JP3887008B1 - 抗ガン剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 ガン細胞から排出されにくく、且つ、ガン細胞に対する局所的治療に好適な新たな抗ガン剤を提供することである。
【解決手段】 本発明による抗ガン剤は、化学式（Ｉ）
【化３】

で表されるロタキサン化合物を有効成分として含有する。このロタキサン化合物は、両端に比較的大きな分子が結合した棒状部分と、この棒状部分が挿入された環状部分（クラウンエーテル）の２つの部分からなる。棒状部分の両端には比較的大きな分子が結合しているため、これがストッパーとなって環状部分が棒状部分から離脱することはできない。これら２つの部分同士は共有結合によって結合していない。このため分子の形状が変化しやすく、受容体を介した取り込みが比較的困難となるが、これをガン細胞内に導入するとガン細胞の増殖が抑制される。
【選択図】 なし

Description

本発明は抗ガン剤に関し、特に、ロタキサン化合物を有効成分として含有する抗ガン剤に関する。

わが国の平均寿命は３０年前と比べて１０歳以上も延びているが、これは死亡原因として従来多かった脳卒中や心疾患の治療薬が数多く開発されたことが大きな原因の一つと考えられている。しかしながら、死亡原因として脳卒中や心疾患が少なくなるにつれ、ガン（悪性新生物）による死亡が年々増加している。現在では、死亡原因の第一位はガンであり、このため現在数多くの研究者によって抗ガン剤の開発が行われている。

多くの抗ガン剤は、ガン細胞に吸収されて初めて作用することから、これまでは受容体を介した取り込みが容易となるよう、分子量が小さく且つ構造の安定した薬剤が有効であると考えられてきた。
特許第３７４１７０６号明細書 高田十志和，木原伸浩，古荘義雄，「インターロックト化合物の合成によるナノ材料の機能設計」，高分子，２００１年，５０［１１］，ｐ．７７０−７７３ 古荘義雄，木原伸浩，高田十志和，「スリッピングによるロタキサン、ポリロタキサンの合成−新しい高分子合成法を考える−」，高分子加工，２００１年，５０［３］，ｐ．１１４−１２０ 木原伸浩，高田十志和，「水素結合に基づくインターロックト化合物の合成−ロタキサン、カテナン合成の最近の進歩−」，有機合成化学協会誌，２００１年，５９［３］，ｐ．２０６−２１８

しかしながら、受容体を介した吸収の容易な抗ガン剤は、逆に細胞から排出されやすいことが多く、このためガン細胞内にとどまりにくいという問題があった。しかも、一度抗ガン剤を排出したガン細胞は、当該抗ガン剤に対して耐性を持つことがあり、同じ抗ガン剤が効かなくなるという問題もあった。

また、受容体を介した吸収の容易な抗ガン剤は、正常細胞にも取り込まれやすいため、局所的治療が困難であり、副作用が生じやすいという問題もあった。

このような問題に鑑み、本発明者は、ガン細胞から排出されにくい新たな抗ガン剤を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、カテナン化合物を有効成分として含有する抗ガン剤の開発に成功した（特許文献１参照）。抗ガン作用を有するこのカテナンは、アミド型［２］カテナンと呼ばれる化合物の一種であり、共有結合していない２つの分子環が鎖のように連結した構造を有している。

カテナンのように、一部が共有結合によって結合していない高分子新奇化合物は、分子量が比較的大きく且つ分子が変形しやすいため、一旦ガン細胞に取り込まれれば容易に排出されないものと考えられる。しかも、このような高分子新奇化合物は、本来細胞内に吸収されにくい。このため、これをガン細胞に対して局所的に使用すれば、正常細胞に与える影響を極めて小さく抑えつつ、ガン細胞の増殖を効果的に抑制することが可能となる。

このような高分子新奇化合物としては、カテナンの他にロタキサン（Rotaxane）と呼ばれる化合物が知られている（非特許文献１〜３参照）。本発明者は、特許文献１においてロタキサンの抗ガン作用を予言しており、これを実証すべく鋭意研究を行った。

本発明は、このような背景のもとなされたものであって、ロタキサン化合物を有効成分として含有する抗ガン剤を提供することを目的とする。

本発明者は、抗ガン作用を有するロタキサン化合物を見いだすべく、鋭意研究を重ねた。その結果、一部のロタキサン化合物に抗ガン作用が確認された。

すなわち、本発明による抗ガン剤は、化学式（Ｉ）

で表されるロタキサン化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

このロタキサン化合物は、正式には、[2] [bis (2- (3,5-dimethylphenylcarbonyloxy) ethyl) ammonium trifluoromethanesulfonate] - [dibenzo-24-crown-8] rotaxaneと呼ばれる化合物であり、分子量は８１９である。このロタキサン化合物は熱に対して比較的安定であり、有機溶媒に可溶且つ水に不溶である。

上記化学式（Ｉ）に示すように、このロタキサン化合物は、両端に比較的大きな分子が結合した棒状部分と、この棒状部分が挿入された環状部分（クラウンエーテル）の２つの部分からなる。環状部分は、棒状部分が挿入された状態であるため、棒状部分を軸として移動することができる。しかしながら、棒状部分の両端には比較的大きな分子が結合しているため、これがストッパーとなって環状部分が棒状部分から離脱することはできない。

このように、棒状部分と環状部分は連結した構造を有しているものの、これら棒状部分と環状部分とは共有結合によって結合していない。このため分子の形状が変化しやすく、受容体を介した取り込みが比較的困難となるが、これをガン細胞内に導入するとガン細胞の増殖が抑制される。

このロタキサン化合物をガン細胞内に導入するには、ガン細胞の細胞膜に孔を開け、この孔から細胞内に導入することが好ましい。細胞膜に孔を開ける方法としては、エレクトロポレーション法を用いることができる。エレクトロポレーション法を用いれば、局所的に上記ロタキサン化合物を導入することができることから、正常細胞に取り込まれる量を極めて少なくすることができ、その結果、副作用など患者の負担を軽減することが可能となる。

現在のところ、本発明者により抗ガン作用が確認されたロタキサン化合物は上記化学式に示すロタキサン化合物だけである。しかしながら、細胞内に取り込まれにくく且つ一旦取り込まれれば容易に排出されないというロタキサン化合物全般が有する特徴を考えれば、上記化学式に示すロタキサン化合物以外にも、抗ガン作用を持つ他のロタキサン化合物が存在するものと予測される。

このように、本発明によれば、ガン細胞から排出されにくく且つ局所的治療に好適な抗ガン剤を提供することが可能となる。

以下、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。

本発明による抗ガン剤は、上記化学式（Ｉ）で表されるロタキサン化合物を有効成分として含有している。このロタキサン化合物の合成方法については特に限定されないが、スリッピング法によって合成可能である。

このようにして得られたロタキサン化合物は、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）等の溶剤に溶解することから、この溶液を抗ガン剤として用いることができる。溶液中のロタキサン濃度としては、特に限定されるものではないが１０ｎＭ（ナノモル濃度）とすることが好ましく、１００ｎＭ以上とすることが特に好ましい。これは、溶液中のロタキサン濃度が１０ｎＭ未満であってもガン細胞の増殖をある程度遅延させる効果は現れるものの、１０ｎＭ以上とすれば明確な増殖遅延効果が現れるからである。また、１００ｎＭ以上とすれば、ガン細胞の増殖抑制効果が顕著となり、時間の経過とともにガン細胞を減少させることが可能となる。

このロタキサン化合物を構成する「棒状部分」と「環状部分」は、共有結合によって結合していない。このため形状が変化しやすく、受容体を介した取り込みが比較的困難である。このため、このロタキサン化合物をガン細胞内に導入するためには、エレクトロポレーション法を用いてガン細胞の細胞膜に孔を開けることが好ましい。エレクトロポレーションによって細胞膜に形成された穴は、電圧の印加を停止すると速やかに修復される。エレクトロポレーション時における電圧波形はＤＣパルスとすることが好ましく、パルス電圧は１０〜４０Ｖ、パルス幅は１０ｍｓｅｃ程度、パルス周期は３ｓｅｃ程度とし、１０回程度のパルスを印加することが好ましい。

そして、エレクトロポレーション法等によりこのロタキサン化合物をガン細胞内に取り込めば、ガン細胞はこれを容易に排出することができないため長時間に亘って作用するだけでなく、このロタキサン化合物に対する耐性も非常に現れにくくなる。

次に、本発明の実施例について説明する。

ロタキサン化合物の抗ガン作用を検証する前に、溶媒濃度の設定及びエレクトロポレーションの条件設定を行った。前者は、溶媒として用いるＤＭＳＯがガン細胞に対してラジカルスカベンジャーとして作用するため、ＤＭＳＯのラジカルスカベンジ作用を実質的に無視しうる状態で検証を行う必要があるためである。また、後者は、エレクトロポレーション時に印加する電圧が高すぎると細胞障害が生じるため、エレクトロポレーションによるガン細胞への影響を実質的に無視しうる状態で検証を行う必要があるためである。

［溶媒濃度の設定］

まず、マウスの悪性黒皮腫細胞株（Ｂ１６）を用意し、これを９６ウェルのマイクロプレートにそれぞれ約５０００個播種した。そして、各ウェルにＤＭＳＯを加えることにより、それぞれ全量を１００ｍＬとした。添加したＤＭＳＯの濃度は、サンプルＡ０〜Ａ５についてそれぞれ表１の通りに設定した。

次に、これらサンプルＡ０〜Ａ５に含まれる細胞株をＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。ＣＯ_２インキュベーターの温度は３７．０℃、ＣＯ_２濃度は５．０％に設定した。次に、細胞増殖試験試薬（生化学工業株式会社製、商品名「Tetra Color One」）を各サンプルに１０μＬ加え、ＣＯ_２インキュベーターで２時間反応させた。そして、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度（対照波長：６００ｎｍ）を測定することにより、細胞株の生存率を測定した。生存率の測定は、細胞増殖試験試薬を反応させた後、２４時間、４８時間及び７２時間の時点でそれぞれ行った。

測定の結果を図１に示す。図１に示すように、溶媒であるＤＭＳＯの濃度が高くなるとラジカルスカベンジ作用が高発現し、ガン細胞の増殖が抑制されることが確認された。このため、ＤＭＳＯの濃度としては、ガン細胞に対して最も影響の少ない０．１％（サンプルＡ１）に決定した。したがって、以下の実験におけるＤＭＳＯ濃度は全て０．１％に固定した。

［エレクトロポレーションの条件設定］

一対の電極を持つ複数のキュベット（BTX社製、商品名「ECM399」）に約５０００個の悪性黒皮腫細胞株（Ｂ１６）と、ＤＭＳＯ（０．１％）を加え、全量をそれぞれ６００ｍＬとした。そして、各キュベットの電極にＤＣパルスを印加し、エレクトロポレーション操作を行った。パルス電圧は、サンプルＢ０〜Ｂ４についてそれぞれ表２の通りに設定した。パルスの印加数は、各サンプルとも１０回とし、パルス周期は約１０ｍｓｅｃ、パルス周期は約３ｓｅｃとした。

次に、これらサンプルＢ０〜Ｂ４に含まれる細胞株を上述した［溶媒濃度の設定］と同じ条件で培養し、細胞増殖試験試薬を反応させた。そして、２４時間後、４８時間後及び７２時間後における細胞株の生存率を測定した。

測定の結果を図２に示す。図２に示すように、エレクトロポレーションを行っていないサンプルＢ０とほぼ同じ結果がサンプルＢ３にて得られた。このため、エレクトロポレーション時の印加電圧としては、ガン細胞に対して最も影響の少ない３０Ｖに決定した。したがって、以下の実験におけるエレクトロポレーション時の印加電圧は、全て３０Ｖに固定した。

［抗ガン作用の検証１（エレクトロポレーションなし）］

悪性黒皮腫細胞株（Ｂ１６）を９６ウェルのマイクロプレートにそれぞれ約５０００個播種し、各ウェルにＤＭＳＯ（０．１％）と式（Ｉ）に示したロタキサン化合物を加えることにより、それぞれ全量を１００ｍＬとした。添加したロタキサン化合物の濃度は、サンプルＣ０〜Ｃ２についてそれぞれ表３の通りに設定した。

次に、これらサンプルＣ０〜Ｃ２に含まれる細胞株を［溶媒濃度の設定］と同じ条件で培養し、細胞増殖試験試薬を反応させた。そして、０時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後における細胞株の生存率を測定した。

測定の結果を図３に示す。図３に示すように、ロタキサン化合物の濃度が高いほど培養後の細胞数が少なく、これにより式（Ｉ）に示したロタキサン化合物にガン細胞の増殖遅延効果があることが確認された。ロタキサン化合物の作用機序の詳細は明らかではないが、ロタキサン化合物は時間依存ではなく、濃度依存的に細胞の増殖抑制に関与していると考えられ、細胞周期に依存しないと思われる。

［抗ガン作用の検証２（エレクトロポレーションあり）］

一対の電極を持つ複数のキュベットに約５０００個の悪性黒皮腫細胞株（Ｂ１６）と、ＤＭＳＯ（０．１％）と、式（Ｉ）に示したロタキサン化合物とを加え、全量をそれぞれ６００ｍＬとした。そして、各キュベットの電極に３０ＶのＤＣパルスを１０回印加し、エレクトロポレーション操作を行った。添加したロタキサン化合物の濃度は、サンプルＤ０〜Ｄ２についてそれぞれ表４の通りに設定した。

次に、これらサンプルＤ０〜Ｄ２に含まれる細胞株を［溶媒濃度の設定］と同じ条件で培養し、細胞増殖試験試薬を反応させた。そして、０時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後における細胞株の生存率を測定した。

測定の結果を図４に示す。図４に示すように、エレクトロポレーションを行うとガン細胞の増殖抑制効果がより顕著となった。特に、ロタキサン化合物の濃度が１００ｎＭであるサンプルＤ２では、時間の経過とともにガン細胞が減少していることが確認された。これにより、ロタキサン化合物の濃度を１００ｎＭ以上とし、且つ、エレクトロポレーションを行うことにより、著しいガン細胞の増殖抑制効果があることが確認された。

また、時間的あるいは濃度的な結果から、抗ガン剤の分類として高濃度で短時間に作用すると示唆された。

［既存の抗ガン剤との比較］

Apoptosis抵抗性遺伝子Bcl-2のmRNA発現、Apoptosis促進性遺伝子Bax及びBadのmRNA発現、並びに、細胞死の実行遺伝子Caspase-3のmRNA発現について、β-actinの通常タンパクを基に検討し、既存の抗ガン剤である5-FUと比較した。各mRNA発現は、Total RNA抽出後、PCR（Polymerase Chain Reaction）法により行い、Agarose gel electorophoresisにより泳動後、蛍光測定により、抗ガン剤を使用しないサンプル（control）との蛍光比を求めた。

結果を図５に示す。図５に示すように、得られた蛍光比はロタキサン化合物と5-FUとで概ね類似していた。しかし、ロタキサン化合物の用量は5-FUの１０分の１以下であり、既存の抗がん剤より抗腫瘍作用が強いことが明らかとなった。以上より、式（Ｉ）に示したロタキサン化合物は抗ガン剤として有用と考えられる。

サンプルＡ０〜Ａ５の評価結果を示すグラフである。 サンプルＢ０〜Ｂ４の評価結果を示すグラフである。 サンプルＣ０〜Ｃ２の評価結果を示すグラフである。 サンプルＤ０〜Ｄ２の評価結果を示すグラフである。 既存の抗ガン剤との比較結果を示す表である。

Claims (4)

1. 化学式（Ｉ）
   

   

   
   で表されるロタキサン化合物を有効成分として含有する抗ガン剤。
2. 前記ロタキサン化合物は溶液中に溶解しており、前記ロタキサン化合物の前記溶液中における濃度が１０ｎＭ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗ガン剤。
3. 前記ロタキサン化合物は溶液中に溶解しており、前記ロタキサン化合物の前記溶液中における濃度が１００ｎＭ以上であることを特徴とする請求項２に記載の抗ガン剤。
4. 前記ロタキサン化合物がエレクトロポレーション法によって細胞内に導入されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の抗ガン剤。

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