JP3850181B2

JP3850181B2 - Optical measurement method and apparatus

Info

Publication number: JP3850181B2
Application number: JP25529699A
Authority: JP
Inventors: 俊仁木村
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: JP2001074657A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光計測方法および装置に関し、詳細には励起光の照射により、蛍光色素で標識された検体等から発生する蛍光を検出する光計測方法および装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子工学分野における技術が急速に発展し、１０万個にも及ぶと考えられているヒトゲノムの塩基配列を解読することを１つの目的とするヒトゲノムプロジェクトが展開されている。
【０００３】
一方、各種遺伝子疾患に影響を与えているＤＮＡに関する研究も進んでおり、その１つの方法としてマイクロアレイ技術が注目されている。
【０００４】
このマイクロアレイ技術は、既に解読されている多数の異なるｃＤＮＡ（特異的結合物質の一例）を基板となるスライドガラス上の１．８×１．８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０〜１５０（μｍ）のスポットとして約６４００個並べたマイクロアレイと称するもの、またはｃＤＮＡをナイロンメンブレンフィルタ上の８×１２（ｃｍ）、７×５（ｃｍ）または２２×２２（ｃｍ）の範囲にドットサイズ約０．５〜１（ｍｍ）のスポットとしてそれぞれ５８８個、５０００個、２７０００個並べたマクロアレイと称するもの、あるいは合成オリゴヌクレオチドをシリコン基板上の１．２８×１．２８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０（μｍ）のスポットとして約６４０００個並べたＤＮＡチップと称するもの等を用いた技術である（上記マイクロアレイ、マクロアレイおよびＤＮＡチップ等を相称して本件では「ＤＮＡアレイ」と称することとする。）。
【０００５】
すなわち、蛍光色素ａで標識された健常者の細胞から取り出したＤＮＡの検体Ａをピペット等でこのＤＮＡアレイ上の各ｃＤＮＡに滴下して、検体ＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このハイブリタイズの処理の後にＤＮＡアレイは所定の溶液で処理され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされなかった検体Ａは各スポットから除去され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされた検体Ａは各スポットに残される。そして、上記処理が施されたＤＮＡアレイ上の各検体のスポット（以後検体スポットと呼ぶ）に、蛍光色素ａを励起する励起光Ｌａを相対的に走査して、この励起光Ｌａの照射により発生した蛍光の検出結果を表す標識信号を得る。
【０００６】
上記と同様の処理を、蛍光色素ｂで標識された遺伝子疾患を有する者の細胞から取り出したＤＮＡの検体Ｂに関しても行い、励起光Ｌｂの照射により発生した蛍光の検出結果を表す標識信号を得、各検体スポット毎に検体Ａの各検体スポットから得られた標識信号と検体Ｂの各検体スポットから得られた標識信号との比の値を求める。
【０００７】
これらの標識信号の比の値は、異常のあるＤＮＡが滴下された検体スポットほど大きくなる（あるいは小さくなる）ことから、各検体スポットにおける標識信号の比の値が大きい方から順に例えば５０箇所分の標識信号の比の値を、その信号が得られた検体スポットと対応付ける表として読み取り、この表に基づいて異常のあるＤＮＡが特定される。
【０００８】
なお、担体上の各検体スポットから発せられる蛍光を検出する光学系には空間分解能が高く焦点深度が浅い共焦点光学系が多く用いられているので、共焦点光学系の焦点位置に一致させたＤＮＡアレイ上の検体スポットへの励起光の照射により検体スポットから発せられた蛍光を前記共焦点光学系の他方の焦点位置に配設されたピンホールを通過させて検出することにより、上記検体スポット以外の位置で発生した蛍光等のノイズを除去することができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＤＮＡアレイ上の各検体スポットの厚さは１ミクロン以下と非常に薄く、励起光が照射されると検体スポットのみならず、検体スポットと密着してこの検体スポットを保持している担体にも強い励起光が照射され、この励起光が照射された担体を形成する成分からも蛍光が発生することがある。この、測定対象ではない担体から発生した蛍光は、検体スポットから発生する蛍光の光路とほぼ等しい光路を進むので、ピンホールによっても十分に除くことができず、検出スポットから発生した蛍光と共に検出器に入射し検出されてしまうことになる。
【００１０】
すなわち、本来の測定対象である検体スポットから発生した蛍光に、担体から発生した測定対象ではない蛍光が混入し、多くのノイズを含む蛍光となり、このノイズを多く含む蛍光が検出されると、各検体スポットから発生する蛍光の強度を高い精度で検出することが困難になる。
【００１１】
なお、この種の課題はＤＮＡアレイの技術に限らず、励起光が照射された検出対象となる被検物（以下総称して検体という）の１点から発せられる蛍光のみを測定対象とする他の光計測装置にも共通する課題である。
【００１２】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、測定対象となる検体以外から発生した蛍光の検出器への入射を低減し、検出される蛍光のＳ／Ｎ比を高めることにより、信頼性の高い計測結果を得ることができる光計測方法および装置を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の光計測方法は、蛍光色素で標識された検体等に励起光を照射し、この励起光の照射により検体等から発生した蛍光を平行光束とし、この平行光束の中央部の光束を遮光部材で遮光して、平行光束の周辺部のみを直進させた後ピンホールに集光し、ピンホールを通過した蛍光を検出することを特徴とするものである。
本発明の他の光計測方法は、蛍光色素で標識された検体等に励起光を照射し、この励起光の照射により検体等から発生した蛍光を平行光束とし、この平行光束の中央部の光束を分散させて、平行光束の周辺部のみを直進させた後ピンホールに集光し、ピンホールを通過した蛍光を検出することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の光計測装置は、蛍光色素で標識された検体等に励起光を照射する照射手段と、該励起光の照射により前記検体から発生した蛍光を平行光束とする第１の光学部材と、該平行光束の中央部の光束を遮光部材で遮光して、該平行光束の周辺部のみを直進させる手段と、前記平行光束の周辺部を集光する第２の光学部材と、該集光された前記光束の集光点に配設されたピンホールと、該ピンホールを通過した前記蛍光を検出する検出器とを備えたことを特徴とするものである。
前記平行光束の周辺部のみを直進させる手段は、第２の光学部材と一体化したり交換可能としたりすることができる。
本発明の他の光計測装置は、蛍光色素で標識された検体等に励起光を照射する照射手段と、該励起光の照射により前記検体から発生した蛍光を平行光束とする第１の光学部材と、該平行光束の中央部の光束を分散させて、該平行光束の周辺部のみを直進させる手段と、前記平行光束の周辺部を集光する第２の光学部材と、該集光された前記光束の集光点に配設されたピンホールと、該ピンホールを通過した前記蛍光を検出する検出器とを備えたことを特徴とするものである。
前記平行光束の周辺部のみを直進させる手段は、平行光束の中央部の光束を分散させる凸レンズまたは凹レンズ、あるいは光拡散板等の光学部材とすることができ、さらにこれらの手段は、第２の光学部材と一体化したり交換可能としたりすることができる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の光計測方法および装置によれば、励起光の照射により、担体に付着させた検体スポットから発生した蛍光を第１の光学部材により平行光束とし、この平行光束の中央部の光束を屈折または分散させて平行光束の光路から除き、周辺部の光束のみを第２の光学部材に入射させ集光させてピンホールを通過させることにより蛍光を検出するので、検体スポットの前後に配された担体等から発生する測定対象外の蛍光がノイズとして検出される割合を少なくすることができる。
【００１６】
すなわち、上記ピンホールの径が理想的に極めて小さければこのピンホールを通過することができる光束は、検体スポットから発光し、光軸に平行に進み第２の光学部材の焦点位置に配されたピンホールに収束する光だけであるからノイズはないが、実際のピンホールには製作上の機械的誤差および組み立て上の位置決め誤差等があるので、極端にピンホール径を小さくすると、検体スポットから発生する測定対象となる蛍光もピンホールによってカットされてしまう。ところが、ピンホールＰｈの前後に収束する光束の中で、担体から発生する光は入射角度が浅い光束（光軸と成す角度が小さい光束）なので、第１と第２の光学部材との間に光束の中央部を遮光する手段を配設すれば、主に上記入射角度が浅い光を遮光できるので、検体スポットから発生しピンホールＰｈを通過する蛍光の強度の減少に比して、担体から発生しピンホールＰｈを通過する、入射角度が浅い、測定対象外の蛍光の強度が大きく減少し、検出される蛍光の強度に占める検体スポットから発生する蛍光の割合が相対的に大きくなる。従って、本来の測定対象である検体スポットから発生する蛍光を高Ｓ／Ｎ比で検出することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の光計測方法を実施する光計測装置を適用したＤＮＡアレイ読取装置の具体的な実施の形態について図を参照して説明する。
【００１８】
図１は、本発明の実施の形態であるＤＮＡアレイ読取装置を示す斜視図、図２は図１に示したＤＮＡアレイ読取装置による読取対象となるＤＮＡアレイ試験片１０の斜視図、図３は図２のＩ−Ｉ位置における断面図である。
【００１９】
ＤＮＡアレイ試験片１０は、スライドガラスからなる坦体１１の表面Ｂａに、複数の既知のｃＤＮＡ（特異的結合物質の一例）と蛍光色素で標識されたＤＮＡとをハイブリタイズさせ、所定の溶液で処理された検体スポット（以下検体スポットＫｓｐと呼ぶ）をマトリクス状に配置したものであり、坦体１１の厚さは１ｍｍ程度であり、坦体１１上に配置される検体スポットＫｓｐの厚さは１μｍ以下、スポット径は３０〜１００μｍ、各スポットの間隔は３００μｍ程度となっている。
【００２０】
ＤＮＡアレイ読取装置１００は、図１に示すようにレーザ光源４０から発せられた励起光Ｌｅをダイクロイックミラー５４により反射させてＤＮＡアレイ試験片１０に配された検体スポットに第１集光レンズ５１を通して照射し、該励起光の照射により検体スポットから発生した蛍光Ｋｅを、共焦点光学系を形成する第１集光レンズ５１および第２集光レンズ５２を介して検出器７０に入射させ検出する構成となっている。
【００２１】
ＤＮＡアレイ試験片１０の下方に配置された共焦点光学系の光軸上には第１集光レンズ５１、ダイクロイックミラー５４、中央部に光を遮光する領域を備えた中央光束遮光板６０、第２集光レンズ５２、ピンホール板５３およびフォトマルチプライヤからなる検出器７０がこの順に配設され、第２集光レンズ５２側の焦点にはピンホール板５３のピンホールＰｈが、また第１集光レンズ５１側の焦点にはＤＮＡアレイ試験片１０上の検体スポットＫｓｐが一致するように配置されており、さらにピンホールＰｈを通過した蛍光を受光する位置に検出器７０が配置されている。
【００２２】
なお、中央光束遮光板６０は、図４（ａ）の平面図、および図４（ｂ）の側面図に示されるように平板ガラス６１の中央部に黒アルマイト処理をした円盤６２を接着したものであり、第１集光レンズ５１と第２集光レンズ５２との間に配設され、第１集光レンズ５１から第２集光レンズ５２に向う光束の中央部を遮光し周辺部の光束のみを通過させる。また、上記ダイクロイックミラー５４は検体から発せられる蛍光Ｋｅを透過させ励起光Ｌｅを反射させる波長特性を備えている。
【００２３】
検体スポットＫｓｐを励起させる波長領域の励起光Ｌｅを平行光束として射出するレーザ光源４０は、この射出された平行光束が、ダイクロイックミラー５４によって検体スポット側に反射され共焦点光学系の光軸に同軸となるように配設されている。
【００２４】
ＤＮＡアレイ試験片１０が載置されるステージ３０には、ステージ３０をＸ−Ｙの方向（図１参照）に２次元状に可動させるステッピングモータ２１、２２が配設され、これらのステッピングモータ２１、２２には共焦点光学系を形成する第１集光レンズ５１側の焦点に検体スポットＫｓｐを順次移送するように各所定の位置を入力する座標コントローラ８０が接続されている。
【００２５】
ここで、座標コントローラ８０により第１および第２のステッピングモータ２１，２２に対して入力される所定の位置とは、ＤＮＡアレイ試験片１０におけるマトリクス状の全ての検体スポットＫｓｐの位置を意味する。
【００２６】
次にＤＮＡアレイ読取装置の作用について説明する。まず始めにＤＮＡアレイ試験片１０が、ステージ３０上の決められた位置に載置される。このとき、ＤＮＡアレイ試験片１０上の検体スポットの各位置を、ステージ３０上のＸ軸方向およびＹ軸方向の座標に対応付けるように各検体スポットの位置の座標を座標コントローラ８０に記憶させる。各ステッピングモータ２１，２２は、座標コントローラ８０に記憶された座標に基づいて、ＤＮＡアレイ試験片１０上の最初の検体スポットＫｓｐ（１，１）の位置に励起光Ｌｅが照射されるように、ステージ３０をＸ−Ｙ平面内に移動させ位置決めする。
【００２７】
ステージ３０のセッティングが完了すると励起光Ｌｅがレーザ光源４０から射出され、ダイクロイックミラー５４により反射され第１集光レンズ５１によって検体スポットＫｓｐ（１，１）上に集光され、励起光Ｌｅが照射された検体スポットＫｓｐ（１，１）から発生した蛍光Ｋｅは、第１集光レンズ５１によって平行光束とされダイクロイックミラー５４を透過する（このとき蛍光Ｋｅに混入する励起光Ｌｅはダイクロイックミラー５４によって反射され検出器に向かう光路から除去される）。ダイクロイックミラー５４を透過した平行光束は中央光束遮光板６０によって中央部の光束が遮光され周辺部の光束のみが第２集光レンズ５２によって集光されピンホールＰｈを通過して検出器７０に入射し、検出器７０によってその強度が検出され外部の処理装置２００に出力される。
【００２８】
外部の処理装置２００には、座標コントローラ８０から出力された検体スポットＫｓｐ（１，１）の位置と検出器７０から出力された蛍光の強度値とが入力され対応づけられて記憶される。
【００２９】
ここで、中央光束遮光板に関する作用の詳細を説明する。図５（ａ）〜（ｃ）に示すようにＤＮＡアレイ読取装置の光学系を簡略化し、共焦点光学系９０を第１集光レンズ９１と第２集光レンズ９２によって形成する。この共焦点光学系の光軸をＺ軸とし、第１集光レンズ９１側の焦点位置をＺｐおよび第２集光レンズ９２側の焦点位置をＺｑとしてピンホールＰｈ１をＺｑの位置に一致させるようにピンホール板９３を配設する。
【００３０】
図５（ｂ）に示すようにＺｐに点光源Ｔｇを配置すると、点光源Ｔｇから発せられる光Ｌｉは第１集光レンズ９１によって平行光束とされ、この平行光束は集光Ｎ１レンズによってピンホールＰｈ１に集光されてピンホールＰｈ１を通過する。
【００３１】
次に点光源ＴｇをＺ軸に沿って点Ｚｐの位置から−の方向のに移動し図５（ａ）に示すようにＺｐ-1の位置に移動すると、点光源Ｔｇから発せられた光Ｌｉは集光Ｍ１レンズによって平行光束とはならずに収束する光束となり第２集光レンズ９２によってピンホールＰｈ１のＺ軸方向マイナス側の点Ｚｑ-1に集光されピンホールＰｈ１を通過する。このとき点Ｚｑ-1に集光される光Ｌｉの中で入射角度が浅い光束（光軸と成す角度が小さい光束）のみが選択的にピンホールＰｈ１を通過するので、点Ｚｐ-1から発生し第１集光レンズ９１および第２集光レンズ９２を経由してピンホールＰｈ１通過する光束の径は細くなり、開口角も小さくなる。
【００３２】
また反対に、点光源ＴｇをＺ軸に沿ってＺｐの位置から＋の方向に移動し、図５（ｃ）に示すようにＺｐ+1の位置に移動すると、点光源Ｔｇから発せられた光Ｌｉは集光Ｍ１レンズによって発散する光束となり集光Ｎ１レンズによってピンホールＰｈ１のＺ軸方向プラス側の点Ｚｑ+1に集光される。このとき上記と同様に点Ｚｑ+1に集光される光Ｌｉの中で入射角度が浅い光束（光軸と成す角度が小さい光束）のみが選択的にピンホールＰｈ１を通過するので、点Ｚｐ+1から発生し第１集光レンズ９１および第２集光レンズ９２を経由してピンホールＰｈ１を通過する光束の径は細くなり、開口角も小さくなる。
【００３３】
上記点光源Ｔｇの位置とピンホールＰｈ１を通過する光Ｌｉの強度との関係は、図５（ｄ）の曲線ＫＲ（ｚ）に示すような深度応答曲線となり、点光源Ｔｇの位置がＺｏから離れるに従いその強度が減少し、点光源Ｔｇの位置をＺ軸のマイナスの方向に移動させた場合の方がプラス方向に移動させた場合に比してピンホールに入射する光量がより大きく減少する。
【００３４】
ここで、図６（ａ）〜（ｃ）に示すように上記共焦点光学系９０の第１集光レンズ９１と第２集光レンズ９２との間に中央光束遮光板９５を配設すると、中央部の光束は遮光され周辺部の光束のみがピンホールを通過するようになる。従って、点光源ＴｇがＺｐ、Ｚｐ+1、Ｚｐ-1のどの位置にあっても中央光束遮光板９５が配設されていない場合より検出される蛍光の強度値が減少するが、その減少の割合は点光源Ｔｇの位置によって異なり、図６（ｄ）の深度応答曲線ＫＳ（ｚ）に示すように点光源Ｔｇの位置をＺ軸のマイナスの方向に移動させた場合の方がプラス方向に移動させた場合に比してピンホールに入射する光量がより極端に減少する。
【００３５】
すなわち、図７に示すようにＺｐから発生する測定対象となる蛍光ｖと、Ｚｐ以外の位置から発生するノイズとなる蛍光ｗとが同時に発生するような場合には、ピンホールＰｈ１を通過する全強度（蛍光ｖの強度＋蛍光ｗの強度）に含まれる測定対象となる蛍光ｖの強度の割合は、中央光束遮光板９５が配設された場合の方が大きくなり、測定対象となる蛍光ｖをより高いＳ／Ｎ比で検出することができる。特に焦点位置ＺｐのＺ軸方向マイナス側から発生するノイズとなる蛍光Ｗを遮断する効果は極めて高い。
【００３６】
上記のことをＤＮＡアレイ読取装置に対応させて説明する。図８に示すように、レーザ光源４０から射出された励起光Ｌｅはダイクロイックミラー５４によって反射され第１集光レンズ５１によって担体１１に保持された検体スポットＫｓｐに集光されるが、一部の励起光Ｌｅは検体スポットＫｓｐを透過して担体の内部も照射する。励起光Ｌｅが照射された検体スポットＫｓｐ近傍の担体、例えば点Ｐからは測定対象ではないノイズとなる蛍光ｗ（以後、担体蛍光ｗと呼ぶ）が発生し、検体スポットＫｓｐから発生した測定対象となる蛍光ｖ（以後、検体蛍光ｖと呼ぶ）と共に第１集光レンズ５１によって概略平行光束とされダイクロイックミラー５４を透過する。ダイクロイックミラー５４を透過した検体蛍光ｖと担体蛍光ｗは第２集光レンズ５２によって集光されピンホールＰｈを通過し検出器７０によってその強度が検出される。このときノイズとなる担体蛍光ｗの光量の多くはピンホール板５３によって検出器７０への入射が阻止されるが光軸Ｚ上の検体スポットＫｓｐの後方に位置する担体から発生し光軸に沿った光路を進む担体蛍光ｗはピンホールＰｈを通過しノイズとして検出される。ここで、中央光束遮光板６０を第１集光レンズ５１と第２集光レンズ５２の間に挿入すると、前記のようにノイズとなる担体蛍光ｗの強度を測定対象である検体蛍光ｖの強度より大きな割合で減少させることができるので検出器７０で検出される蛍光の強度に含まれるノイズの割合は減少する。
【００３７】
最初の検体スポットＫｓｐ（１，１）における計測が終了すると、座標コントローラ８０から次の計測位置がステッピングモータ２１，２２に入力され、検体スポットＫｓｐ（２，１）に励起光Ｌｅが照射されるようにＤＮＡアレイ試験片１０は移動される。そしてこの検体スポットＫｓｐ（２，１）に励起光Ｌｅが照射され、最初の検体スポットＫｓｐ（１，１）を計測したときと同様の計測が行われ、その結果は前記と同様に外部の処理装置２００に記憶される。なお、上記計測においては各検体スポットＫｓｐから発生する蛍光の相対的な強度を検出すればよいので、検出される蛍光の強度の絶対値が中央光束遮光板の挿入によって減少しても計測精度を劣化させることはない。
【００３８】
以上の操作を繰り返すことにより、ＤＮＡアレイ試験片１０上の全ての検体スポットＫｓｐを計測し、処理装置２００にこれらの全ての検体スポットＫｓｐの位置と検体スポットから発生した蛍光の強度の値とが対応付けられて記憶される。さらに蛍光色素ｂで標識されたＤＮＡの検体ＢとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせ所定の溶液で処理されたＤＮＡアレイ試験片に関しても同様の計測が行われ、これらの対応関係に基づいて、周知のようにＤＮＡ発現解析等が行われる。
【００３９】
また、中央光束遮光板６０の中央の遮光領域は、光が完全に遮光されなくても透過光量を減衰させる領域であればよく、金属薄膜を蒸着したもの、あるいは光を拡散するように粗面加工したもの等であってもよい。また、その構造は、例えば図９（ａ）に示すようにリング６３の中央部の遮光板６２を３本の支柱６４で支持する等の構造であってもよい。
【００４０】
また、中央光束遮光板６０は、図９（ｂ）、（ｃ）に示すように平板ガラス６１の中央に凸部もしくは凹部を設け、ピンホールＰｈに向う光を途中で屈折させ、分散させて光路から除外する遮光領域を備えた光学部材とすることもできる。
【００４１】
また、中央光束遮光板６０を交換可能に配設することにより、中央部の遮光領域の大きさを変える等、各計測内容に適した検出形態を整えることによりさらにＳ／Ｎ比の高い検出を行うことができる。
【００４２】
また、図９（ｄ）に示すように第２集光レンズ５２の中央部に凸部を設ける等、前記の遮光手段を第２集光レンズ５２の中央部に一体に形成することにより上記と同等の効果を得ることができる。
【００４３】
上記のように本発明による光計測方法および装置によれば、測定対象となる検体以外から発生した蛍光の検出器への入射を低減し、検出される蛍光のＳ／Ｎ比を高めることにより、信頼性の高い計測結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＮＡアレイ読取装置の一実施形態を示す図
【図２】ＤＮＡアレイ読取装置に使用されるＤＮＡアレイ試験片を示す図
【図３】ＤＮＡアレイ試験の断面図
【図４】中央光束遮光板の構造を示す図
【図５】検体スポットの前後から発生しピンホールに入射する蛍光の光路を説明する図
【図６】検体スポットの前後から発生しピンホールに入射する蛍光の強度を減衰させる効果を説明する図
【図７】中央光束遮光板の有無による測定対象外の蛍光の混入割合の差を説明する図
【図８】測定対象外の蛍光の検出光路への混入を減少させる説明図
【図９】中央光束遮光板の例
【符号の説明】
１０ＤＮＡアレイ試験片
１１坦体
２１ステッピングモータ
２２ステッピングモータ
３０ステージ
４０レーザ光源
５１第１集光レンズ
５２第２集光レンズ
５３ピンホール板
５４ダイクロイックミラー
６０中央光束遮光板
７０検出器
８０座標コントローラ
１００ＤＮＡアレイ読取装置
Ｌｅ励起光
Ｋｅ蛍光
Ｋｓｐ検体スポット
Ｐｈピンホール[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an optical measurement method and apparatus, and more particularly to an optical measurement method and apparatus for detecting fluorescence generated from a specimen or the like labeled with a fluorescent dye by irradiation with excitation light.
[0002]
[Prior art]
In recent years, rapid progress in technology in the field of genetic engineering has led to the development of a human genome project with the goal of deciphering the base sequence of the human genome, which is thought to be as many as 100,000.
[0003]
On the other hand, research on DNA affecting various gene diseases is also progressing, and microarray technology is attracting attention as one of the methods.
[0004]
In this microarray technology, a large number of different cDNAs (examples of specific binding substances) that have already been decoded have a dot size of 50 to 150 (μm) in the range of 1.8 × 1.8 (cm) on a glass slide as a substrate. )), A so-called microarray in which about 6400 spots are arranged, or a dot size of about 0. 12 (cm), 7 x 5 (cm) or 22 x 22 (cm) on a nylon membrane filter. Dot size within a range of 1.28 x 1.28 (cm) on a silicon substrate, or a 5 to 1 (mm) spot, called a macroarray with 588, 5000, and 27000, respectively. This technique uses what is called a DNA chip in which about 64,000 spots are arranged as 50 (μm) spots. Roarei, in the present case referred a macro array, and DNA chips phases is referred to as a "DNA array".).
[0005]
That is, a sample A of DNA extracted from a healthy person's cell labeled with a fluorescent dye a is dropped onto each cDNA on the DNA array with a pipette or the like, and the sample A and the cDNA are hybridized. After this hybridization process, the DNA array is treated with a predetermined solution, the specimen A that has not been hybridized with cDNA is removed from each spot, and the specimen A that has been hybridized with cDNA remains at each spot. Then, the spot of each specimen on the DNA array subjected to the above processing (hereinafter referred to as specimen spot) is relatively scanned with excitation light La that excites the fluorescent dye a, and is generated by irradiation of the excitation light La. A labeled signal representing the detection result of the detected fluorescence is obtained.
[0006]
The same processing as described above is performed on the sample B of DNA taken from the cell of a person having a genetic disease labeled with the fluorescent dye b, and a labeled signal representing the detection result of the fluorescence generated by irradiation with the excitation light Lb is obtained. Then, for each sample spot, the value of the ratio between the label signal obtained from each sample spot of the sample A and the label signal obtained from each sample spot of the sample B is obtained.
[0007]
The value of the label signal ratio increases (or decreases) as the sample spot where the abnormal DNA is dropped, and therefore, for example, for 50 spots in order from the highest value of the label signal ratio in each sample spot. The label signal ratio value is read as a table corresponding to the specimen spot from which the signal was obtained, and abnormal DNA is identified based on this table.
[0008]
Note that confocal optical systems with high spatial resolution and shallow depth of focus are often used as optical systems for detecting fluorescence emitted from each specimen spot on the carrier, so that the focal positions of the confocal optical systems are matched. By detecting the fluorescence emitted from the specimen spot by irradiating the specimen spot on the DNA array through a pinhole disposed at the other focal position of the confocal optical system, the specimen spot is detected. Noise such as fluorescence generated at other positions can be removed.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, the thickness of each sample spot on the DNA array is very thin, 1 micron or less. When irradiated with excitation light, not only the sample spot but also the carrier that holds the sample spot in close contact with the sample spot. In some cases, strong excitation light is irradiated, and fluorescence is also generated from components forming the carrier irradiated with the excitation light. The fluorescence generated from the carrier that is not the measurement target travels in an optical path that is almost the same as the optical path of the fluorescence generated from the specimen spot. Therefore, it cannot be sufficiently removed even by pinholes, and the detector together with the fluorescence generated from the detection spot. Will be detected.
[0010]
In other words, the fluorescence generated from the specimen spot that is the original measurement target is mixed with the fluorescence that is not the measurement target generated from the carrier, and becomes a fluorescence containing a lot of noise. It becomes difficult to detect the intensity of the fluorescence generated from the specimen spot with high accuracy.
[0011]
Note that this type of problem is not limited to DNA array technology, and only the fluorescence emitted from one point of a test object (hereinafter collectively referred to as a specimen) irradiated with excitation light is measured. This is a problem that is common to all optical measurement devices.
[0012]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and by reducing the incidence of fluorescence generated from other than the sample to be measured to the detector and increasing the S / N ratio of the detected fluorescence, An object of the present invention is to provide an optical measurement method and apparatus capable of obtaining a highly reliable measurement result.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
Optical measurement method of the present invention, the fluorescent dye is irradiated with excitation light labeled analytes such, the fluorescence generated from the specimen or the like by irradiation of the excitation light into a parallel light beam, blocks the light beam in the central portion of the parallel light beam The light is shielded by a member, and only the peripheral part of the parallel light beam is linearly traveled. Then, the light is condensed on the pinhole, and the fluorescence passing through the pinhole is detected.
Another optical measurement method of the present invention is to irradiate a specimen labeled with a fluorescent dye with excitation light, to convert the fluorescence generated from the specimen or the like by irradiation of the excitation light into a parallel light beam, and to a light beam at the center of the parallel light beam Is dispersed, and only the peripheral portion of the parallel light beam is made to travel straight, and then condensed on the pinhole, and the fluorescence that has passed through the pinhole is detected.
[0014]
The optical measurement device of the present invention includes an irradiation means for irradiating a sample or the like labeled with a fluorescent dye with excitation light, a first optical member that converts fluorescence generated from the sample by irradiation of the excitation light into a parallel light beam, the light beam of the central portion of the flat Yukimitsu bundle from light by a light shielding member, and means for linearly moving only the peripheral portion of the flat Yukimitsu bundle, and a second optical member for condensing the peripheral portion of the parallel light beam, is said population light And a pinhole disposed at a condensing point of the light beam, and a detector for detecting the fluorescence passing through the pinhole .
The means for linearly moving only the peripheral part of the parallel light beam can be integrated with the second optical member or exchangeable.
Another optical measurement apparatus according to the present invention includes an irradiating unit that irradiates a sample or the like labeled with a fluorescent dye with excitation light, and a first optical member that converts the fluorescence generated from the sample by irradiation of the excitation light into a parallel light beam. And means for dispersing the light beam at the center of the parallel light beam so that only the peripheral part of the parallel light beam goes straight, the second optical member for condensing the peripheral part of the parallel light beam, and the condensed light A pinhole disposed at a condensing point of the light beam and a detector that detects the fluorescence that has passed through the pinhole.
The means for linearly moving only the peripheral part of the parallel light beam can be a convex lens or a concave lens that disperses the light beam at the central part of the parallel light beam, or an optical member such as a light diffusing plate. It can be integrated with the optical member or exchangeable.
[0015]
【The invention's effect】
According to the optical measurement method and apparatus of the present invention, the fluorescence generated from the specimen spot attached to the carrier by the irradiation of the excitation light is converted into a parallel light beam by the first optical member, and the light beam at the center of the parallel light beam is refracted. Alternatively, the fluorescent light is detected by dispersing it and removing it from the optical path of the parallel light beam, allowing only the peripheral light beam to enter the second optical member, condensing it, and passing it through the pinhole. It is possible to reduce the rate at which non-measurement fluorescence generated from a carrier or the like is detected as noise.
[0016]
That is, if the diameter of the pinhole is ideally extremely small, a light beam that can pass through the pinhole is emitted from the specimen spot, travels parallel to the optical axis, and is disposed at the focal position of the second optical member. There is no noise because it is only the light that converges on the pinhole, but there are mechanical errors in manufacturing and positioning errors in assembly in the actual pinhole. The generated fluorescence to be measured is also cut by the pinhole. However, among the light beams that converge before and after the pinhole Ph, the light generated from the carrier is a light beam having a shallow incident angle (a light beam having a small angle with the optical axis), and therefore, between the first and second optical members. If a means for shielding the central portion of the light beam is provided, the light having a shallow incident angle can be shielded mainly. Therefore, compared with the decrease in the intensity of the fluorescence generated from the specimen spot and passing through the pinhole Ph, The intensity of the fluorescence that is generated and passes through the pinhole Ph is shallow, the fluorescence intensity outside the measurement target is greatly reduced, and the ratio of the fluorescence generated from the specimen spot in the detected fluorescence intensity becomes relatively large. Therefore, it is possible to detect the fluorescence generated from the specimen spot that is the original measurement target with a high S / N ratio.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, a specific embodiment of a DNA array reading apparatus to which an optical measuring apparatus that performs an optical measuring method of the present invention is applied will be described with reference to the drawings.
[0018]
1 is a perspective view showing a DNA array reader according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a perspective view of a DNA array test piece 10 to be read by the DNA array reader shown in FIG. 1, and FIG. It is sectional drawing in the II position of FIG.
[0019]
The DNA array test piece 10 is obtained by hybridizing a plurality of known cDNAs (an example of a specific binding substance) and a DNA labeled with a fluorescent dye on the surface Ba of a carrier 11 made of a slide glass. The processed specimen spots (hereinafter referred to as specimen spots Ksp) are arranged in a matrix, the thickness of the carrier 11 is about 1 mm, and the thickness of the specimen spot Ksp arranged on the carrier 11 is 1 μm or less, the spot diameter is 30 to 100 μm, and the interval between the spots is about 300 μm.
[0020]
As shown in FIG. 1, the DNA array reader 100 reflects the excitation light Le emitted from the laser light source 40 by the dichroic mirror 54 and passes through the first condenser lens 51 to the specimen spot arranged on the DNA array test piece 10. A configuration in which the fluorescence Ke generated from the specimen spot by irradiation with the excitation light is incident on the detector 70 via the first condenser lens 51 and the second condenser lens 52 forming the confocal optical system and detected. It has become.
[0021]
On the optical axis of the confocal optical system disposed below the DNA array test piece 10, there is a first condenser lens 51, a dichroic mirror 54, a central light-shielding plate 60 having a light-shielding region at the center, and a first light-shielding plate 60. A detector 70 comprising a two condensing lens 52, a pinhole plate 53, and a photomultiplier is arranged in this order, and the pinhole Ph of the pinhole plate 53 is at the focal point on the second condensing lens 52 side. The specimen spot Ksp on the DNA array test piece 10 is arranged at the focal point on the condensing lens 51 side, and the detector 70 is arranged at a position for receiving the fluorescence that has passed through the pinhole Ph. .
[0022]
The central light-shielding plate 60 is obtained by bonding a black alumite-treated disc 62 to the central portion of the flat glass 61 as shown in the plan view of FIG. 4A and the side view of FIG. 4B. And is arranged between the first condenser lens 51 and the second condenser lens 52, shields the central part of the light flux from the first condenser lens 51 toward the second condenser lens 52, and emits light in the peripheral part. Only pass through. The dichroic mirror 54 has a wavelength characteristic that allows the fluorescence Ke emitted from the specimen to pass therethrough and reflects the excitation light Le.
[0023]
The laser light source 40 that emits excitation light Le in a wavelength region that excites the specimen spot Ksp as a parallel light beam is reflected by the dichroic mirror 54 toward the specimen spot and coaxial with the optical axis of the confocal optical system. It arrange | positions so that it may become.
[0024]
The stage 30 on which the DNA array test piece 10 is placed is provided with stepping motors 21 and 22 that move the stage 30 in two dimensions in the XY directions (see FIG. 1). , 22 is connected to a coordinate controller 80 for inputting each predetermined position so as to sequentially transfer the specimen spot Ksp to the focal point on the first condenser lens 51 side forming the confocal optical system.
[0025]
Here, the predetermined position input to the first and second stepping motors 21 and 22 by the coordinate controller 80 means the positions of all the sample spots Ksp in a matrix form on the DNA array test piece 10.
[0026]
Next, the operation of the DNA array reader will be described. First, the DNA array test piece 10 is placed at a predetermined position on the stage 30. At this time, the coordinate controller 80 stores the coordinates of the position of each specimen spot so that each position of the specimen spot on the DNA array test piece 10 is associated with the coordinates in the X-axis direction and the Y-axis direction on the stage 30. Based on the coordinates stored in the coordinate controller 80, each of the stepping motors 21 and 22 irradiates the excitation light Le at the position of the first specimen spot Ksp (1, 1) on the DNA array test piece 10. The stage 30 is moved and positioned in the XY plane.
[0027]
When the setting of the stage 30 is completed, the excitation light Le is emitted from the laser light source 40, reflected by the dichroic mirror 54, and condensed on the specimen spot Ksp (1, 1) by the first condenser lens 51, and irradiated with the excitation light Le. The fluorescence Ke generated from the sample spot Ksp (1, 1) is converted into a parallel beam by the first condenser lens 51 and passes through the dichroic mirror 54 (excitation light Le mixed in the fluorescence Ke at this time is transmitted by the dichroic mirror 54). Reflected and removed from the optical path towards the detector). The parallel luminous flux that has passed through the dichroic mirror 54 is shielded by the central luminous flux shielding plate 60 at the central portion, and only the peripheral luminous flux is condensed by the second condenser lens 52 and passes through the pinhole Ph and enters the detector 70. The intensity is detected by the detector 70 and output to the external processing device 200.
[0028]
In the external processing apparatus 200, the position of the specimen spot Ksp (1, 1) output from the coordinate controller 80 and the fluorescence intensity value output from the detector 70 are input and associated with each other and stored.
[0029]
Here, the detail of the effect | action regarding a center light beam light-shielding board is demonstrated. As shown in FIGS. 5A to 5C, the optical system of the DNA array reader is simplified, and the confocal optical system 90 is formed by the first condenser lens 91 and the second condenser lens 92. The optical axis of this confocal optical system is the Z axis, the focal position on the first condenser lens 91 side is Zp, and the focal position on the second condenser lens 92 side is Zq so that the pinhole Ph1 matches the position of Zq. A pinhole plate 93 is disposed on the surface.
[0030]
When the point light source Tg is arranged in Zp as shown in FIG. 5B, the light Li emitted from the point light source Tg is converted into a parallel light flux by the first condenser lens 91, and this parallel light flux is pinholed by the condenser N1 lens. The light is focused on Ph1 and passes through the pinhole Ph1.
[0031]
Next, when the point light source Tg is moved along the Z-axis from the position of the point Zp to the − direction and moved to the position of Zp−1 as shown in FIG. 5A, the light Li emitted from the point light source Tg. Becomes a converged light beam without being converted into a parallel light beam by the condensing M1 lens, and is converged by the second condensing lens 92 at a point Zq-1 on the minus side in the Z-axis direction of the pinhole Ph1 and passes through the pinhole Ph1. At this time, only the light beam having a shallow incident angle (light beam having a small angle with the optical axis) out of the light Li condensed at the point Zq-1 selectively passes through the pinhole Ph1, and thus is generated from the point Zp-1. The diameter of the light beam passing through the pinhole Ph1 via the first condenser lens 91 and the second condenser lens 92 is reduced, and the aperture angle is also reduced.
[0032]
On the other hand, when the point light source Tg is moved along the Z axis from the position of Zp in the + direction and moved to the position of Zp + 1 as shown in FIG. 5C, light emitted from the point light source Tg. Li becomes a light beam diverging by the condensing M1 lens and is condensed by the condensing N1 lens at a point Zq + 1 on the plus side of the pinhole Ph1 in the Z-axis direction. At this time, only the light beam having a shallow incident angle (light beam having a small angle with the optical axis) out of the light Li condensed at the point Zq + 1 in the same manner as described above selectively passes through the pinhole Ph1. The diameter of the light beam generated from +1 and passing through the pinhole Ph1 via the first condenser lens 91 and the second condenser lens 92 is reduced, and the aperture angle is also reduced.
[0033]
The relationship between the position of the point light source Tg and the intensity of the light Li passing through the pinhole Ph1 is a depth response curve as shown by the curve KR (z) in FIG. 5D, and the position of the point light source Tg is changed from Zo. As the distance increases, the intensity decreases, and the amount of light incident on the pinhole is greatly reduced when the position of the point light source Tg is moved in the negative direction of the Z-axis compared to when it is moved in the positive direction. .
[0034]
Here, as shown in FIGS. 6A to 6C, when a central light beam shielding plate 95 is disposed between the first condenser lens 91 and the second condenser lens 92 of the confocal optical system 90, The light beam in the central part is shielded, and only the light beam in the peripheral part passes through the pinhole. Therefore, although the point light source Tg is located at any position of Zp, Zp + 1, Zp-1, the intensity value of the detected fluorescence is reduced as compared with the case where the central light beam shielding plate 95 is not disposed. The ratio varies depending on the position of the point light source Tg. As shown in the depth response curve KS (z) in FIG. 6D, the position when the position of the point light source Tg is moved in the negative direction of the Z axis is positive. The amount of light incident on the pinhole is more drastically reduced than when moved.
[0035]
That is, as shown in FIG. 7, in the case where the fluorescence v to be measured generated from Zp and the fluorescence w to be noise generated from a position other than Zp are generated simultaneously, all of the light passing through the pinhole Ph1 is generated. The ratio of the intensity of the fluorescence v to be measured included in the intensity (the intensity of the fluorescence v + the intensity of the fluorescence w) is larger when the central light-shielding plate 95 is disposed, and the fluorescence v to be measured. Can be detected with a higher S / N ratio. In particular, the effect of blocking the fluorescence W that is noise generated from the minus side of the focal position Zp in the Z-axis direction is extremely high.
[0036]
The above will be described with reference to a DNA array reader. As shown in FIG. 8, the excitation light Le emitted from the laser light source 40 is reflected by the dichroic mirror 54 and collected by the first condenser lens 51 on the specimen spot Ksp held by the carrier 11. The excitation light Le passes through the specimen spot Ksp and irradiates the inside of the carrier. A carrier near the sample spot Ksp irradiated with the excitation light Le, for example, fluorescence w (hereinafter referred to as carrier fluorescence w) that is noise that is not a measurement target is generated from the point P, and the measurement target generated from the sample spot Ksp Fluorescence v (hereinafter referred to as “analyte fluorescence v”) is converted into a substantially parallel light beam by the first condenser lens 51 and transmitted through the dichroic mirror 54. The specimen fluorescence v and the carrier fluorescence w transmitted through the dichroic mirror 54 are collected by the second condenser lens 52, pass through the pinhole Ph, and the intensity thereof is detected by the detector 70. At this time, most of the amount of light of the carrier fluorescence w which becomes noise is prevented from being incident on the detector 70 by the pinhole plate 53, but is generated from the carrier located behind the specimen spot Ksp on the optical axis Z and along the optical axis. The carrier fluorescence w traveling along the optical path passes through the pinhole Ph and is detected as noise. Here, when the central light beam shielding plate 60 is inserted between the first condenser lens 51 and the second condenser lens 52, the intensity of the carrier fluorescence w, which becomes noise as described above, is the intensity of the analyte fluorescence v that is the measurement target. Since it can be reduced at a larger rate, the proportion of noise included in the intensity of fluorescence detected by the detector 70 is reduced.
[0037]
When the measurement at the first specimen spot Ksp (1, 1) is completed, the next measurement position is input from the coordinate controller 80 to the stepping motors 21 and 22, and the specimen spot Ksp (2, 1) is irradiated with the excitation light Le. Thus, the DNA array test piece 10 is moved. Then, the sample spot Ksp (2, 1) is irradiated with the excitation light Le, and the same measurement as when the first sample spot Ksp (1, 1) is measured is performed. It is stored in the device 200. In the above measurement, it is only necessary to detect the relative intensity of the fluorescence generated from each specimen spot Ksp. Therefore, even if the absolute value of the detected fluorescence intensity is reduced by the insertion of the central light-shielding plate, the measurement accuracy is improved. There is no deterioration.
[0038]
By repeating the above operation, all the specimen spots Ksp on the DNA array test piece 10 are measured, and the position of all the specimen spots Ksp and the intensity value of the fluorescence generated from the specimen spot are detected in the processing apparatus 200. Correspondingly stored. Furthermore, the same measurement is performed on a DNA array test piece that is hybridized with a sample B of DNA labeled with a fluorescent dye b and cDNA and treated with a predetermined solution. DNA expression analysis and the like are performed.
[0039]
Further, the central light shielding area of the central light beam shielding plate 60 may be an area that attenuates the amount of transmitted light even if the light is not completely shielded, or a rough surface that diffuses light. It may be processed. Further, the structure may be a structure in which the light shielding plate 62 at the center of the ring 63 is supported by three columns 64 as shown in FIG. 9A, for example.
[0040]
Further, as shown in FIGS. 9B and 9C, the central light-shielding plate 60 is provided with a convex portion or a concave portion in the center of the flat glass 61 to refract and disperse light toward the pinhole Ph in the middle. It can also be set as the optical member provided with the light-shielding area | region excluded from an optical path.
[0041]
In addition, by arranging the central light-shielding plate 60 to be replaceable, by changing the size of the light-shielding area at the center, the detection form suitable for each measurement content is arranged, so that detection with a higher S / N ratio is possible. It can be carried out.
[0042]
Further, as shown in FIG. 9D, the light shielding means is integrally formed in the central portion of the second condenser lens 52, such as by providing a convex portion in the central portion of the second condenser lens 52. The same effect can be obtained.
[0043]
As described above, according to the optical measurement method and apparatus of the present invention, by reducing the incidence of fluorescence generated from other than the sample to be measured on the detector and increasing the S / N ratio of the detected fluorescence, A highly reliable measurement result can be obtained.
[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing an embodiment of a DNA array reader of the present invention. FIG. 2 is a diagram showing a DNA array test piece used in the DNA array reader. FIG. 3 is a cross-sectional view of a DNA array test. FIG. 5 is a diagram showing the structure of the central light-shielding plate. FIG. 5 is a diagram for explaining the optical path of fluorescence generated before and after the specimen spot and incident on the pinhole. FIG. 6 is fluorescent light generated before and after the specimen spot and incident on the pinhole. FIG. 7 is a diagram for explaining the effect of attenuating the intensity of light. FIG. 7 is a diagram for explaining the difference in the mixing ratio of fluorescence outside the measurement target depending on the presence or absence of the central light-shielding plate. [Figure 9] Example of central beam shield plate [Explanation of symbols]
10 DNA array test piece 11 carrier 21 stepping motor 22 stepping motor 30 stage 40 laser light source 51 first condenser lens 52 second condenser lens 53 pinhole plate 54 dichroic mirror 60 central beam shielding plate 70 detector 80 coordinate controller 100 DNA array reader Le excitation light Ke fluorescence Ksp specimen spot Ph pinhole

Claims

A sample labeled with a fluorescent dye is irradiated with excitation light, the fluorescence generated from the sample by irradiation of the excitation light is converted into a parallel light beam, and the light beam at the center of the parallel light beam is shielded by a light shielding member. An optical measurement method characterized by detecting only the fluorescent light that has passed through the pinhole after converging only the peripheral portion of the lens.

An irradiating means for irradiating a specimen labeled with a fluorescent dye with excitation light, a first optical member for converting the fluorescence generated from the specimen by irradiation of the excitation light into a parallel light beam, and a light beam at the center of the parallel light beam Is shielded by a light- shielding member so that only the peripheral part of the parallel light flux goes straight, a second optical member for condensing the peripheral part of the parallel light flux, and a condensing point of the condensed light flux An optical measurement apparatus comprising: a pinhole disposed; and a detector that detects the fluorescence that has passed through the pinhole.

3. The optical measuring device according to claim 2, wherein means for moving only the peripheral part of the parallel light beam straight is integrated with the second optical member.

It said means for linearly moving only the peripheral portion of the parallel light beam, the optical measuring apparatus according to claim 2 or 3, wherein it is interchangeable.

A specimen labeled with a fluorescent dye is irradiated with excitation light, the fluorescence generated from the specimen by the irradiation of the excitation light is converted into a parallel light beam, the light beam at the center of the parallel light beam is dispersed, and the peripheral part of the parallel light beam A light measuring method, wherein the light is condensed in a pinhole, and the fluorescence passing through the pinhole is detected.

An irradiating means for irradiating a specimen labeled with a fluorescent dye with excitation light, a first optical member for converting the fluorescence generated from the specimen by irradiation of the excitation light into a parallel light beam, and a light beam at the center of the parallel light beam Are distributed at the peripheral portion of the parallel light beam, a second optical member for condensing the peripheral portion of the parallel light beam, and a condensing point of the condensed light beam. An optical measuring device comprising: a pinhole; and a detector that detects the fluorescence that has passed through the pinhole.

7. The optical measuring device according to claim 6, wherein the means for linearly moving only the peripheral part of the parallel light beam is an optical member that disperses the light beam at the central part of the parallel light beam.

8. The optical measuring device according to claim 6, wherein means for moving only the peripheral part of the parallel light beam straight is integrated with the second optical member.

9. The optical measurement apparatus according to claim 6, wherein means for moving only the peripheral part of the parallel light beam straight is replaceable.