JP3773957B2 - 精子の輸送及び貯蔵のためのｃｙｂ媒体の使用 - Google Patents

Description

本発明は、精子の生存率を確保する、その精子の貯蔵及び輸送のための新規方法に関する。
男性不妊症の診断は、男性病学的技法の高まる精巧さの観点から最近、よりますます複雑になって来ている。これは、コンピューター処理された像分析、細胞生物学及び生化学のような技術における必要な専門知識を有し、そして従って、最新の情報を採り入れた診断技法を提供することができる特殊化された男性病センターの創設を導いて来た。
しかしながら、そのような特殊化されたセンターの発展に対する限界は、患者が分析の直前に精液サンプルを提供するためにセンターに行かなければいけないことである。精液の血漿の存在下でいづれかの時間、放置される場合、通常１時間後、精液は生存率及び機能的適性を失うので、精液の新鮮なサンプルが必要とされる。
従って、精液サンプルが診断試験のために男性病センターに送付され得るよう周囲温度で精液サンプルを貯蔵し／保存し、患者の個人的な出席の必要性を除く方法を提供する必要性が存在する。
本発明者は、精液が卵黄緩衝液として知られている特定の媒体に周囲温度で貯蔵され得ることを今や、見出した。
従って、第１の観点においては、本発明は、CYB媒体を含んで成る、周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送のための媒体を提供する。
CYB媒体は、Wendel, L. and Prins, G. S., J. Androl. 8 : 41-47(1987)により最初に記載された既知の低温保護剤媒体である。それは次の成分から成る：
40％のTES／TRIS緩衝液
30％のクエン酸ナトリウム／フルクトース溶液
20％の新鮮な卵黄
１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（10,000IU）。
TES＝Ｎ′−トリス（ヒドロキシ メチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸。TRIS＝ヒドロキシメチルアミノエタン。
TES／TRIS緩衝液は、水200ml当たりTES 8.66ｇ及びTRIS 2.06ｇを含む。
クエン酸ナトリウム／フルクトース溶液は、水200ml当たりクエン酸ナトリウム 5.88ｇ及びフルクトース 4.0ｇを含む。
CYB媒体の構成成分は、一緒に混合され、そして600ｇで２×10分間、遠心分離され、粒状物質が除去される。pHは、7.4に調節される。
好ましい態様において、媒体はまた、酸化防止剤も含む。適切な酸化防止剤は、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、カタラーゼ、グルタチオン及びマンニトールを包含する。それらの成分は、遊離基スキャベンジャーとして作用するであろう。特に好ましい酸化防止剤は、１mMの濃度で存在するα−トコフェロールである。
第２の観点においては、本発明は、周囲温度での精液の貯蔵、及び／又は輸送への使用のためのCYB媒体を供給する。
第３の観点においては、本発明は、周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送のためへのCYB媒体の使用を提供する。
第４の観点においては、本発明は、精液とCYB媒体とを接触せしめる段階を含んで成る、周囲温度での精液を貯蔵し、そして／又は輸送するための方法を提供する。本発明のこの観点において、精液はCYB媒体により約１：１に希釈される。
上記すべての観点の好ましい態様において、精液はヒト精液である。
本発明の個々の観点の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、個々の他の観点について定義される通りである。
本発明は現在、次の例により記載されるが、それらは本発明を限定するものではない。
例１
（Ａ）方法
（ｉ）サンプル密度プロトコール
精子懸濁液10μｌを、精子希釈流体（SDS；下記を参照のこと）190μｌに添加し、十分に混合し、そして計数チャンバーの両側を満たした（改良されたノイバウアー規則）。
次に、これを放置し、沈降せしめた。
スライドを通して診断的に作用する５個の大きな正方形区画における精子の数を計数し、ここで個々の大きな正方形区画は16個の小さな正方形区画を有した。
精子の頭が境界上に存在する場合、その上部及び左側境界上に存在するもののみが包含された。
５個の大きな平方形区画における精子の数＝100万個の精子／ml（10⁶／ml）。
精子希釈流体(SDF)
NaHCO₃ 50ｇ
ホルマリン 10ml
蒸留水により全体を１ｌにされる。
（ii）運動性の評価
精子懸濁液10μｌをスライド上に置き、そして24×24mmのカバースリップにより被覆した。正方形の格子を有する接眼レンズ計数線を用いて、領域を定義し、そしてその領域内の運動性精子を計数する。その領域内の非運動性精子を計数する。その視野を動かし、そして少なくとも100の精子が計数されるまで、その工程を反復する。％運動率（計数された合計の精子に対する運動（％））を計算する。
（iii）パーコール調製された精子
100％の調製されたパーコール溶液（下記を参照のこと）３mlを、試験管の底に配置した。50％の調製されたパーコール溶液（下記を参照のこと）３mlを、前記100％プロトコールの上部に注意して積層した（50％パーコールを１mlのピペットを用いて一度に１mlを積層した）。
精液サンプル２mlをグラジエントカラムの上部に積層した。次に、これを1900rpmで20分間、遠心分離した（500ｇ）。
精液漿をカラムの上部から除去した（凍結保存した）。
精子をバンドにおいて分離した（50／100の界面でのグラジエントの中央から50％、及び管の底部から100％）。これをBWW（下記を参照のこと）７〜10mlに再懸濁し、そして1900rpmで５分間、遠心分離した。
上清液を除去し、そして精子ペレットを既知量のBWWに再懸濁した（精子ペレットの回収に依存して、500ml〜１ml）。
密度を記録し、そして精子濃度を20×10⁶／mlに調節した。
不連続パーコールグラジエント
100％パーコール溶液−100ml
10×イーグル平衡塩類溶液10ml、Flow Labs, Irvine, Scotland,
パーコール90ml, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden,
５％アルブミナ−６ml、Armour Pharmacoutical Company, Eastbourne, England,
ピルビン酸ナトリウム ３mg、
乳酸ナトリウム 0.37ml、
炭酸水素ナトリウム（NaHCO₃） ２００mg。
50％パーコール溶液
BWWにより１：１に希釈された100％パーコール溶液。
BWW原液 − 蒸留水１ｌにおいて製造される。
NaCl 5.54ｇ
Kcl 0.356ｇ
CaCl₂（二水和物） 0.250ｇ
KH₂PO₄ 0.162ｇ
MgSO₄・7H₂O 0.294ｇ
BWW−200ml
NaHCO₃ 420mg
グルコース 200mg
ピルピン酸ナトリウム 6mg
アルブミナ−５％（＝最終的には0.3％） 12ml
乳酸ナトリウム 0.74ml
ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO） 2.0ml
ヘペス緩衝液（Flow Laboratory, Irvine, Scotland） 4.0ml
BWW原液 181ml
（Ｂ）サンプル処理
（ｉ）患者の精液サンプルを、30mlの無菌サンプル容器に得た。30分の液体化（liquification）期間を、サンプル体積、密度及び丸型細胞の計数の記録の前に可能にした。
（ii）次に、サンプルを２つのアリコートに分離し、そして次のようにして処理した：
１つのアリコートを、上記のようにしてパーコール グラジエント上で調製した。
残るアリコートを固定された体積（4.0ml）のCYB媒体と共に混合し、それにより、ほとんどの精液サンプルのために少なくとも１：１の希釈溶液を付与した。サンプル運動性を、24時間にわたっての特使サービスによる急送のために絶縁されたポリスチレン ボックスによる包装の前、再び調べた。
パーコールグラジエント上で調製されたアリコートを次のようにして分析した。
（ａ）先体反応アッセイ
20×10⁶／mlに精子密度を調節した精子サンプルを、50％／100％パーコールグラジエント パーコールに従って調製した。
精子200μｌを等体積のA23187遊離酸に添加し、1.25μＭ又は2.5μＭのＡ23187の最終濃度を付与した。
混合物を37℃で３時間インキュベートした。
混合物を500ｇで５分間洗浄し、そして上清液を除去し、そしてBWWに20×10⁶／mlで再懸濁した。
サンプルの運動性を記録した。
精子懸濁液50μｌを、低浸透圧膨潤媒体（Hypo-osmotic Swelling Medium）500μｌに添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。
懸濁液を500ｇで５分間、遠心分離、上清液を捨て、そしてペレットを氷冷却のメタノール50μｌに再懸濁し、20×10⁶／mlの最終精子濃度にした。
10μｌをHendleyスライドの個々のスポット上に置き、そして空気乾燥せしめた。
次に、これをレクチン−フルオレセイン インチオシアネート（PBS中、２mg／ml）により被覆し、そして暗室において15分間インキュベートした。
過剰のレクチンを、PBSにより洗浄した。
一滴のCitifluorを、Hendleyスライドの個々のスポット上に付与し、そして次は、スライドを蛍光顕微鏡下での試験のためにカバースリップにより被覆した。
低浸透圧膨潤媒体
クエン酸ナトリウム 7.35ｇ
フルクトース 13.51ｇ
蒸留水 １ｌ
（ｂ）精子侵入アッセイ
精子選択物をBWWにより１：１に希釈した。
次に、その希釈された精子選択物を、平らな細管（200μｍ）中に負荷した。
その管の一端を、Critoseal（Mackay and Lynn, Edinburgh）によりキャップした。
精子選択物細管の開放端を、精液サンプル（50μｌ）中に配置した。
次に、これを、20度（約）の角度で30分間、37℃でインキュベートした。
精子選択的及びPenetrak管を精子から除き、印をされた顕微鏡管上に置き、そして管の開放端から１，３及び4.5cmに存在する精子の数を計数した（２つの視野においての精子の数の計算−40倍の対物レンズを用いる）。
クーリエにより送付されたアリコート
サンプルの到着後、サンプルを、パーコール調製の前、運動性損失について分析し、そして診断アッセイをくり返し、輸送希釈剤がその“視野”情況下でそれらの重要な診断パラメーターを維持することができるかを決定した。実験の変動性を、厳密に相互関係するプロトコールの使用により、及び主観的アッセイ、たとえば先体反応試験の評価に同じ技法を用いることにより減じられる。
結果
（ａ）精子運動性
ドナーのランダム選択から運ばれた21の精液サンプルを調査した。CYB媒体における輸送の前及び後での運動性を測定した。

それらの結果は、CYBにおけるｔ＝24での精子漸進運動性が、ｔ＝０での応答に対して、平均して十分に関連していることを示す。
（ｂ）先体反応アッセイ
上記と同じ精液の21サンプルに関して、生存細胞の精子％は次の通りであった：

それらのデータは、CYBにおけるｔ＝24でのイオン透過担体Ａ23187による処理に続いて生存する％細胞率は、ｔ＝３での応答に対して平均して十分に関連していることを示す。
（ｃ）精子侵入アッセイ
CYB中でのｔ＝０での及びｔ＝24時での精子侵入（ｔ＝1.5cm、３cm及び4.5cmでの）は次の通りであった：

CYBにおいて、ｔ＝０で測定される値とｔ＝24時で測定される値との間の統計学的に有意な差異は存在しなかった。
例２
24時間、CYBにおいてインキュベートされた精子の一般的精液分析（運動性以外の）
精液の液化を、存在しない、中ぐらい又は正常のいづれかであるとして評価した。試験されたサンプルにおいては、粘液系、すなわち不完全な浄化の存在をまた、液体が自由に流動するかどうかを決定するために、ピペットを通してサンプルを吸い上げることによってバックアップした。CYBとの１：１の混合及び24時間のインキュベーションの後、評価をくり返した。

明らかに、CYBにおけるインキュベーションは、精子のこの観察される性質に対して有意な効果を有さない。
異常形の分析を精液中の精子に対して行ない、そしてｔ＝０及びｔ＝24時でCYBと共に１：１で混合した。細胞を、分析の前、標準のホルマリン溶液に固定し、細胞を40倍の対物レンズを用いて観察する。

明らかに、CYB中でのインキュベーションは、精子形態を変更しないように見える。いくつかの矛盾は、サンプリングエラーによるものと仮定される。
CYB中での抗精子抗体の測定
サンプルを、高い抗精子抗体レベルを有することが前もって知られている患者の血清により処理した。従って、抗体を試験サンプルに移し、24時間後、抗体検出に対するCYBの効果の明白な評価を可能にした。
精液サンプルを30分間、液化し、そして次に、600ｇでの５分間の遠心分離によりミニパーコールグラジエント上に調製した。
次に、精液を、200ｇでの５分間の遠心分離によりイーグル培養培地における0.4％BSAにより２度洗浄した。次に、精液を、イーグル培養培地における0.4％BSA溶液500μｌに再懸濁した。
ドナー精液500μｌを、血清500μｌと共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルをイーグル培養培地における0.4％BSA溶液により２度洗浄し、そして次に、培養培地１mlにより再懸濁し、そして次に、CYBにより１：１で混合した。
MAR試験のために、洗浄された精子を、MAR評価の前、それらの精液血漿中に再構成した。これは、精液と０＋血液調製物及びIgG抗血清との混合を包含した。IBBA試験は、抗−精子抗体の検出のためのより敏感で且つ特異的なアッセイである。

IBBA結果は、前のアッセイにおける血清サンプルにより得られた結果に対応した。従って、CYBの作用は、抗精子抗体の検出をそこなうように思えない。

Claims (21)

1. CYB媒体を含んで成る、周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送のための媒体。
2. 周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送への使用のためのCYB媒体。
3. 周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送のためへのCYB媒体の使用。
4. CYB媒体と精液とを接触せしめる段階を含んで成る、周囲温度での精液の貯蔵及び／又は輸送のための方法。
5. 前記精液がCYB媒体により1:1に希釈される請求の範囲第４項記載の方法。
6. 前記CYB媒体が酸化防止剤をさらに含んで成る、請求の範囲第１項記載の媒体。
7. 前記酸化防止剤がα−トコフェロール、カタラーゼ、グルタチオン又はマンニトールである請求の範囲第６項記載の媒体。
8. 前記酸化防止剤が１mMの濃度で存在するα−トコフェロールである請求の範囲第７項記載の媒体。
9. 前記精液がヒト精液である請求の範囲第１項又は第６項〜第８項のいずれか１項記載の媒体。
10. 前記CYB媒体が酸化防止剤をさらに含んで成る、請求の範囲第２項記載の媒体。
11. 前記酸化防止剤がα−トコフェロール、カタラーゼ、グルタチオン又はマンニトールである請求の範囲第10項記載の媒体。
12. 前記酸化防止剤が１mMの濃度で存在するα−トコフェロールである請求の範囲第11項記載の媒体。
13. 前記精液がヒト精液である請求の範囲第２項又は第10項〜第12項のいずれか１項に記載の媒体。
14. 前記CYB媒体が酸化防止剤をさらに含んでなる、請求の範囲第３項記載の使用。
15. 前記酸化防止剤がα−トコフェロール、カタラーゼ、グルタチオン又はマンニトールである請求の範囲第14項記載の使用。
16. 前記酸化防止剤が１mMの濃度で存在するα−トコフェロールである請求の範囲第15項記載の使用。
17. 前記精液がヒト精液である請求の範囲第３項又は第14項〜第16項のいずれか１項記載の使用。
18. 前記CYB媒体が酸化防止剤をさらに含んで成る、請求の範囲第４項記載の方法。
19. 前記酸化防止剤がα−トコフェロール、カタラーゼ、グルタチオン又はマンニトールである請求の範囲第18項記載の方法。
20. 前記酸化防止剤が１mMの濃度で存在するα−トコフェロールである請求の範囲第19項記載の方法。
21. 前記精液がヒト精液である請求の範囲第４項又は第18項〜第20項のいずれか１項記載の方法。