JP3822946B2

JP3822946B2 - 二分子膜素子

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Publication number: JP3822946B2
Application number: JP10984197A
Authority: JP
Inventors: 峰男池松
Original assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Current assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: JPH1052880A; US6056922A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二分子膜素子、例えば、生体の細胞膜に近似した膜構造でタンパク質等を保持するための二分子膜を備え、保持したタンパク質を機能させたり、またその機能を測定する際に利用可能な安定性に優れた二分子膜を有する素子の構成に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生体の細胞膜と同様な構成の二分子膜を作成することが提案されており、この二分子膜を用いて細胞膜中と同様にタンパク質を機能させてタンパク質機能の研究を行ったり、さらには、二分子膜とタンパク質の機能を利用したバイオ素子の作成等が期待されている。
【０００３】
現在のところ報告されている人工の二分子膜を有する素子では、極性基と疎水基とより構成される脂質単分子を用いている。そして、水溶液中に、図１１（ａ）に示されるように中央に穴が設けられたテフロン基板７０が直立配置され、このテフロン基板７０の穴部分に、図１１（ｂ）に示すように互いに極性基を外側に向け、疎水基を内側に向けた２層の脂質単分子膜７２が形成され、これによって脂質二分子膜を構成している。
【０００４】
ところが、このようにして作成された二分子膜は、互いの分子間力で吸着しているだけであるので、衝撃などにより二分子膜構造がすぐに破壊されてしまう。また、静置状態であっても数時間程度しか図示するような二分子膜構造を維持することができないという問題があった。
【０００５】
そこで、より安定性の高い二分子膜の作成を目的として、二分子膜をサポート基板上に形成することが提案されている。図１２（ａ）に示す例では、一方の脂質単分子の極性基を水溶液中に水平配置されたガラス等のサポート基板上に吸着させて単分子膜７２を形成し、さらにこの単分子膜７２の上に脂質単分子を吸着することによって二層目の単分子膜７２を形成して二分子膜を得ている。
【０００６】
また、他の例では、図１２（ｂ）のように金が形成された基板８０の表面に、例えばステアリルメルカプタンを導入し、基板表面に金−Ｓ結合によりアルカンチオール単分子膜７４を形成し、得られた単分子膜７４上に、さらに脂質単分子膜７２を吸着させて二分子膜を形成している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のようにサポート基板を利用して作成した二分子膜であっても、水溶液中に静置した状態で、その二分子膜構造を維持可能な時間は、数時間〜十数時間程度と低い。従って、得られた二分子膜中にタンパク質を入れる等の処理を行うことは困難であり、素子としての実用性に欠ける。このため、より安定性に優れた二分子膜を得ることが求められていた。
【０００８】
本発明は、上記課題を解消するためになされ、より長い時間、二分子膜構造を維持可能な素子を得ることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明に係る二分子膜素子は以下のような特徴を有する。
【００１０】
まず、二分子膜素子は、基板上に二分子膜が形成された素子であって、この二分子膜をゲル層で直接又は間接的に覆うことを特徴とする。このようにゲル層で二分子膜を覆うことにより二分子膜の安定性が向上する。また、ゲル層を用いることにより、特に、ゲル層の材料としてハイドロゲルを用いることにより、二分子膜の周囲に水分を固定することが可能となり、例えば、二分子膜や、この膜に導入されたタンパク質を機能させる場合に必要とされる電解質水溶液を二分子膜の周囲に固定し、膜に電解質水分を供給することが可能となる。更に、ゲル層により、二分子膜表面での水系の動きが止められて膜の乱れが防止される。よって、この水分を固定するというゲル層の機能は、結果として、膜の安定化にも貢献する。
【００１１】
また、上記構成に加え、さらに、二分子膜とゲル層との間に、高分子膜を形成することを特徴とする。このように高分子膜で二分子膜上を覆い、これを更にゲル層で覆う構成とすることにより、二分子膜の安定性が一段と向上する。高分子膜で覆うことによって膜の安定性が向上するのは、高分子側の単分子膜が極性基を備えるためであると考えられ、高分子膜と対向する単分子膜の極性基と高分子の極性基とが逆の極性を有する場合に、特に、高分子膜側の単分子膜の極性基が上記高分子膜の極性基と強く相互作用するためと考えられる。
【００１２】
上述の二分子膜素子において、高分子膜の材料としては、アミノ酸、具体的にはポリリシンが適用されうる。ゲル層の材料としては、糖、具体的にはアガロースゲルが適用されうる。このような材料を高分子膜やゲル層に用いれば、より生体中に近い環境を二分子膜の周囲に作成することができ、例えば、タンパク質を二分子膜内に導入した場合において、そのタンパク質を十分に機能させることが可能となる。
【００１３】
次に、上記基板上に形成された二分子膜素子を有する素子が、水系中で直立配置された上記基板の少なくとも上方側に設けられ、二分子膜の膜厚方向に延びて水系における二分子膜の上部を支持するための膜支持部を有することを特徴とする。
【００１４】
また、上記膜支持部は、二分子膜の膜厚以上の長さを有し、この膜支持部により、水系中で直立配置される前記二分子膜の浮き上がりを抑えることを特徴とする。更に、前記膜支持部は、少なくとも前記二分子膜との接触面が非極性材料によって形成されていることを特徴とする。そして、この膜支持部は、基板の上方及び下方の両端部に設けてもよい。
【００１５】
また、この二分子膜の水系側が、ゲル層で覆われていることを特徴とする。なお、二分子膜と、ゲル層との間には高分子膜を形成することも可能である。上記ゲル層の材料としては、ハイドロゲルが適用され、また糖が適用される。また、上記高分子膜の材料としてはアミノ酸が用いられることを特徴とする。
【００１６】
水系に直立配置される二分子膜素子においては、二分子膜のうち水系側の単分子層が浮力の影響を受けるため、膜上部の脂質単分子膜の脱離がおこり易い。そこで、上述のように膜上部に膜支持部を設けて膜分子の脱離および分子の水系中への流出を防止することにより、二分子膜の安定性をさらに高くすることが可能となる。
【００１８】
上述のような二分子膜素子において、上記の素子において用いられている二分子膜は、好ましくは、基板表面の金属に極性基が結合したアルカンチオール単分子膜と、このアルカンチオール単分子膜に疎水基を向けて配置した脂質単分子膜と、により構成されていることを特徴とする。二分子膜の一方の分子膜を基板に結合させることにより、基板表面に極めて安定な第１層目の単分子膜が形成される。従って、この基板表面の１層目の単分子膜に、分子間力によって吸着する２層目の単分子膜（脂質単分子膜）の安定性も向上することとなり、結果として安定な二分子膜が得られることとなる。
【００１９】
また、基板として、開口部を有する金属基板若しくは開口部を有し表面に金属が形成された基板や、表面に開口部を有する所定パターンの金属が形成された基板を用い、金属基板又は金属には、二分子膜の基板側の単分子膜と結合する金属材料を用い、二分子膜を上記基板の間隙領域にも形成する構成も適用される。この場合、開口部領域に形成された二分子膜の膜中にタンパク質を導入する。このように開口部を有する金属基板若しくは金属が形成された基板を利用して二分子膜を形成することにより、高い安定性を有する二分子膜が得られるとともに、開口部領域に形成された二分子膜中にタンパク質を後から入れることが容易となる。従って、上記構成を採用することにより、実際に二分子膜素子をバイオ素子として機能させることが容易になる。
【００２０】
さらに、本発明の別の構成では、上述のような二分子膜を有する素子において、二分子膜と、ゲル層との間にリポソームが配置されていることを特徴とする。このように二分子膜上に形成されたリポソームをゲル層で覆うことによって、リポソームの置かれる環境をより生体内に近いものとすることができる。従って、リポソームの膜内にタンパク質を導入していれば、そのタンパク質をより安定にかつ正常に機能させることが可能となる。また、ゲル層によって二分子膜およびリポソームを固定できるので、安定性に優れ、長い寿命の二分子膜素子が得られる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態（以下、実施形態という）について図面を用いて説明する。
【００２２】
実施形態１．
［二分子膜素子の構成］
本発明の二分子膜素子は、タンパク質等を保持するための二分子膜を備えている。この二分子膜は、有機分子からなる単分子膜の２層構造からなり、好ましくは脂質単分子膜と、アルキル鎖を有する有機分子からなる単分子膜との二層構造（いわゆる脂質二分子膜）が適用される。
【００２３】
図１は、このような二分子膜を備えた素子の本実施形態に係る構成を示している。図１において、ガラス基板１０の表面にはＡｕ膜１２が形成され、基板１３が構成されている。Ａｕ膜１２の表面には、金と、ステアリルメルカプタン［ＨＳ（ＣＨ₂）₁₇ＣＨ₃］のメルカプト（−ＳＨ）基とが、金−Ｓ結合し、この結合によってアルカンチオール［ＳＣ_nＨ_2n+1：本実施形態では、ｎ＝１８、Ｓ（ＣＨ₂）₁₇ＣＨ₃）］単分子膜１６が形成されている。
【００２４】
さらに、アルカンチオール単分子膜１６の表面には、脂質、ここでは大豆リン脂質が、分子間力によって、その疎水基をアルカンチオール単分子膜１６に向けて吸着しており、脂質単分子膜１８が形成されている。そして、上記アルカンチオール単分子膜１６と脂質単分子膜１８により、生体の細胞膜に構成が類似する二分子膜（ＢＬＭ：Bilayer Membrene）１４が構成されている。
【００２５】
本実施形態においては、上記ＢＬＭ１４の表面、すなわち脂質単分子膜１８の極性基側に、ゲル状の膜（以下、単にゲル層という）２２を形成している。また、脂質単分子膜１８の表面とこのゲル層２２との間には、極性基を有する高分子膜２０が吸着形成されている。ここで、脂質単分子膜１８の脂質としては、「正」又は「負」の極性基を備えた脂質や、非極性の脂質が使用可能である。例えば、脂質単分子膜１８の脂質として上記極性基が「負」のリン脂質を用いた場合、脂質単分子膜１８上に吸着形成されている高分子膜２０は、正極性の極性基を有するアミノ酸、ここでは、以下のような化学式（１）［ｎの平均値＝４１］で示されるポリ−Ｌ−リシンが用いられている。
【００２６】
【化１】

このポリ−Ｌ−リシンなどのように、脂質単分子膜１８中の例えば大豆リン脂質に含まれるホスファチジルセリン（phosphatidylserine）などと反対の極性を有する高分子からなる高分子膜２０を脂質単分子膜１８の表面に設けると、互いの正負の極性基が相互作用し、また、高分子膜２０のポリマー主鎖が脂質単分子膜１８の極性基を包み込むような状態になることが考えられる。そして、このような機構によって、ＢＬＭ１４の表面をポリ−Ｌ−リシンを利用した高分子膜２０で覆ってＢＬＭ１４を固定する構成とすれば、ＢＬＭ１４の安定性、すなわちＢＬＭの寿命を向上させることが可能となる。また、高分子膜２０としてアミノ酸を用いることにより、二分子膜における環境をより生体中に近似した環境とすることが可能となる。なお、本実施形態において、高分子膜２０の材料としてアミノ酸を用いているが、この場合高分子膜２０には、アミノ酸以外の他の成分も含み得る。
【００２７】
また、上記高分子膜２０の表面に形成されたゲル層２２としては、具体的には糖の一種であるアガロース［化学式：（Ｃ₆Ｈ₁₀Ｏ₅・Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₄）_n］をゲル化したものが用いられている。但し、ゲル層の材料はアガロースには限られず、生体環境に近似し、かつ長時間安定してゲル状態を維持できる材料であればよい。また、生体環境に近似させ、タンパク質を機能させるという観点より、ゲルとしては上述のような含水性のハイドロゲルを用いることが好ましい。このように、高分子膜２０表面にさらにゲル層２２を設けることによってＢＬＭ１４をさらに確実に固定でき、ＢＬＭ１４の寿命は、一層向上する。なお、ＢＬＭ１４の表面を直接ゲル層２２で覆ってもよい。また本明細書においてゲル層２２の材料として糖（アガロースゲル）若しくはハイドロゲルを開いているが、この場合に、ゲル層２２には、これら以外の成分も含み得る。
【００２８】
図１に示す二分子膜素子は、水溶液中において基板ごと直立配置される。このため、従来の構成、例えば図１２（ａ）、（ｂ）に示すように素子を水中に水平配置した場合と比較すると、浮力の影響により二層目の脂質単分子膜１８だけ（図１２（ａ）（ｂ）では、単分子７２が膜１８に対応）が剥がれてしまうことが防止されている。
【００２９】
また、ＢＬＭ１４を直接又は高分子膜２０を介して間接的に覆う層として、ゲル層２２を用いることにより、ＢＬＭ１４の周囲に膜系電解質溶液を固定することが可能となり、ＢＬＭ１４や、この膜に導入されたタンパク質を機能させる場合に必要とされる電解質水溶液をこれらに供給することが可能となる。さらに、このゲル層２２が存在しているために、ＢＬＭ１４の表面では水溶液の動きが止められることから、膜の乱れが防止され、膜の寿命を長くすることができる。
【００３０】
具体的には、図１２（ａ）（ｂ）に示すような従来の構成では、数時間〜十数時間程度の寿命の二分子膜しか得られなかったのに対し、図１に示すような二分子膜１４は、２０時間程度の寿命を有している。
【００３１】
［素子の作成方法］
次に、図１に示す二分子膜素子の作成方法の一例について説明する。
【００３２】
（１）脂質およびデカン溶液の調整
本実施形態においては、上述のように脂質としてリン脂質、より具他的にはホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）を４７％含有する大豆リン脂質（製品名 Sigma type IV-S ）を用いており、この大豆リン脂質をＫａｇａｗａ＆Ｒａｃｋｅｒの方法に従って精製する。
【００３３】
具体的には、以下の手順によって実行可能である。
【００３４】
ｉ）まず、リン脂質（１０ｍｇ）にアセトンを加え、常温で一昼夜放置する。
【００３５】
ｉｉ）次に、アセトンを捨て、ロータリーエバポレータで約１０分間、吸引乾燥する。
【００３６】
ｉｉｉ）その後、ジエチルエーテルを少量加え、上記ｉｉ）と同様に乾燥処理を施す。
【００３７】
ｉｖ）上記ｉｉｉ）の処理を数回繰り返し、乾燥後、さらにロータリーポンプで３０分間吸引乾燥させる。
【００３８】
ｖ）最後に、ｎ−デカン（１ｍｌ）加え、精製したリン脂質をデカン液中に溶解する。
【００３９】
なお、ここでは脂質としてリン脂質が用いられているが、脂質であればこれには限られない。用いる脂質の種類は、最終的に二分子膜内に導入されるタンパク質との適合性や、その他素子のおかれる環境などによって適宜設定可能である。
【００４０】
（２）基板１３の作成
生体試料観察用に用いられているカバーガラスを洗浄し、このガラス上に、スパッタ法により、Ａｕ膜１２を約１００ｎｍ形成し、基板１３を得る。但し、図１に示すガラス基板１０はカバーガラスには限られない。なお、成膜されるＡｕ膜１２は、必要に応じて開口部を有する所望のパターン（例えば格子状または網目状）にかつ所望の厚さに形成すれば良い。また、Ａｕに代えてＡｇも適用可能であり、さらに、基板１３として金属基板（Ａｕ基板、Ａｇ基板）を用いてもよい。但し、Ａｇを金属基板又は基板表面の金属膜として利用する場合、Ａｇ基板又はＡｇ膜が正電位となると電解質溶液中に溶出してしまうため、外部からの電位制御は、Ａｇ電位が正電位とならないように制御する必要がある。
【００４１】
（３）二分子膜の形成
ｉ）ステアリルメルカプタン（ＳＭ）のエタノール溶液（１０ｍＭ）を作成し、この溶液中に、上記（２）によって作成した基板１３を浸し、約３０℃で一昼夜放置する。
【００４２】
この放置期間中に、基板表面のＡｕとステアリルメルカプタンのメルカプト（−ＳＨ）基とが反応して金−Ｓ結合が起こる。そして、この金−Ｓ結合によって、図１のＡｕ膜１２表面にアルキル鎖を有する単分子膜、ここではＳＭ単分子膜、すなわちアルカンチオール単分子膜１６が形成される。
【００４３】
ｉｉ）アルカンチオール単分子膜１６が形成された基板を所定のセル内に取り付け、上記（１）において調整したリン脂質を含むデカン溶液（濃度：２０ｍｇ／ｍｌ）を、アルカンチオール単分子膜１６上に適当量（４０μｌ）滴下し、２分間程度放置する。これにより、アルカンチオール単分子膜１６上に図１に示すように脂質単分子膜１８が吸着形成される。
【００４４】
ｉｉｉ）脂質単分子膜１８が形成後、容器内に高分子としてアミノ酸であるポリ−Ｌ−リシンを溶かした水溶液を入れる。これにより、ポリ−Ｌ−リシンの正極性基（−ＮＨ₃）がリン脂質単分子膜１８の負極性基に吸着し、高分子膜２０としてポリ−Ｌ−リシンが脂質単分子膜１８を覆って、脂質単分子膜１８を固定、保護する。
【００４５】
（４）アガロースゲルの調整
ｉ）低溶融点（３０℃以下）のゲル（製品名 Agarose, Sigma VII）を数重量％になるように電解質溶液（膜系、すなわち二分子膜を置いて機能させる水溶液に用いているものと同じ）に分散させる。
【００４６】
ｉｉ）この電解質溶液を加熱しながら撹拌し、一旦沸騰させ、３０数℃まで冷やす。
【００４７】
ｉｉｉ）高分子膜形成後の素子が置かれるセル内には膜系電解質溶液が入れられており、この膜系電解質溶液を予め３０℃以上に加熱し、その後この膜系電解質と、上記ｉｉ）で得られたアガロース溶液とを置換する。
【００４８】
ｉｖ）セル内を満たすアガロース溶液をスターラーを用いて撹拌しながら常温に戻す。このように常温に戻す過程でアガロースがゲル化する。よって、高分子膜２０形成後、高分子膜２０の表面にアガロースゲル層２２が形成されることとなる。
【００４９】
以上のような手順により、ＢＬＭ１４の表面に高分子膜２０、およびさらにその表面にアガロースゲル層２２が形成され、本実施形態の二分子膜素子が得られる。このようにして得られた素子を所定セルにセットし、上記膜系の電解質溶液、例えば［０．１ＭＫＣｌ溶液，ｐＨ７．２］中に配置し、二分子膜を機能させる。ここで、この素子は、ＢＬＭ１４の補強材として高分子膜およびアガロースゲル層を設けているので、上述のように従来の二分子膜と比較して寿命の長い二分子膜が得られている。
【００５０】
ここで、ハイドロゲルであるアガロースゲルのアガロース濃度は、二分子膜を固定できる範囲において低濃度であることが好ましい。なぜなら、ゲル濃度が高くなるとゲル層内でゲルの網目が多くなって層が固くなり、外部からの衝撃に対する耐性は増加するが、含水率が少なくなり、タンパク質や、二分子膜素子の機能を発揮させるために必要な物質やイオンのゲル層内での動きが妨げられるためである。
【００５１】
また、後述するように二分子膜内にタンパク質を導入したり二分子膜にタンパク質を膜内に有するリポソームを吸着させたりして、外部の物質をこれらのタンパク質によって検出する場合には、検出対象物質はゲル層２２を通ってタンパク質に到達する必要がある。このような観点からは、ゲル層２２は、二分子膜の固定機能が失われない範囲で薄くすることが好ましい。
【００５２】
［水系に配置した二分子膜素子の構成］
次に、上記構造の二分子膜素子を用い、この素子を水系にて直立配置した際の二分子膜の寿命をさらに向上させる為の構成を説明する。以下、この水系中の素子構成について図１および図２を用いて説明する。なお、以後、図面の説明に関し、すでに説明した部材と対応する部分には同一符号を付して説明を省略する。
【００５３】
［構成］
基板１３の表面には、予め金−Ｓ結合によってアルカンチオール単分子膜１６が形成されており、この基板１３が、図２に示すように内部に液溜め３４が形成されたテフロンよりなるセル３０に取り付けられている。
【００５４】
セル３０の液溜め３４内には、このセル３０内に基板１３を取り付けた状態において、基板のＢＬＭ形成面側に、ＢＬＭ膜厚方向に向かって延びるように膜支持部３２が突設されている。
【００５５】
また、セル３０の液溜め３４には、図１に示した脂質単分子膜１８、高分子膜２０、アガロースゲル層２２を形成するための各種溶液が注入可能となっている。そして、基板１３をセル３０に取り付けた状態で、上述の手順に沿って各種溶液をこの液溜め３４に入れ、膜形成処理を施すことにより、図１に示すような構成の二分子膜素子が基板１３の表面に形成される。さらに、素子形成後においては、図２（ａ）のように、液溜め３４には、例えば［０．１ＭＫＣｌ，ｐＨ７．２］の電解質溶液４０が注入される。
【００５６】
次に、膜支持部３２の機能について説明する。図２に示されるように、セル３０に取り付けられて電解質溶液４０に曝された二分子膜素子は、二分子膜１４の上部に位置する脂質単分子膜１８が浮力の影響を強く受けて、アルカンチオール単分子膜１６から脱離しようとする。ここで、図２に示すような膜支持部３２が、二分子膜１４の上方に存在しなければ、脱離した脂質単分子膜１８は、電解質溶液４０中に流出してしまう。脂質分子が電解質溶液４０中に流出すると、二分子膜１４は、その二層目の配列状態が大きく乱れ、膜は急速に壊れてしまう。
【００５７】
これに対し、二分子膜１４の上方に膜支持部３２を突設配置することにより、脂質分子の電解質溶液４０中への流出を防止している。なお、実施形態１に示すように、ＢＬＭ１４の表面をさらにアミノ酸の高分子膜２０およびアガロースゲル層２２で覆ったとしても、これら高分子およびアガロースは、強固な化学結合によって二分子膜上に形成される訳ではない。つまり、単に分子間力や物理的吸着によってＢＬＭ１４表面に吸着形成されているにすぎないので、これら高分子膜２０とアガロースゲル層２２を二分子膜で覆う構成により、脱離した脂質分子の溶液中への流出を完全に防止することは難しい。
【００５８】
膜支持部３２を設けて電解質溶液４０中への流出を妨げれば、図２（ａ）に示すように、ＢＬＭ１４の上部にアルカンチオール単分子膜から脱離した脂質分子がこの膜支持部３２の下側に溜まる。そして、ＢＬＭ１４から脱離する脂質分子と膜支持部３２の下側に脂質溜まりから供給される脂質分子との間で平衡状態が達成され、これによりＢＬＭ１４が安定化されると考えられる。
【００５９】
膜支持部３２のＢＬＭ１４の膜厚方向への突出量は、膜支持機能を十分発揮させるためには、少なくともＢＬＭ１４の膜厚（通常のＢＬＭ１４の膜厚は、６〜７ｎｍ）以上とすることが必要である。
【００６０】
膜支持部３２の形状については、図２（ａ）に示すように逆Ｌ字形状として、ＢＬＭ１４の上方を囲むようにすれば、脂質分子の流出をより確実に防止できる。また、図２（ｂ）のように基板１３から遠ざかるにつれて下方に迫り出す形状でもよい。さらに、十分な突出量があれば、図２（ｃ）に示すように単にＢＬＭ膜厚方向に延びる矩形形状であってよい。
【００６１】
また、セル３０およびこのセル３０と一体的に形成された膜支持部３２の材質は、テフロンとして以上説明しているが、テフロン材料には限られず、各種ＢＬＭ形成溶液および電解質溶液に対して耐性を有する材料であれば良い。なお、ＢＬＭ膜に影響を与えないという観点からはこの材料として、少なくともその表面が疎水性（非極性）であることが好ましい。これは、膜の上方において膜支持部表面が極性を示していると、脂質単分子の極性基が膜支持部に引きつけられて脂質単分子膜の配列が乱れる可能性があるからである。
【００６２】
［特性評価結果］
次に、膜支持膜を設けた二分子膜素子の特性の評価結果について説明する。なお、この評価においては、金属膜を有する基板１３の表面に形成したアルカンチオール単分子膜とこの単分子膜に吸着形成する脂質単分子膜とからなる二分子膜を用いている。
【００６３】
また、さらにポリ−Ｌ−リシンを含む高分子膜を二分子膜上に形成した構成についても合わせて評価した。
【００６４】
まず、上述の手順（１）〜（３）ｉ）を用い、図３に示すように、基板１３の金表面にアルカンチオール単分子膜１６を形成する。
【００６５】
次に、白金（Ｐｔ）線３８を銀ペースト３７を利用してＡｕ膜１２に接続する。銀ペースト３７を乾燥させた後、エポキシ樹脂３６によってＰｔ線３８とＡｕ膜１２との接続部をコートして補強する。その後エポキシ樹脂３６が乾燥硬化するまで放置し、図３に示す試料を得る。
【００６６】
試料形成後、これを図２に示すようにセル３０にセットし、試料の基板１３の表面、すなわちアルカンチオール単分子膜１６表面に対して脂質溶液（デカン溶液）を３０〜４０μｌを添加し、この状態で約２分間放置し、アルカンチオール単分子膜１６と、溶液中の脂質分子とをなじませる。
【００６７】
次に、セル３０の液溜め３４に電解質溶液４０（０．１ＭＫＣｌバッファ液）を注入し、この状態において塩橋を介した銀・塩化銀電極と、基板１３のＡｕ膜１２を利用した金電極との間の交流インピーダンスを所定時間ごとに測定する。測定結果は図５に示す。また、電解質溶液４０を注入後（例えば、注入後１０時間経過後）に、液溜め３４にポリＬリシン（ＰＬＬ）溶液を注入して、交流インピーダンスを測定した結果は、図６に示す。
【００６８】
（測定結果１：基板＋アルカンチオール単分子膜＋脂質単分子膜）
図４は、二分子膜素子の膜系の等価回路を示している。図４において、Ｃ₁はアルカンチオール単分子膜１６の固有の容量、すなわち２層目の単分子膜が存在しない状態における容量である。また、Ｃ₂は２層目の脂質単分子膜の容量、Ｒｍは二分子膜の膜抵抗である。この等価回路に示されるように二分子膜の１層目の単分子膜１６の容量Ｃ₁と２層目の脂質単分子膜の容量Ｃ₂とは銀・塩化銀電極と金電極間との間に直列接続され、２つの容量の合成容量、つまり二分子膜容量Ｃｍと、膜抵抗Ｒｍとが、銀・塩化銀電極と金電極間に並列に接続されていることとなる。
【００６９】
図５は、１００Ｈｚで測定した上記銀・塩化銀電極と金電極間における膜抵抗および膜容量の経時変化を示している。なお、図において、横軸は時間（ｈｒ）、左縦軸は膜抵抗Ｒｍ（×１０⁶Ω）、右縦軸は二分子膜容量Ｃｍ（×１０^-7Ｆ）を示している。測定開始（ｔ＝０）から（つまり、セル３０に電解質溶液４０を注入してから）、約４０時間が経過するまでの期間ｔ１は、アルカンチオール単分子膜１６の表面に存在する脂質膜が徐々に薄膜化していく。そして、この期間ｔ１においては、膜抵抗Ｒｍおよび膜容量Ｃｍのいずれもほぼ一定値ではあるが、例えば脂質デカン溶液の層が薄くなって二分子膜の状態へと近づくため、膜容量Ｃｍが多少上昇する。
【００７０】
４０〜５０時間の期間ｔ２においては、二分子膜状態の領域が増加することにより膜容量Ｃｍは急激に上昇する。
【００７１】
ここで、通常の二分子膜の単位面積当たりの各値：特性膜容量［Ｃｍ＝５００ｎＦ／ｃｍ²］と、金電極面積：０．７８ｃｍ²を用い、金電極全体に二分子膜が形成されていると仮定して膜容量を算出すると、膜容量Ｃｍ＝３９０ｎＦとなる。なお、膜構造によって異なるが、二分子膜の特性膜比抵抗は、例えばＲｍ＝２００ＭΩ＊ｃｍ²、膜抵抗Ｒｍの値は、例えばＲｍ＝２５６ＭΩである。
【００７２】
上記期間ｔ２の膜容量は最大値でＣｍ＝１００ｎＦである。また、膜抵抗Ｒｍは、例えばＲｍ＝０．１ＭΩである。従って、上記算出結果とこの膜容量を比較すると、電極面積の約２５％が二分子膜となっていることが推測できる。なお、二分子膜化していないところは、二分子膜に比べてその膜厚が非常に大きいと考えられるため、その部分における容量は無視することができる。
【００７３】
また、図５において５０時間を経過したところで、膜容量Ｃｍは小さくなる。これは、ＢＬＭの二層目である脂質単分子膜が剥がれて表面にアルカンチオール単分子膜が露出するためであると考えられる。現実には、アルカンチオール単分子膜の膜容量Ｃ１が脂質単分子膜の存在時に比較して５倍程度であるので、２層目の単分子膜が剥離すると、膜容量Ｃｍが上昇することとなる。しかし、図５に示す測定における設定周波数（１００Ｈｚ）では、実際のコンデンサが動作しないのでこの期間ｔ３においては抵抗成分が減少し、本測定装置における検出電流が装置の測定レンジ外となり、事実上測定不能になるため膜容量Ｃｍ値が低下する。
【００７４】
このように、基板に金−Ｓ結合を利用したアルカンチオール単分子膜と、脂質単分子膜よりなる二分子膜を所定の水系中に直立配置した場合、膜支持部を設けることによってＢＬＭの寿命を２０〜４０時間程度にすることが可能となる。
【００７５】
（測定結果２：基板＋アルカンチオール単分子膜＋脂質単分子膜＋ＰＬＬ膜）
図６は、図５の系内に、さらにＰＬＬ溶液を注入した場合における膜容量の経時変化を示している。なお、測定条件は、図５の場合と同様であり、図６においても、１００Ｈｚで測定した上記銀・塩化銀電極と金電極間における膜容量を表している。図において、横軸は時間（ｈｒ）、縦軸は二分子膜容量Ｃｍ（×１０^-8Ｆ）を示している。
【００７６】
図６によると、４５０時間程度経過するまでの期間は膜容量Ｃｍは安定しており、この期間、二分子膜は、高分子膜に覆われてその二分子膜状態を維持していることがわかる。また、４５０時間を経過すると、膜容量Ｃｍに上昇がみられる。膜容量Ｃｍが上昇するのは、図５の場合と同様に、チオール単分子膜１６の表面上に存在する脂質膜が薄膜化して二分子膜状態の領域が増加するためである。そして、その後、脂質単分子膜の剥離が起こり、図５と同様に現実の膜容量Ｃｍが増大することにより、設定周波数１００Ｈｚの条件下では、抵抗成分が小さくなり検出電流が測定レンジを超えるため、図６に示すように膜容量Ｃｍが低下する。
【００７７】
以上のことから、基板に金−Ｓ結合を利用したアルカンチオール単分子膜と、脂質単分子膜よりなる二分子膜を所定の水系中に直立配置した場合、膜支持部を設け、更に高分子膜を設けることにより、ＢＬＭの寿命は更に長くなり、図６における条件においては、４５０時間程度にすることが可能となる。
【００７８】
（二分子膜の寿命の比較例）
上述のような測定を二分子膜の構成を代えてそれぞれ実行したところ、各二分子膜の寿命は次表１のようになった。
【００７９】
【表１】

表１において、素子構成（１）は、図２のような膜支持部３２を設けず、ＳＭ（ステアリルメルカプタン）の単分子膜と脂質単分子膜より形成されたＢＬＭを用い、ＢＬＭ表面を高分子（ＰＬＬ）膜、アガロースゲル層で覆うという構成である。そしてこの構成（１）の場合、ＢＬＭの寿命は、電気的特性の安定な期間で判断すると、約２０時間となっている。これにより、従来のＳＭの単分子膜と脂質単分子膜のみによってＢＬＭを構成した場合における膜の寿命（長くて十数時間程度）に比較すると、ゲル層を有することにより安定性の高いＢＬＭを有する素子が得られることが明らかである。
【００８０】
次に、表１の素子構成（２）〜（４）は、膜支持部を設けた場合の構成である。具体的には構成（２）は、ＳＭの単分子膜と脂質単分子膜とから構成されたＢＬＭ、構成（３）は、構成（２）と同様のＢＬＭの表面にＰＬＬ膜を形成したもの、構成（４）は、構成（２）と同様のＢＬＭに、ＰＬＬ膜およびアガロースゲル層を形成した構成である。但し、構成（４）は実際には後述する図１０に示すようにＰＬＬ膜とゲル層との間にリポソームが配置された構成となっている。これら、構成（２）〜（４）に示すように、膜支持部を設けた場合には、素子構成（２）〜（４）のいずれにおいても、その寿命は、それぞれ（２）２０〜４０時間、（３）百数十〜数百時間、（４）一ケ月以上、ときわめて長くなっている。従って、水系中において、膜支持部を設けることにより、ＢＬＭの安定性が飛躍的に向上することが明らかである。
【００８１】
表に示されるように、ゲル層を設けることにより、特に素子構成（４）にあっては、一ケ月以上の寿命を有するＢＬＭが得られており、二分子膜素子として十分な安定性が得られている。即ち、ゲル層により、ＢＬＭ中にタンパク質を導入して、タンパク質機能を発揮するに必要な安定性が得られている。
【００８２】
また、素子構成（２）、（３）、（４）の比較からも明らかなように、ゲル層を設けることにより、素子の寿命は著しく向上している。
【００８３】
実施形態２．
本実施形態では、二分子膜を形成する基板を開口部を有する例えば格子状または網目状の構成とし、膜安定性を高めるために、膜支持部を設ける。図７は、このような基板を用いて作成した二分子膜素子の構成例を示している。また、図８（ａ），（ｂ）は、図７に示す素子において二分子膜中にタンパク質を導入した場合の構成を示しており、具体的には図８（ａ）は、二分子膜素子の平面の模式的な構造を示し、図８（ｂ）は、この二分子膜素子の断面を示している。なお、図７及び図８に示す基板の厚さは、現実には図示するものより厚く、また基板に形成される開口部の形状は、図示するような形状には限られない。
【００８４】
本実施形態２の例では、基板として格子状の金基板５０を用いており、図７に示すように、金基板５０の表面に、金−Ｓ結合によってアルカンチオール単分子膜１６が形成されている。また、アルカンチオール単分子膜１６の表面にはこれを取り囲むように、膜１６に疎水基を向けて脂質（例えばリン脂質）単分子膜１８が吸着し、アルカンチオール単分子膜１６と脂質単分子膜１８よりなる二分子膜が形成されている。
【００８５】
また、金基板５０の間隙部分５２においては、脂質単分子膜１８が互いに疎水基を内側に向き合って二分子膜を構成している。そして、脂質単分子膜１８の表面、すなわち極性基側には、上述の実施形態と同様に高分子（ＰＬＬ）膜２０、さらにアガロースゲル層２２が形成されている。
【００８６】
図７に示すように、高分子膜２０及びゲル層２２によって二分子膜を固定することにより上述のように膜の安定化を図ることができる。更に、二分子膜１４の表面側に設けられたゲル層２２が、二分子膜１４に導入されたタンパク質を機能させる場合に必要とされる電解質水溶液を二分子膜１４及びタンパク質５４の周囲に固定しつつ、これらに電解質水分を供給することが可能となる。更に、ゲル層２２が、二分子膜表面での水系の動きを止めることから膜の乱れを防止することができ、より長い期間、二分子膜構造を維持し、またタンパク質５４が機能し得る状態を維持する。
【００８７】
金基板５０の表面に強固な金−Ｓ結合を利用してアルカンチオール単分子膜１６を形成すると、金基板５０の全面にアルカンチオール単分子膜１６が形成されることとなり、アルカンチオール単分子膜１６の形成領域に、後からこの単分子膜１６を押し退けてタンパク質を導入する余裕が確保しずらい。そこで、基板に開口部を設け、その基板を用いて二分子膜を形成することにより、基板の開口部である間隙部分５２の二分子膜は、基板表面に形成された二分子膜の２層目の脂質単分子が疎水基が膜の内側を向くように互いに向かい合った脂質二分子膜となる。このため、形成された二分子膜内に後からタンパク質を導入する際、この間隙部分５２における二分子膜にタンパク質を導入することが容易となる。
【００８８】
また、これら図８（ａ）、（ｂ）に示されるように、二分子膜１４にタンパク質５４を導入する場合、二分子膜１４を形成後、先に間隙部分５２にタンパク質５４を導入する。そして、その後、高分子膜２０およびアガロースゲル層２２によって二分子膜１４およびタンパク質５４の表面を覆って二分子膜１４及び導入されたタンパク質５４を膜の両側から固定する。
【００８９】
なお、二分子膜素子は、図２に示すような水系中に直立配置されるため、水系中にて、脂質単分子膜１８の浮き上がりを防止するための図２のような膜支持部３２を膜上方に設けることにより、一段と素子の寿命を延ばすことが可能となる。
【００９０】
また、図７及び図８では金属基板５０を用いているが、これには限られず、同様な形状の基板、例えばガラス基板の表面に金属を形成したものを利用してもよい。
【００９１】
さらに、上述のように格子状の基板５０を用いずに、例えば開口部のない平板状のガラス基板上に、図８（ａ）のような開口部を有する形状に金属材料をパターニングして二分子膜素子用の基板としてもよい。図９の素子では、このような基板１３を利用しており、この基板１３上に二分子膜１４を作成している。この場合、金属材料は１層目の単分子１６と結合する材料（例えばＡｕ、Ａｇ）を用いており、図示されるように金属材料（Ａｕ膜１２）の存在しない間隙領域には、金−Ｓ結合によるアルカンチオール単分子膜１６が形成されないこととなる。従って、この領域にタンパク質５４を導入することが容易となる。
【００９２】
実施形態３．
次に、実施形態１に示す二分子膜素子の他の構成例について図１０を用いて説明する。
【００９３】
図１０において、少なくとも表面に金膜が形成された基板１３上にアルカンチオール単分子膜および脂質単分子膜より構成された二分子膜１４が形成されている（但し、基板表面の金属膜は図示せず）。本実施形態では、二分子膜１４の表面に実施形態１と同様にアミノ酸の高分子（ＰＬＬ）膜２０が設けられ、さらにこの高分子膜２０の表面に、タンパク質５４を膜内に有するリポソーム６０が吸着されている。リポソーム６０は、図示されるようにリン脂質単分子膜５８の二分子膜構造であり、その外側表面には、リン脂質単分子膜５８の極性基（負極性基）が位置している。従って、この脂質単分子膜５８の極性基が、高分子であるＰＬＬの正極性基に引きつけられることにより、高分子膜２０の表面にリポソームが吸着形成される。また、高分子膜２０及びリポソームを覆うようにさらにアガロースゲル層２２を形成し、二分子膜１４および表面のリポソーム６０を固定すれば、素子の安定性を高めることができる。なお、ＢＬＭ１４の二層目として、「正」の極性基を有する脂質を用いて単分子膜を形成すれば、必ずしも、ＢＬＭ１４とリポソームとの間に高分子膜２０を介在させる必要はない。そして、このような場合において、高分子膜は、リポソームとアガロースゲル層２２との間に形成してもよい。
【００９４】
以上のように、基板上に作成した二分子膜１４および高分子膜２０を利用してその上にリポソームを形成することにより、リポソーム６０の環境を生体内に近似したものとすることができ、リポソーム６０の安定性を高め、またタンパク質５４をより正常かつ安定的に機能させることが可能となる。なお、図１０に示す二分子膜素子は水系中におかれることから、実施形態１と同様に膜の上方に膜支持部を設けることにより、一段と膜の安定性を高めることが可能となる。
【００９５】
以上説明した各実施形態において、二分子膜（リポソームを含む）に導入されるタンパク質は、用途に応じて選択可能であり、また、基板、二分子膜、高分子膜、ゲル層を構成する材料としては、用いられるタンパク質との適合性および素子が置かれる環境に応じて、適切なものを選択することが好ましい。
【００９６】
また、タンパク質として様々な刺激に応じて変化をするものを膜中に導入し、このタンパク質を機能させれば、本発明の二分子膜素子を光センサ、臭いセンサなどの様々なセンサなどに利用することが可能となる。
【００９７】
更に、例えば図９の素子のにおいて二分子膜のサポート基板として、図８（ａ）のマトリクスパターン（５０）のように所望のパターンに形成した金属材料（Ａｕ膜１２）を電極として用いることにより、膜内の特定位置のタンパク質を機能させたり、タンパク質を機能させることによって発生する電気特性の変化などを検出することが可能となる。具体的には、例えば、高度好塩菌などに含まれる光感応性タンパク質などを用いて二分子膜素子を構成し、これを光センサなどに用いた場合、基板上の上記金属を配線として利用することができる。
【００９８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の各二分子膜素子によれば、ゲル層、又はゲル層と高分子膜との組合せ、もしくは膜支持部又は膜支持部とゲル層などとの組合せ等により、形成された二分子膜の安定性を高めることができ、素子としての実用性を格段に向上させることが可能となる。従って、素子にタンパク質を導入し、これを用いてタンパク質機能の研究もしくはタンパク質機能を利用した素子の作成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態１に係る二分子膜素子の構成を示す図である。
【図２】本発明の実施形態１に係る二分子膜素子の構成を示す図である。
【図３】本発明の二分子膜素子の特性評価に用いた試料の構成を示す図である。
【図４】本発明の二分子膜素子の二分子膜の等価回路を示す図である。
【図５】図３に示す試料を用いて測定した膜抵抗と膜容量の経時変化を示す図である。
【図６】図３に示す試料を用いセル内に更にＰＬＬ溶液を添加した場合の膜容量の経時変化を示す図である。
【図７】本発明の実施形態２に係る二分子膜素子の構成を示す図である。
【図８】図７に示す二分子膜素子にタンパク質を導入した状態を示す図である。
【図９】本発明の実施形態２の他の構成例を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態３に係る二分子膜素子の構成を示す図である。
【図１１】従来の二分子膜素子の構成を示す図である。
【図１２】図１１とは別の従来の二分子膜素子の構成を示す図である。
【符号の説明】
１０ガラス基板、１２Ａｕ膜、１３基板、１４二分子膜（ＢＬＭ）、１６アルカンチオール単分子膜、１８，５８脂質単分子膜、２０高分子膜、２２ゲル層、３０セル、３２膜支持部、３４液溜め、３９カバーガラス、５０金基板、５２間隙部分、５４タンパク質、６０リポソーム。

Claims

基板上に二分子膜が形成された二分子膜素子であって、
前記基板は、水系の中に直立するように配置され、
前記基板の少なくとも上方側に前記二分子膜の膜厚方向に延びて水系における二分子膜の上部を支持するための膜支持部を備えることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１に記載の二分子膜素子において、
前記膜支持部は、前記二分子膜の膜厚以上の長さを有し、
この膜支持部によって、水系中で直立するように配置される前記二分子膜の浮き上がりを抑えることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１又は請求項２のいずれかに記載の二分子膜素子において、
前記膜支持部は、少なくとも前記二分子膜との接触面が非極性材料によって形成されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記二分子膜上にゲル層が形成されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項４に記載の二分子膜素子において、
前記ゲル層の材料として、糖が用いられていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項４又は請求項５のいずれかに記載の二分子膜素子において、
前記ゲル層の材料として、ハイドロゲルが用いられていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項４〜請求項６のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記ゲル層は、アガロースゲルを含むことを特徴とする二分子膜素子。
請求項４〜請求項７のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記二分子膜、前記ゲル層との間に、更に高分子膜が形成されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項８に記載の二分子膜素子において、
前記高分子膜の材料として、アミノ酸が用いられていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項８に記載の二分子膜素子において、
前記高分子膜は、ポリリシンを含み、
前記ゲル層は、アガロースゲルを含むことを特徴とする二分子膜素子。
請求項４〜請求項１０のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記二分子膜と、前記ゲル層との間に、更にリポソームが配置されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項８〜請求項１０のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記高分子膜上にリポソームが配置され、前記高分子膜及び前記リポソームが前記ゲル層によって覆われていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１〜１２のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記二分子膜は、前記基板の表面上に形成されている金属材料に極性基が結合したアルカンチオール単分子膜と、このアルカンチオール単分子膜に疎水基を向けて配置した脂質単分子膜と、より構成されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１〜１２のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記基板は、金属基板又は少なくとも表面の一部に金属が形成された基板であり、
前記金属基板又は金属には、前記二分子膜の基板側の単分子膜と結合する金属材料が用いられていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１〜１２のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記基板は、開口部を有する金属基板若しくは開口部を有し表面に金属が形成された基板、又は表面に開口部を備えた所定パターンの金属が形成された基板であり、
前記金属基板又は金属には、前記二分子膜の基板側の単分子膜と結合する金属材料が用いられ、
前記基板又は前記金属の開口部領域に、更に二分子膜が形成され、
この前記開口部領域に形成された二分子膜の膜中にタンパク質が導入されていることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の二分子膜素子において、
前記金属材料は、金又は銀であることを特徴とする二分子膜素子。
請求項１〜１６のいずれか一つに記載の二分子膜素子において、
前記二分子膜は、タンパク質を保持するための膜であることを特徴とする二分子膜素子。