JP3735115B2 - 分析方法および除草剤の同定への適用 - Google Patents
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Description
本発明は、一定のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの活性を阻害する化合物を検出するための新規な方法、抗生物質または除草剤として使用するための活性を有する化合物を同定するためのこれらの方法の使用、それによって誘導される除草剤、並びに、E. coliイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードする新規なｃＤＮＡ配列に関する。
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、全ての細菌、植物および動物に見られる酵素であり、タンパク質を製造するのに必要とされる。細菌の当該酵素の阻害剤は抗生物質として有用である可能性があり、本出願人は、それらが除草剤としての適用性をも有し得ることを見い出した。
遺伝コードがタンパク質に正確に翻訳されることは極めて重要である。これが確実に起きるようにするために、各アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、正確な（同族）アミノ酸を正確な（同族）種のｔＲＮＡに結合させなければならない。これが確実に起きるようにするために、これらの酵素の一定のものは、「編集」機構を展開して、不適当な中間体複合物および「誤って結合した（mischarged）」ｔＲＮＡ種を（異なる段階で）加水分解してしまう。特別の例としては、バリン、即ち、イソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書中以下においてＩＴＲＳと称す）に関する非同族アミノ酸（１）、およびトレオニン（２）、即ちバリル−ｔＲＮＡシンテターゼに関する非同族アミノ酸、およびホモシステイン、即ちメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼに関する非同族アミノ酸である。
本出願人は、これらの編集機構を使用するという手段を見いだし、酵素活性の阻害剤、そして結果的には産業上の適用性を有する生物学的に活性のある化合物の阻害剤を見い出すための分析技術を開発した。
本発明の一つの側面によれば、二価の金属陽イオン、対応するｔＲＮＡ種および適切な非同族アミノ酸と反応した際に、ＡＴＰのピロホスフェートへの加水分解を生じるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの阻害剤を検出するための分析法であって、当該二価の金属陽イオン、ＡＴＰ、当該ｔＲＮＡ、当該非同族アミノ酸、無機ピロホスファターゼおよび当該アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを、少なくとも部分的には純粋な形態で、有効な阻害剤とともにおよびそれなしの両方で、インキュベートすること、並びに、ホスフェートのための検出手段を供給すること、並びに、得られた結果を比較することを含む上記の分析法が提供される。
本発明のもう一つ別の側面によれば、E. coliのイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼの検出のための分析法であって、（ａ）マグネシウムイオン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、対応するｔＲＮＡ種、イシロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼおよび無機ピロホスファターゼをバリンとインキュベートすること；（ｂ）酵素の有効な阻害剤をさらに含む同様の混合物を同時にインキュベートすること；（ｃ）インキュベートからのホスフェートの産生を検出すること；および（ｄ）結果を比較すること、を含む上記の分析法が提供される。
本明細書で使用する場合、酵素に関して使用される「部分意的に純粋な」という表現は、酵素調製物が妨害活性を含まないこと、特にはホスファターゼを含まないこと、そして、例えば、例示されるＩＴＲＳの分析の特別の場合には、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼを含まないことを意味する。
本分析技術で使用されるｔＲＮＡは、特定の酵素に適切な純粋なｔＲＮＡであってもよく、またSigma（UK）Ltd,から商業上入手できるE. coli株ＷからのｔＲＮＡ種の混合物のようなｔＲＮＡの混合物であってもよいが、但し、当該混合物は特定の酵素に適した十分なｔＲＮＡを含む。
本発明の分析法は、商業的環境中で生物学的活性のための化学物質をスクリーニングするために適用できる。従って、「容易に加水分解可能な」という用語は、分析反応が通常の速度で進行し得ることを意味する。
誤ってアシル化された生成物を除去する編集機構のためにこのスクリーンで使用し得る酵素およびアミノ酸の特別の例は、バリン、トレオニンおよびホモシステインの各々についてＩＴＲＳ、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼおよびメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼである。
二価の金属陽イオンは、好ましくはマグネシウムまたはマンガンである。マグネシウムは特に好ましい。
好ましい態様では、本分析法で使用する酵素は、細菌源、好ましくはE. coliからのＩＴＲＳであり、アミノ酸はバリンである。
本分析法は以下に例示する原理に基づく。アミノアシル−ｔＲＮＡの生合成に関与するＩＴＲＳ（酵素）の２つの部分反応は以下のように表される：
１）酵素（ＩＴＲＳ）＋ＡＴＰ＋ile←−→酵素：ile-ＡＭＰ＋ＰＰｉ
ＩＴＲＳはＭｇ2+イオンの存在下で、ピロホスフェート（ＰＰｉ）が放出されて、酵素に非常に強く結合したままのアミノアシルアデニレート（ｉｌｅ−ＡＭＰ）が形成される部分反応を触媒する。
２）酵素：ile-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡileu←−→ile-ｔＲＮＡile＋ＡＭＰ＋酵素
酵素結合アミノアシルアデニレートは同族ｔＲＮＡと反応して、ｉｌｅｕをｔＲＮＡに移し、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を放出する。
理解され得るように、ピロホスフェートは工程１で産生する。無機ピロホスファターゼの添加はこれをホスフェートに転換する（これは、例えば、Lanzetta et al(3)により記載され、HowardとRidley(4)によりわずかに改良されたマラカイトグリーンを含む方法等の適切なホスフェート測定法により比色定量的に測定することができる）。従って、ホスフェートを検出することによりＩＴＲＳ活性を検出することが可能になるはずである。
しかしながら、上記の２つの反応は固く結びついている。化学量論によれば関与する各ピロホスフェートに対して反応するための１当量のｔＲＮＡが必要とされる。検出するのに十分なピロホスフェート及びその結果のホスフェートを生成するためには大量のｔＲＮＡが必要であろう。これは非常に費用がかかるため、日常的に高出量スクリーンでの用途のために使用することはできない。
バリンがイソロイシンの代わりとなる場合には、それはまた最初に反応して酵素に結合したアミノアシルＡＭＰを形成する。その反応図は下記のように表される：
１．酵素＋ＡＴＰ＋val←−→酵素：val-ＡＭＰ＋ＰＰｉ
２．tRNAile＋酵素：val-ＡＭＰ←−→tRNAile＋酵素＋val＋ＡＭＰ
この場合アミノアシル−ｔＲＮＡを形成するよりむしろ、それはｔＲＮＡileの存在下でＩＴＲＳ酵素によって急速に加水分解される（５）。本発明の分析法はバリンによりｔＲＮＡを再利用できるという点でこれを利用しており、反応の程度は制限されない。従って、酵素はＡＴＰのＰＰｉへの（そして、ピロホスファターゼを介して最終的にはＰｉへの）加水分解を触媒する。
酵素は酵素に結合した非同族アミノアシルアデニレートの加水分解を触媒し、ｔＲＮＡへの転換は存在しないため、触媒量のみのｔＲＮＡが必要となる。さらに、出発酵素およびバリンもピロホスフェートを生成しながら再生される。
複数の分析条件による実験により、ＩＴＲＳ酵素との反応が一度開始すると少なくとも４０分間は直線速度が維持できることが示された。＞０．３ OD単位の色の変化が好ましい。
ｔＲＮＡは本反応で再利用されるため、本反応で使用されるｔＲＮＡの量は一般的には低い。例えば、約０．０５ｍｇ〜約０．３ｍｇ／２００μｌ反応混合物の投与量を使用できる。上記の通り、これはE. coliからの純粋なまたは混合したｔＲＮＡ種であればよい。
一つの好ましい態様では、Sigma（UK）LtdからのE. coliからの混合ｔＲＮＡ種を、約０．１ｍｇ／２００μｌ反応混合物の量で添加する。
ＡＴＰの存在量は約０．０５から約１０ｍＭであり得る。
バリンに関するＫｍは約０．０５ｍＭであり、従って、少なくとも０．５ｍＭのバリン、好適には約０．５ｍＭから約２５ｍＭのバリン、好ましくは約５ｍＭのバリンを使用して最大付近の速度が得られる。対照的に、3Ｈ−Ｉｌｅ分析を用いた場合のＩｌｅに関するＫｍは約４．３μＭであることが分かった。
精製した又は部分精製した酵素を、組換えＤＮＡ技術の使用を含む慣用技術（６）によって調製することができる。E. coliから得られ、下記のように部分精製したＩＴＲＳを用いる場合、約０．１０μｇから約５μｇの量を使用することが好適である。この量に基づいた場合、好適な分析時間は約９０分以上までであることが分かった。
また本発明者は今回、E. coli ＩＴＲＳをコードする遺伝子の配列を決定した。従って、本発明の別の側面によれば、配列番号１（Seq ID No 1）に示されるｃＤＮＡ配列と、その配列の非重要的な（non-critical）対立遺伝子変異体（allelic variations）が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、その配列の１以上の位置における非重要的な（non-critical）アミノ酸置換（単数または複数）または欠失（単数または複数）を有するその変異体が提供される。
本発明は、配列番号１に示される配列と少なくとも７０％の核酸相同性を有し、機能的に均等なタンパク質をコードする配列を含む。好ましい態様では、核酸配列は、配列番号１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。
本発明は、配列番号２に示される配列と機能的に均等な配列であって、当該配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む。好ましい態様では、アミノ酸配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。
発現されたＩＴＲＳを本発明の分析法で使用することができることが理解されるであろう。
上記の分析技術を使用することによって、酵素の阻害剤を検出するための高出量スクリーンを実施することが可能である。本発明のさらに別の側面では、上記した分析法で検出される生物学的適用を有する酵素阻害剤が提供される。
特に、本出願人は、ＩＴＲＳの阻害剤が除草剤としての適用性を有しているかもしれないことを見い出した。かかる化合物は、本出願人の同時係属している国際特許公開ＷＯ９３／１９５９９号に記載されている。
本発明のさらに別の側面においては、国際特許公開ＷＯ９３／１９５９９号の下記化合物を除く、植物のイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ酵素を阻害することによって作用する除草性化合物が提供される：
一般式（Ｉ）または（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物、式中Ｙは下位式（ＩＣ）または（ＩＤ）または（ＩＥ）の基を示し、式中Ｒ2は基ＣＯ−ＸＲ3であり、式中ＸはＯまたはＳであり、Ｒ3は水素または農薬的に許容できるエステル形成基である；またはＲ2は基−Ｒ4であり、式中Ｒ4は場合により置換されているアリールまたは複素環基である；またはＲ2は基ＣＯ−ＮＲ5Ｒ6であり、式中、Ｒ5およびＲ6は同一または異なって、各々農薬的に許容できるアミド形成基を示す；式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物の立体異性体および式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物の塩（式中Ｒ2はＣＯＸＲ3であり、ＸはＯであり、Ｒ3は水素である）。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
１．E. coli ＩＴＲＳの部分精製
ａ）細胞破壊：
１００ｇのE. coli細胞ペーストを、２００ｍｌの緩衝液Ａ（１００ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ７．４、３０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジニトリロテトラアセテート）、４ｍＭの２−メルカプトエタノール、６ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）および１ｍＭのベンズアミジン）と混合した。細胞をフレンチプレス中で８，０００ｐｓｉ（５．５×１０4ｋＰａ）で破壊した。抽出物を４℃で２０分間、６×２５０ｍｌのSorvall GSAローター中、２３，５００×ｇ（１２，０００ｒｐｍ）で回転した。
ｂ）沈降：
上清を除去し、緩衝液Ａ中の２．５％硫酸プロタミンを滴下法で添加して最終濃度０．１％にした。抽出物を２３，５００×ｇ（１２，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心した。上清を除去し、５０％硫酸アンモニウムをゆっくり添加し、氷上で３０分間混合させた。抽出物を再度１２，０００ｒｐｍで１５分間回転し、ペレットを形成させた。
ｃ）Sephadex G-50カラム上でのゲル濾過：
ペレットを少量の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭの２−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。８×５０ｍｌのSorvall SS-34ローター中で３９，０００×ｇ（１８，０００ｒｐｍ）で１５分間さらに遠心を行い、抽出物をベッド容量２５０ｍｌでSephadex G-50カラム（５ｃｍ ｉ．ｄ．）に添加した。緩衝液Ｂで溶出したタンパク質を回収し、−８０℃で貯蔵した。
ｄ）Q-Sepharoseカラム上でのイオン交換：
緩衝液Ｂ中で予め平衡化したPharmacia Q-Sepharoseカラム（１１．５ｃｍ×５ｃｍ）を調製した。Sephadex G-50カラムからの抽出物を添加し、０から１ＭのＮａＣｌこう配を適用した。このカラムからの全フラクションを保管し、以下に記載する放射標識法によって分析した。活性フラクション（４７−５７）をプールし、９０％硫酸アンモニウムを添加し、次いで、８×５０ｍｌのSorvall SS-34ローター中で１５分間１２，０００×ｇ（１７，４００ｒｐｍ）で回転した。上清を除去し、得られたペレットを緩衝液Ｂ中に溶解した。
ｅ）Superdex-200カラム上でのゲル濾過：
工程ｄ）からの５ｍｌの抽出物を予めパックしたPharmacia Superdex-200 HiLoadカラム（２ｃｍ ｉ．ｄ．）にベッド容量１２０ｍｌで添加した。それを緩衝液Ｂおよび５０ｍＭのＮａＣｌ中で予め平衡化した。フラクションの全てを分離して保管し、放射標識分析を用いて試験した。フラクション２５−４０をプールし、等量のグリセロールを添加した。この抽出物を比色定量分析上で最初の現像操作のために用いた場合、それは汚染（contaminating）ホスファターゼ活性を含んでいることが分かった。
ｆ）汚染ホスファターゼ活性の除去：
ＦＰＬＣシステム上で０から１ＭのＮａＣｌのこう配を有する高分解能Q-Sepharoseカラムを用いて、汚染ホスファターゼを含まないＩＴＲＳ活性を含むフラクションを０．３ＭのＮａＣｌで溶出した。
２． 3 Ｈ−イソロイシンに基づく放射標識分析を用いるＩＴＲＳ活性の測定
フラクション操作の間のＩＴＲＳの活性を、SteinmetzおよびWeil（７）により記載された下記のような方法に基づいた条件を用いてモニターした。
この方法で用いたストック試薬は下記の通りである：
緩衝溶液：
５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、３００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのグルタチオン、および１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
ＡＴＰ：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭ
ｔＲＮＡ（混合物）：
E. coli株Ｗからの約０．５４ナノモルのｔＲＮＡile／ｍｇ（Sigma（UK）Ltdにより供給）。ストックは、５０ｍｇ混合ｔＲＮＡ／ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉ ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）から成る。
イソロイシン：
２％水性エタノール中約１００Ｃｉ／ミリモルのＬ−［４，５−3Ｈ］−イソロイシン（Amershamから得た）。５０μｌの3Ｈ−イソロイシン、１００μｌの冷イソロイシン、および８５０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の１００μＭのストックを調製した。
酵素−ＩＴＲＳ：
上記のように調製した。本実施例で用いた酵素の比活性は約１４５ｎＭ生成物／分／ｍｇであり、約５から１０％活性であった。酵素は適宜希釈した。本分析中の酵素量は、使用した酵素の純度に応じて調整できることが理解されるであろう。
２００μｌの最終容量のための分析混合物は、
２０μｌの緩衝溶液
２０μｌのＡＴＰ
２０μｌのｔＲＮＡ
２０μｌの3Ｈ−イソロイシン溶液
１００μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
から成る。
標準分析（２００μｌ中）をエッペンドルフ（Eppendorf）マイクロ遠心チューブ中で４重で行った。成分を３７℃で２〜３分間予めインキュベートして、反応を約２０μｌの上記のような適当に希釈した酵素抽出物の添加によって開始した。
最終反応液は以下の濃度で試薬を含有していた：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１５ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ
３０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのグルタチオン
０．１％のウシ血清アルブミン
１ｍＭのＡＴＰ
５ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ
3Ｈ−Ｉｌｅを含有する１０μＭのイソロイシン
分析物を３７℃で２０分間インキュベートして、５０μｌの２０％ＴＣＡの添加によって停止し、チューブを氷上に置いた。
２００μｌの反応混合物を１．５ｃｍ2のセルロース３ＭＭフィルター上にピペットで載せた。フィルターを以下のように洗浄した（４のグループで）：クロスコンタミネーションを避けるためにレプリケートの各々の組について新鮮な洗浄培地を用いて１×１０％ＴＣＡ、２×５％ＴＣＡ、および２×エタノール。乾燥フィルターを２０ｍｌのシンチレーションバイアル中に置き、放射活性を１５ｍｌのオプチファーゼ（Optiphase）中で計測した。
２． 基質としてバリンを用いることに基づく比色定量分析を用いるＩＴＲＳ活性の測定
インキュベーションを以下に記載するような２００μｌの最終容量で４重（上記のように）でセットアップした。本方法で使用したストック試薬は以下の通りであった：
緩衝溶液：
５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、３００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのグルタチオン、および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
ＡＴＰ：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中７．５ｍＭ
ｔＲＮＡ（混合物）：
E. coli株Ｗからの約０．５４ナノモルｔＲＮＡile／ｍｇ（Sigma（UK）Ltdによって供給）。１．２ｍｇの混合ｔＲＮＡ／ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）のストックを作製した。
Ｌ−バリン
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の３０ｍＭのストック
無機ピロホスファターゼ
これは、凍結乾燥粉末としてSigma（UK）Ltdにより供給されるBakers酵母からのＨＰＬＣ精製グレードの形態であった。これは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で１０ユニット／ｍｌの濃度に作製した。
酵素−ＩＴＲＳ：
上記のように調製した。本実施例で使用した酵素の比活性は約１４５ｎＭの生成物／分／ｍｇであり、約５％〜１０％活性であった。酵素を適宜希釈した。分析中の酵素量は、使用した酵素の純度に応じて調整することができることが理解されるであろう。
最終容量２００μｌのための分析混合物は：
２０μｌの緩衝溶液
２０μｌのＡＴＰ
２０μｌのｔＲＮＡ
２０μｌの無機ピロホスファターゼ
１００μｌのＬバリン
から成る。
標準分析（２００μｌ中）をエッペンドルフ（Eppendorf）マイクロ遠心チューブ中で４重で実施した。成分を３７℃で２〜３分間予めインキュベートして、反応を２０μｌの（上記のように）適当に希釈した酵素抽出物の添加によって開始した。
即ち、最終反応液は以下の濃度で試薬を含有していた：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１０ｍＭのＭｇＣｌ2
３０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのグルタチオン
０．７５ｍＭのＡＴＰ
１５ｍＭのバリン
E. coliからの混合物ｔＲＮＡ種０．１２ｍｇ（上記したようなもの）
Sigma（UK）Ltdから入手可能なBakers酵母からＨＰＬＣ精製したもの
１ユニット／μｌの無機ピロホスファターゼ、および
適切な濃度のＩＴＲＳ（例えば１〜２ｇ／ｍｌの上記したような酵素）
試料を３７℃で２０〜６０分間インキュベートした。反応をHowardおよびRidley（４）により記載されるような試薬を含むマラカイトグリーンの添加によって停止し、続いて、３４％クエン酸の添加によって停止した。次いで、光学的吸収をスペクトロフォトメーターを用いて６３０ｎｍの波長で測定する。新規な比色定量分析法を用いて測定したＡＴＰの０．０４８ｍＭのＫｍ値は、3Ｈ−Ｉｌｅ分析を用いて得た０．０４７ｍＭのＫｍと密接に一致した。
２つの化合物の阻害の持続を測定し、結果を、標準3Ｈ−イソロイシン分析を用いて得た値と比較した。3Ｈ−イソロイシン濃度を１００μＭまで変化させながら化合物１を０、０．２５μＭおよび１．０μＭの濃度で試験して、化合物１がイソロイシンに関して競合的であることが分かった。
結 果
本発明のバリンに基づいた分析を用いて測定した５０％阻害（Ｉ50）を与える濃度：
標準3Ｈ−イソロイシン放射測定分析を用いて測定した５０％阻害（Ｉ50）を与える濃度：
２つの分析は共に阻害剤としての化合物を検出し、両方の分析は、２つの阻害剤の効力が異なることを示した。現実の値が異なる理由は以下の通りである：
１） 化合物２は実際には、測定し得るものより効力があり、見かけのＩ50値は分析においては酵素の濃度によって主として測定される（８）。放射測定分析は感度がより高いので酵素の使用量が少なく、従って本発明の分析の場合より低い見かけＩ50値を生み出す。
２） 化合物１および化合物２はともにアミノ酸と競合する。放射測定分析の場合、アミノ酸、イソロイシンはＫｍより約２倍だけ高い濃度で使用されているのに対し、本発明の分析では、それは約３０倍高い。従って、Ｋｍに対するアミノ酸の比率がこのように１５倍相違することを考慮すると、２つの分析で与えられた２つの値は十分に一致する。従って、ここに記載したバリンに基づく分析は、E. coliＩＴＲＳの阻害剤を検出するための比色定量法として有用であることが理解されるであろう。
３．E. coliＩＴＲＳ遺伝子の配列決定
遺伝子は２工程で配列決定した：
ａ） Promega“Erase-A-Base”キット（Promega Cat. No. E5850）を使用した。遺伝子をベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした。Erase-A-Baseシステムにより、Henikoff（９）が開発した方法を用いて、プラスミドまたはＭ１３クローンから一方向に縮小された（nested）欠失セットの一連のものを構築することが可能になる。この場合、各々が異なる部位の遺伝子を含む欠失変異体を、Sequenase Version 2.0キットを用いて、ｐＵＣ／Ｍ１３リバースシークエンスプライマー（５’−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’）により配列決定した。
ｂ）約６０％の遺伝子を、“Erase-A-Base”システムを用いて配列決定した。この配列情報を用いて合成オリゴヌクレオチドプライマー（下記に記載するもの）を設計し、遺伝子配列中のギャップを読むことができた。ギャップを満たし、遺伝子の完全なコードヌクレオチド配列を得た。
トップ鎖のためのプライマー
ボトム鎖のためのプライマー
参考文献：
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ゼネカ・リミテッド
（Ｂ）町名：１５ スタンホープ ゲート
（Ｃ）都市名：ロンドン
（Ｅ）国名：ＵＫ
（Ｆ）ポストコード（ＺＩＰ）：Ｗ１Ｙ ６ＬＮ
（ii）発明の名称：分析方法および除草剤の同定への適用
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター読取形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーデスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release＃1.0,バージョン＃1.25(EPO)
（２）配列番号１のついての情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）長さ：２８２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：1..2814
（xi）配列の記載：配列番号１
（２）配列番号２のついての情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）長さ：９３８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、全ての細菌、植物および動物に見られる酵素であり、タンパク質を製造するのに必要とされる。細菌の当該酵素の阻害剤は抗生物質として有用である可能性があり、本出願人は、それらが除草剤としての適用性をも有し得ることを見い出した。
遺伝コードがタンパク質に正確に翻訳されることは極めて重要である。これが確実に起きるようにするために、各アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、正確な（同族）アミノ酸を正確な（同族）種のｔＲＮＡに結合させなければならない。これが確実に起きるようにするために、これらの酵素の一定のものは、「編集」機構を展開して、不適当な中間体複合物および「誤って結合した（mischarged）」ｔＲＮＡ種を（異なる段階で）加水分解してしまう。特別の例としては、バリン、即ち、イソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書中以下においてＩＴＲＳと称す）に関する非同族アミノ酸（１）、およびトレオニン（２）、即ちバリル−ｔＲＮＡシンテターゼに関する非同族アミノ酸、およびホモシステイン、即ちメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼに関する非同族アミノ酸である。
本出願人は、これらの編集機構を使用するという手段を見いだし、酵素活性の阻害剤、そして結果的には産業上の適用性を有する生物学的に活性のある化合物の阻害剤を見い出すための分析技術を開発した。
本発明の一つの側面によれば、二価の金属陽イオン、対応するｔＲＮＡ種および適切な非同族アミノ酸と反応した際に、ＡＴＰのピロホスフェートへの加水分解を生じるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの阻害剤を検出するための分析法であって、当該二価の金属陽イオン、ＡＴＰ、当該ｔＲＮＡ、当該非同族アミノ酸、無機ピロホスファターゼおよび当該アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを、少なくとも部分的には純粋な形態で、有効な阻害剤とともにおよびそれなしの両方で、インキュベートすること、並びに、ホスフェートのための検出手段を供給すること、並びに、得られた結果を比較することを含む上記の分析法が提供される。
本発明のもう一つ別の側面によれば、E. coliのイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼの検出のための分析法であって、（ａ）マグネシウムイオン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、対応するｔＲＮＡ種、イシロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼおよび無機ピロホスファターゼをバリンとインキュベートすること；（ｂ）酵素の有効な阻害剤をさらに含む同様の混合物を同時にインキュベートすること；（ｃ）インキュベートからのホスフェートの産生を検出すること；および（ｄ）結果を比較すること、を含む上記の分析法が提供される。
本明細書で使用する場合、酵素に関して使用される「部分意的に純粋な」という表現は、酵素調製物が妨害活性を含まないこと、特にはホスファターゼを含まないこと、そして、例えば、例示されるＩＴＲＳの分析の特別の場合には、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼを含まないことを意味する。
本分析技術で使用されるｔＲＮＡは、特定の酵素に適切な純粋なｔＲＮＡであってもよく、またSigma（UK）Ltd,から商業上入手できるE. coli株ＷからのｔＲＮＡ種の混合物のようなｔＲＮＡの混合物であってもよいが、但し、当該混合物は特定の酵素に適した十分なｔＲＮＡを含む。
本発明の分析法は、商業的環境中で生物学的活性のための化学物質をスクリーニングするために適用できる。従って、「容易に加水分解可能な」という用語は、分析反応が通常の速度で進行し得ることを意味する。
誤ってアシル化された生成物を除去する編集機構のためにこのスクリーンで使用し得る酵素およびアミノ酸の特別の例は、バリン、トレオニンおよびホモシステインの各々についてＩＴＲＳ、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼおよびメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼである。
二価の金属陽イオンは、好ましくはマグネシウムまたはマンガンである。マグネシウムは特に好ましい。
好ましい態様では、本分析法で使用する酵素は、細菌源、好ましくはE. coliからのＩＴＲＳであり、アミノ酸はバリンである。
本分析法は以下に例示する原理に基づく。アミノアシル−ｔＲＮＡの生合成に関与するＩＴＲＳ（酵素）の２つの部分反応は以下のように表される：
１）酵素（ＩＴＲＳ）＋ＡＴＰ＋ile←−→酵素：ile-ＡＭＰ＋ＰＰｉ
ＩＴＲＳはＭｇ2+イオンの存在下で、ピロホスフェート（ＰＰｉ）が放出されて、酵素に非常に強く結合したままのアミノアシルアデニレート（ｉｌｅ−ＡＭＰ）が形成される部分反応を触媒する。
２）酵素：ile-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡileu←−→ile-ｔＲＮＡile＋ＡＭＰ＋酵素
酵素結合アミノアシルアデニレートは同族ｔＲＮＡと反応して、ｉｌｅｕをｔＲＮＡに移し、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を放出する。
理解され得るように、ピロホスフェートは工程１で産生する。無機ピロホスファターゼの添加はこれをホスフェートに転換する（これは、例えば、Lanzetta et al(3)により記載され、HowardとRidley(4)によりわずかに改良されたマラカイトグリーンを含む方法等の適切なホスフェート測定法により比色定量的に測定することができる）。従って、ホスフェートを検出することによりＩＴＲＳ活性を検出することが可能になるはずである。
しかしながら、上記の２つの反応は固く結びついている。化学量論によれば関与する各ピロホスフェートに対して反応するための１当量のｔＲＮＡが必要とされる。検出するのに十分なピロホスフェート及びその結果のホスフェートを生成するためには大量のｔＲＮＡが必要であろう。これは非常に費用がかかるため、日常的に高出量スクリーンでの用途のために使用することはできない。
バリンがイソロイシンの代わりとなる場合には、それはまた最初に反応して酵素に結合したアミノアシルＡＭＰを形成する。その反応図は下記のように表される：
１．酵素＋ＡＴＰ＋val←−→酵素：val-ＡＭＰ＋ＰＰｉ
２．tRNAile＋酵素：val-ＡＭＰ←−→tRNAile＋酵素＋val＋ＡＭＰ
この場合アミノアシル−ｔＲＮＡを形成するよりむしろ、それはｔＲＮＡileの存在下でＩＴＲＳ酵素によって急速に加水分解される（５）。本発明の分析法はバリンによりｔＲＮＡを再利用できるという点でこれを利用しており、反応の程度は制限されない。従って、酵素はＡＴＰのＰＰｉへの（そして、ピロホスファターゼを介して最終的にはＰｉへの）加水分解を触媒する。
酵素は酵素に結合した非同族アミノアシルアデニレートの加水分解を触媒し、ｔＲＮＡへの転換は存在しないため、触媒量のみのｔＲＮＡが必要となる。さらに、出発酵素およびバリンもピロホスフェートを生成しながら再生される。
複数の分析条件による実験により、ＩＴＲＳ酵素との反応が一度開始すると少なくとも４０分間は直線速度が維持できることが示された。＞０．３ OD単位の色の変化が好ましい。
ｔＲＮＡは本反応で再利用されるため、本反応で使用されるｔＲＮＡの量は一般的には低い。例えば、約０．０５ｍｇ〜約０．３ｍｇ／２００μｌ反応混合物の投与量を使用できる。上記の通り、これはE. coliからの純粋なまたは混合したｔＲＮＡ種であればよい。
一つの好ましい態様では、Sigma（UK）LtdからのE. coliからの混合ｔＲＮＡ種を、約０．１ｍｇ／２００μｌ反応混合物の量で添加する。
ＡＴＰの存在量は約０．０５から約１０ｍＭであり得る。
バリンに関するＫｍは約０．０５ｍＭであり、従って、少なくとも０．５ｍＭのバリン、好適には約０．５ｍＭから約２５ｍＭのバリン、好ましくは約５ｍＭのバリンを使用して最大付近の速度が得られる。対照的に、3Ｈ−Ｉｌｅ分析を用いた場合のＩｌｅに関するＫｍは約４．３μＭであることが分かった。
精製した又は部分精製した酵素を、組換えＤＮＡ技術の使用を含む慣用技術（６）によって調製することができる。E. coliから得られ、下記のように部分精製したＩＴＲＳを用いる場合、約０．１０μｇから約５μｇの量を使用することが好適である。この量に基づいた場合、好適な分析時間は約９０分以上までであることが分かった。
また本発明者は今回、E. coli ＩＴＲＳをコードする遺伝子の配列を決定した。従って、本発明の別の側面によれば、配列番号１（Seq ID No 1）に示されるｃＤＮＡ配列と、その配列の非重要的な（non-critical）対立遺伝子変異体（allelic variations）が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、その配列の１以上の位置における非重要的な（non-critical）アミノ酸置換（単数または複数）または欠失（単数または複数）を有するその変異体が提供される。
本発明は、配列番号１に示される配列と少なくとも７０％の核酸相同性を有し、機能的に均等なタンパク質をコードする配列を含む。好ましい態様では、核酸配列は、配列番号１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。
本発明は、配列番号２に示される配列と機能的に均等な配列であって、当該配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む。好ましい態様では、アミノ酸配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。
発現されたＩＴＲＳを本発明の分析法で使用することができることが理解されるであろう。
上記の分析技術を使用することによって、酵素の阻害剤を検出するための高出量スクリーンを実施することが可能である。本発明のさらに別の側面では、上記した分析法で検出される生物学的適用を有する酵素阻害剤が提供される。
特に、本出願人は、ＩＴＲＳの阻害剤が除草剤としての適用性を有しているかもしれないことを見い出した。かかる化合物は、本出願人の同時係属している国際特許公開ＷＯ９３／１９５９９号に記載されている。
本発明のさらに別の側面においては、国際特許公開ＷＯ９３／１９５９９号の下記化合物を除く、植物のイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ酵素を阻害することによって作用する除草性化合物が提供される：
一般式（Ｉ）または（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物、式中Ｙは下位式（ＩＣ）または（ＩＤ）または（ＩＥ）の基を示し、式中Ｒ2は基ＣＯ−ＸＲ3であり、式中ＸはＯまたはＳであり、Ｒ3は水素または農薬的に許容できるエステル形成基である；またはＲ2は基−Ｒ4であり、式中Ｒ4は場合により置換されているアリールまたは複素環基である；またはＲ2は基ＣＯ−ＮＲ5Ｒ6であり、式中、Ｒ5およびＲ6は同一または異なって、各々農薬的に許容できるアミド形成基を示す；式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物の立体異性体および式（Ｉ）、（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物の塩（式中Ｒ2はＣＯＸＲ3であり、ＸはＯであり、Ｒ3は水素である）。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
１．E. coli ＩＴＲＳの部分精製
ａ）細胞破壊：
１００ｇのE. coli細胞ペーストを、２００ｍｌの緩衝液Ａ（１００ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ７．４、３０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジニトリロテトラアセテート）、４ｍＭの２−メルカプトエタノール、６ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）および１ｍＭのベンズアミジン）と混合した。細胞をフレンチプレス中で８，０００ｐｓｉ（５．５×１０4ｋＰａ）で破壊した。抽出物を４℃で２０分間、６×２５０ｍｌのSorvall GSAローター中、２３，５００×ｇ（１２，０００ｒｐｍ）で回転した。
ｂ）沈降：
上清を除去し、緩衝液Ａ中の２．５％硫酸プロタミンを滴下法で添加して最終濃度０．１％にした。抽出物を２３，５００×ｇ（１２，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心した。上清を除去し、５０％硫酸アンモニウムをゆっくり添加し、氷上で３０分間混合させた。抽出物を再度１２，０００ｒｐｍで１５分間回転し、ペレットを形成させた。
ｃ）Sephadex G-50カラム上でのゲル濾過：
ペレットを少量の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭの２−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。８×５０ｍｌのSorvall SS-34ローター中で３９，０００×ｇ（１８，０００ｒｐｍ）で１５分間さらに遠心を行い、抽出物をベッド容量２５０ｍｌでSephadex G-50カラム（５ｃｍ ｉ．ｄ．）に添加した。緩衝液Ｂで溶出したタンパク質を回収し、−８０℃で貯蔵した。
ｄ）Q-Sepharoseカラム上でのイオン交換：
緩衝液Ｂ中で予め平衡化したPharmacia Q-Sepharoseカラム（１１．５ｃｍ×５ｃｍ）を調製した。Sephadex G-50カラムからの抽出物を添加し、０から１ＭのＮａＣｌこう配を適用した。このカラムからの全フラクションを保管し、以下に記載する放射標識法によって分析した。活性フラクション（４７−５７）をプールし、９０％硫酸アンモニウムを添加し、次いで、８×５０ｍｌのSorvall SS-34ローター中で１５分間１２，０００×ｇ（１７，４００ｒｐｍ）で回転した。上清を除去し、得られたペレットを緩衝液Ｂ中に溶解した。
ｅ）Superdex-200カラム上でのゲル濾過：
工程ｄ）からの５ｍｌの抽出物を予めパックしたPharmacia Superdex-200 HiLoadカラム（２ｃｍ ｉ．ｄ．）にベッド容量１２０ｍｌで添加した。それを緩衝液Ｂおよび５０ｍＭのＮａＣｌ中で予め平衡化した。フラクションの全てを分離して保管し、放射標識分析を用いて試験した。フラクション２５−４０をプールし、等量のグリセロールを添加した。この抽出物を比色定量分析上で最初の現像操作のために用いた場合、それは汚染（contaminating）ホスファターゼ活性を含んでいることが分かった。
ｆ）汚染ホスファターゼ活性の除去：
ＦＰＬＣシステム上で０から１ＭのＮａＣｌのこう配を有する高分解能Q-Sepharoseカラムを用いて、汚染ホスファターゼを含まないＩＴＲＳ活性を含むフラクションを０．３ＭのＮａＣｌで溶出した。
２． 3 Ｈ−イソロイシンに基づく放射標識分析を用いるＩＴＲＳ活性の測定
フラクション操作の間のＩＴＲＳの活性を、SteinmetzおよびWeil（７）により記載された下記のような方法に基づいた条件を用いてモニターした。
この方法で用いたストック試薬は下記の通りである：
緩衝溶液：
５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、３００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのグルタチオン、および１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
ＡＴＰ：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭ
ｔＲＮＡ（混合物）：
E. coli株Ｗからの約０．５４ナノモルのｔＲＮＡile／ｍｇ（Sigma（UK）Ltdにより供給）。ストックは、５０ｍｇ混合ｔＲＮＡ／ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉ ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）から成る。
イソロイシン：
２％水性エタノール中約１００Ｃｉ／ミリモルのＬ−［４，５−3Ｈ］−イソロイシン（Amershamから得た）。５０μｌの3Ｈ−イソロイシン、１００μｌの冷イソロイシン、および８５０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の１００μＭのストックを調製した。
酵素−ＩＴＲＳ：
上記のように調製した。本実施例で用いた酵素の比活性は約１４５ｎＭ生成物／分／ｍｇであり、約５から１０％活性であった。酵素は適宜希釈した。本分析中の酵素量は、使用した酵素の純度に応じて調整できることが理解されるであろう。
２００μｌの最終容量のための分析混合物は、
２０μｌの緩衝溶液
２０μｌのＡＴＰ
２０μｌのｔＲＮＡ
２０μｌの3Ｈ−イソロイシン溶液
１００μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
から成る。
標準分析（２００μｌ中）をエッペンドルフ（Eppendorf）マイクロ遠心チューブ中で４重で行った。成分を３７℃で２〜３分間予めインキュベートして、反応を約２０μｌの上記のような適当に希釈した酵素抽出物の添加によって開始した。
最終反応液は以下の濃度で試薬を含有していた：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１５ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ
３０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのグルタチオン
０．１％のウシ血清アルブミン
１ｍＭのＡＴＰ
５ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ
3Ｈ−Ｉｌｅを含有する１０μＭのイソロイシン
分析物を３７℃で２０分間インキュベートして、５０μｌの２０％ＴＣＡの添加によって停止し、チューブを氷上に置いた。
２００μｌの反応混合物を１．５ｃｍ2のセルロース３ＭＭフィルター上にピペットで載せた。フィルターを以下のように洗浄した（４のグループで）：クロスコンタミネーションを避けるためにレプリケートの各々の組について新鮮な洗浄培地を用いて１×１０％ＴＣＡ、２×５％ＴＣＡ、および２×エタノール。乾燥フィルターを２０ｍｌのシンチレーションバイアル中に置き、放射活性を１５ｍｌのオプチファーゼ（Optiphase）中で計測した。
２． 基質としてバリンを用いることに基づく比色定量分析を用いるＩＴＲＳ活性の測定
インキュベーションを以下に記載するような２００μｌの最終容量で４重（上記のように）でセットアップした。本方法で使用したストック試薬は以下の通りであった：
緩衝溶液：
５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、３００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのグルタチオン、および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
ＡＴＰ：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中７．５ｍＭ
ｔＲＮＡ（混合物）：
E. coli株Ｗからの約０．５４ナノモルｔＲＮＡile／ｍｇ（Sigma（UK）Ltdによって供給）。１．２ｍｇの混合ｔＲＮＡ／ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）のストックを作製した。
Ｌ−バリン
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の３０ｍＭのストック
無機ピロホスファターゼ
これは、凍結乾燥粉末としてSigma（UK）Ltdにより供給されるBakers酵母からのＨＰＬＣ精製グレードの形態であった。これは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で１０ユニット／ｍｌの濃度に作製した。
酵素−ＩＴＲＳ：
上記のように調製した。本実施例で使用した酵素の比活性は約１４５ｎＭの生成物／分／ｍｇであり、約５％〜１０％活性であった。酵素を適宜希釈した。分析中の酵素量は、使用した酵素の純度に応じて調整することができることが理解されるであろう。
最終容量２００μｌのための分析混合物は：
２０μｌの緩衝溶液
２０μｌのＡＴＰ
２０μｌのｔＲＮＡ
２０μｌの無機ピロホスファターゼ
１００μｌのＬバリン
から成る。
標準分析（２００μｌ中）をエッペンドルフ（Eppendorf）マイクロ遠心チューブ中で４重で実施した。成分を３７℃で２〜３分間予めインキュベートして、反応を２０μｌの（上記のように）適当に希釈した酵素抽出物の添加によって開始した。
即ち、最終反応液は以下の濃度で試薬を含有していた：
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１０ｍＭのＭｇＣｌ2
３０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのグルタチオン
０．７５ｍＭのＡＴＰ
１５ｍＭのバリン
E. coliからの混合物ｔＲＮＡ種０．１２ｍｇ（上記したようなもの）
Sigma（UK）Ltdから入手可能なBakers酵母からＨＰＬＣ精製したもの
１ユニット／μｌの無機ピロホスファターゼ、および
適切な濃度のＩＴＲＳ（例えば１〜２ｇ／ｍｌの上記したような酵素）
試料を３７℃で２０〜６０分間インキュベートした。反応をHowardおよびRidley（４）により記載されるような試薬を含むマラカイトグリーンの添加によって停止し、続いて、３４％クエン酸の添加によって停止した。次いで、光学的吸収をスペクトロフォトメーターを用いて６３０ｎｍの波長で測定する。新規な比色定量分析法を用いて測定したＡＴＰの０．０４８ｍＭのＫｍ値は、3Ｈ−Ｉｌｅ分析を用いて得た０．０４７ｍＭのＫｍと密接に一致した。
２つの化合物の阻害の持続を測定し、結果を、標準3Ｈ−イソロイシン分析を用いて得た値と比較した。3Ｈ−イソロイシン濃度を１００μＭまで変化させながら化合物１を０、０．２５μＭおよび１．０μＭの濃度で試験して、化合物１がイソロイシンに関して競合的であることが分かった。
結 果
本発明のバリンに基づいた分析を用いて測定した５０％阻害（Ｉ50）を与える濃度：
１） 化合物２は実際には、測定し得るものより効力があり、見かけのＩ50値は分析においては酵素の濃度によって主として測定される（８）。放射測定分析は感度がより高いので酵素の使用量が少なく、従って本発明の分析の場合より低い見かけＩ50値を生み出す。
２） 化合物１および化合物２はともにアミノ酸と競合する。放射測定分析の場合、アミノ酸、イソロイシンはＫｍより約２倍だけ高い濃度で使用されているのに対し、本発明の分析では、それは約３０倍高い。従って、Ｋｍに対するアミノ酸の比率がこのように１５倍相違することを考慮すると、２つの分析で与えられた２つの値は十分に一致する。従って、ここに記載したバリンに基づく分析は、E. coliＩＴＲＳの阻害剤を検出するための比色定量法として有用であることが理解されるであろう。
３．E. coliＩＴＲＳ遺伝子の配列決定
遺伝子は２工程で配列決定した：
ａ） Promega“Erase-A-Base”キット（Promega Cat. No. E5850）を使用した。遺伝子をベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした。Erase-A-Baseシステムにより、Henikoff（９）が開発した方法を用いて、プラスミドまたはＭ１３クローンから一方向に縮小された（nested）欠失セットの一連のものを構築することが可能になる。この場合、各々が異なる部位の遺伝子を含む欠失変異体を、Sequenase Version 2.0キットを用いて、ｐＵＣ／Ｍ１３リバースシークエンスプライマー（５’−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’）により配列決定した。
ｂ）約６０％の遺伝子を、“Erase-A-Base”システムを用いて配列決定した。この配列情報を用いて合成オリゴヌクレオチドプライマー（下記に記載するもの）を設計し、遺伝子配列中のギャップを読むことができた。ギャップを満たし、遺伝子の完全なコードヌクレオチド配列を得た。
トップ鎖のためのプライマー
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ゼネカ・リミテッド
（Ｂ）町名：１５ スタンホープ ゲート
（Ｃ）都市名：ロンドン
（Ｅ）国名：ＵＫ
（Ｆ）ポストコード（ＺＩＰ）：Ｗ１Ｙ ６ＬＮ
（ii）発明の名称：分析方法および除草剤の同定への適用
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター読取形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーデスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release＃1.0,バージョン＃1.25(EPO)
（２）配列番号１のついての情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）長さ：２８２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：1..2814
（xi）配列の記載：配列番号１
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）長さ：９３８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２
Claims (4)
- 二価の金属陽イオン、対応するｔＲＮＡ種および、バリン、トレオニンおよびホモシステインからなる群から選択される適切な非同族アミノ酸と反応した際に、ＡＴＰのピロホスフェートへの加水分解を触媒する、イソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼおよびメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼからなる群から選択されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの阻害剤を検出するための分析法であって、
二価の金属陽イオン、ＡＴＰ、当該ｔＲＮＡ、当該非同族アミノ酸、無機ピロホスファターゼおよび当該アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを、少なくとも部分的には純粋な形態で、有効な阻害剤とともにおよびそれなしの両方で、インキュベートすること、並びに、
ホスフェートのための検出手段を供給すること、並びに、
得られた結果を比較すること
を含む上記の分析法。 - E. coliのイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼの検出のための分析法であって、
（ａ）マグネシウムイオン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、適切なｔＲＮＡ種、イソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼおよび無機ピロホスファターゼをバリンとインキュベートすること；
（ｂ）酵素の有効な阻害剤をさらに含む同様の混合物を同時にインキュベートすること；
（ｃ）インキュベートからのホスフェートの産生を検出すること；および
（ｄ）結果を比較すること、
を含む上記の分析法。 - ホスフェートが比色定量的に検出される、請求項１または２に記載の分析法。
- 高出量分析として作動する、請求項１から３のいずれか１項に記載の分析法。
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