JP3718572B2

JP3718572B2 - Method for producing malonic acid derivative

Info

Publication number: JP3718572B2
Application number: JP3650897A
Authority: JP
Inventors: 英司尾崎; 隆一遠藤
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2017-02-20
Also published as: JPH10229890A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用なマロン酸モノエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マロン酸モノエステルの製造方法としてはマロン酸ジエステルを化学的に加水分解する方法が一般的である。しかしながらこの方法では、反応終了後、生成物であるマロン酸モノエステルを、未反応のマロン酸ジエステルおよび副生成物であるマロン酸から単離するのが困難であり、高純度のマロン酸モノエステルを得ることができない。
【０００３】
高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、Meldrum's 酸を原料とする方法が知られている（例えば、Matoba Katsuhide et al., Chem. Pharm. Bull., 31(8), 2955(1983)、又はRigo B. et al., Tetrahedron Lett., 30(23), 3073(1989) 参照）。しかしながら、この方法は、高価なMeldrum's 酸を使用するため実用的な方法とは言い難く、工業的生産には適していない。
【０００４】
また、高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、マロン酸ジエステルにエステル結合を加水分解する能力を有する酵素又は微生物を作用させる方法が公知である（特開平8-173174号公報）。しかしながら、原料となるマロン酸ジエステルはコスト的に不利である。
したがって、生産性に優れた高純度のマロン酸モノエステルの製造方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用なマロン酸モノエステルの生産性に優れた製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シアノ酢酸エステルに、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属又はゴルドナ(Gordona) 属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させると、マロン酸モノエステルが選択的に生成され、エステル結合の加水分解等の副反応もなく、高純度のマロン酸モノエステルを製造することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、一般式(1) ：
ＮＣＣＨ₂ＣＯＯＲ (1)
（式中、Ｒは、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、又は炭素数１〜20のアルキル基を示す。）
で表されるシアノ酢酸エステルを、コリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物で処理して加水分解することを特徴とする、一般式(2) ：
ＨＯＯＣＣＨ₂ＣＯＯＲ (2)
（式中、Ｒは、前記のとおりである。）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
上記一般式(1) 又は(2) において、Ｒで表されるアルキル基は、直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよい。このアルキル基の炭素数は１〜20であり、好ましくは１〜10であり、より好ましくは２〜６である。具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、イソブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、オクチル、2-エチルヘキシル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシルなどが例示される。
【０００９】
Ｒで表されるアルケニル基は、直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよく、好ましくは炭素数２〜６である。具体的には、ビニル基、アリル基などが例示される。
Ｒで表されるアリール基としては、フェニル基などが例示される。
【００１０】
Ｒで表されるアラルキル基としては、ベンジル基などが例示される。
一般式(1) で表されるシアノ酢酸エステルの中で、代表的な化合物としては、例えば、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、シアノ酢酸n-プロピル、シアノ酢酸イソプロピル、シアノ酢酸ベンジル等が挙げられる。
【００１１】
本発明に使用される微生物は、コリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有していれば、特に制限されない。具体的には、コリネバクテリウムニトリロフィラス(Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419、ゴルドナテラエ(Gordona terrae) MA-1 (FERM BP-4535)等が例示される。
【００１２】
これらの微生物のなかで、ゴルドナテラエMA-1は、上記寄託番号にて工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、コリネバクテリウムニトリロフィラスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）などから入手可能である。
【００１３】
微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解能を向上させるため、培地にニトリル化合物を少量添加することも可能である。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行うのが好ましい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
【００１４】
本発明においては、上記のようなコリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、又は該培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られる菌体、若しくは菌体処理物を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌体の破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、菌体から分離した粗酵素又は精製酵素などが挙げられる。菌体又は菌体処理物は、架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定したり、イオン交換樹脂、ケーソー土などの固体担体に物理的、化学的に固定化して用いることにより、反応を行った後に回収再利用することも可能である。
【００１５】
本発明において、マロン酸モノエステルは以下の方法で製造することができる。反応媒体に基質であるシアノ酢酸エステルを添加して溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応媒体に添加する前に又は添加した後に触媒となる微生物の培養物等を加える。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら加水分解反応を行う。反応媒体としては、例えば、イオン交換水、緩衝液等が用いられる。反応温度は通常０〜70℃、好ましくは10〜35℃であるが、菌体等のニトリラーゼ活性が高くなる温度で行えばよい。反応液のpHは用いる微生物酵素の至適pHに依存するが、一般的にはpH６〜９の範囲内で実施すると化学的加水分解反応による副反応を抑えることができるので好ましい。反応液中の菌体又は菌体処理物の濃度は、乾燥重量として通常0.01〜５重量％相当量である。また、反応液の基質濃度は0.01〜70重量％の間で特に制限はないが、 0.1から15重量％の範囲内で行うことが好ましい。
【００１６】
さらに、加水分解反応中、シアノ酢酸エステルを連続添加することによりマロン酸モノエステルを高濃度に蓄積させることができる。その際、基質による酵素の失活を最小限に抑えるため、反応液の基質濃度を0.01〜10重量％、好ましくは 0.1〜５重量％の範囲に維持しながら基質を添加する。
【００１７】
反応終了後、触媒として使用した微生物の菌体を遠心分離、濾過などの操作により除去してから、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することにより未反応のシアノ酢酸エステルを回収可能である。抽出残液を硫酸、塩酸などの酸でpH１〜２とした後に、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することにより、生成物であるマロン酸モノエステルを得ることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
ゴルドナテラエ MA-1 (FERM BP-4535)を滅菌したＬＢ培地（１％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ NaCl ）３mlに植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた菌体培養液１mlを滅菌した下記培地Ａ 100mlに植菌し、30℃で48時間培養した。
【００１９】
培地Ａ（ pH 7.2 ）
グリセロール 1.0 ％
イソバレロニトリル 0.2 ％
酵母エキス 0.02 ％
ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.2 ％
ＮａＣｌ 0.1 ％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.02 ％
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 10 ppm
ＣｏＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ 10 ppm
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 1 ppm
ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ 7 ppm
【００２０】
培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄したのち、50mMリン酸緩衝液（pH7.0) 100mlに懸濁した。この菌体懸濁液の濁度は、ＯＤ630 ＝5.5 であった。この菌体懸濁液に基質としてシアノ酢酸エチル1.00ｇを添加し、30℃で１時間反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：TSKgel ODS-120A （東ソー株式会社製）、 4.6mm I.D. × 25 cm、移動相：５％アセトニトリル，95％水， 0.1％リン酸、流速： 0.5ml/min、検出：ＵＶ 220nm）で分析したところ、全ての基質がマロン酸モノエチルに変換されていた。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、２Ｎ塩酸を添加し、pHを 2.0に調整し、反応生成物であるマロン酸モノエチルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去して、1.05ｇのマロン酸モノエチルを得た（収率89.9％）。
【００２１】
〔実施例２〕
微生物としてコリネバクテリウムニトリロフィラス ATCC 21419 を用いた以外は全て実施例１と同様にして1.07ｇのマロン酸モノエチルを得た（収率91.6％）。
【００２２】
〔実施例３〕
基質としてシアノ酢酸メチルを用いた以外は全て実施例１と同様にして0.97ｇのマロン酸モノメチルを得た（収率81.4％）。
【００２３】
〔実施例４〕
基質としてシアノ酢酸n-プロピルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.05ｇのマロン酸モノn-プロピルを得た（収率91.3％）。
【００２４】
〔実施例５〕
基質としてシアノ酢酸イソプロピルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.02ｇのマロン酸モノイソプロピルを得た（収率88.7％）。
【００２５】
〔実施例６〕
基質としてシアノ酢酸n-ブチルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.06ｇのマロン酸モノn-ブチルを得た（収率93.4％）。なお、ＨＰＬＣ分析の移動相として、40％アセトニトリル，60％水，0.1 ％リン酸を用いた。
【００２６】
〔実施例７〕
基質としてシアノ酢酸t-ブチルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.05ｇのマロン酸モノt-ブチルを得た（収率92.5％）。
【００２７】
〔実施例８〕
基質としてシアノ酢酸アリルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.02ｇのマロン酸モノアリルを得た（収率87.2％）。
【００２８】
〔実施例９〕
基質としてシアノ酢酸2-エチルヘキシルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.01ｇのマロン酸モノ2-ヘチルヘキシルを得た（収率91.8％）。
【００２９】
〔実施例10〕
基質としてシアノ酢酸ベンジルを用いた以外は全て実施例６と同様にして反応を行った。酵素反応終了後、10％のシアノ酢酸ベンジルが未反応であった。未反応のシアノ酢酸ベンジルを酢酸エチルで抽出除去した。その抽出後、水層に２Ｎ塩酸を添加してpHを 2.0に調整し、次いで反応生成物であるマロン酸モノベンジルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去し、0.89ｇのマロン酸モノベンジルを得た（収率80.3％）。
【００３０】
〔実施例11〜19〕
実施例１と同様にして得られた菌体懸濁液に、シアノ酢酸エチルを５〜50重量％濃度となるように添加し、25℃で20時間反応させた。反応終了後の反応収率を液体クロマトグラフィーで測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】

【００３２】
〔実施例20〕
実施例１と同様にして得られた菌体懸濁液 100mlに、シアノ酢酸エチルを５ｇ添加し、25℃で反応させた。以後、反応液中の基質濃度が５重量％を超えないように、基質濃度を測定しながら合計30ｇのシアノ酢酸エチルを分割して添加した。30時間後、反応収率は 100％であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用な、マロン酸モノエステルを生産性よく製造することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a malonic acid monoester useful as a synthetic intermediate for various chemical products, medicines, agricultural chemicals and the like.
[0002]
[Prior art]
As a method for producing malonic acid monoester, a method in which malonic acid diester is chemically hydrolyzed is generally used. In this method, however, it is difficult to isolate the product malonic acid monoester from the unreacted malonic acid diester and the byproduct malonic acid after the completion of the reaction. Can't get.
[0003]
As a method for obtaining a high-purity malonic acid monoester, a method using Meldrum's acid as a raw material is known (for example, Matoba Katsuhide et al., Chem. Pharm. Bull., 31 (8), 2955 (1983), Or Rigo B. et al., Tetrahedron Lett., 30 (23), 3073 (1989)). However, this method is not practical because it uses expensive Meldrum's acid, and is not suitable for industrial production.
[0004]
Further, as a method for obtaining a highly pure malonic acid monoester, a method is known in which an enzyme or microorganism having the ability to hydrolyze an ester bond is allowed to act on malonic acid diester (Japanese Patent Laid-Open No. 8-173174). However, malonic acid diester as a raw material is disadvantageous in terms of cost.
Therefore, development of a method for producing a high-purity malonic acid monoester excellent in productivity has been desired.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The subject of this invention is providing the manufacturing method excellent in productivity of the malonic acid monoester useful as synthetic intermediates, such as various chemical products, a pharmaceutical, and an agrochemical.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
When the present inventors acted on a cyanoacetic acid ester with a culture, a microbial cell or a treated cell of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or Gordona and having nitrilase activity, malonic acid The present inventors have found that a monoester can be selectively produced and a high-purity malonic acid monoester can be produced without side reactions such as hydrolysis of an ester bond, thereby completing the present invention.
[0007]
The present invention relates to a general formula (1):
NCCH ₂ COOR (1)
(In the formula, R represents an alkenyl group, an aryl group, an aralkyl group, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.)
The cyanoacetate ester represented by the general genus is characterized by being hydrolyzed by treatment with a culture of microorganisms having a nitrilase activity, a microbial cell or a treated microbial cell, belonging to the genus Corynebacterium or Gordona. (2):
HOOCCH ₂ COOR (2)
(Wherein R is as described above.)
The manufacturing method of the malonic acid monoester represented by these is provided.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the general formula (1) or (2), the alkyl group represented by R may have a linear or branched structure. The alkyl group has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and more preferably 2 to 6 carbon atoms. Specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, isobutyl, n-pentyl, isopentyl, hexyl, octyl, 2-ethylhexyl, decyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl , Octadecyl, icosyl and the like.
[0009]
The alkenyl group represented by R may have a linear or branched structure, and preferably has 2 to 6 carbon atoms. Specific examples include a vinyl group and an allyl group.
Examples of the aryl group represented by R include a phenyl group.
[0010]
Examples of the aralkyl group represented by R include a benzyl group.
Typical examples of the cyanoacetate represented by the general formula (1) include methyl cyanoacetate, ethyl cyanoacetate, n-propyl cyanoacetate, isopropyl cyanoacetate, and benzyl cyanoacetate. .
[0011]
The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Corynebacterium or Gordona and has nitrilase activity. Specifically, Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419, Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535), etc. are illustrated.
[0012]
Among these microorganisms, Gordona Terrae MA-1 is deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology with the above deposit number. Corynebacterium nitrilophilus is also available from the American Type Culture Collection (ATCC).
[0013]
Microorganisms can be cultured in a liquid medium or a solid medium. As the medium, a medium in which components such as a carbon source, a nitrogen source, vitamins, and minerals that can normally be utilized by microorganisms are appropriately blended is used. In order to improve the hydrolytic ability of microorganisms, it is possible to add a small amount of a nitrile compound to the medium. Culturing is performed at a temperature and pH at which the microorganism can grow, but it is preferably performed under the optimal culture conditions for the strain to be used. In order to promote the growth of microorganisms, aeration and agitation may be performed.
[0014]
In the present invention, a culture obtained by culturing a microorganism having a nitrilase activity in a medium belonging to the genus Corynebacterium or Gordona as described above, or collecting a culture such as centrifugation from the culture as it is. The microbial cells obtained by the operation or the processed microbial cells can be used. Examples of the treated cells include cells treated with acetone, toluene, etc., disrupted cells, cell-free extracts obtained by disrupting cells, crude enzymes or purified enzymes separated from the cells. Bacteria or treated cells are recovered after reacting by comprehensively immobilizing them on a cross-linked acrylamide gel, etc., or by physically or chemically immobilizing them on a solid support such as ion exchange resin or caustic soil. It can be reused.
[0015]
In the present invention, malonic acid monoester can be produced by the following method. Add cyanoacetate as a substrate to the reaction medium and dissolve or suspend. Also, a microorganism culture or the like that becomes a catalyst is added before or after the substrate is added to the reaction medium. Then, the hydrolysis reaction is carried out while controlling the reaction temperature and, if necessary, the pH of the reaction solution. As the reaction medium, for example, ion exchange water, a buffer solution or the like is used. The reaction temperature is usually from 0 to 70 ° C., preferably from 10 to 35 ° C., but may be performed at a temperature at which nitrilase activity such as bacterial cells becomes high. The pH of the reaction solution depends on the optimum pH of the microbial enzyme to be used, but generally it is preferable to carry out the reaction within the range of pH 6 to 9 because side reactions due to chemical hydrolysis can be suppressed. The density | concentration of the microbial cell in a reaction liquid or a microbial cell processed material is 0.01-5 weight% equivalent normally as a dry weight. The substrate concentration of the reaction solution is not particularly limited between 0.01 and 70% by weight, but is preferably within the range of 0.1 to 15% by weight.
[0016]
Furthermore, malonic acid monoester can be accumulated at a high concentration by continuously adding cyanoacetic acid ester during the hydrolysis reaction. At that time, in order to minimize the inactivation of the enzyme by the substrate, the substrate is added while maintaining the substrate concentration of the reaction solution in the range of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight.
[0017]
After completion of the reaction, the microbial cells used as the catalyst are removed by centrifugation, filtration, and the like, and then extracted with a solvent such as hexane or ethyl acetate to recover unreacted cyanoacetate. The extraction residual liquid is adjusted to pH 1-2 with an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, and then extracted with a solvent such as hexane or ethyl acetate to obtain a product, malonic acid monoester.
[0018]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1]
Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) was inoculated into 3 ml of sterilized LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained bacterial cell culture solution was inoculated into 100 ml of the following sterilized medium A and cultured at 30 ° C. for 48 hours.
[0019]
Medium A ( pH 7.2 )
Glycerol 1.0%
Isovaleronitrile 0.2%
Yeast extract 0.02%
KH ₂ PO ₄ 0.2%
NaCl 0.1%
MgSO ₄ · 7H ₂ O 0.02%
FeSO ₄ · 7H ₂ O 10 ppm
CoCl ₂ · 4H ₂ O 10 ppm
CaCl ₂ · 2H ₂ O 1 ppm
MnCl ₂ · 4H ₂ O 7 ppm
[0020]
After completion of the culture, the culture broth was centrifuged, and the whole amount of the obtained bacterial cells was washed with ion-exchanged water and then suspended in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). The turbidity of this cell suspension was OD630 = 5.5. To this cell suspension, 1.00 g of ethyl cyanoacetate as a substrate was added and reacted at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC, column: TSKgel ODS-120A (manufactured by Tosoh Corporation), 4.6 mm ID × 25 cm, mobile phase: 5% acetonitrile, 95% water, 0.1% phosphoric acid, flow rate: 0.5 ml / min, detection: UV 220 nm), all substrates were converted to monoethyl malonate. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, 2N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2.0, and the reaction product, monoethyl malonate, was extracted with ethyl acetate. Anhydrous sodium sulfate was added to the organic layer for dehydration, and the solvent was evaporated to obtain 1.05 g of monoethyl malonate (yield 89.9%).
[0021]
[Example 2]
Except for using Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419 as a microorganism, 1.07 g of monoethyl malonate was obtained in the same manner as in Example 1 (yield 91.6%).
[0022]
Example 3
Except for using methyl cyanoacetate as a substrate, 0.97 g of monomethyl malonate was obtained in the same manner as in Example 1 (yield 81.4%).
[0023]
Example 4
Except for using n-propyl cyanoacetate as a substrate, 1.05 g of mono n-propyl malonate was obtained in the same manner as in Example 1 (yield 91.3%).
[0024]
Example 5
Except for using isopropyl cyanoacetate as a substrate, 1.02 g of monoisopropyl malonate was obtained in the same manner as in Example 1 (yield 88.7%).
[0025]
Example 6
Except for using n-butyl cyanoacetate as a substrate, 1.06 g of mono n-butyl malonate was obtained in the same manner as in Example 1 (yield 93.4%). In addition, 40% acetonitrile, 60% water, and 0.1% phosphoric acid were used as the mobile phase for HPLC analysis.
[0026]
Example 7
Except that t-butyl cyanoacetate was used as a substrate, 1.05 g of mono t-butyl malonate was obtained in the same manner as in Example 6 (yield 92.5%).
[0027]
Example 8
Except for using allyl cyanoacetate as a substrate, 1.02 g of monoallyl malonate was obtained in the same manner as in Example 6 (yield 87.2%).
[0028]
Example 9
Except for using 2-ethylhexyl cyanoacetate as a substrate, 1.01 g of mono 2-hexyl hexyl malonate was obtained in the same manner as in Example 6 (yield 91.8%).
[0029]
Example 10
The reaction was carried out in the same manner as in Example 6 except that benzyl cyanoacetate was used as the substrate. After completion of the enzyme reaction, 10% benzyl cyanoacetate was unreacted. Unreacted benzyl cyanoacetate was extracted and removed with ethyl acetate. After the extraction, 2N hydrochloric acid was added to the aqueous layer to adjust the pH to 2.0, and then the reaction product, monobenzyl malonate, was extracted with ethyl acetate. Anhydrous sodium sulfate was added to the organic layer for dehydration, and the solvent was distilled off to obtain 0.89 g of monobenzyl malonate (yield 80.3%).
[0030]
(Examples 11 to 19)
To the cell suspension obtained in the same manner as in Example 1, ethyl cyanoacetate was added to a concentration of 5 to 50% by weight and reacted at 25 ° C. for 20 hours. The reaction yield after completion of the reaction was measured by liquid chromatography. The results are shown in Table 1.
[0031]
[Table 1]

[0032]
Example 20
To 100 ml of the cell suspension obtained in the same manner as in Example 1, 5 g of ethyl cyanoacetate was added and reacted at 25 ° C. Thereafter, a total of 30 g of ethyl cyanoacetate was added in portions while measuring the substrate concentration so that the substrate concentration in the reaction solution did not exceed 5% by weight. After 30 hours, the reaction yield was 100%.
[0033]
【The invention's effect】
According to the present invention, a malonic acid monoester useful as a synthetic intermediate for various chemical products, medicines, agricultural chemicals and the like can be produced with high productivity.

Claims

General formula (1):
NCCH ₂ COOR (1)
(Wherein R represents an alkenyl group, an aryl group, an aralkyl group, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms), a cyanoacetic acid ester represented by the genus Corynebacterium or Gordona General formula (2) characterized in that it is hydrolyzed by treatment with a culture, microbial cell or treated microbial cell of a microorganism belonging to the genus and having nitrilase activity:
HOOCCH ₂ COOR (2)
(Wherein R is as defined above), a method for producing a malonic acid monoester.

The method for producing malonic acid monoester according to claim 1, wherein during the hydrolysis reaction, the ester is continuously added while maintaining the concentration of cyanoacetic acid ester in the reaction solution in the range of 0.01 to 10% by weight. .

The microorganism having nitrilase activity is corynebacterium Nitrilophyllus (Corynebacterium nitrilophilus) Or Gordona Terrae (Gordona terrae) The process for producing a malonic acid monoester according to claim 1 or 2.

The microorganism having nitrilase activity is corynebacterium Nitrilophyllus (Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419 Or Gordona Terrae (Gordona terrae) MA-1 (FERM BP-4535) The process for producing a malonic acid monoester according to claim 1 or 2.

An unreacted formula obtained by extracting the reaction solution obtained by the production method according to claim 1 with a solvent. (1) After removing the cyanoacetate ester represented by (2) A process for producing a malonic acid monoester represented by the formula: