JP3849001B2 - Anti-2'-deoxycytidine antibodies and their production and use - Google Patents

Description

【０００７】
（式中、Ｒは担体ポリペプチド又は蛋白質である。）
により表わされる抗原を提供する。この抗原は、次の式（III)：
【化３】

【０００８】
により表わされる２′−デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）をＯ−サクシニル化し、次にこれと担体ポリペプチドとを、例えばカルボジイミドの存在下で結合させることにより製造することができる。
本発明はさらに、ｄＣｙｄに対する抗体、特に前記の式（Ｉ）又は（II）に対して生成される抗−ｄＣｙｄ抗体を提供する。この抗体はポリクローナル抗体すなわち抗血清、又はモノクローナル抗体である。ｄＣｙｄとの親和定数Ｋａが１×１０⁴ Ｍ^-1以上であるものが特に好ましい。特に、ポリクローナル抗体（抗血清）では１０⁴ Ｍ^-1以上、特に１０⁵ Ｍ^-1以上、モノクローナル抗体では１０⁸ Ｍ^-1以上、特に１０⁹ Ｍ^-1以上であることが好ましい。
【０００９】
本発明はさらに、上記の抗−ｄＣｙｄを産生するハイブリドーマに関する。
本発明はまた、検体中に存在することが予想されるｄＣｙｄと前記抗−ｄＣｙｄ抗体とを反応せしめ、反応が生じたか否か、又は反応の量を直接的又は間接的に測定することを特徴とする検体中の２′−デオキシシチジンの測定方法を提供する。この方法の１つの態様によれば、検体中のｄＣｙｄと、標識されたｄＣｙｄ試薬とを、前記抗−ｄＣｙｄ抗体であって好ましくは固相担体に固定化されているものに対して競合せしめ、そして次に該抗体と反応した該標識されたｄＣｙｄを測定する。また他の態様によれば、固相に固定化されたｄＣｙｄ（好ましくは、前記抗原の形態で）と検体中のｄＣｙｄを前記の抗体に対して競合せしめ、そして固相に固定されたｄＣｙｄに結合したｄ−Ｃｙｄ抗体を測定する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、（Ｉ）式又は（II）式の抗原は、ｄＣｙｄを無水コハク酸でサクシニル化し、５′−位及び／又は３′−位のサクシニル化された誘導体を例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、次にこれを担体ポリペプチド又は蛋白質と結合せしめることにより調製する。担体ポリペプチド又は蛋白質としては、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グロブリン、牛サイログロブリン、牛グロブリン、ヘモシアニン（ＫＬＨ）、アスカリス等の蛋白質、並びにポリリジン、ポリリジルグルタミン酸等の合成ポリペプチドなどが使用される。
【００１１】
ｄＣｙｄのサクシニル化は、ｄＣｙｄに無水コハク酸を室温で数分間反応させ、反応液を減圧乾固して５′位誘導体（５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ）と３′位誘導体（３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ）を得ることにより行う。それぞれの分離は、例えばＯＤＳ−シリカゲルカラムを移動相として０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有０〜３０％アセトニトリルを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なう。ＨＰＬＣにより分取した５′位及び／又は３′位の誘導体の確認は、ＦＡＢ−質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）及びＮＭＲによって行なわれる。
【００１２】
担体ポリペプチド又は蛋白質、サクシニル化ｄＣｙｄ及び縮合剤ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を一昼夜反応させることによって行なわれた反応液を水で透析し、過剰の縮合剤及びサクシニル化ｄＣｙｄを除去し、内容液を凍結乾燥すれば、ｄＣｙｄ抗原Ｉ又はIIが得られる。このように得られたｄＣｙｄの抗原は２７０nm吸光度の増加から、担体ポリペプチドがＫＬＨの場合、ＫＬＨ１モルに対して、Ｉ式では３３６モル、II式では５８６モルが結合していることが確認された。又、担体ポリペプチドがＢＳＡの場合、ＢＳＡ１モルに対してＩ式では９モル、II式では８モルが結合していることが確認された。
【００１３】
ｄＣｙｄ抗原（Ｉ）又は（II）を動物に免疫すれば、ｄＣｙｄに対する抗体が得られる。この抗体の調製は、例えば、つぎのようにして行なわれる。すなわち抗原（Ｉ）又は（II）を、フロインド完全アジュバンドを用いてｗ／ｏエマルジョンを調製し、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の動物に投与し、約２週間毎にフロインド不完全アジュバンドを用いてｗ／ｏエマルジョンを調製し、追加投与を行なう。１回目免疫以降に血清中抗体価の上昇がみられる。抗体価の測定は、ＥＩＡ法で行なうことができ、この血清を採取すれば、ｄＣｙｄに対する抗体が得られる。
【００１４】
また、このようにして免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と細胞融合することによりハイブリドーマを作り、モノクローナル抗体を得ることもできる。
本発明においては、抗体とｄＣｙｄとの親和定数Ｋａが１×１０⁷ Ｍ^-1以上であることが好ましい。Ｋａ値の測定は八木沢の方法（八木沢晧記、蛋白質核酸酵素別冊NO. 31, P219-226, 1987）により行うことができる。
本発明はまた、前記の抗−ｄＣｙｄ抗体を用いて検体中のｄＣｙｄを測定する方法を提供する。この方法は一般的には、検体中のｄＣｙｄと試薬としての抗−ｄＣｙｄ抗体とを反応せしめ、そしてその反応結果から検体中のｄＣｙｄの存在又は存在量を求める方法である。
【００１５】
この方法の１つの態様によれば、検体中のｄＣｙｄと試薬としての所定量の標識されたｄＣｙｄとを、抗−ｄＣｙｄ抗体に対して競合的に反応せしめる。この場合、検体中のｄＣｙｄ量が多くなるに従って検体中のｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄへの結合量が多くなり、逆に標識ｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄ抗体への結合が少なくなり、標識ｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄへの結合量又は結合しなかった標識ｄＣｙｄの量を測定することにより、検体中のｄＣｙｄの量を求めることができる。この態様において、抗−ｄＣｙｄ抗体を固相担体に固定化しておけば、反応後に固相担体を洗浄することにより、固体担体に固定化された抗−ｄＣｙｄ抗体に結合したｄＣｙｄを未結合のｄＣｙｄから単体に分離することができる。
【００１６】
上記の場合の固相担体としては、ポリスチレンビーズ、イムノアッセイ用ウエルプレート等、免疫測定において常用されている固相担体を用いることができる。抗−ｄＣｙｄ抗体の標識としては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等、免疫測定において常用されている標識を用いることができ、特に放射性同位元素が好ましい。放射性同位元素としては、例えば¹²⁵ Ｉ、¹³¹ Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³ Ｈ等、免疫測定において常用されているものを用いることができる。
【００１７】
検体及び試薬の希釈剤並びに反応媒体としては、水性緩衝液、例えばpH６〜８のリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等の常用の緩衝液が使用される。反応は好ましくは室温において１０〜６０分間行われる。
検体中のｄＣｙｄを測定するための他の態様によれば、固相担体に固定されたｄＣｙｄと検体中のｄＣｙｄとを、試薬としての抗−ｄＣｙｄに対して競合的に反応せしめる。検体中のｄＣｙｄ量が多くなるに従って、検体中のｄＣｙｄと結合する抗−ｄＣｙｄの量が多くなり、逆に固相担体に固定化されたｄＣｙｄに結合する抗−ｄＣｙｄの量が少なくなり、固相担体に固定されたｄＣｙｄに結合する抗−ｄＣｙｄの量を測定することにより、検体中のｄＣｙｄの量を求めることができる。
【００１８】
この場合、固相担体としては、前記のものを用いることができる。また、固相担体に固定するｄＣｙｄとしては、前記の抗原の形態で、すなわちｄＣｙｄと担体ポリペプチド又は蛋白質との結合体の形態で用いることが好ましい。固相担体へのｄＣｙｄの固定化は、常法により、例えばｄＣｙｄを含有する緩衝液を固相担体と接触せしめ、次にこれらを所定時間、例えば６０〜１８０分間、室温において、又は４℃で一晩インキュベートし、次に洗浄液により未固定のｄＣｙｄを洗浄除去すればよい。
【００１９】
固相担体に結合した抗−ｄＣｙｄと抗体の測定は、抗−ｄＣｙｄ抗体自体を標識しておくことにより、又は抗−ｄＣｙｄ抗体と結合する第二の抗体であって標識されているものを用いて行うことができる。第二抗体としては、抗−ｄＣｙｄ抗体を生産に用いた動物種により生産された免疫グロブリンに対する抗体、例えば抗−ｄＣｙｄ抗体がマウスの抗体であれば、マウスの抗体に対するマウス以外の動物種の抗体、例えばヤギの抗体を用いることができる。
【００２０】
前記のごとく、抗−ｄＣｙｄ抗体を直接標識する場合の標識としては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等を用いることができ好ましくは酵素標識を用いる。また、第二抗体の標識としては、酵素標識、蛍光物質、放射性同位元素等を用いることができ、好ましくは酵素標識を用いる。この場合の酵素としては、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウリカーゼ等の常用の酵素標識を用いることができ、酵素の種類に応じて常用の検出系を用いることができる。例えば、第二抗体の酵素標識としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用い、酵素反応により生成するｐ−ニトロフェノールを４０５nmにおける吸光度により測定することができる。
【００２１】
この測定における検体中試薬の希釈液、反応媒体、洗浄液等としては、前に記載したものを使用することができる。実施に当っては例えば、免疫測定用プレートのウエルに前記のｄＣｙｄ抗原の溶液を入れてインキュベートし、次に洗浄することによりｄＣｙｄ抗原をウエルに固定し、次にこのウエルに検体及び抗−ｄＣｙｄ抗体を加えて反応せしめた後ウエルの洗浄によって未結合の試薬等を除去し、次に抗−ｄＣｙｄ抗体に対する第二抗体を加えて反応せしめ、次に洗浄した後、アルカリホスファターゼのごとき標識酵素及び該酵素に対する基質例えばｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加し、所定時間後に発色を測定すればよい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のｄＣｙｄの抗原を使用すれば、特異性のきわめて高いｄＣｙｄに対する抗体を得ることができ、この抗体を使用すれば体液などの検体中のｄＣｙｄ量を正確かつ簡便に定量することができる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１． ｄＣｙｄのサクシニル化誘導体の調製
ｄＣｙｄ ０．０５mmol／１mlの水溶液に、無水コハク酸０．４mmol／トリエチルアミン−ジオキサン（１：９，Ｖ／Ｖ）１mlを混合し、室温で１０分間放置した。反応液を減圧乾固し、誘導体を得た。これをＨＰＬＣで分離精製した。カラムは、ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫを１０×２５０mmに充填した市販品を用い、その温度は４０℃とした。
【００２４】
溶離は、０．１％ＴＦＡ含有０〜３０％アセトニトリルの直線濃度勾配溶出法により、３０分間で行なった。溶離液の流速は３ml／分とした。検出は２８０nmの吸光度により行ない、４つのピークが表われた。図１にその結果を示す。第２と第３のピークを分取した。第２のピークに５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが第３のピークに３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが含まれることが、ＦＡＢ−ＭＳ及び ¹Ｈ−ＮＭＲにより判明した。ＦＡＢ−ＭＳの結果を図２に示す。
【００２５】
実施例２． ５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ又は３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄと担体ポリペプチドの縮合
５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ又は３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ１５μmol の１２．５mMリン酸緩衝液（pH５．２５）の溶液１mlに１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＡＣ・ＨＣｌ）７５μmol を加え、ＫＬＨ０．９５nmol又はＢＳＡ７８nmolの５０mMリン酸緩衝液（pH７．２）と０．１Ｍ ＮａＣｌの溶液１mlをさらに加えてpH６．４に調整し、暗所で１昼夜反応させた。反応液を水で４８時間透析した。
【００２６】
その後、透析内液を凍結乾燥して、各抗原、５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ担体ポリペプチド及び３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ担体ポリペプチドを得、これを４℃で保存した。また、透析液の一部を希釈し、２７０nmの吸光度を測定することにより、ハプテン結合量を測定したところ、３３６モルの５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが１モルのＫＬＨに結合していた。又、５８６モルの３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが１モルのＫＬＨに結合していた。一方、１モルのＢＳＡに対して、９モルの５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが結合していた。８モルの３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが同じく１モルのＢＳＡに対して結合していた。
【００２７】
実施例３． 抗体の調製
担体ポリペプチドとしてＫＬＨを用いた抗原１mgを水１mlに溶かし、フロインドの完全アジュバンド１mlとｗ／ｏエマルジョンを調製した。これを雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）の腹腔に０．１mlずつ注射し、その後２週間毎にブースターした。２回目の免疫から、フロインド不完全アジュバンドを使用し、同様にエマルジョンを調製し投与した。次に投与後３日後にマウスの尾を切断することにより採血した。この血清を４℃で一夜放置して、抗体を得た。これを−２０℃で保存した。
【００２８】
実施例４． 抗体価の測定
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原又はＢＳＡ自身を０．６μｇ／mlとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）（pH７．０）に溶かした。その５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。さらに３７℃で２時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢ（ＴＰＢ）で試料穴を５回洗浄した。実施例３で得た抗血清をＴＰＢで希釈し、５０μｌずつ試料穴に分注した。
【００２９】
これを３７℃で１時間半振盪した。ＴＰＢで５回洗浄後、３μｇ／mlアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧのＴＰＢ溶液５０μｌを分注し、３７℃で１時間半振盪した。１mM ＭｇＣｌ₂ を含む２２．４mM−ニトロフェニルフォスフェートの１００mM ＮａＨＣＯ₃ 溶液（pH９．８）を５０μｌずつ分注した。生成するｐ−ニトロフェノールの吸光度を４０５nmの波長のＥＩＡリーダーで測定した。その結果を図３及び４に示す。
【００３０】
実施例５． 抗体の特異性
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原０．６μｇ／mlのＰＢ溶液５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。３７℃で２時間放置し、ＴＰＢで５回洗浄した。これにハプテンのＴＰＢ希釈液５０μｌずつさらに分注し、３７℃で１０分間放置した。これに１００００倍希釈抗血清液５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間半放置した。次にＴＰＢで５回洗浄した後、以下実施例４と同様に操作した。その結果を図５及び６に示す。図５及び６より、この抗体はｄＣｙｄに対して親和定数Ｋａ＝１×１０⁵ Ｍ^-1を有していた。
この結果は、本発明のポリクローナル抗体が他のヌクレオチド類の中でｄＣｙｄに対して特異的に結合することを示している。
【００３１】
実施例６． モノクローナル抗体の調製
実施例２における第５回目のブースター後、３日目に、マウスの脾細胞を取り出し、培養したマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコールを用いた常法により融合した。融合したハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養し、生成するコロニーをさらに１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地などで液体培養し、限界希釈を３回行なうことによりクローニングをおこない、ハイブリドーマＤＣＹＤ−１を得た。
【００３２】
培養上清中のモノクローナル抗体を４℃で保存した。なお、これらのモノクローナル抗体はｄＣｙｄに対して１０⁹ Ｍ^-1の親和定数Ｋａを有していた。
ハイブリドーマＤＣＹＤ−１は、Ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＤＣＹＤ−１と命名され、平成７年８月２４日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３２として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００３３】
実施例７． モノクローナル抗体の特異性
実施例５で示した方法で、希釈抗血清の代わりに、実施例６で得たモノクローナル抗体含有培地を用いて、他の条件は同じにして行なった。その結果を第７図に示す。
図７から明らかな通り、本発明のモノクローナル抗体は他の種々のヌクレオチド類中でｄＣｙｄに対して特異的に反応する。
【００３４】
実施例８． ｄＣｙｄの測定
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原０．６μｇ／mlのＰＢ溶液５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。３７℃で２時間放置し、ＴＰＢで５回洗浄した。ｄＣｙｄの標準物質（０．１〜１００μＭ）及び検体をＴＰＢでそれぞれ希釈し５０μｌずつ分注し３７℃、３０分放置した。次にモノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１を加え３７℃１時間半放置した。
さらにＴＰＢで５回洗浄後、以下実施例４と同様に操作した。その結果を図８に示す。本曲線から０．１μＭのｄＣｙｄが測定できることが明らかになった。
実施例９．
実施例８と同様の方法で作製した２′デオキシシチジンＢＳＡコートプレートに検体２０μｌ、及びモノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１培養上清希釈液２００μｌを加え、室温にて１時間放置した。プレートをＴＰＢで５回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immuno Research)を１％ＢＳＡ含有Ｔ−ＰＢＳで１万倍希釈し、その１００μｌを加え室温３０分放置した。ＴＰＢで５回洗浄後、ＯＰＤ基質液を１００μｌ加え２０分放置し、反応停止剤として２Ｎ硫酸１００μｌを加えた後、４９２nmの吸光度をＥＩＡプレートリーダーで測定した。その結果を表１及び表２に示す。検体は健常者１６例、癌患者１９例を１００倍希釈して測定した。

各血清は夫々１００倍希釈にて測定。
【表１】

【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の抗原の合成中間体であるサクシニル化ｄＣｙｄのＨＰＬＣ溶出図である。
【図２】図２は、本発明の抗原の合成中間体である５′−Ｏ−サクシニル化ｄＣｙｄのマススペクトル図である。
【図３】図３は本発明の抗血清を５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗原又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と反応させて抗体価を測定した場合の図である。
【図４】図４は、本発明の抗血清を３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗原又はＢＳＡと反応させて抗体価を測定した場合の図である。
【図５】図５は、本発明の抗−５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗血清を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図である。図中、ハプテンの略号は、シトシン（Ｃｙｔ）、シチジン（Ｃｙｄ）、２′−デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）、シチジン−５′−リン酸（ＣＭＰ）、２′−デオキシシチジン−５′−リン酸（ｄＣＭＰ）、２′−デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）、２′−デオキシグア（ｄＧｕｏ）、チミジン（Ｔｈｄ）である。
【図６】図６は、本発明の抗−３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗血清を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図であり、図中ハプテンの略号は図５の通りである。
【図７】図７は本発明のモノクローナル抗体を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図であり、図中のハプテンの略号は図５の通りである。
【図８】図８は、モノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１を用いてｄＣｙｄを測定する場合の標準曲線の１例である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibody against 2'-deoxycytidine (sometimes abbreviated as dCyd) and the production and use thereof. More specifically, the present invention relates to an antibody against dCyd (sometimes abbreviated as anti-2′-deoxycytidine antibody or anti-dCyd antibody), an antigen for producing the antibody, a method for producing the antibody, and production of the antibody. The present invention relates to a hybridoma, a dCyd measurement method using the antibody, and a dCyd measurement kit comprising the antibody.
[0002]
[Prior art]
dCyd is a component of gene DNA, and free dCyd was considered as an intermediate in DNA biosynthesis or metabolism. Yoshioka et al. [Biol. Pharm Bull., 17 (2), 169-172, 1994] found that patients whose dCyd increased in the blood during chemotherapy after surgery for Egyptian breast cancer patients had a poor prognosis and died. I made it clear. Conversely, it was found that patients showing normal values without increasing prognosis have a good prognosis. Therefore, measurement of the concentration of dCyd in body fluid has become important for elucidating the prognosis and pathology of cancer.
[0003]
Conventionally, dCyd has been separated and measured by thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, etc., but these methods have low sensitivity, complicated operation, and the disadvantage that many samples cannot be measured at one time. there were. On the other hand, the immunoassay is generally excellent as a method capable of measuring a large number of specimens simply and rapidly. However, to carry out this method, it is necessary to prepare antigens and antibodies. However, dCyd antigens and antibodies have never been prepared.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention intends to provide an immunoassay method for dCyd and a kit therefor, and as its premise, it intends to provide a dCyd antigen, an anti-dCyd antibody, a hybridoma producing the antibody, and the like. .
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In such a situation, the present inventors have succinylated the hydroxyl group at the 5′-position or 3′-position of dCyd and dehydrated and condensed with the amino group of the carrier polypeptide via these carboxyl groups. It was found that an antibody against dCyd having high specificity can be obtained by using the dCyd antigen represented by ().
[0006]
Accordingly, the present invention provides the following formula (I) or (II):
[Chemical 2]

[0007]
(Wherein R is a carrier polypeptide or protein)
The antigen represented by is provided. This antigen has the following formula (III):
[Chemical 3]

[0008]
2'-deoxycytidine (dCyd) represented by can be prepared by O-succinylation and then linking it to a carrier polypeptide, for example, in the presence of carbodiimide.
The present invention further provides antibodies against dCyd, in particular anti-dCyd antibodies generated against formula (I) or (II) above. This antibody is a polyclonal antibody, ie an antiserum, or a monoclonal antibody. Those having an affinity constant Ka with dCyd of 1 × 10 ⁴ M ⁻¹ or more are particularly preferred. In particular, it is preferably 10 ⁴ M ⁻¹ or more, particularly 10 ⁵ M ⁻¹ or more for a polyclonal antibody (antiserum), and more preferably 10 ⁸ M ⁻¹ or more, particularly 10 ⁹ M ⁻¹ or more for a monoclonal antibody.
[0009]
The present invention further relates to a hybridoma that produces the above-described anti-dCyd.
The present invention is also characterized in that dCyd expected to be present in a sample is reacted with the anti-dCyd antibody, and whether or not a reaction has occurred or the amount of the reaction is directly or indirectly measured. A method for measuring 2'-deoxycytidine in a specimen is provided. According to one aspect of this method, the dCyd in the specimen and the labeled dCyd reagent are allowed to compete with the anti-dCyd antibody, preferably immobilized on a solid support, Then, the labeled dCyd reacted with the antibody is measured. According to another aspect, dCyd immobilized on a solid phase (preferably in the form of the antigen) and dCyd in a specimen are allowed to compete with the antibody, and dCyd immobilized on the solid phase Bound d-Cyd antibody is measured.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the antigen of the formula (I) or (II) is obtained by succinylated dCyd with succinic anhydride, and the succinylated derivative at the 5′-position and / or 3′-position is subjected to, for example, high performance liquid chromatography ( HPLC), which is then prepared by conjugation with a carrier polypeptide or protein. Examples of carrier polypeptides or proteins include proteins such as human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), globulin, bovine thyroglobulin, bovine globulin, hemocyanin (KLH), Ascaris, and polylysine, polylysylglutamic acid, etc. Polypeptides and the like are used.
[0011]
In the succinylation of dCyd, succinic anhydride was reacted with dCyd at room temperature for several minutes, and the reaction solution was dried under reduced pressure to obtain a 5′-position derivative (5′-O—S-dCyd) and a 3′-position derivative (3′- O-S-dCyd). Each separation is performed, for example, by high performance liquid chromatography (HPLC) using 0-30% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) using an ODS-silica gel column as a mobile phase. Confirmation of the derivative at the 5′-position and / or the 3′-position fractionated by HPLC is carried out by FAB-mass spectrometry (FAB-MS) and NMR.
[0012]
The reaction solution obtained by reacting the carrier polypeptide or protein, succinylated dCyd and the condensing agent dicyclohexylcarbodiimide (DCC) overnight is dialyzed with water to remove excess condensing agent and succinylated dCyd, and the content solution is frozen. When dried, dCyd antigen I or II is obtained. From the increase in absorbance at 270 nm, the dCyd antigen thus obtained confirmed that 336 mol in the formula I and 586 mol in the formula II were bound to 1 mol of KLH when the carrier polypeptide was KLH. It was. In addition, when the carrier polypeptide was BSA, it was confirmed that 9 mol in the formula I and 8 mol in the formula II were bound to 1 mol of BSA.
[0013]
When an animal is immunized with dCyd antigen (I) or (II), an antibody against dCyd can be obtained. This antibody is prepared, for example, as follows. That is, the antigen (I) or (II) is prepared in w / o emulsion using Freund's complete adjuvant and administered to animals such as mice, rats, cows, rabbits, sheep, horses, etc. A w / o emulsion is prepared using incomplete adjuvant and boosted. The serum antibody titer increases after the first immunization. The antibody titer can be measured by the EIA method. When this serum is collected, an antibody against dCyd can be obtained.
[0014]
In addition, monoclonal antibodies can be obtained by collecting antibody-producing cells from the immunized animals and fusing them with myeloma cells to produce hybridomas.
In the present invention, the affinity constant Ka between the antibody and dCyd is preferably 1 × 10 ⁷ M ⁻¹ or more. The Ka value can be measured by the method of Yagisawa (Yukizawa Yuki, Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No. 31, P219-226, 1987).
The present invention also provides a method for measuring dCyd in a specimen using the anti-dCyd antibody. This method is generally a method in which dCyd in a sample is reacted with an anti-dCyd antibody as a reagent, and the presence or amount of dCyd in the sample is determined from the reaction result.
[0015]
According to one embodiment of this method, dCyd in a sample and a predetermined amount of labeled dCyd as a reagent are reacted competitively with an anti-dCyd antibody. In this case, as the amount of dCyd in the sample increases, the amount of binding of dCyd in the sample to anti-dCyd increases, conversely, the binding of labeled dCyd to the anti-dCyd antibody decreases, and the labeled dCyd binds to anti-dCyd. The amount of dCyd in the sample can be determined by measuring the amount of labeled dCyd bound to or not labeled. In this embodiment, if the anti-dCyd antibody is immobilized on a solid phase carrier, the solid phase carrier is washed after the reaction, whereby dCyd bound to the anti-dCyd antibody immobilized on the solid carrier is converted to unbound dCyd. Can be separated into single bodies.
[0016]
As the solid phase carrier in the above case, a solid phase carrier commonly used in immunoassay, such as polystyrene beads and immunoassay well plates, can be used. As a label of the anti-dCyd antibody, a label that is commonly used in immunoassay, such as a radioisotope, a fluorescent substance, and an enzyme, can be used, and a radioisotope is particularly preferable. As the radioisotope, for example, those commonly used in immunoassay such as ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³² P, ¹⁴ C, and ³ H can be used.
[0017]
As the diluent for the specimen and reagent and the reaction medium, an aqueous buffer, for example, a usual buffer such as a phosphate buffer, an acetate buffer, a Tris buffer, or the like having a pH of 6 to 8 is used. The reaction is preferably carried out at room temperature for 10-60 minutes.
According to another embodiment for measuring dCyd in a specimen, dCyd immobilized on a solid phase carrier and dCyd in the specimen are reacted competitively with anti-dCyd as a reagent. As the amount of dCyd in the sample increases, the amount of anti-dCyd that binds to dCyd in the sample increases, and conversely, the amount of anti-dCyd that binds to dCyd immobilized on the solid phase carrier decreases. By measuring the amount of anti-dCyd bound to dCyd immobilized on the phase carrier, the amount of dCyd in the specimen can be determined.
[0018]
In this case, the aforementioned solid phase carrier can be used. The dCyd immobilized on the solid phase carrier is preferably used in the form of the antigen, that is, in the form of a conjugate of dCyd and a carrier polypeptide or protein. For immobilization of dCyd on the solid phase carrier, for example, a buffer containing dCyd is contacted with the solid phase carrier, and then these are allowed to contact for a predetermined time, for example, 60 to 180 minutes, at room temperature, or at 4 ° C. Incubate overnight and then wash away unfixed dCyd with wash solution.
[0019]
The anti-dCyd and the antibody bound to the solid phase carrier are measured by labeling the anti-dCyd antibody itself or by using a second antibody that binds to the anti-dCyd antibody and is labeled. Can be done. As the second antibody, an antibody against an immunoglobulin produced by an animal species using an anti-dCyd antibody, for example, if the anti-dCyd antibody is a mouse antibody, an antibody of an animal species other than a mouse against a mouse antibody For example, goat antibodies can be used.
[0020]
As described above, as a label for directly labeling an anti-dCyd antibody, a radioisotope, a fluorescent substance, an enzyme, or the like can be used, and preferably an enzyme label is used. As the label of the second antibody, an enzyme label, a fluorescent substance, a radioisotope, or the like can be used, and preferably an enzyme label is used. As the enzyme in this case, a common enzyme label such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, uricase can be used, and a common detection system can be used depending on the type of enzyme. For example, when alkaline phosphatase is used as the enzyme label of the second antibody, p-nitrophenyl phosphate can be used as a substrate, and p-nitrophenol produced by the enzyme reaction can be measured by absorbance at 405 nm.
[0021]
As the diluent, reaction medium, washing solution and the like of the reagent in the sample in this measurement, those described above can be used. In practice, for example, the dCyd antigen solution is placed in a well of an immunoassay plate and incubated, and then washed to fix the dCyd antigen to the well. Then, the well and the sample and anti-dCyd are fixed to the well. After reacting by adding an antibody, unbound reagents and the like are removed by washing the well, then a second antibody against the anti-dCyd antibody is added and reacted, and then washed, followed by a labeling enzyme such as alkaline phosphatase and A substrate for the enzyme such as p-nitrophenyl phosphate is added, and color development may be measured after a predetermined time.
[0022]
【The invention's effect】
When the dCyd antigen of the present invention is used, an antibody against dCyd having extremely high specificity can be obtained. If this antibody is used, the amount of dCyd in a sample such as a body fluid can be accurately and easily quantified.
[0023]
【Example】
Next, examples will be described.
Example 1. Preparation of succinylated derivative of dCyd In an aqueous solution of dCyd 0.05 mmol / 1 ml, 0.4 mmol of succinic anhydride / triethylamine-dioxane (1: 9, V / V) 1 ml was mixed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The reaction solution was dried under reduced pressure to obtain a derivative. This was separated and purified by HPLC. The column used was a commercial product packed with 10 × 250 mm of CAPCELLPAK, and the temperature was 40 ° C.
[0024]
Elution was performed for 30 minutes by a linear concentration gradient elution method of 0 to 30% acetonitrile containing 0.1% TFA. The flow rate of the eluent was 3 ml / min. Detection was performed by absorbance at 280 nm, and four peaks appeared. The result is shown in FIG. The second and third peaks were collected. It was found by FAB-MS and ¹ H-NMR that 5′-O—S-dCyd was contained in the second peak and 3′-O—S-dCyd was contained in the third peak. The result of FAB-MS is shown in FIG.
[0025]
Example 2 Condensation of 5'-O-S-dCyd or 3'-O-S-dCyd and carrier polypeptide 5'-O-S-dCyd or 3'-O-S-dCyd 15 μmol of 12.5 mM phosphate buffer (pH 5 .25) is added to 1 ml of a solution of 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDAC · HCl), and KLH 0.95 nmol or BSA 78 nmol 50 mM phosphate buffer (pH 7.2). The solution was further adjusted to pH 6.4 by adding 1 ml of 0.1 M NaCl solution, and reacted for one day in the dark. The reaction was dialyzed against water for 48 hours.
[0026]
Thereafter, the dialysis internal solution was lyophilized to obtain each antigen, 5′-O—S-dCyd carrier polypeptide and 3′-O—S-dCyd carrier polypeptide, which were stored at 4 ° C. A part of the dialysate was diluted and the absorbance at 270 nm was measured to measure the amount of hapten bound. As a result, 336 mol of 5'-O-S-dCyd was bound to 1 mol of KLH. In addition, 586 moles of 3'-O-S-dCyd was bound to 1 mole of KLH. On the other hand, 9 mol of 5′-O—S—dCyd was bonded to 1 mol of BSA. Eight moles of 3'-O-S-dCyd were also bound to 1 mole of BSA.
[0027]
Example 3 Preparation of antibody 1 mg of antigen using KLH as a carrier polypeptide was dissolved in 1 ml of water to prepare 1 ml of Freund's complete adjuvant and w / o emulsion. This was injected into the peritoneal cavity of female BALB / c mice (6 weeks old) 0.1 ml each, and then boosted every 2 weeks. From the second immunization, an incomplete Freund adjuvant was used and an emulsion was prepared and administered in the same manner. Next, blood was collected by cutting the tail of the mouse 3 days after administration. The serum was left overnight at 4 ° C. to obtain antibodies. This was stored at -20 ° C.
[0028]
Example 4 Measurement of antibody titer An antigen using BSA as a carrier polypeptide or BSA itself was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (PB) (pH 7.0) so as to be 0.6 µg / ml. 50 μl thereof was dispensed into the sample holes of the microplate. The sample was further left at 37 ° C. for 2 hours, and the sample hole was washed 5 times with 0.05% Tween 20-containing PB (TPB). The antiserum obtained in Example 3 was diluted with TPB, and 50 μl was dispensed into sample holes.
[0029]
This was shaken at 37 ° C. for 1.5 hours. After washing 5 times with TPB, 50 μl of a 3 μg / ml alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG TPB solution was dispensed and shaken at 37 ° C. for 1.5 hours. 50 μl each of 22.4 mM nitrophenyl phosphate containing 100 mM NaHCO ₃ (pH 9.8) containing 1 mM MgCl ₂ was dispensed. The absorbance of the resulting p-nitrophenol was measured with an EIA reader having a wavelength of 405 nm. The results are shown in FIGS.
[0030]
Example 5 FIG. Specificity of antibody 50 μl of a 0.6 μg / ml PB solution of antigen using BSA as a carrier polypeptide was dispensed into a sample hole of a microplate. It was left at 37 ° C. for 2 hours and washed 5 times with TPB. To this, 50 μl of hapten TPB dilution was further dispensed and left at 37 ° C. for 10 minutes. To this, 50 μl of a 10,000-fold diluted antiserum solution was dispensed and left at 37 ° C. for 1.5 hours. Next, after washing 5 times with TPB, the same operation as in Example 4 was followed. The results are shown in FIGS. 5 and 6, this antibody had an affinity constant Ka = 1 × 10 ⁵ M ⁻¹ for dCyd.
This result indicates that the polyclonal antibody of the present invention specifically binds to dCyd among other nucleotides.
[0031]
Example 6 Preparation of monoclonal antibody On the third day after the fifth booster in Example 2, mouse spleen cells were taken out and fused with cultured mouse myeloma cells P3U1 by a conventional method using polyethylene glycol. The fused hybridoma was cultured in HAT medium, and the resulting colonies were further liquid-cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum and cloned by limiting dilution three times to obtain hybridoma DCYD-1.
[0032]
The monoclonal antibody in the culture supernatant was stored at 4 ° C. These monoclonal antibodies had an affinity constant Ka of 10 ⁹ M ⁻¹ for dCyd.
The hybridoma DCYD-1 was named Mouse-mouse hybrida DCYD-1 and was deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology as FERM P-15132 on August 24, 1995.
[0033]
Example 7 Specificity of monoclonal antibody The monoclonal antibody-containing medium obtained in Example 6 was used in the same manner as in Example 5 except that the diluted antiserum was used instead of the diluted antiserum. The result is shown in FIG.
As is apparent from FIG. 7, the monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with dCyd in various other nucleotides.
[0034]
Example 8 FIG. Measurement of dCyd 50 μl of an antigen 0.6 μg / ml PB solution using BSA as a carrier polypeptide was dispensed into a sample hole of a microplate. It was left at 37 ° C. for 2 hours and washed 5 times with TPB. The dCyd standard (0.1-100 μM) and specimen were diluted with TPB, dispensed in 50 μl portions, and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Next, monoclonal antibody DCYD-1 was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1.5 hours.
Further, after washing with TPB 5 times, the same operation as in Example 4 was performed. The result is shown in FIG. From this curve, it became clear that dCyd of 0.1 μM can be measured.
Example 9
To a 2 ′ deoxycytidine BSA-coated plate prepared in the same manner as in Example 8, 20 μl of specimen and 200 μl of monoclonal antibody DCYD-1 culture supernatant dilution were added and left at room temperature for 1 hour. After the plate was washed 5 times with TPB, a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (Jackson Immuno Research) was diluted 10,000-fold with 1% BSA-containing T-PBS, 100 μl thereof was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After washing 5 times with TPB, 100 μl of OPD substrate solution was added and allowed to stand for 20 minutes. After adding 100 μl of 2N sulfuric acid as a reaction terminator, the absorbance at 492 nm was measured with an EIA plate reader. The results are shown in Tables 1 and 2. Samples were measured by diluting 100 times and 16 healthy subjects and 19 cancer patients.

Each serum was measured at 100-fold dilution.
[Table 1]

[Table 2]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an HPLC elution diagram of succinylated dCyd, which is a synthetic intermediate of the antigen of the present invention.
FIG. 2 is a mass spectrum diagram of 5′-O-succinylated dCyd, which is a synthetic intermediate of the antigen of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the antibody titer measured by reacting the antiserum of the present invention with 5′-O—S-dCyd-KLH antigen or bovine serum albumin (BSA).
FIG. 4 is a graph showing the antibody titer measured by reacting the antiserum of the present invention with 3′-O—S-dCyd-KLH antigen or BSA.
FIG. 5 shows the binding specificity when the anti-5′-O—S-dCyd-KLH antiserum of the present invention is reacted with various haptens. In the figure, hapten abbreviations are cytosine (Cyt), cytidine (Cyd), 2'-deoxycytidine (dCyd), cytidine-5'-phosphate (CMP), 2'-deoxycytidine-5'-phosphate ( dCMP), 2'-deoxyadenosine (dAdo), 2'-deoxygua (dGuo), thymidine (Thd).
FIG. 6 is a diagram showing the binding specificity when the anti-3′-O—S-dCyd-KLH antiserum of the present invention is reacted with various haptens, and the abbreviations of the haptens are shown in the figure. It is as FIG.
FIG. 7 is a view showing the binding specificity when the monoclonal antibody of the present invention is reacted with various haptens, and the hapten abbreviations in the figure are as shown in FIG.
FIG. 8 is an example of a standard curve when dCyd is measured using monoclonal antibody DCYD-1.

Claims (5)

The following formula (I) or (II):

(Wherein R is a carrier polypeptide or protein)
2 'obtained using 2'-deoxycytidine antigens expressed by as immunogens - an antibody that specifically binds to deoxycytidine. A hybridoma producing the antibody according to claim 1 . A 2'-deoxycytidine expected to be present in a sample is reacted with the antibody according to claim 1 , and whether or not a reaction has occurred or the amount of the reaction is directly or indirectly measured. For measuring 2'-deoxycytidine in a specimen. The 2'-deoxycytidine immobilized on the solid phase and the 2'-deoxycytidine in the sample are allowed to compete with the antibody according to claim 1 , and then 2'-deoxycytid immobilized on the solid phase. A method for measuring 2'-deoxycytidine in a sample, comprising measuring the amount of the antibody bound to cytidine. A 2'-deoxycytidine measurement kit comprising the antibody according to claim 1 .

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