JP3814909B2

JP3814909B2 - Oligonucleotide probe for detecting bacteria belonging to the genus Legionella and a method for detecting bacteria belonging to the genus Legionella

Info

Publication number: JP3814909B2
Application number: JP00505097A
Authority: JP
Inventors: 若子佐藤; 孝行江崎; 啓之山本
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1997-01-14
Filing date: 1997-01-14
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2017-01-14
Also published as: JPH10191982A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌という場合がある）を検出、同定または定量するためのオリゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】
環境中からのレジオネラ検出では、通常低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジオネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性などを試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオネラかどうか判断している。
【０００３】
すなわち培養による方法では、コロニーがレジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではないため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するという問題点がある。
またレジオネラが生育していた環境中の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もある。
【０００４】
レジオネラを検出、定量する別の手段として抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかるという問題点がある。
【０００５】
ところで、特開昭61-88900号には、ＤＮＡプローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されている。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハイブリダイゼーションに用いることができないという問題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプローブとして使用する場合、検出対象としている部分が明らかではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難である。
【０００６】
また特公平5-78319号には、核酸プローブを用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載されており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L. bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MSH9, L. oakridgenis(オークリツジ10), L. lansing2, L. SC-32C-C8, L. WA-316, L. WO-44-3C(L. feeleii), L. phoenix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW), L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L. SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特異的に検出することができる例証的プローブが記載されている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識しているのか不明確であり、検出精度に問題がある。
【０００７】
また特表平1-503356号には、特定の配列を有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載され、実施例において３種の混合したプローブを用いて、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出している。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
【０００８】
【表１】

【０００９】
しかし上記検出方法では、３種類のプローブを調製して用いる必要があり、また知られている３８種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験されておらず、残り４５％を検出できるかどうか不明であるという問題点がある。
【００１０】
また特表平5-507206号にも、特定の配列を有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が明らかではないという問題点がある。
【００１１】
また、In situ identification of Legionellaceae using 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal laser scanning microscopy, Werner Manz, Rudolf Amann et. al. Microbiology(1995), 141, 29-39には、レジオネラファミリーを検出するためのプローブとして、２種類のプローブの評価結果が報告されている。一つは16SrRNAの226-243（大腸菌の16SrRNAナンバーリング）をターゲットとするプローブ、もう一つは同705-722をターゲットとするプローブである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができ、しかも容易に調製することができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検出することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次のレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法である。
（１）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプローブであって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3'からなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
（２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識してなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用標識オリゴヌクレオチドプローブ。
（３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用試薬。
（４）レジオネラ属に属する細菌、そのDNAまたはrRNAを含む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプローブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出方法。
【００１４】
本発明のプローブは既知のレジオネラ16SrRNAの可変領域に相補的な配列のなかから、レジオネラ属に保存性の良く、かつ他の属と相違する部分を選び出すことによって得られたものである。すなわち本発明のプローブの配列は、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）に相当する。従って本発明のプローブの配列は、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）の相補的配列、または16SrRNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）をターゲットにし、これらの配列を認識するに足るものである。
【００１５】
Escherichia coli、Ps. aeruginosa、Legionella pneumophiliaおよび他のLegionellaの16SrRNA配列の一部の塩基配列を表２に示す。
【表２】

【００１６】
本発明のプローブは、前記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドから化学合成により容易に合成することができる。このため、同一のプローブを何度でも容易に得ることができ、ロットにより特異性が異なるということはない。また本発明のプローブは塩基数が比較的短いことから、in situハイブリダイゼーションに用いることもでき、しかも一種類のプローブから検出できるレジオネラ属細菌の種類も多い。これらの点から、検出試薬として優れている。
【００１７】
本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質などの標識物質で標識したプローブである。このような標識物質としては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体的なものとしては³²Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法でプローブに導入することができる。
【００１８】
本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むものであり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよく、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーションを容易に実施することができるようにキット化されたものでもよい。
【００１９】
本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブまたはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこのDNAを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、その後標識物質を指標にして検出することにより、例えば放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出することにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレジオネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等により容易に検出、同定または定量することができる。
【００２０】
本発明のプローブは一種類で検出、同定または定量することができるレジオネラ属細菌の種の種類が多く、少なくともレジオネラ３４種（後記表３参照）を検出することができる。このように本発明のプローブは、従来のプローブに比べて、一種類のプローブでより多くの種の種類のレジオネラを検出することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、前記標識オリゴヌクレオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する細菌またはそのDNAを含む検体に接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネラ属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーションは従来と同様の方法により行うことができる。例えば、細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなどのフィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌操作を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温にすることにより、レジオネラ属細菌のDNAをフィルター上に固定する。このフィルターをハイブリダイゼーション溶液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリゴヌクレオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼーション時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す温度を選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マイナス５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検出感度を示す温度は、予め実験により求めることができる。プローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗浄し、非特異的な結合をしているプローブを除去する。洗浄は緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが好ましい。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よりも低く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実験により求めることができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質の種類に応じて公知の方法により行うことができる。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することにより検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方法により光量を測定することにより検出できる。また抗原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定することにより検出できる。
【００２３】
このように本発明のプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができる。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行うことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つのコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、例えば培地プレートに生育しているコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか一度に判別することができる。また、原理的に培養による検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織中でレジオネラがどのように分布しているかということを明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブを容易に入手できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
実施例および比較例
１）オリゴヌクレオチドプローブの調製
本発明のプローブを、公知の固相ホスホロアミダイド法により合成した。合成したプローブは高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精製後は凍結乾燥して保管した。その後の操作には、脱イオン水に溶解して用いた。
【００２５】
上記プローブをDIG oligoprobe tailed label kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコキシゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃度になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解し、後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上記ジコキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として作用する化合物である。
【００２６】
２）検体の調製
報告されているレジオネラ属のうち、表３に示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシズ）を入手し、DNA抽出後、ドットブロットを実施した。なお比較例としては、Enterobacter cloacae(ATCC 23355)、Escherichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella pneumoniae(ATCC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 13315)、Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella typhimurium(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC 8100)、Staphylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと同様にDNAを抽出後、ドットブロットに供した。
【００２７】
すなわち、レジオネラをBCYEα寒天培地（Buffered charcoal-yeast extract agar supplemented with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。DNAの抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.4.1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従って実施した。
【００２８】
抽出したDNAのＡ₂₆₀nmにおける吸収を測定し、それぞれのDNAを同一濃度になるよう調整した後、ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットした。風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィルターを５分間ずつ順次置き、DNAを変性させた。（１）0.5N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl pH7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citorate pH7.0。その後、120℃で30分間加温してDNAをフィルターに固定し、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
【００２９】
３）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはDIG oligoprobe tailed label kitのStandard 5 x SSC procedureに基づき実施した。以下に手順を示す。
DNAを固定した前記フィルターをプラスチックバッグの中に入れ、100cm²あたり20mlのハイブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシールした。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブリダイゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含む新しいハイブリダイゼーション液を100cm²あたり2.5mlになるようプラスチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら50℃で２〜３時間反応させた。
【００３０】
その後、フィルターをプラスチックバッグから取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm²あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm²あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替え、さらに1５分間洗浄した。
【００３１】
フィルターを100mlあたり160mlの100mM Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジコキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液に変え、繰返した。
【００３２】
100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl₂溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECLハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとなって現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階に分けて反応性を判断した。その結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】

【００３４】
【表４】

【００３５】
【表５】

【００３６】
表３の注
Ｎｏ．１〜３６の菌が実施例、Ｎｏ．１０１〜１０８の菌が比較例
評価基準
＋＋：強いシグナルあり
＋：シグナルあり
±：わずかにシグナルが確認される
−：反応確認されず
＊１ DNAが抽出できず、ハイブリダイゼーションは実施せず
【００３７】
表３の結果から、本発明のプローブを用いると、試験に供したレジオネラのうちL. islaelensisを除く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことがわかる。またレジオネラ以外の菌からはほとんどシグナルが得られなかった。
このことから、本発明のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが可能で、レジオネラ属特異性があることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特定な塩基配列を有し、多数の種のレジオネラ属細菌の16SrRNAの特定の位置の配列および16SrRNAをコードするDNAの相補的配列と、特異的に相補的な塩基対を形成する。このため、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出するためのプローブとして好適に用いることができる。また塩基が短いので容易に調製することができる。
【００３９】
本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブは上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識しているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４０】
本発明の試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４１】
本発明の検出方法は上記標識オリゴヌクレオチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそのDNAと接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出するようにしているので、レジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４２】
【配列表】

【００４３】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an oligonucleotide probe and a labeled oligonucleotide probe for detecting, identifying or quantifying bacteria belonging to the genus Legionella (hereinafter sometimes referred to as Legionella genus), and a Legionella genus comprising the labeled oligonucleotide probe. A reagent for detecting bacteria, and a method for detecting Legionella bacteria using them.
[0002]
[Prior art]
For detection of Legionella from the environment, Legionella is usually quantified by culture in Legionella selective medium such as WYOα after low pH treatment. However, common and specific forms and biochemical properties have not been reported for Legionella, so after colony formation, auxotrophy, Gram staining, morphology observation, antibody reactivity, etc. are tested. And it is judged whether it is Legionella from the result of some of these identification tests.
[0003]
That is, in the culture method, it takes 5 to 10 days for the colonies to exhibit the color, shape, and other characteristics peculiar to Legionella, and since it is not a complete selective medium, some of the resulting colonies are similar to Legionella. Some bacteria form colonies, and the identification of auxotrophy, Gram staining, etc. is essential by catching colonies. For this reason, there is a problem that detection of Legionella bacteria requires a long period of about two weeks.
In addition, the growth conditions in the environment where Legionella grew and the growth conditions using the selective medium are greatly different, and there is also a problem that a colony may not be formed on the medium depending on the physiological state of Legionella.
[0004]
Although there is a method using an antibody as another means for detecting and quantifying Legionella, no antibody capable of detecting a wide range of species of Legionella has been reported. In addition, the method using an antibody has a problem that it takes time and effort to obtain the antibody.
[0005]
JP-A-61-88900 describes a method for detecting Legionella using a DNA probe. However, since this method uses a fragment mixture of genomic DNA obtained after a partial separation operation by partially decomposing genomic DNA with a restriction enzyme, it is difficult to repeat exactly the same fragment mixture, and it depends on the lot. There is a problem that a difference occurs in sex. In addition, there is a problem that it cannot be used for so-called in situ hybridization. Furthermore, when a genomic DNA fragment mixture is used as a probe, the part to be detected is not clear, and it is difficult to give an academic meaning to the obtained result.
[0006]
Japanese Patent Publication No. 5-78319 describes a method for detecting, identifying or quantifying an organism using a nucleic acid probe. Examples thereof include 23 Legionella species, specifically L. pnueumophila (PHA1 ), L. micdadei (HEBA), L. bozemanii (WIGA), L. dumoffi (TEX-KL), L. garmanii (LS-13), L. jordanis (BL540), L. longbeachae , L. MSH9, L . oakridgenis (Okuritsuji 10), L. lansing 2, L. SC-32C-C8, L. WA-316, L. WO-44-3C (L. feeleii), L. phoenix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3 (ORW), L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L. SC18 -C9, L. SC63-C7, L-81- An illustrative probe capable of specifically detecting 716 ( L. wadsworthii ) has been described. However, this nucleic acid probe is also a mixture and has the same problems as described above. In addition, the length and sequence of the probe base are not clear, and it is unclear which part of the rRNA is recognized, and there is a problem in detection accuracy.
[0007]
In addition, JP-T-1-503356 describes a method for detecting Legionella using a nucleic acid probe having a specific sequence. In the examples, 21 types (excluding serotypes) using three mixed probes are described. Of Legionella species are detected. The target Legionella species are shown in Table 1.
[0008]
[Table 1]

[0009]
However, in the above detection method, it is necessary to prepare and use three types of probes, and only about 55% of the 38 known Legionella (1994) have been tested, and the remaining 45% can be detected. There is a problem that it is unknown.
[0010]
Japanese National Publication No. 5-507206 also describes a method for detecting Legionella species using a probe having a specific sequence. However, this probe is for detecting a sequence amplified by PCR using a primer specific to Legionella, and there is a problem that the Legionella specificity of the probe is not clear.
[0011]
In situ identification of Legionellaceae using 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal laser scanning microscopy, Werner Manz, Rudolf Amann et.al. Microbiology (1995), 141, 29-39, probes for detecting Legionella family. As a result, evaluation results of two types of probes have been reported. One is a probe targeting 16S rRNA 226-243 (16S rRNA numbering of E. coli), and the other is a probe targeting 705-722.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to detect a large number of Legionella bacteria in a short time with a single probe specifically and with high accuracy, and can be easily prepared as an oligonucleotide for detecting Legionella bacteria. A probe is provided and used to detect Legionella bacteria of a large number of species specifically and accurately with a short time.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides the following oligonucleotide probe and labeled oligonucleotide probe for detecting Legionella bacteria, a reagent for detecting Legionella bacteria containing the labeled oligonucleotide probe, and a method for detecting Legionella bacteria using them.
(1) consists of deoxyribonucleotides or ribonucleotides, consisting Legionella (Legionella) a probe having a sequence complementary to the variable regions of bacterial 16SrRNA belonging to the genus nucleotide sequence 5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3 ' An oligonucleotide probe for detecting bacteria belonging to the genus Legionella.
(2) A labeled oligonucleotide probe for detecting bacteria belonging to the genus Legionella, wherein the oligonucleotide probe according to (1) is labeled with a radioactive element, an enzyme, a fluorescent substance or a chemical substance.
(3) A reagent for detecting bacteria belonging to the genus Legionella, comprising the labeled oligonucleotide probe according to (2) above.
(4) Bacteria belonging to the genus Legionella, samples containing DNA or rRNA thereof are brought into contact with the labeled oligonucleotide probe described in (2) above or the reagent described in (3) above, and hybridization is performed. And detecting a bacterium belonging to the genus Legionella.
[0014]
The probe of the present invention was obtained by selecting a portion that is well-preserved in Legionella genus and is different from other genera from sequences complementary to the variable region of known Legionella 16S rRNA. That is, the probe sequence of the present invention corresponds to the base sequence 871-890 of DNA encoding 16S rRNA of Legionella pneumophila and other Legionella (numbering of E. coli 16S rRNA). Therefore, the sequence of the probe of the present invention is the complementary sequence of DNA sequence 871-890 (numbering of E. coli 16S rRNA) encoding 16S rRNA of Legionella pneumophila and other Legionella, or the base sequence 871 of 16S rRNA. It targets -890 (E. coli 16S rRNA numbering) and is sufficient to recognize these sequences.
[0015]
Table 2 shows partial nucleotide sequences of 16S rRNA sequences of Escherichia coli , Ps. Aeruginosa , Legionella pneumophilia and other Legionella .
[Table 2]

[0016]
Since the base sequence of the probe of the present invention is clear as described above and the length of the base sequence is about 20 bases, it can be easily synthesized from nucleotides or deoxynucleotides by chemical synthesis. For this reason, the same probe can be easily obtained any number of times, and the specificity does not vary from lot to lot. In addition, since the probe of the present invention has a relatively short base number, it can be used for in situ hybridization, and there are many types of Legionella bacteria that can be detected from one type of probe. From these points, it is excellent as a detection reagent.
[0017]
The labeled oligonucleotide probe for bacterial detection belonging to the genus Legionella of the present invention is a probe obtained by labeling the probe with a labeling substance such as a radioactive element, an enzyme, a fluorescent substance or a chemical substance. As such a labeling substance, conventionally used labeling substances can be used. Specific examples include radioactive elements such as ³² P; fluorescent substances such as FITC and rhodamine; haptens such as dicoxigenin; alkaline phosphatase and peroxidase. Enzymes: biochemical substances such as biotin. These labeling substances can be introduced into the probe by a known method.
[0018]
The reagent for detecting bacteria belonging to the genus Legionella of the present invention contains the above labeled oligonucleotide probe, may consist of only the labeled oligonucleotide probe, may be dissolved in a buffer solution, etc. It may be a kit so that hybridization with can be easily carried out.
[0019]
The labeled oligonucleotide probe of the present invention or a reagent containing the same is hybridized with Legionella bacteria or a sample containing the DNA, and then detected using the labeling substance as an index, for example, radioactivity, color development, fluorescence, By detecting using luminescence or the like as an indicator, Legionella bacteria hybridized with the probe can be easily detected, identified or quantified with high precision and visually or with a microscope.
[0020]
The probe of the present invention has many types of Legionella bacteria that can be detected, identified or quantified by a single type, and at least 34 types of Legionella (see Table 3 below) can be detected. As described above, the probe of the present invention can detect more kinds of types of legionella with one kind of probe than the conventional probe.
[0021]
In the detection method of the present invention, the labeled oligonucleotide probe or reagent is brought into contact with a bacterium belonging to the genus Legionella or a sample containing DNA thereof, and hybridization is performed, and then the Legionella bacterium is detected using the label as an index. It is. Hybridization can be performed by a method similar to the conventional method. For example, when bacteria are targeted, DNA of Legionella genus bacteria can be obtained by impregnating the cells with a filter such as a nylon filter, performing lysis on the filter, and then irradiating with ultraviolet rays or raising the temperature to 80 ° C or higher. On the filter. This filter is usually immersed in a hybridization solution for 1 hour or longer, and further immersed in a hybridization solution to which a labeled oligonucleotide is added, and allowed to react for 2 to 24 hours. As the temperature at the time of hybridization, it is preferable to select a temperature showing sufficient specificity and detection sensitivity, and the Tm value of the probe is usually minus 5 to 10 ° C. A temperature exhibiting sufficient specificity and detection sensitivity can be obtained by experiments in advance. The filter that has been reacted with the probe is washed with a buffer to remove the probe having nonspecific binding. Washing is preferably performed 2 to 3 times by replacing the buffer with a new one. The washing temperature is preferably a temperature that maintains sufficient sensitivity, and is usually set lower than the hybridization temperature. The temperature that maintains sufficient sensitivity can be obtained in advance by experiments.
[0022]
Detection after hybridization can be performed by a known method according to the type of the labeling substance. For example, when labeled with a radioactive element, it can be detected by measuring the radioactivity by a known method. Moreover, when label | marking with an enzyme, it can detect by measuring an enzyme activity by a well-known method. Moreover, when it labels with a fluorescent substance, it can detect by measuring a light quantity by a well-known method. Further, when labeled with an antigen or an antibody, it can be detected by reacting with the antigen or antibody using an antibody or antigen that specifically reacts with the labeled antigen or antibody, and measuring the reaction product by a known method.
[0023]
Thus, by using the probe of the present invention, a wide range of Legionella species belonging to the genus Legionella can be specifically detected by hybridization. For this reason, the several identification operation of Legionella colony performed conventionally can be skipped, and a detection can be performed easily. That is, in the conventional culturing method, each colony must be picked and used for identification. By colony hybridization using the probe of the present invention, for example, it grows on a medium plate. It is possible to determine whether all colonies are Legionella at once. In principle, Legionella that cannot be cultured is not detected by detection by culture, but Legionella species that cannot be cultured by the detection method of the present invention can also be detected. It is also possible to clarify how Legionella is distributed in biofilms and tissues in the environment. Furthermore, since the probe is not a genomic DNA fragment mixture, a probe with the same performance can be easily obtained.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples and Comparative Example 1) Preparation of oligonucleotide probe The probe of the present invention was synthesized by a known solid phase phosphoramidide method. The synthesized probe was purified by high performance liquid chromatography. After purification, it was lyophilized and stored. For the subsequent operation, it was dissolved in deionized water.
[0025]
The probe was labeled with dicoxygenin using a DIG oligoprobe tailed label kit (Boehringer Mannheim). This oligonucleotide probe labeled with dicoxigenin was mixed with a hybridization solution (0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate, 1% (w / v) Blockingreagent, 0.1% (w / v) N- lauroylsarkosine, 0.02% (w / v) Sodium dodesyl sulfate (hereinafter referred to as SDS), 0.1 mg / l Poly (a)] and used in the hybridization described below. The dicoxigenin is a kind of hapten and is a compound that acts as an antigen.
[0026]
2) Preparation of specimens Among Legionella genus reported, 35 kinds shown in Table 3 (two of them are subspices of L. pneumophila ) were obtained, and after performing DNA extraction, dot blot was performed. Note as a comparative example, Enterobacter cloacae (ATCC 23355), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Proteus vulgaris (ATCC 13315), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Serratia marcescens (ATCC 8100) and Staphylococcus aureus (ATCC 12600) were used to extract DNA in the same manner as Legionella, and then subjected to dot blot.
[0027]
That is, Legionella was mixed with BCYEα agar medium (Buffered charcoal-yeast extract agar supplemented with α-ketoglutarate, composition; yeast extract 10.0 g per 1000 ml of distilled water, activated carbon powder 1.5 g, ACES buffer 10.0 g, agar 15.0 g, L-cysteine monohydrochloride After culturing with 0.4 g of salt, 0.25 g of soluble iron pyrophosphate and 1.0 g of α-ketoglutarate monopotassium (pH 6.9 ± 0.05), the plate was scraped with a platinum loop. DNA extraction was performed according to Current Protocols in Molecular Biology. 2.4.1. Preparation of Genomic DNA form Bacteria.
[0028]
Absorption at A ₂₆₀ nm of the extracted DNA was measured, and each DNA was adjusted to have the same concentration, and then 100 ng was dot blotted onto a nylon filter. After air drying, the filter was sequentially placed on filter paper moistened with the following solutions for 5 minutes to denature the DNA. (1) 0.5N NaOH, 0.5M NaCl, (2) 1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl pH7.4, (3) 0.3M NaCl, 30 mM sodium citorate pH7.0. Thereafter, the mixture was heated at 120 ° C. for 30 minutes to immobilize the DNA on a filter and used for the following hybridization.
[0029]
3) Hybridization Hybridization was performed based on Standard 5x SSC procedure of DIG oligoprobe tailed label kit. The procedure is shown below.
Place the above-mentioned filter on which DNA has been fixed in a plastic bag, 20 ml of hybridization solution (0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate, 1% (w / v) Blockingreagent, 0.1% (w / v) N-lauroylsarkosine per 100 cm ² , 0.02% (w / v) Sodium dodesyl sulfate (hereinafter SDS), 0.1 mg / l Poly (a)] was added, and air bubbles were removed and sealed. The reaction was carried out at 68 ° C. for 1 hour or more while gently shaking in a hybridization oven. The prehybridization solution was discarded, and a new hybridization solution containing the oligonucleotide probe prepared in the above 1) at a concentration of 0.3 pmol / ml was placed in a plastic bag so as to be 2.5 ml per 100 cm ² . After sealing with air bubbles removed, the mixture was reacted at 50 ° C. for 2 to 3 hours while gently shaking in a hybridization oven.
[0030]
Thereafter, the filters were removed from the plastic bag, 0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0 , placed 50ml per 100 cm ² in a container such as Tupperware a 0.1% SDS solution, immersing the filter, washed shaken by weak bonds The probe was removed. After 5 minutes, the solution was replaced and washed for another 5 minutes. Thereafter, 15 ml of 15 mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate pH 7.0, 0.1% SDS solution was placed in a container such as a tapper, 50 ml per 100 cm ² , and the filter was immersed and washed to remove a probe with weak binding. After 15 minutes, the solution was replaced and washed for another 15 minutes.
[0031]
The filter was placed in 160 ml of 100 mM Maleic acid, 150 mM NaCl pH 7.5 solution per 100 ml. Next, the filter was immersed in a solution obtained by adding 1% blocking reagent to the above solution, and allowed to react for 20 minutes while gently shaking. An anti-dicoxygenin alkaline phosphatase-conjugated antibody was added in an amount of 1/10000 of the above liquid volume, and allowed to react with gentle shaking for 20 minutes. The filter was taken out, 100 mM Maleic acid, 150 mM NaCl pH 7.5, 0.3% tween 20 was put into a new container, the filter was immersed, and washed for 10 minutes while gently shaking. Change to a new solution and repeat. The liquid was changed again and repeated.
[0032]
A filter was placed in a solution of 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ and allowed to stand for 2 minutes or longer. CDP-Star (manufactured by Boehringer Mannheim) was diluted 1/100 with the above solution, and the filter was immersed and allowed to stand for 5 minutes. Excess liquid from the filter was cut off, placed in a plastic bag, and allowed to react at 37 ° C for 10 minutes. Thereafter, it was exposed to an X-ray film (ECL hyperfilm, Amersham) for 30 minutes and developed. Since the portion where the probe reacted appeared as a black signal, the generated signal was visually divided into four stages to determine the reactivity. The results are shown in Table 3.
[0033]
[Table 3]

[0034]
[Table 4]

[0035]
[Table 5]

[0036]
Note No. in Table 3 1 to 36 bacteria are examples, no. 101-108 bacteria are comparative evaluation criteria ++: There is a strong signal +: There is a signal ±: Slight signal is confirmed-: No reaction is confirmed * 1 DNA cannot be extracted, and hybridization is not performed. ]
From the results of Table 3, it can be seen that when the probe of the present invention was used, strong signals were obtained from all Legionella except L. islaelensis among the Legionella subjected to the test. Moreover, almost no signal was obtained from bacteria other than Legionella.
From this, it was confirmed that the probe of the present invention can detect most Legionella species and has Legionella genus specificity.
[0038]
【The invention's effect】
The oligonucleotide probe of the present invention has a specific base sequence, a base complementary specifically to a sequence at a specific position of 16S rRNA of many species of Legionella bacteria and a complementary sequence of DNA encoding 16S rRNA. Form a pair. For this reason, it can be suitably used as a probe for specifically detecting a large number of species of Legionella bacteria with a single type of probe in a short time. Moreover, since the base is short, it can be easily prepared.
[0039]
In the labeled oligonucleotide probe of the present invention, since the above-mentioned oligonucleotide probe is labeled with a labeling substance, Legionella bacteria can be specifically and precisely detected with a single probe for many species of Legionella bacteria by hybridization. Can be detected.
[0040]
Since the reagent of the present invention contains the labeled oligonucleotide probe, it is possible to detect Legionella bacteria in a short time by hybridization with a high degree of accuracy using a single probe. .
[0041]
In the detection method of the present invention, the labeled oligonucleotide probe or reagent is contacted with Legionella bacterium or its DNA and hybridized, and then detected using the label as an index. Therefore, Legionella bacterium is detected for a short time. Thus, a large number of species of Legionella can be specifically detected with a single probe with high accuracy.
[0042]
[Sequence Listing]

[0043]

[0044]

[0045]

[0046]

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

Claims

A probe consisting of deoxyribonucleotides or ribonucleotides and having a sequence complementary to the variable region of 16S rRNA of bacteria belonging to the genus Legionella , characterized by the base sequence 5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3 ' An oligonucleotide probe for detecting bacteria belonging to the genus Legionella.

A labeled oligonucleotide probe for detecting bacteria belonging to the genus Legionella, wherein the oligonucleotide probe according to claim 1 is labeled with a radioactive element, an enzyme, a fluorescent substance or a chemical substance.

A reagent for detecting bacteria belonging to the genus Legionella, comprising the labeled oligonucleotide probe according to claim 2.

Detection by using a label as an index after contacting a labeled oligonucleotide probe according to claim 2 or a reagent according to claim 3 with a sample containing bacteria belonging to the genus Legionella, DNA or rRNA thereof. A method for detecting a bacterium belonging to the genus Legionella.