に使用するリパーゼの使用量は、反応条件によって適宜決定すればよく、特に制限されるものではないが、通常は、油脂１g当たり50〜5,000 ユニット、好ましくは、100〜1,500 ユニット程度が使用される。
【００２１】
加水分解反応は、通常行われている油脂の条件で行なってよい。即ち、前記リパーゼを用いて、１〜500％（重量％、以下同じ））の水量の下、15〜60℃の温度条件（15℃未満ではリパーゼの反応速度が遅くなり、60℃を超えるとリパーゼの失活が著しい。）で30分〜72時間静置又は撹拌することにより加水分解を行なう。但し、本発明で使用するリパーゼの活性を十分に発現させるためには、以下の条件がより好ましい。
【００２２】
すなわち、20〜200%の水分量であること、25〜50℃の温度条件であること、撹拌して反応させること（エステル化反応は静置したままでも進行するが、撹拌により反応効率が大幅に上昇する。）、脂肪酸の酸化的劣化を防止するため窒素気流下で１〜50時間程度の短時間で反応させること、である。
【００２３】
本発明において、リパーゼによる油脂の加水分解率は、次式Ｉ：
加水分解率(%)＝（酸価／ケン化価）× 100 〔Ｉ〕
によって算出することができる。
【００２４】
式Ｉにおいて、酸価とは、サンプリングした水と油のエマルジョンを湯浴中で加温（30〜100℃）することによりエマルジョンが破壊された時の、上層に得られる加水分解油の測定値をいい、ケン化価とは、上記エマルジョンの分解前の油脂のケン化価をいう。
【００２５】
このようにして行なった加水分解後の加水分解油中には、主成分の遊離脂肪酸と未分解グリセリドおよび若干のグリセリンが含まれているが、次に行なう選択的エステル化反応を円滑に進行させるためには、未分解グリセリドおよびグリセリンは除去しておく必要がある。遊離の脂肪酸画分を分取する方法としては、通常行なわれているアルカリによる抽出法（アルカリ反応させて脂肪酸塩とした後、水層側に分画する方法）、溶剤液−液分配による方法、クロマトグラフィーによる方法、低温結晶化分別による方法、分子蒸留による方法、精密真空蒸留による方法等が挙げられる。なお、クロマトグラフィーについてはカラムクロマトグラフィーがより好ましく、高速液体クロマトグラフィーが最も好ましい。
【００２６】
前記加水分解反応において、１回のリパーゼ処理で所望の加水分解率は得られるが、更に収率よく遊離脂肪酸の分解を望む場合には、一回目の反応で未分解であったグリセリド画分を、上記と同様の条件で再度加水分解反応を繰り返すことにより、収率よく脂肪酸を回収することができる。
【００２７】
次に、得られた脂肪酸の選択的エステル化反応を行う。
選択的エステル化反応に使用するリパーゼとしては、リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物、好ましくはリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g）、リゾムコール属に属する微生物、好ましくはリゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）が生産するリパーゼ（ノボノルディスク（株）製）、フミコーラ（Humicola）属に属する微生物、好ましくはフミコーラ・ラングノーサ（Humicola langunosa）が生産するリパーゼ（ノボノルディスク（株）製）、フザリウム（Fusarium）属に属する微生物、好ましくはフザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）が生産するリパーゼ等が挙げられる。リパーゼの使用量はその活性や所望の高度不飽和脂肪酸の濃縮度によっても異なるが、脂肪酸とアルコールとの反応混液1g当たり30〜2,000 ユニット、好ましくは100〜1,000 ユニット程度が使用される。
【００２８】
選択的エステル化反応を行なうための反応混液中の脂肪酸とアルコールとの原料比（モル比）は1:1〜1:10、好ましくは1:2〜1:8程度である。
エステル化反応は、通常行なわれているリパーゼの反応条件で行なってよい。即ち、前記選択的エステル反応に使用するリパーゼを用いて、0.5〜100%（重量%、以下同様）の水分量の下、15〜50℃の温度条件（15℃未満ではリパーゼの反応速度が遅くなり、50℃を超えるとリパーゼの失活が著しい。）で30分〜72時間静置又は攪拌することによりエステル化（エステル合成）を行なう。
【００２９】
但し、本発明で使用する選択的エステル化用リパーゼの活性を十分に発現させるためには、以下の条件がより好ましい。
すなわち、５〜50%の水分量であること、25〜40℃の温度条件であること、撹拌して反応させること（エステル化反応は静置したままでも進行するが、撹拌により反応効率が大幅に上昇する。）、脂肪酸の酸化的劣化を防止するため、窒素気流下で１〜30時間程度の短時間で反応させること、である。
【００３０】
本発明において、リパーゼによる脂肪酸のエステル合成率は、次式II：
エステル合成率(%)＝
（反応開始時の反応混液の酸価−反応終了時の反応混液の酸価）÷反応開始時の反応混液の酸価 × 100 〔II〕
によって算出することができる。
【００３１】
上記のエステル合成率を算出することによって、高度不飽和脂肪酸が濃縮した脂肪酸画分の収率を求めることができる。例えば、エステル合成率が60%の場合には、脂肪酸画分の収率は、100%から60%を差し引いた値（40%）となる。
前記エステル化反応において、１回のリパーゼ処理で所望の純度の高度不飽和脂肪酸を含む脂肪酸は得られるが、更に高純度の高度不飽和脂肪酸を望む場合には、一回目の反応によって得られた脂肪酸画分を同様の処理により、再度選択的エステル化反応を繰り返し脂肪酸画分を分取することで、更に高純度まで精製することができる。
【００３２】
選択的エステル化反応後の反応混合物中には、高度不飽和脂肪酸が濃縮した遊離脂肪酸画分以外に、ワックスエステル及び未反応の高級アルコールが含まれている。したがって、繰り返しエステル化反応を行うときは、遊離脂肪酸画分を得るために、ワックスエステル及びアルコールを除去し精製しておく必要がある。
【００３３】
遊離の脂肪酸画分を分取する方法としては、通常行なわれているアルカリによる抽出法（アルカリ反応させて脂肪酸塩とした後、水層側に分画する方法）、溶剤液−液分配による方法、クロマトグラフィーによる方法、低温結晶化分別による方法、分子蒸留による方法、精密真空蒸留による方法等が挙げられる。クロマトグラフィー等を行うことによって、高度不飽和脂肪酸を95％以上の高純度に精製することができる。なお、クロマトグラフィーについてはカラムクロマトグラフィーがより好ましく、高速液体クロマトグラフィーが最も好ましい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
【００３５】
〔実施例１〕
マグロ油（ケン化価;184、DHA22.9%,EPA6.5%）100gに、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）が生産するリパーゼ（天野製薬（株）製、リパーゼAK）を油1gに対して600 ユニットになるように溶解した蒸留水100gを加えて、撹拌しながら40℃で16時間加水分解反応を行った。加水分解反応後の反応液は、十分平衡に達していた。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た（加水分解の酸価は114.6であった）。
【００３６】
更に、該加水分解油にn-ヘキサン１Lを溶解してから、１Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）に、再度500mlの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに500mlのn-ヘキサンを加えてから4N-塩酸で中和し、ヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃縮精製したところ、56.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化し、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸酸19.4%、ステアリン酸4.5%、オレイン酸21.2%、リノール酸1.2%、EPA4.3%、DHA24.2%であった。
【００３７】
〔実施例２〕
実施例１で得られたマグロ油由来の脂肪酸画分（DHA24.2%、EPA4.3%）50g及びラウリルアルコール70g を含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/g）30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は72.1%であった。）。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン1.2Lに溶解してから1.2Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。
【００３８】
分離したヘキサン層（上層）に再度0.6Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに0.6Lのn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、12.9gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸5.2%、ステアリン酸1.2%、オレイン酸5.7%、EPA4.0%、DHA71.6%であった。
【００３９】
〔実施例３〕
実施例２で得られたω−３系高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分10g及びラウリルアルコール14g を含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/g）4,800 ユニットを溶解した蒸留水6mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は28.4%であった。）。
【００４０】
実施例２と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出し、7.3gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸0.8%、ステアリン酸0.9%、オレイン酸0.9%、EPA1.7%、DHA90.6%であった。
【００４１】
〔実施例４〕
マグロ油（ケン化価;184、DHA22.9%,EPA6.5%）100gに、シュードモナス（Pseudomonas sp.）属の微生物が生産するリパーゼ（昭和電工（株）、Liposam）を油1gに対して2,000 ユニットになるように溶解した蒸留水を100g加えて、撹拌しながら40℃で16時間加水分解反応を行った。加水分解反応後の反応液は、十分平衡に達していた。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た（加水分解の酸価は139.5 であった）。
【００４２】
更に、該加水分解油をn-ヘキサン１Lに溶解してから、１Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度500mlの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノールを合わせ、これに500mlのn-ヘキサンを加えてから4N-塩酸で中和してヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃縮精製したところ、68.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸19.8%、ステアリン酸4.7%、オレイン酸24.0%、リノール酸1.2%、EPA5.0%、DHA18.8%であった。
【００４３】
〔実施例５〕
実施例４で得られたマグロ油由来の脂肪酸画分（DHA18.8%、EPA5.0%）50g及びラウリルアルコール70g を含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/g）30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間で選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は71.6%であった）。実施例３と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出し、11.4gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸8.0%、ステアリン酸1.8%、オレイン酸9.4%、リノール酸0.5%、EPA5.1%、DHA65.0%であった。
【００４４】
〔実施例６〕
実施例５で得られたω−３系高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分10g及びラウリルアルコール14g を含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、リパーゼ原末120,000 U/g）12,000ユニットを溶解した蒸留水6mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は22.8%であった。）。実施例５と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出し、6.3gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸1.7%、ステアリン酸0.4%、オレイン酸2.1%、EPA2.8%、DHA85.4%であった。
【００４５】
〔実施例７〕
マグロ油（ケン化価;184、DHA22.9%,EPA6.5%）100gにキャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea ）が生産するリパーゼ（名糖産業製、リパーゼOF）を油1gに対して、1,000 ユニットになるように溶解した蒸留水100gを加えて、撹拌しながら40℃で16時間加水分解反応を行った。加水分解反応後の反応液は、十分平衡に達していた。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た（加水分解の酸価は119.4 であった）。
【００４６】
更に、該加水分解油にn-ヘキサン１L を溶解してから、１L の2N- 水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）には再度500ml の2N- 水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水- エタノール層を合わせ、これに500ml のn-ヘキサンを加えてから4N- 塩酸で中和してヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃縮精製したところ、58.4g が得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸20.6% 、ステアリン酸4.7%、オレイン酸24.4% 、リノール酸1.4%、EPA6.4% 、DHA13.1%であった。
【００４７】
〔実施例８〕
実施例７で得られたマグロ油由来の脂肪酸画分（DHA13.1%、EPA6.4% ）50g とラウリルアルコール 70gからなる反応混液（モル比1:2 ）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬製、タリパーゼ原末120,000 U/g ））30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は81.7% であった）。
【００４８】
次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン1.2Lに溶解してから1.2Lの2N- 水酸化カリウム／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度0.6Lの2N- 水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに0.6Lのn-ヘキサンを加えて、4N- 塩酸で中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、8.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸8.0%、ステアリン酸1.8%、オレイン酸9.4%、リノール酸0.5%、EPA6.4% 、DHA58.3%であった。
【００４９】
〔実施例９〕
実施例８で得られた高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分5gとラウリルアルコール 7g からなる反応混液（モル比1:2 ）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬製、タリパーゼ原末120,000 U/g ））3,000 ユニットを溶解した蒸留水3ml を加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は32.5% であった）。
【００５０】
次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン2.4Lに溶解してから2.4Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度1.2Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに1.2Lのn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、3.0gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸1.9%、ステアリン酸0.5 % 、オレイン酸2.0%、EPA5.1% 、DHA81.0%であった。
【００５１】
〔比較例１〕
マグロ油（ケン化価;184、DHA22.9%, EPA6.5% ）を常法に従いケン化分解して得られた遊離脂肪酸画分（DHA23.0%、EPA6.8%）100g及びラウリルアルコール140gを含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、リパーゼ原末120,000 U/g）60,000ユニットを溶解した蒸留水60mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は68.9%であった。）。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン2.4Lに溶解してから2.4Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度1.2Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに1.2Lのn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、27.8gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸4.3%、ステアリン酸1.1%、オレイン酸5.0%、EPA6.9%、DHA68.8%であった。
【００５２】
ここで、常法（60〜80℃で１〜２時間の還流下）を用いたケン化分解で得られる脂肪酸は色調が濃く、リパーゼで分解した脂肪酸は淡いものであった。淡い色調の脂肪酸は反応工程のダメージが少ないことが予想され、リパーゼで分解した脂肪酸は、ケン化分解により得られた脂肪酸よりも酸化分解物の含有量が少ない点で品質に優れている。
【００５３】
〔比較例２〕
比較例１で得られたω−３系高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分25g及びラウリルアルコール35g を含む反応混液（モル比1:2）に、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/g）12,000ユニットを溶解した蒸留水15mlを加え（反応混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エステル合成率は28.3%であった。）。
【００５４】
比較例１と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出し、18.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸0.7%、オレイン酸0.9%、EPA4.6%、DHA85.1%であった。
【００５５】
〔実施例１０〕
実施例２で得られたDHA高純度濃縮脂肪酸混合物を医薬品原体用に更に濃縮するため、通常行なわれている塩酸−エタノール法により該脂肪酸混合物をエチルエステル体に変換した。得られた脂肪酸エチルエステルを全自動分取型高速液体クロマトグラフィー（三菱化工機（株）製）に装着したDevelosil ODS-10/20 を充填したカラム（直径50mm×長さ500mm,野村化学（株）製）に１バッチ当たり4,000μlを自動注入した。溶離液は100%メタノールで行ない、カラム恒温槽を30℃に設定しながら、流速40ml/minで流し、分取時間を50min/バッチでDHAエチルエステルの分取を行なった。
【００５６】
ピークの検出は紫外部吸収検出器でUV214nmでモニターしながら行ない、DHAエチルエステル画分を3.25g分取した。得られたDHAエチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析したところ、99.9%の純度であった。
【００５７】
以上の結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】

【００５９】
表１から明らかなように、ケン化分解で得られた脂肪酸、リパーゼによる加水分解によって得られた脂肪酸ともに、選択的エステル化を行うことによりかなりEPA含量を下げることは可能である。しかし、本発明により、リパーゼ処理で得られた脂肪酸原料を用いエステル化反応した方が、脂肪酸画分中のEPA含量をより低くできた。すなわち、本発明の方法のように、選択的エステル化反応に供する初発脂肪酸原料をリパーゼを用いて加水分解することにより、できるだけEPA含量を下げてDHAを高純度に精製することができるため、本発明の方法は極めて有効な方法である。このことは、実施例と比較例とを比較した結果から明らかである。
【００６０】
また、本発明の方法は、ケン化分解により得られた脂肪酸よりも高品質の脂肪酸を得ることができる点で優れている。
さらに、簡便な工程で脂肪酸画分が得られるリパーゼを用いた加水分解は、DHAの高純度精製において効果的に行える極めて有望な方法である。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、高度不飽和脂肪酸の精製方法が提供される。種々の生理活性作用を有するω−３系高度不飽和脂肪酸を、本発明の方法によって収率よく高純度に精製できることは、医薬品、生化学試薬等に十分に利用できることから、本発明は産業上極めて有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for purifying ω-3 highly unsaturated fatty acids with high yield and high purity.
[0002]
[Prior art]
In recent years, bioactive effects of highly unsaturated fatty acids have attracted attention. In particular, eicosapentaenoic acid (hereinafter referred to as EPA) and docosahexaenoic acid (hereinafter referred to as DHA) have a preventive effect on adult diseases such as arteriosclerosis and thrombosis, an anticancer effect, and an ability to enhance learning ability. It is known to have many physiologically active actions. Various studies have been made on its usage.
[0003]
For example, (1) chromatography method, (2) liquid-liquid partition method, (3) low-temperature solvent fractional crystallization method, (4) Known are a method using urea addition, (5) a method using an adduct to a double bond, (6) a method using distillation, and a method combining these.
[0004]
However, in the methods (2) to (5), a solvent must be used, and a solvent removal step is required, so that the steps are complicated. In addition, although the method (1) enables high-purity purification, it is necessary to use a solvent and a column, and the production cost is too high. Furthermore, in the method (6), the processing cost is relatively low, but the recovery rate of the target fraction is not so high.
Therefore, development of a method that can be purified to a high yield and a high purity by using a low cost processing method is desired.
[0005]
As a method for purifying highly unsaturated fatty acids, attention has been paid to a method using lipase, which has been reacted at normal temperature and normal pressure. For purification of highly unsaturated fatty acids using lipase, fats and oils are hydrolyzed with lipase and concentrated in the undegraded glyceride fraction (selective hydrolysis reaction), or fatty acid mixture containing highly unsaturated fatty acids and alcohol There is known a method (selective esterification reaction) in which a lipase is allowed to act on a reaction mixture consisting of: esterification of fatty acids other than highly unsaturated fatty acids, and the highly unsaturated fatty acids are purified into a free fatty acid fraction.
[0006]
The latter is more effective when purifying highly unsaturated fatty acids as a raw material for pharmaceuticals with high purity. As a method of concentrating γ-linolenic acid of ω-6 fatty acids, borage oil (γ-linolenic acid) Using a lipase produced by Geotricham sp. From a fatty acid mixture with a content of 25%), γ-linolenic acid in the free fatty acid fraction is reduced to a concentration of 70% in the reaction mixture containing lower alcohol and n-hexane. Methods for purification are known (JAOCS, Vol. 71, no. 6, p563 (1994), JAOCS, Vol. 72, no. 4, p417 (1995)).
[0007]
As a method for concentrating DHA, it comprises a fatty acid mixture obtained by concentrating a fatty acid mixture of fish oil (EPA 11%, DHA content 8%) to DHA 27% (EPA 27%) by urea addition method, and its methyl ester and lower alcohol. An esterification reaction (in this case, an acidolysis reaction between a methyl ester and an alcohol also proceeds) using a lipase produced by a Rhizomucor bacterium in a system in which n-hexane is added to the reaction mixture. Thus, a method of concentrating DHA to 72% in the free fatty acid fraction is also known (JAOCS, Vol. 66, no. 8, p1120 (1989)).
[0008]
However, all of these methods use a large amount of hexane corresponding to 10 to 20 times the volume (volume) of the reaction mixture (weight), so that not only the fats and oils deteriorate, but also the tank capacity during actual production. Becomes enormous, and further, the cost for removing the organic solvent increases. Therefore, establishment of a reaction system under simple and mild conditions not containing an organic solvent is desired in order to prevent the deterioration of fats and oils and to reduce the production cost.
As for the hydrolysis method of fats and oils containing highly unsaturated fatty acids, no suitable industrial method capable of breaking down fats and oils has been found yet.
[0009]
For the hydrolysis of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids, chemical methods such as non-catalytic high-pressure hydrolysis (up to 50 atm) or medium-pressure hydrolysis (up to 10 atm) using an alkali catalyst are generally employed. In the case of a highly unsaturated fatty acid, it cannot be decomposed under such severe conditions due to the problem of oxidative stability. Therefore, the saponification decomposition method currently performed in the laboratory must be selected. However, the saponification decomposition method requires a large amount of alcohol, caustic soda, acid, water, etc., for the fats and oils, and the heat treatment under alkaline causes deterioration of the fats and oils. In addition, there are disadvantages that the process of collecting used alcohol and wastewater treatment are complicated and the process becomes complicated.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for purifying ω-3 polyunsaturated fatty acids.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies based on the above-mentioned problems, the present inventors have hydrolyzed fats and oils containing highly unsaturated fatty acids under mild conditions, and have studied a method for efficiently obtaining free highly unsaturated fatty acids. The present inventors have found that a fatty acid fraction can be obtained in a simple process without using an organic solvent or a large amount of water when a hydrolysis reaction is performed using a lipase having high resolution, and the present invention has been completed. .
[0012]
That is, the present invention hydrolyzes fats and oils containing ω-3 polyunsaturated fatty acids using lipase, and the resulting fatty acid mixture is converted into a linear higher alcohol in a reaction system containing no organic solvent using lipase. Is a method for purifying ω-3 polyunsaturated fatty acid, characterized by subjecting it to selective esterification reaction.
[0013]
Furthermore, the present invention provides a method for hydrolyzing fats and oils containing ω-3 polyunsaturated fatty acids using lipase, and converting the resulting fatty acid mixture into a linear higher alcohol in a reaction system containing no organic solvent using lipase. And then selectively esterifying with a linear higher alcohol using the lipase used in the selective esterification reaction. This is a method for purifying ω-3 polyunsaturated fatty acids.
[0014]
Here, examples of the lipase used for hydrolysis include lipases produced by microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Candida, such as Pseudomonas fluorescens, Candida cilindraceae, etc., and lipases used for selective esterification reactions. Examples thereof include lipases produced by microorganisms belonging to the genus Rhizopus, Rhizomucor, Humicola, or Fusarium. Moreover, fish oil is mentioned as fats and oils containing a omega-3 type | system | group highly unsaturated fatty acid (for example, docosahexaenoic acid), for example.
[0015]
Furthermore, the present invention is a method for purifying ω-3 highly unsaturated fatty acid, wherein the ω-3 highly unsaturated fatty acid obtained by the purification method is fractionated using column chromatography.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The fatty acid composition in the fatty acid fraction obtained by hydrolyzing fats and oils using lipase has a fatty acid composition that is very similar to the fatty acid fraction obtained by hydrolysis by saponification. It was found that a fatty acid fraction having a slightly lower EPA content than the fatty acid composition obtained by saponification decomposition can be obtained if the properties of are selected properly. When purifying DHA with high purity using selective esterification reaction, it is preferable to use a fatty acid raw material with less initial EPA, and the fatty acid fraction obtained by hydrolysis with lipase is used as the raw material for selective esterification reaction. This is a very effective method for high purity purification of DHA.
[0017]
The highly unsaturated fatty acid purification method of the present invention is characterized by first hydrolyzing fats and oils using lipase, and subjecting the resulting fatty acid mixture to selective esterification reaction using lipase. The selective esterification reaction is carried out in a reaction system in which no organic solvent is present. Here, the “organic solvent” in the present invention refers to an organic solvent (excluding alcohol) such as n-hexane, diethyl ether, toluene, and benzene, and the “reaction system not including an organic solvent” refers to fatty acid, A reaction system composed of higher chain alcohols, water, enzymes and the like.
[0018]
The fats and oils containing polyunsaturated fatty acids used in the present invention include fish oils, for example, those extracted from the head of tuna or skipjack, those extracted from the whole fish of sardines, mackerel, saury or horse mackerel, or squid Young or liver oil extracted from cod liver is preferable because it contains a large amount of EPA and DHA. Fish oil extraction methods include tuna or bonito head, whole sardine, mackerel, saury or horse mackerel fish, or squid or cod liver, which is boiled and extracted, solvent extracted, pressed, etc. Can be mentioned.
[0019]
Examples of the highly unsaturated fatty acid include ω-3 series highly unsaturated fatty acid, which has at least 4 to 6 double bonds, and is from the third position from the end of the methyl group of the chain structure. This refers to those in which a double bond has begun, such as EPA and DHA.
[0020]
The extracted fish oil is hydrolyzed using lipase to obtain a mixture of fatty acids. Examples of the lipase include microorganisms belonging to the genus Pseudomonas, preferably lipase produced by Pseudomonas fluorescence (Lipase AK manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) or Pseudomonas sp. Lipase produced by Showa Denko Co., Ltd. (Liposam) or lipase produced by microorganisms belonging to the genus Candida, preferably Candida cylindracea, etc. Can be mentioned. The use form of these lipases may be used as it is, but a lipase immobilized on a fixing agent (for example, acrylic resin, ion exchange resin, celite, ceramic carrier, etc.) may be used, and is not particularly limited. The amount of lipase used for hydrolysis may be appropriately determined depending on the reaction conditions, and is not particularly limited. Usually, about 50 to 5,000 units, preferably about 100 to 1,500 units, are used per gram of fat and oil. Is done.
[0021]
You may perform a hydrolysis reaction on the conditions of the fats and oils currently performed normally. That is, using the lipase, the reaction rate of the lipase is slowed under a temperature condition of 15-60 ° C. (less than 15 ° C.) under a water amount of 1-500% (weight%, the same applies hereinafter), and when the temperature exceeds 60 ° C. The lipase is significantly deactivated.) And is hydrolyzed by standing or stirring for 30 minutes to 72 hours. However, in order to fully express the activity of the lipase used in the present invention, the following conditions are more preferable.
[0022]
That is, the water content is 20 to 200%, the temperature is 25 to 50 ° C., and the reaction is carried out with stirring (the esterification reaction proceeds even if left standing, but the reaction efficiency is greatly increased by stirring. In order to prevent oxidative degradation of fatty acids, the reaction is performed in a short time of about 1 to 50 hours under a nitrogen stream.
[0023]
In the present invention, the hydrolysis rate of fats and oils by lipase is represented by the following formula I:
Hydrolysis rate (%) = (acid value / saponification value) × 100 [I]
Can be calculated.
[0024]
In formula I, the acid value is the measured value of the hydrolyzed oil obtained in the upper layer when the emulsion is broken by heating the sampled water-oil emulsion in a hot water bath (30-100 ° C.). The saponification value means the saponification value of the fats and oils before the emulsion is decomposed.
[0025]
The hydrolyzed oil thus hydrolyzed contains free fatty acids as main components, undegraded glycerides, and some glycerin, but the subsequent selective esterification reaction proceeds smoothly. In order to do this, it is necessary to remove undegraded glycerides and glycerin. As a method for fractionating free fatty acid fractions, a conventional alkali extraction method (method of alkali reaction to obtain a fatty acid salt followed by fractionation on the aqueous layer side), a solvent liquid-liquid distribution method And a method by chromatography, a method by low-temperature crystallization fractionation, a method by molecular distillation, a method by precision vacuum distillation, and the like. As for chromatography, column chromatography is more preferable, and high performance liquid chromatography is most preferable.
[0026]
In the hydrolysis reaction, a desired hydrolysis rate can be obtained by one lipase treatment. However, when it is desired to decompose free fatty acids with a higher yield, the glyceride fraction that has not been decomposed in the first reaction is obtained. By repeating the hydrolysis reaction again under the same conditions as described above, the fatty acid can be recovered with good yield.
[0027]
Next, selective esterification reaction of the obtained fatty acid is performed.
As the lipase used in the selective esterification reaction, a microorganism belonging to the genus Rhizopus, preferably a lipase produced by Rhizopus delemar (manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Talipase bulk powder 120,000 U / g) Produced by microorganisms belonging to the genus Rhizomucor, preferably lipases produced by Rhizomucor miehei (manufactured by Novo Nordisk), microorganisms belonging to the genus Humicola, preferably Humicola langunosa Lipase (manufactured by Novo Nordisk Co., Ltd.), microorganisms belonging to the genus Fusarium, preferably lipase produced by Fusarium heterosporum. The amount of lipase used varies depending on the activity and the concentration of the desired polyunsaturated fatty acid, but 30 to 2,000 units, preferably about 100 to 1,000 units, are used per gram of the reaction mixture of fatty acid and alcohol.
[0028]
The raw material ratio (molar ratio) of fatty acid to alcohol in the reaction mixture for carrying out the selective esterification reaction is 1: 1 to 1:10, preferably about 1: 2 to 1: 8.
The esterification reaction may be carried out under the usual lipase reaction conditions. That is, using the lipase used for the selective ester reaction, the reaction rate of lipase is slow at a temperature of 15-50 ° C. under a water content of 0.5-100% (% by weight, the same applies hereinafter) (below 15 ° C. When the temperature exceeds 50 ° C., the lipase is inactivated.) By standing or stirring for 30 minutes to 72 hours, esterification (ester synthesis) is performed.
[0029]
However, in order to fully express the activity of the selective esterification lipase used in the present invention, the following conditions are more preferable.
That is, the water content is 5 to 50%, the temperature is 25 to 40 ° C., and the reaction is carried out with stirring (the esterification reaction proceeds even if left standing, but the reaction efficiency is greatly improved by stirring. In order to prevent oxidative degradation of fatty acids, the reaction is performed in a nitrogen gas stream in a short time of about 1 to 30 hours.
[0030]
In the present invention, the ester synthesis rate of fatty acid by lipase is represented by the following formula II:
Ester synthesis rate (%) =
(Acid value of the reaction mixture at the start of the reaction−acid value of the reaction mixture at the end of the reaction) ÷ acid value of the reaction mixture at the start of the reaction × 100 [II]
Can be calculated.
[0031]
By calculating the ester synthesis rate, the yield of the fatty acid fraction enriched with highly unsaturated fatty acids can be determined. For example, when the ester synthesis rate is 60%, the yield of the fatty acid fraction is a value obtained by subtracting 60% from 100% (40%).
In the esterification reaction, a fatty acid containing a highly unsaturated fatty acid with a desired purity can be obtained by a single lipase treatment, but when a highly unsaturated highly unsaturated fatty acid is desired, it was obtained by the first reaction. The fatty acid fraction can be further purified to a higher purity by repeating the selective esterification reaction again and fractionating the fatty acid fraction by the same treatment.
[0032]
The reaction mixture after the selective esterification reaction contains a wax ester and an unreacted higher alcohol in addition to the free fatty acid fraction enriched in highly unsaturated fatty acids. Therefore, when the esterification reaction is repeatedly performed, it is necessary to remove the wax ester and the alcohol in order to obtain a free fatty acid fraction.
[0033]
As a method for fractionating free fatty acid fractions, a conventional alkali extraction method (method of alkali reaction to obtain a fatty acid salt followed by fractionation on the aqueous layer side), a solvent liquid-liquid distribution method And a method by chromatography, a method by low-temperature crystallization fractionation, a method by molecular distillation, a method by precision vacuum distillation, and the like. By performing chromatography or the like, highly unsaturated fatty acids can be purified to a purity of 95% or more. As for chromatography, column chromatography is more preferable, and high performance liquid chromatography is most preferable.
[0034]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0035]
[Example 1]
100g of tuna oil (saponification value: 184, DHA 22.9%, EPA 6.5%) and lipase produced by Pseudomonas fluorescence (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd., lipase AK) per gram of oil Then, 100 g of distilled water dissolved to 600 units was added, and a hydrolysis reaction was carried out at 40 ° C. for 16 hours with stirring. The reaction solution after the hydrolysis reaction reached a sufficient equilibrium. Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a hydrolyzed oil (hydrolysis acid value was 114.6).
[0036]
Furthermore, after dissolving 1 L of n-hexane in the hydrolyzed oil, 1 L of 2N-potassium hydroxide / ethanol solution is added to make the fatty acid potassium salt, so that the fatty acid fraction is converted into a water-ethanol layer (lower layer). It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 500 ml of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 500 ml of n-hexane was added thereto, and then neutralized with 4N-hydrochloric acid, and the fatty acid fraction was extracted into the hexane layer. When n-hexane was distilled off using a rotary evaporator and the fatty acid fraction was concentrated and purified, 56.2 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method, and the fatty acid composition was analyzed by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 19.4%, stearic acid 4.5%, oleic acid 21.2%, linoleic acid 1.2%, EPA was 4.3% and DHA was 24.2%.
[0037]
[Example 2]
The reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 50 g of the fatty acid fraction (DHA 24.2%, EPA 4.3%) derived from tuna oil obtained in Example 1 and 70 g of lauryl alcohol was mixed with Rhizopus delemer. Add 30 ml of distilled water in which 30,000 units of lipase produced by Tanabe Seiyaku Co., Ltd. (Tanapase Pharmaceutical Co., Ltd., 120,000 U / g) are dissolved (the amount of enzyme is 200 units per gram of the reaction mixture) and stir in a nitrogen stream. The selective esterification reaction was carried out at 30 ° C. for 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 72.1%). Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a reaction mixture. Further, after dissolving the reaction mixture in 1.2 L of n-hexane, 1.2 L of 2N-potassium hydroxide / ethanol solution was added to convert the fatty acid to a potassium salt. It was moved to.
[0038]
To the separated hexane layer (upper layer), 0.6 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 0.6 L of n-hexane was added thereto, and neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. When n-hexane was distilled off by a rotary evaporator to concentrate the fatty acid, 12.9 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography. As a result, palmitic acid 5.2%, stearic acid 1.2%, oleic acid 5.7%, EPA 4.0%, DHA71 It was .6%.
[0039]
Example 3
Lipase produced by Rhizopus delemer in the reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 10 g of the fatty acid fraction concentrated in ω-3 highly unsaturated fatty acid obtained in Example 2 and 14 g of lauryl alcohol (Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Talipase powder 120,000 U / g) Add 6 ml of distilled water in which 4,800 units are dissolved (enzyme amount is 200 units per gram of reaction mixture) and stir in a nitrogen stream at 30 ° C. The selective esterification reaction was performed again in 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 28.4%).
[0040]
The fatty acid fraction was extracted by the method scaled down in the same manner as in Example 2 to obtain 7.3 g. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography. As a result, palmitic acid 0.8%, stearic acid 0.9%, oleic acid 0.9%, EPA 1.7%, DHA90 It was .6%.
[0041]
Example 4
100g of tuna oil (saponification value: 184, DHA 22.9%, EPA 6.5%) and lipase produced by microorganisms of the genus Pseudomonas (Pseudomonas sp.) 100 g of distilled water dissolved to 2,000 units was added, and a hydrolysis reaction was carried out at 40 ° C. for 16 hours with stirring. The reaction solution after the hydrolysis reaction reached a sufficient equilibrium. Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a hydrolyzed oil (hydrolysis acid value was 139.5).
[0042]
Further, after dissolving the hydrolyzed oil in 1 liter of n-hexane, 1 liter of 2N-potassium hydroxide / ethanol solution is added to make the fatty acid potassium salt, whereby the fatty acid fraction is converted into a water-ethanol layer (lower layer). It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 500 ml of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. Water-ethanol from which the fatty acid was extracted was combined, 500 ml of n-hexane was added thereto, and then neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. When n-hexane was distilled off using a rotary evaporator and the fatty acid fraction was concentrated and purified, 68.2 g was obtained. The fatty acid obtained was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 19.8%, stearic acid 4.7%, oleic acid 24.0%, linoleic acid 1.2%, EPA5 It was 0.0% and DHA 18.8%.
[0043]
Example 5
The reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 50 g of the fatty acid fraction derived from tuna oil (DHA 18.8%, EPA 5.0%) and 70 g of lauryl alcohol obtained in Example 4 was mixed with Rhizopus delemer. Add 30 ml of distilled water in which 30,000 units of lipase produced by Tanabe Seiyaku Co., Ltd. (Tanapase Pharmaceutical Co., Ltd., 120,000 U / g) are dissolved (the amount of enzyme is 200 units per gram of the reaction mixture) and stir in a nitrogen stream. The selective esterification reaction was carried out at 30 ° C. for 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 71.6%). The fatty acid fraction was extracted by the method scaled down in the same manner as in Example 3, and 11.4 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 8.0%, stearic acid 1.8%, oleic acid 9.4%, linoleic acid 0.5%, EPA5 .1% and DHA 65.0%.
[0044]
Example 6
Lipase produced by Rhizopus delemer in the reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 10 g of the fatty acid fraction concentrated in ω-3 highly unsaturated fatty acid obtained in Example 5 and 14 g of lauryl alcohol (Tanabe Seiyaku Co., Ltd., lipase bulk powder 120,000 U / g) Add 6ml of distilled water in which 12,000 units are dissolved (enzyme amount is 200 units per gram of reaction mixture) and stir under nitrogen flow at 30 ° C. The selective esterification reaction was performed again in 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 22.8%). The fatty acid fraction was extracted by the method scaled down in the same manner as in Example 5 to obtain 6.3 g. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography. As a result, palmitic acid 1.7%, stearic acid 0.4%, oleic acid 2.1%, EPA 2.8%, DHA85 It was 4%.
[0045]
Example 7
100g of tuna oil (saponification value; 184, DHA22.9%, EPA6.5%) produced by Candida cylindracea is 1,000 gram of oil for 1g of oil. 100 g of distilled water dissolved so as to become a unit was added, and a hydrolysis reaction was performed at 40 ° C. for 16 hours while stirring. The reaction solution after the hydrolysis reaction reached a sufficient equilibrium. Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a hydrolyzed oil (the acid value of hydrolysis was 119.4).
[0046]
Further, 1 L of n-hexane is dissolved in the hydrolyzed oil, and then 1 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution is added to make the fatty acid potassium salt, whereby the fatty acid fraction is converted into a water-ethanol layer (lower layer). It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 500 ml of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 500 ml of n-hexane was added thereto, and then neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. N-Hexane was distilled off using a rotary evaporator and the fatty acid fraction was concentrated and purified. As a result, 58.4 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 20.6%, stearic acid 4.7%, oleic acid 24.4%, linoleic acid 1.4%, EPA6 .4% and DHA 13.1%.
[0047]
Example 8
The reaction mixture (molar ratio 1: 2) composed of 50 g of the fatty acid fraction derived from tuna oil (DHA 13.1%, EPA 6.4%) obtained in Example 7 and 70 g of lauryl alcohol was mixed with Rhizopus delemer. 30 ml of distilled water in which 30,000 units are dissolved (the amount of enzyme is 200 units per gram of reaction mixture) is added, and stirred under a nitrogen stream. Selective esterification reaction was carried out at 20 ° C. for 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 81.7%).
[0048]
Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a reaction mixture. Furthermore, after dissolving the reaction mixture in 1.2 L of n-hexane, 1.2 L of 2N-potassium hydroxide / ethanol solution was added to make the fatty acid a potassium salt. It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 0.6 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 0.6 L of n-hexane was added thereto, and neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. When n-hexane was distilled off by a rotary evaporator to concentrate the fatty acid, 8.2 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and the fatty acid composition was analyzed by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 8.0%, stearic acid 1.8%, oleic acid 9.4%, linoleic acid 0.5%, EPA6 4% and DHA 58.3%.
[0049]
Example 9
Lipase produced by Rhizopus delemer (manufactured by Tanabe Seiyaku) is used in the reaction mixture (molar ratio 1: 2) consisting of 5 g of the fatty acid fraction enriched with highly unsaturated fatty acid obtained in Example 8 and 7 g of lauryl alcohol. , Talipase bulk powder 120,000 U / g)) Add 3 ml of distilled water in which 3,000 units are dissolved (enzyme amount is 200 units per gram of reaction mixture), and select again in 20 hours at 30 ° C with stirring under nitrogen flow. An esterification reaction was performed. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 32.5%).
[0050]
Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a reaction mixture. Furthermore, the reaction mixture was dissolved in n-hexane (2.4 L), 2.4 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added, and the fatty acid fraction was converted to a potassium salt, whereby the fatty acid fraction was separated from the water-ethanol layer (lower layer). It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 1.2 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 1.2 L of n-hexane was added thereto, and neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. When n-hexane was distilled off by a rotary evaporator to concentrate the fatty acid, 3.0 g was obtained. The resulting fatty acid was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed for fatty acid composition by capillary gas chromatography. As a result, 1.9% palmitic acid, 0.5% stearic acid, 2.0% oleic acid, EPA 5.1%, DHA81 It was .0%.
[0051]
[Comparative Example 1]
100 g of free fatty acid fraction (DHA 23.0%, EPA 6.8%) obtained by saponification and decomposition of tuna oil (saponification value: 184, DHA 22.9%, EPA 6.5%) according to a conventional method and lauryl alcohol 60 ml of distilled water in which 60,000 units of lipase produced by Rhizopus delemer (manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd., 120,000 U / g of lipase bulk powder) was dissolved in a reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 140 g. In addition, the enzyme amount was 200 units per gram of the reaction mixture, and a selective esterification reaction was carried out at 30 ° C. for 20 hours with stirring under a nitrogen stream. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 68.9%). Subsequently, the aqueous layer containing lipase was removed from the reaction solution to obtain a reaction mixture. Furthermore, the reaction mixture was dissolved in n-hexane (2.4 L), 2.4 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added, and the fatty acid fraction was converted to a potassium salt, whereby the fatty acid fraction was separated from the water-ethanol layer (lower layer). It was moved to. To the separated hexane layer (upper layer), 1.2 L of 2N potassium hydroxide / ethanol solution was added again to re-extract the fatty acid. The water-ethanol layer from which the fatty acid was extracted was combined, 1.2 L of n-hexane was added thereto, and neutralized with 4N-hydrochloric acid to extract the fatty acid fraction in the hexane layer. When n-hexane was distilled off by a rotary evaporator to concentrate the fatty acid, 27.8 g was obtained. The fatty acid obtained was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and analyzed by fatty acid composition by capillary gas chromatography.As a result, palmitic acid 4.3%, stearic acid 1.1%, oleic acid 5.0%, EPA 6.9%, DHA68 It was 8%.
[0052]
Here, the fatty acid obtained by saponification decomposition using a conventional method (at 60 to 80 ° C. under reflux for 1 to 2 hours) was dark in color, and the fatty acid decomposed by lipase was light. The light-colored fatty acid is expected to have little damage in the reaction process, and the fatty acid decomposed by lipase is superior in quality in that the content of the oxidative decomposition product is lower than the fatty acid obtained by saponification decomposition.
[0053]
[Comparative Example 2]
Lipase produced by Rhizopus delemer in the reaction mixture (molar ratio 1: 2) containing 25 g of the fatty acid fraction concentrated in ω-3 highly unsaturated fatty acid obtained in Comparative Example 1 and 35 g of lauryl alcohol (Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Talipase bulk powder 120,000 U / g) Add 15 ml of distilled water in which 12,000 units are dissolved (enzyme amount is 200 units per gram of reaction mixture) and stir in a nitrogen stream at 30 ° C. The selective esterification reaction was performed again in 20 hours. The reaction solution after the esterification reaction reached a sufficient equilibrium (the ester synthesis rate was 28.3%).
[0054]
In the same manner as in Comparative Example 1, the fatty acid fraction was extracted by a scaled-down method, and 18.2 g was obtained. The fatty acid obtained was methyl esterified by boron trifluoride-methanol method and the fatty acid composition was analyzed by capillary gas chromatography. It was.
[0055]
Example 10
In order to further concentrate the DHA high-purity concentrated fatty acid mixture obtained in Example 2 for a drug substance, the fatty acid mixture was converted into an ethyl ester by a conventional hydrochloric acid-ethanol method. Column (50mm diameter x 500mm length, Nomura Chemical Co., Ltd.) packed with Develosil ODS-10 / 20 mounted on fully automatic preparative high-performance liquid chromatography (Mitsubishi Chemical Corporation) with the resulting fatty acid ethyl ester )) Was automatically injected at 4,000 μl per batch. The eluent was 100% methanol, the column thermostat was set to 30 ° C., and the flow rate was 40 ml / min. DHA ethyl ester was fractionated at a fractionation time of 50 min / batch.
[0056]
Peak detection was performed while monitoring at 214 nm with an ultraviolet absorption detector, and 3.25 g of DHA ethyl ester fraction was collected. When the obtained DHA ethyl ester was analyzed by capillary gas chromatography, it was 99.9% pure.
[0057]
The results are shown in Table 1.
[0058]
[Table 1]

[0059]
As is clear from Table 1, it is possible to considerably reduce the EPA content by performing selective esterification on both the fatty acid obtained by saponification decomposition and the fatty acid obtained by hydrolysis with lipase. However, according to the present invention, the esterification reaction using the fatty acid raw material obtained by the lipase treatment was able to lower the EPA content in the fatty acid fraction. That is, as in the method of the present invention, by hydrolyzing the starting fatty acid raw material to be used in the selective esterification reaction with lipase, DHA can be purified with a high purity by reducing the EPA content as much as possible. The method of the invention is a very effective method. This is clear from the result of comparing the example and the comparative example.
[0060]
Further, the method of the present invention is superior in that a fatty acid having a higher quality than that obtained by saponification decomposition can be obtained.
Furthermore, hydrolysis using a lipase that can obtain a fatty acid fraction by a simple process is a very promising method that can be effectively performed in high-purity purification of DHA.
[0061]
【The invention's effect】
The present invention provides a method for purifying highly unsaturated fatty acids. The fact that ω-3 polyunsaturated fatty acids having various physiological activities can be purified with high yield and high purity by the method of the present invention is sufficient for use in pharmaceuticals, biochemical reagents, etc. Very useful.

Claims

Hydrolysis of fats and oils containing docosahexaenoic acid using Pseudomonas fluorescens lipase, and the resulting fatty acid mixture is selectively esterified with linear higher alcohols in a reaction system that does not contain organic solvents using lipase. And a method for purifying docosahexaenoic acid .

The method for purifying docosahexaenoic acid according to claim 1, wherein the lipase used in the selective esterification reaction is produced by a microorganism belonging to the genus Rhizopus, Rhizomucor, Humicola or Fusarium.

Characterized by preparative by minute using column chromatography docosahexaenoic acid obtained by the purification method according to claim 1 or 2, the purification method of docosahexaenoic acid.