JP3715313B2 - ヒト細胞接着性タンパク質aamp‐1及びその利用 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は一般にAAMP-1に関連し、そしてAAMPのアミノ末端領域に由来するペプチドP189に関連する。特に、本発明はAAMP-1,P189又はそのフラグメントをコードするDNAセグメント;このDNAセグメントによりコードされるポリペプチド;このDANセグメントを含む組換DNA分子;この組換DNA分子を含む細胞;AAMP-1,P189又はそのフラグメントを製造する方法;AAMP-1に特異的な抗体;及びサンプル中のAAMP-1の量を測定する方法に関連する。本発明は更に、AAMP,P189又はそのフラグメントを、細胞間接着もしくは細胞・支持体間接着、患者における創傷治癒、補てつ許容、組織におけるヘパリンの集中、並びに悪性細胞の転移及び侵入の阻害等、を助長するうえで利用する方法に関連する。
背景情報
主要組織学的複合体クラスIIタンパク質は最近になって、HIV-1エンベロープタンパク質に対する相同性を有することがわかった(H.Goldingら、J.Exp.Med.,167,914(1988);H.Goldingら、J.Clin.Invest.,83,1430(1989);J.A.T.Young,Nature 332,215(1988))。かかる相同性領域はHIV-1タンパク質に対して生起された抗体にとっての標的を担うことがあり、それ故AIDSにおける免疫系を損わせる。Goldingら(J.Exp.Med.167,914(1988))はHIV-1 gp41−エンベロープタンパク質のカルボキシ末端及び全てのヒトHLAクラスII抗原のベーター鎖のアミノ末端部に位置する共通のエピトープを同定した。このエピトープは小さいながらも(5個が連続して同一又は類似)、彼らはそれが「分子擬態物」の有効な例であるものと認め、なぜなら各タンパク質由来の合成ペプチドに対して生起させたモノクローナル抗体は天然のHIV-1エンベロープ及びMHCクラスII分子と互換的に反応するからである。HIV-1陽性個体の1/3がHIV-1エンベロープタンパク質に由来するペプチド、MHCクラスII分子由来の同族ペプチド及び天然MHCクラスII分子に特異的な血清抗体を有することが示されている(H.Goldingら、J.Exp.Med. 167,914(1988))。HLAクラスIIベーター鎖の他の2領域及びその他の免疫関連タンパク質、インターロイキン−2もHIV-1に対する一定の相同性を示した(J.A.T.Young,Nature 333:215(1988);M.A.VegaらNature 345:26(1990);W.E.Reiher IIIら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9188(1986))、HIV-1ワクチンの開発における重要な考えは、HIV-1に対する相同性を有する更なる宿主細胞表層タンパク質であってHIV-1のペプチドに特異的な抗体と交差反応しうるタンパク質の潜在的な存在にある。
一定の接着性分子は細胞間及び細胞・支持体間相互作用を司ることが知られ、そのことは発育、分化、免疫機能、創傷治癒、悪性形質転換及び腫瘍侵入転移における中心的な役割を果たす。それらは組織構成における構造的パターンを司り、細胞骨格と細胞外マトリックスとのトランスメンブラン連結に関与し、細胞の移動方向の誘導を担い、シグナル変換に関与し、細胞運動を阻害しうる強力な接着力を供するか、あるいは細胞運動のけん引を担う弱い及び/もしくは可逆性の接着力を供しうる(Edelman,G.M.Ann.Rev.Cell Biol.2:81-116(1986);Edelmanら、Ann.Rev.Biochem.60:155-90(1991);Edelman,G.M.,Dev.Dynamics 193:2-10(1992);Behrens,J.ら、Sem Cell Biol.3:169-78(1992))。
イムノグロブリン超科の構成員は様々な結合特性を示すことが知られ、そして数多くの接着性タンパク質が含まれる。かかる接着性タンパク質の改変は、細胞間接着、細胞と支持体との接着、並びに腫瘍細胞と白血球の内皮細胞への接着における変化に介して、正常及び腫瘍細胞の移動の刺激性又は阻害性の役割を果たすことが示されている(Buck,C.A.,Sem.Cell Biol.3:179-88(1992);Shevach,E.M.Immunophysiology,The Role of Cells and Cytokines in Immunity and Inflamation(Oppenheim,J.J.,and Shevach,E.M.編)pp104-28,Oxford University Press,New York)。更に、2種類のグリコサミノグリカンであるヘパリン及びヒアルロナンは、このような接着性タンパク質の一部、例えば神経細胞接着性分子(NCAM)、クラスター分化(CD)タンパク質、CD4及びCD44の結合メカニズムに関与していることが知られている。例えばBuck,C.A.,Sem.Cell Biol.3:179-88(1992);Cole,G.J.et al.,Nature 320:445-7(1986);Cole,G.J.らNeuron 2:1157-65(1989):ReyesらCell Regul.1:567-76(1990);ArufoらCell 61:1303-13(1990);MiyakeらJ.Exp.Med.172:69-75(1990);及びLederman,S.らJ.Immunol.143:1149-54(1989)を参照のこと。
ヘパリン結合性タンパク質及びペプチドの、合成支持体に対するヘパリン結合の促進、培養支持体に対する細胞接着、移植許容及び創傷治癒への利用、並びに腫瘍転移及び悪性細胞の侵入を阻害するうえでのそれらの利用が従来述べられている(Furchtらの米国特許第5,081,031号、Tsilibaryらの米国特許第5,152,784号、Charonisの米国特許第5,120,828号)。
発明の概要
本発明は、HIV-1エンベロープ及びnefタンパク質の保存領域に対して強い局部的相同性を有するイムノグロブリン(Ig)型ドメインを有するタンパク質AAMP-1に関する。本発明は更にAAMPのアミノ末端領域に由来するポリペプチドP189に関する。P189及びAAMPは共に細胞凝集及びヘパリン結合を助長することができる。
本発明の一般的な目的はAAMP-1又はそのフラグメントの提供にある。
本発明の特定の目的はAAMP-1をコードするDNAセグメント又はそのフラグメントの提供にある。
本発明の更なる目的はAAMP-1遺伝子に対応するポリペプチド又はそのフラグメントの提供にある。
本発明の別の目的はベクターとAAMP-1遺伝子をコードするDNAセグメントとを含んで成る組換DNA分子又はそのフラグメントの提供にある。
本発明の更なる目的は上記の組換分子を含む細胞の提供にある。
本発明の別の目的は、AAMP-1遺伝子又はそのセグメントによりコードされるポリペプチド又はそのフラグメントを生産する方法の提供にある。
本発明の更なる目的はAAMP-1又はその固有フラグメントに対する結合親和力を有する抗体の提供にある。
本発明の更なる目的はサンプル中のAAMP-1又はそのフラグメントの量を測定する方法の提供にある。
本発明の別の目的は、防御抗体を誘引する、有害な自己抗体を阻止する、又は患者における体細胞に対するHIV結合についてAIDSウィルスと競合するのに有効な量の上記のポリペプチドと、薬理学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含んで成る治療薬の提供にある。
本発明の更なる目的はP189ペプチド又はそのフラグメントの提供にある。
本発明の更なる目的はP189ペプチド又はそのフラグメントをコードするDNAセグメントの提供にある。
本発明の追加の目的は、AAMP又は近縁のヘパリン結合性ペプチドの利用を含んで成る、細胞間接着及び細胞・支持体間接着を媒介するための方法の提供にある。
本発明の更なる目的は培養支持体に対する細胞接着の促進、補てつ許容及び創傷治癒のための、並びに悪性細胞の転移及び侵入を阻止するための方法の提供にあり、ここでこの方法はAAMP又は近縁のヘパリン結合性ペプチドの利用を含んで成る。
本発明の更なる目的及び利点は以下の説明から明となるであろう。
【図面の簡単な説明】
図1。ラムダgt11発現ライブラリーから単離したヒトA2058メラノーマ細胞AAMP-1 cDNAのヌクレオチド配列と、その推定アミノ酸配列。ファージインサートAAMP-1を、シーケナーゼ2.0(U.S.Biochemical)によるジデオキシヌクレオチド・ターミネーション法(F.Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463(1977))を利用する配列決定のための二本鎖cDNAの製造のため、Bluescriptプラスミド(Stratagene)にサブクローニングした。ヌクレオチド残基は5′末端から番号付けした。アミノ酸配列の番号付けはオープンリーディングフレームの第一アミノ酸残基「=で下線を付した)から始めた。推定ヘパリン結合部位はアミノ酸残基(aa)7〜12を含む。このアミノ末端の酸性領域aa35〜95に「----」の下線を付した。潜在的なイムノグロブリン様ドメインを含んで成るアミノ酸領域90〜357(A.F.Williams and A.N.Barclay,Ann Rev.Immunol.6,381(1988);A.F.Williams and A.N.BarclayのImmunoglobulin Genes,T.HonjoらEds.(Academic Press Limited,San Diego,CA,1989),pp.361-387))には、ベーターストランドの二次構造推定「****」及びベーターターン「>>>>」を、Chou and Fasman(Advances in Enz.47,45(1978))の方法を基礎に下線を付した。イムノグロブリン相同性によりジスルフィド結合を形成すると推定されるシステインペアー、107と141、150と219、227と276及び293と337には「< >」の印を付けた。潜在的なトランスメンブラン領域aa385〜410には「−」の下線を付した。セリン#419における潜在的なタンパク質キナーゼホスホリル化部位には「$$$$」を下に付した(タンパク質キナーゼCホスホリル化部位共通配列(Ser/Thr-Xaa-Lys/Arg)〔ここでXaaは通常不帯電残基である〕〔J.R.Woodgett,K.L.Gould,T.Hunter,Eur.J.Biochem.161,177(1986)〕もスレオニン#238,291及び357において見い出せた)。核酸配列1722−1728にあるポリアデニル化部位はかっこ「( )」内に示した。
図2。AAMP-1 cDNAでプローブした(つり出した)ヒトメラノーマA2058細胞のノーザンブロット。一本の1.6kbバンドが全細胞質(レーン1)及びポリアデニレートに富む(レーン2)A2058 RNAのブロット上に認められた。総細胞質RNA 41μgがNonidet P-40(0.65%)に溶解した6百万個の細胞から単離でき、7Mの尿素、1%のドデシル硫酸ナトリウム、Trisバッファー、NaCl及びEDTAの存在下で水性相に分け、次いでフェノール/クロロホルム抽出に付した。メッセンジャーRNAに富むRNA 2.2μgをFast Trackキットバージョン2.1(Invitrogen Corp.San Diego,CA)により1600万個の細胞から単離した。RNAをホルムアルデヒドで変性させ、1%のアガロース/ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、Schleicher & Schnell Nytranナイロン膜に移し、そして紫外光で架橋した。1765bpのAAMP-1 cDNAをランダムプライミングを利用して(アルファ−32P)dCTP(NEN Research Products,Boston,MA)でラベルした。65℃での一夜のハイブリダイゼーションをChurch and Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci 81,1991(1984))に従って行った。
図3。ヒトT細胞活性化におけるAAMP-1発現のノーザンブロット。Hourは培養時間を意味する。A:AAMP-1の一本鎖1.6kbメッセージ。B:ベータ−2ミクログロブリン標準品。レーン1−3:非刺激ヒトCD4+T細胞。単離細胞の純度は98%より高かった。レーン1及び2(それぞれ0及び24時間)はミトゲン刺激なし、そしてレーン3はタンパク質合成インヒビター、シクロヘキシミドの存在下で12時間経過した後であり、このインヒビターは一定のmRNA種を安定化することがよく観察されている(K.Kellyら、P.Leder,Cell 35,603(1983))。レーン4〜8:抗−CD3及び抗−CD2モノクローナル抗体で活性化したCD4+T細胞。レーン4,5,6,7及び8はそれぞれ1,2,4,16及び24時間の時点を示す。RNAサンプルをManiatisらのグアニジニウムイソチオシアネートセシウムクロリド法(T.E.Maniatis,E.Fritsch,J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York第2版、1989)、pp.7.18-7.22))により、CD4+T細胞から調製した。ホルムアルデヒド/0.8%のアガロースゲルで電気泳動させた10μgの全RNA(各レーン)をニトロセルロースに移し、そして(アルファ−32P)dCTPラベルしたランダムプライムプローブ、AAP-1及びベータ−2ミクログロブリンに42℃で順に一夜ハイブリダイズさせた。
図4。AAMPヘパリン結合。組換AAMPタンパク質(約15μgのゲル精製化及びImmobilon-P(商標)にブロット化)はバックグランド(BSA)よりも2.2±0.4倍多くトリチウム化ヘパリン(2.5U/ml)に結合し、そしてそれはタンパク質のモル当りのバックグランドを超えるカウント/分(cpm)で表わし(6アッセイ)、そして等量の未ラベルヘパリンと競合させている(3アッセイ)。AAMP由来のペプチドP189(0.3μg/Cova Link(商標)プラスチックウェル(データーポイント当り2〜3))は2アッセイにおいて、バックグランド(0.1%のBSAを含む同一のバッファーで処理したウェル)よりも3.0±0.6倍多くのトリチウム化ヘパリン(50U/ml)と結合した;最大ペプチド結合を伴うアッセイにおいて、下に示すcpm/μmoleタンパク質の結果(1:1の低温ヘパリン競合を伴わない及び伴うトリチウム化ヘパリン競合)は組換AAMPタンパク質についての値に近かった。ポリプロピレンチューブの中の200μg/mlの溶液から沈殿させたP189凝集体はバックグランド(0.1%のBSAを含む同一のバッファーとイキュベートしたチューブからのすすぎ液)よりも9.1±1.3倍多くのトリチウム化ヘパリン(0.05U/ml)と結合し、組換タンパク質についての結果と同じ範囲における結果(図示)であった(2アッセイ)。その結合能は未ラベルヘパリンとも競合できる(1:1)。未ラベルヘパリンと競合させた組換AAMPのアッセイにおけるバックグランド結合能をAAMP組換タンパク質の平均バックグランドに標準化した。トリチウム化ヘパリンの回収はP189凝集体結合アッセイにおいて18%及び25%であった(Recomb.=組換体、Comp.=競合)。
図5。固定化P189ペプチドに対する細胞接着のヘパリン阻害。可溶化P189をペプチドに付加するリンカーアーム上のアミノ基でカバーしたCova Link(商標)プレートのウェルに、その完全配列がリガンド又は細胞に対する結合にとって有効となるように加えた。X軸伝いで表示の如く上昇していく濃度のヘパリンを、プレートにペプチドを結合した後、洗浄溶液の中に加えた。未結合のヘパリンをA2058メラノーマ細胞懸濁物の添加の前に洗い流した。37℃で1時間のインキュベーション後、未結合の細胞を洗い流し、そして残留細胞をDiff Quik(商標)で染色した。付加細胞中の染料保持を可溶化の後に光学的に定量した。各O.D.単位は約100,000個の細胞を表わす。P189のスクランブル配列から作り上げたコントロールペプチドP350は、ヘパリンに対する曝露抜きで50%低い細胞結合能を示し、そしてP189について示す最大ヘパリン曝露を経て30%高い細胞結合能を示した。
図6。A2058メラノーマ細胞のペプチド誘導化凝集。細胞/ペプチド懸濁物の中で形成させ、且つスライド上で沈降させた細胞凝集体の目視計測。10以上の丸い密集した(clustered)細胞の凝集体が、各ペプチドのスライド上のチャンバー領域の中央の140mm2の面積において数えられた(マルチプル・スライド;ペプチドのない同じスライド上でのバックグランド凝集について補正)。ヘパリン(5U/ml)は細胞に対するP189の凝集作用を失わさせた。
発明の詳細な説明
「AAMP」又は「AAMP-1」なる語は、少なくとも45.7kDの分子量を有するタンパク質又はペプチドを意味し、そしてSEQ ID NO.7に示すアミノ酸配列、その変異体又はフラグメントと実質的に又はほぼ相同性である。通常、かかるタンパク質は記載のアミノ酸配列と少なくとも約50%相同、好ましくは90%以上相同、そしてより好ましくは約95%以上相同である。従って、他の変異体、類似体及び改変配列として、ヒトの各変異体の多くの天然哺乳動物種が含まれる。これらのタンパク質は通常AAMP又はそのフラグメントと共通の少なくともある種の生物活性、例えばヘパリン結合親和性及び細胞接着特性も示すであろう。抗血清により探しあてられる近縁のポリペプチド又はタンパク質も含まれる。
ポリペプチド「フラグメント」「部分」又は「セグメント」は少なくとも約6個のアミノ酸、そしてより一般的には少なくとも約12個のアミノ酸のアミノ酸残基ストレッチである。
本発明は、一次構造配列が共通しているAAMPタンパク質形態又はそのフラグメントを包括し、そして化学的及び生化学的修飾、例えばグリコシル化、ホスホリル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合及びその他の基礎的一次配列におけるささいな改変を包括することを意図している。ある態様においては、これらの修飾は有用なラベリング試薬となるか、又は精製標的、例えばアフィニティーリガンドとして働くであろう。このことは当業者に容易に理解されるであろう。ポリペプチドをラベルする様々な方法及びかかるポリペプチドをラベルするのに有用な様々な置換基又はラベルは当業者に公知であり、そして放射性アイソトープ、例えば32P、ラベル化抗リガンド(例えば抗体)に結合するリガンド、蛍光体、ケミルミネッセント剤、酵素、並びにラベル化リガンドについての特異的結合性ペアーとして働きうる抗リガンドが含まれる。ラベルの選択は必要な感度、プライマーとのコンジュゲーションのし易さ、安定性の要件及び入手可能な装置に依存する。ポリペプチドをラベルする方法は当業界に公知である。
かかるポリペプチドは一般に可溶性であるが、しかし固相支持体、例えばニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材(例えばSepharoseビーズ)、磁性ビーズ、ガラスウール、細胞又はその他の支持体、例えば限定することなく、補てつ具(例えば人工心臓弁)、外科材料(例えば静脈内カテーテル、縫合糸)等に複合しうる。
核酸に適用する際の「AAMP」なる語は、AAMPポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸を意味し、ここでこのフラグメントはSEQ ID NO:1に示すヌクレオチド配列又はそのフラグメントと実質的に又はほぼ相同性である。本発明の核酸にはRNA,cDNA、ゲノムDNA、合成形態及び複合ポリマー、センス及びアンチセンスストランドの両者、が含まれる。更に、各アイソフォームの様々なアレルも含まれる。天然以外の配列を含んで成る組換核酸も本発明により提供される。
核酸において、「フラグメント」又は「セグメント」は少なくとも約18ヌクレオチド、そして通常は少なくとも約36ヌクレオチドのストレッチである。
「単離された」「実質的に純粋な」及び「実質的に均質な」なる語は同義語として用いており、そしてAAMPタンパク質もしくはポリペプチド、又はそのフラグメント、又はそれらをコードするDNAセグメントを説明しており、ここでかかるタンパク質もしくはペプチド、又はDNA分子は天然でそれに付随している成分から分離されている。
AAMPポリペプチドもしくはそのフラグメント、又はそれをコードするDNAセグメントは、天然状態でそれに付随している天然夾雑物から分離されているとき、天然に結合している成分を実質的に含まない。即ち、化学合成された又は天然において由来する細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは天然に結合している成分を実質的に含まないであろう。同様に、化学合成された又は天然において由来する細胞とは異なる細胞系において合成された核酸も天然に結合している成分を実質的に含まないであろう。
核酸の説明のために用いているときの「相同性」なる語は、2本の核酸又は表示のその配列を最適に整合させて比較したときに、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、そのヌクレオチドの少なくとも60%において、通常は約75%〜99%、そしてより好ましくはそのヌクレオチドの少なくとも約98%〜99%において同一であることを示している。
また、例えば実質的に類似の配列、アレル変異体及び天然又は誘導配列も含まれる。更に、本発明は化学修飾された及び置換された核酸、例えば修飾されたヌクレオチド塩基を含むもの、又はラベルされているものを含む。核酸を修飾するための様々な方法及び様々な置換基が当業界に公知であり、そしてペプチドを修飾するのに従来説明されてきたものが含まれる。
本発明のアレルの野生型配列が一般に採用されるが、ある状況においては、1もしくは複数の突然変異又はささいな修飾、例えばアミノ酸配列の変化をもたらし、サイレント突然変異を供するか、又はアミノ酸残基の修飾又はアミノもしくはカルボキシ末端基の修飾をもたらす欠損、置換、反転又は挿入を導入してよい。
ここで提供する新規の核酸は大量のAAMPポリペプチド、そのフラグメント又は核酸及びそのセグメントを作るために有用である。AAMP又はそのフラグメントをコードするDNAセグメントは当業界に公知の方法により発現構築体を調製するのに利用できるであろう。この発現構築体は通常天然又はその他のプロモーターの転写コントロール下にあるAAMPまたはそのフラグメントをコードする1又は複数のDNA配列を含んで成る。通常、このプロモーターは哺乳細胞における発現のための真核系プロモーターであり、ここでその哺乳細胞はAAMPタンパク質又はそのフラグメントを欠くものでも欠いていないものであってもよい。この転写調節配列は一般に宿主により認識される異種エンハンサー又はプロモーターを含むであろう。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するであろうが、しかしプロモーター、例えばtrp,lac及びファージプロモーター、tRNAプロモーター及び解糖系酵素プロモーターが公知である(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989))。
簡単に入手できる発現ベクター、例えば複製系並びに転写及び翻訳調節配列が、AAMP DNA配列のための挿入部位と共に利用できうる。
原核系宿主の中でDNA配列を増幅する又はAAMPタンパク質もしくはそのフラグメントを製造することを望むとき、好適なプロモーターは原核系プロモーター、例えばtrp,lac及びラムダである。通常、高レベルの転写発現を供するために強力なプロモーターを採用するであろう。
AAMP又はそのフラグメントの発現のためには、原核系及び真核系の両者の多種多様な宿主が利用されるであろう。有用な宿主には細菌、例えばE.コリ(E.coli)、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳細胞、一般には不死化させた、例えば様々なマウス細胞系、サルの細胞系、チャイニーズハムスターの卵巣細胞系、ヒト細胞系、それらの誘導体等が含まれる。あるケースにおいては、これらの細胞は腫瘍宿主細胞に由来するか、又は野生型細胞を癌遺伝子、腫瘍を起こさせるウィルス等で形質転換させたものであってよい。
宿主細胞に発現構築体を導入する手段は特定の構築体及び標的宿主に依存して変わるであろう。
全長AAMPペプチド又はそのフラグメントが、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を作るのに有用であろう。
モノクローナル抗体のためには、適当な動物を選び、そして所望の免疫プロトコールに従う。適当な時期に、かかる動物の脾臓を切り取り、そして個々の脾臓細胞を、一般に不死化ミエローマ細胞に、適当な選択条件下で融合させる。その後、細胞をクローニング選別し、そして各クローンの上清液を、抗原の所望の領域に対して特異的な適当な抗体の生産について試験する。抗体を生産するための技術は当業界において公知である:例えばGodingらMonoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.)Academic Press,N.Y.;Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1998);を参照のこと。これは米国特許第4,381,292、4,451,570及び4,618,577号に例示されている。その他の適当な技術はリンパ球の抗原性ポリペプチドに対するインビトロ曝露、あるいはファージ類似ベクターにおける抗体のライブラリーの選択を含む(Huseら、Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lamda,Science 246:1275-81(1989))。108リッター/モル、好ましくは109〜1010又はそれより強い親和力を有するモノクローナル抗体が、これらの標準手順によって一般に作られるであろう。
作製した抗体は数多くの目的、例えばイムノアッセイにおいて、プローブとして、診断もしくは治療において、又は該タンパク質もしくはペプチド又はそれらのフラグメントの記載の特性を司るタンパク質の部分を分析するための基礎的研究探索において利用できうる。
免疫学応答は通常イムノアッセイにより測定又は検出される。通常、かかるイムノアッセイは抗原起源、例えば検出すべき抗原と同一の細胞により同一の方法で生産される抗原起源のある程度の精製を包括する。このイムノアッセイは、ある状況においては、ラジオイムノアッセイ、酵素連結アッセイ、蛍光アッセイ、又は任意の数多くのその他の選り抜きのものであり、そのほとんどは同等に機能するが、しかし特定の条件で長所を発揮しうる。
本発明の抗体は修飾を伴って又は伴わないで利用できうる。しばしば、これらの抗体は検出可能なシグナルを供する物質を共有又は非共有結合させることによりラベルされているであろう。多種多様なラベル及びコンジュゲーション技術が知られ、そして特許及び科学文献の両方においてかなり報告されている。適当なラベルには放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光成分、ケミルミネッセント成分、磁性粒子等が含まれる。
細胞間接着を助長するタンパク質及びペプチドは、支持体に対する細胞接着を助長するうえで有用であり、それ故補てつの組織許容、そして創傷治癒をも助長するであろう。更に、ヘパリン結合性ポリペプチドは、ヘパリン含有組織の中にヘパリンを局部的に集中するのに、又はヘパリン含有溶液からヘパリンを除去するのに、かかるタンパク質又はペプチドをアフィニティーリガンドとして用いることにより、利用できうる。従って、AAMP及びそのフラグメントは上記の方法を助長するのにも利用できうる。
有効な治療のために必要な試薬の量は様々な要因、例えば投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及びその他の投与した医薬品に依存するであろう。そこで、安全性及び効能を最適化するために処置投与量を力価検定すべきである。これらの化合物は獣医学的利用及びヒトにおける臨床学的利用のため、その他の治療剤と同様に、生理学的に許容される担体の中で哺乳動物に投与されうる。
薬理組成物は非経口的、局所的、経口的、又は局所投与、例えばエアゾールにより、又は経皮的に、予防及び/又は治療処置のために投与されるであろう。この薬理組成物は投与方法に依存して様々な単位投与形態で投与してよい。
本発明の薬理組成物は往々にして静脈内的に投与されるであろう。そこで、本発明は許容の担体、好ましくは水性担体の中に溶解又は懸濁された本発明の化合物の溶液を含んで成る、静脈投与用の組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、0.4%の食塩水等を使用してよい。固体組成物については、慣用の無毒な固体担体、例えば薬理級マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウム等が利用されうる。
本発明のポリペプチドで処理した補てつ、外科材料等はポリペプチド組成物でコートされていてよい。好ましくはこのポリペプチドはこの材料の表層に付加させ、そしてより好ましくはこのポリペプチドはこの材料の中に一体化させる。
診断用途として、本明細書で提供する試薬は、標的サンプル中のAAMP及び/もしくはそのフラグメント、又はAAMPもしくはそのフラグメントをコードする核酸を検出及び測定するのに利用できうる。
AAMP又はそれをコードする核酸の存在の検出において、AAMPに関する免疫交差反応性、並びにサザンブロット、ノーザンブロット、プラークリフト、コロニーハイブリダイゼーション、又はPCRもしくはその他の増幅法を含むいくつかの当業界公知の任意の方法を採用することができる。例えば、SambrookらMolecular Cloninng:A Laboratory Manual(2nd ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,F.Ausubelらed.Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987、及び定期刊行物)、又はPCRについて、例えば米国特許第4,683,195及び4,683,202号、PCR technology,Erlich,ed.,Stockton Press,New York(1989)及びPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innisらeds.,Academic Press,Sna Diego(1990)を参照のこと。
本発明の態様のより詳しい説明を以下にする。
一の態様において、本発明はAAMP-1に対応するアミノ酸配列、又はそのうちの少なくとも6個の連続アミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードするDNAセグメントに関する。一の好適な態様において、このDNAセグメントはSEQ ID NO:1に示す配列、そのアレル又は種変異体、又はそのうちの少なくとも18個の連続ヌクレオチド(好ましくは、そのうちの少なくとも18,30,40又は50個の連続ヌクレオチド)を含んで成る。更なる好適な態様において、このDNAセグメントは、SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列そのアレル又は種変異体、又はそのうちの少なくとも6個の連続アミノ酸(好ましくは、そのうちの少なくとも6,10,15,20,30又は50個の連続アミノ酸)をコードする。
更なる態様おいて、本発明は、天然で結合しているタンパク質を含まないポリペプチド又は固相支持体に結合したポリペプチドであって、AAMPに対応するアミノ酸配列又はそのうちの少なくとも6個の連続アミノ酸(好ましくはそのうちの6,10,15,20,30又は50個の連続アミノ酸)を含んで成るポリペプチドに関する。一の好適な態様において、このポリペプチドはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列、又はそれと等価のアレルもしくは種変異体(例えば免疫学的もしくは機能的にそれと等価)、又はそのうちの少なくとも6個のアミノ酸(好ましくはそのうちの少なくとも6,10,15,20,30又は50個の連続アミノ酸)を含んで成る。
別の態様において、本発明はベクター(例えばプラスミド又はウィルスベクター)及び上記のAAMP-1に対応するポリペプチドをコードするDNAセグメント(上記)を含んで成る組換DNA分子に関する。好適な態様において、このコードセグメントはベクターの中でプロモーターに作動連結して存在している。
更なる態様において、本発明は上記の組換DNA分子を含む細胞に関する。適当な宿主細胞には原核細胞(例えばE.コリを含む細菌)並びに下等真核細胞(例えば酵母)及び高等真核細胞(例えば哺乳細胞)が含まれる。細胞への組換分子の導入は当業界公知の方法を利用して行われうる。
別の態様において、本発明はAAMP-1に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する方法であって、上記の細胞を、そのDNAセグメントが発現されるように培養し、そしてこれによりポリペプチドを生成し、次いでそのポリペプチドを単離することを含んで成る方法に関する。
更なる別の態様において、本発明はAAMP-1に対する結合親和性を有する抗体又はその一部に関する。一の好適な態様において、AAMP-1はSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列、そのアレルもしくは種変異体、又はそのうちの少なくとも5個の連続アミノ酸(好ましくは少なくともそのうちの6,10,15,20,30又は50個の連続アミノ酸)を含んで成る。一の好適な態様において、この抗体は1AA3である。
抗体(モノクローナル又はポリクローナル)は天然形態及び組換形態におけるAAMP-1又はその固有のフラグメントに対して生起することができる。かかる抗体のフラグメントも本発明の範囲に属する。
AAMP-1は免疫原として用いる融合又は共有結合ポリペプチドとして、その他の物質、特にポリペプチドに連結していてよい。AAMP-1又はそのフラグメントは様々な免疫原、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、ヘビ毒素等に融合又は共有結合させることができうる。例えば、Microbiology Hoeber Medical Division(Harper and Row,1969),Landsteiner,Specificity of Serological Reactions(Dover Publications,New York,1962)及びポリクローナル抗血清の調製法の詳細についてはWilliamsら、Methods in Immunology and Immunochemistry,Vol.1(Academic Press,New York,1967)を参照のこと。典型的な方法は動物の抗原による超免疫を含む。次いで動物の血液を反復免疫のすぐ後に集め、そしてガンマーグロブリンを単離する。
ある状況において、様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが所望される。かかるモノクローナル抗体を調製するための技術の詳細はStitesら、editors,Basic and Clinical Immunology,(Lange Medical Publications,Los Altos,CA、第4版)及びその中の引用文献、並びに特にKohler and MilsteinのNature 256:495-497(1975)(モノクローナル抗体を作製する一の方法が述べられている)に記載されている。
別の態様において、本発明はAAMP-1又はそのフラグメントに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体又は結合性フラグメントを製造するハイブリドーマに関する。一の好適な態様において、AAMP-1はSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、そのアレルもしくは種変異体、又はそのうちの少なくとも6個の連続アミノ酸(好ましくは、そのうちの少なくとも6,10,15,20,30又は50個の連続アミノ酸)を有する。別の好適な態様において、このハイブリドーマは1AA3を含んで成る。
更なる別の態様において、本発明は診断キットに関し、それは:
i)少なくとも一種の上記のモノクローナル抗体;並びに
ii)前記モノクローナル抗体の結合性パートナー及びラベルを含んで成るコンジュゲート;
を含んで成る。
更なる態様において、本発明は
i)少なくとも一種の上記のモノクローナル抗体及び
ii)抗体
を含んで成るコンジュゲートを含んで成る診断キットに関する。
更なる態様において、本発明はサンプル中のAAMP-1の量を測定するための方法に関連し、この方法はこのサンプルを上記の抗体と接触させ、次いで抗体とサンプル中の任意のAAMP-1とで形成される免疫複合体の量を測定することを含んで成る。形成される免疫複合体の量を測定する方法は当業界に公知の方法、例えばRIA,ELISA並びに直接及び間接イムノアッセイである。
別の態様において、本発明はHIV感染症に対する予防又は炎症性免疫障害もしくは腫瘍障害の処置において利用するのに適当な、投与ルートに応じて選定された量の上記のポリペプチドを含んで成る治療剤に関する。皮下又は筋肉内投与ルートが好ましいが、上記のポリペプチドは腹腔内又は静脈内ルートにより投与してもよい。当業者は任意の特定の処置プロトコールのために投与する量が容易に決定できることを理解しているであろう。適量は1〜50マイクロモルの範囲に属するものと予測されうる。
別の態様において、本発明はAIDSを予防するための上記のポリペプチドの利用方法に関する。当業者は、任意の特定の処置プロトコールのために投与すべき量を容易に決定することができることを理解するであろう。
更なる態様において、本発明はAAMPのアミノ末端領域に由来するポリペプチドP189をコードするDNAセグメントに関する。好適な態様において、このDNAセグメントはSEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列又はそのフラグメントを有する。更なる好適な態様において、このDNAセグメントはSEQ ID NO:5に示すヌクレオチド配列を有する。
別の態様において、本発明はAAMPのアミノ末端領域に由来するポリペプチドに関する。好適な態様において、このポリペプチドはP189であり、そしてSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む。別の好適な態様において、このポリペプチドはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有する。
更なる態様において、本発明は固相支持体に結合した上記のP189ポリペプチド又はそのフラグメントにも関する。
本発明の更なる態様は、ベクターと、ヒト細胞接着性ポリペプチドP189をコードするDNAセグメントとを含んで成る組換DNA分子に関する。好適な態様において、このDNAセグメントはSEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列を有する。更なる別の好適な態様において、このDNAセグメントはSEQ ID NO:5に示すヌクレオチド配列を有する。
別の態様において、本発明は上記の組換DNA分子を含み、そしてSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有する接着性ポリペプチドを発現できる細胞に関する。
更なる態様において、本発明は細胞培養物の中にAAMP,P189及びそのフラグメントより成る群から選ばれる有効な量の接着性ポリペプチドを導入することにより細胞間接着を助長する方法にも関連する。
別の態様において、本発明はAAMP,P189及びそのフラグメントより成る群から選ばれる接着性ポリペプチドにより支持体を処理することにより、支持体に対する細胞接着を助長する方法に関する。好適な態様において、この支持体は補てつ具を構成し、これにより前記の方法は補てつ具の許容性を助長する。当業者は任意の特定の処置プロトコールにとって投与すべき量が所望の細胞接着レベルに依存して容易に決定できることを理解するであろう。
更なる態様において、本発明はAAMP,P189及びそのフラグメントより成る群から選ばれる有効な量の接着性ポリペプチドを患者に投与することによりその患者における創傷治癒を助長する方法に関する。ここでも、当業者は任意の特定の処理プロトコールにとって投与すべき量が当業界に公知のその他のヘパリン結合性ペプチドと類似して、又はその他の当業界に公知の方法によって容易に決定できうることを理解するであろう。例えば、Furchtらの米国特許第5,081,031号、Tsilibaryらの米国特許第5,152,784号、Charonisの米国特許第5,120,828号を参照のこと。
更なる別の態様において、本発明はヘパリンに結合することのできる有効な量の接着性ポリペプチドをヘパリンを集中させることを所望する領域に投与することにより、組織の中でヘパリンを局部的に集中させるための方法に関連し、ここでこの接着性ポリペプチドはAAMP,P189及びそのフラグメントより成る群から選ばれる。好適な態様において、この方法はヘパリンを外来材料のまわりに集中するのに用いられ、これはその外来材料をAAMP,P189及びそのフラグメントより成る群から選ばれる接着性ポリペプチドでコートすることによる。当業者は、任意の特定の処置プロトコールのために投与すべき量が、当業者に公知のその他のヘパリン結合性ペプチドと類似に、又は当業者に公知のその他の方法によって容易に決定できることを理解するであろう。
本発明は以下の限定でない実施例の中で更に詳しく説明する。
実施例
以下のプロトコール及び実験の詳細が以降の実施例に引用されている。
細胞 正常ドナー由来のヒト末梢血液単核細胞(PBMC)をフィコール・ヒパク密度勾配遠心により分離した。休止CD4+Tリンパ球を次にAdvanced Magnetic Particles(Advanced Magnetic,Cambridge,MA)又はDynalbeads(Dynal Inc.,Fort Iee,NJ)(共にヤギ抗−マウスIgGに結合)による大まかな免疫磁性ネガティブ選別により獲得した。ネガティブ選別は記載の通りにして(Horgan,K.J.and Shaw,S.,Immunomagnetic negative selection of lymphocyte subsets in Coligan,J.E.et al.(Eds.)Current Protocols in Immunology,Wiley Interscience,New York(1991)p.7.4.1.)、抗−HLAクラスIImAb(IVA12),CD20 mAb(IF5),CD16 mAb(3G8)CD11b mAb(NIH11b-1),CD14 mAb(MMA),CD8 mAb(B9.8)及びグリコホリンに対するmAb(10F7)より成るmAbのカクテルを用いて行った。単離された細胞の純度は98%以上であった。選別したCD4+T細胞は、最適濃度(1/200の希釈率)のフィトヘマグルチニン(M形態)(PHA)(Gibco,Grand Island,NY)に対する増殖応答がないという基準に基づき単球を含まない(Davis,L.,and P.E.Lipsky(1986)J.Immunol.136:3588)。
T−細胞活性化アッセイ T−細胞活性化アッセイを標準の技術を利用して行った。簡単には、10×106の精製CD4+T−細胞を35mmの平底ウェルの中の培養培地〔RPMI 1640(Hanzleton Biologics Inc.Lenexa,KS):20mMのグルタミン(Hazleton)、10%の熱不活性化FCS(Biofluids,Rockville,MD)、100IU/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン添加〕の中で、刺激を与えずに、又はウェルに結合させておく抗体で刺激しながら、様々な時間にわたり培養した。T−細胞刺激条件は記載の通りである(van Seventer,G.A.ら(1991)Enr.J.Immunol.21:1711)。mAbを、PBSの中で希釈し、4℃で一夜インキュベートし、次いでPBSで洗うことにより、ウェルのプラスチック上に固定した。CD3 mAb OKT3及びCD2 mAb 95-5-49を全て3ml/ウェルの容量で、1μg及び10μg精製Ig/mlにおいてそれぞれ適用した。腹水に由来する精製イムノグロブリンとして下記のモノクローナル抗体を利用した:CD2 mAb(T11.1エピトープに特異的):95-5-49,IgG1(Dr.R.R.Quinones,George Washington University,Washington,D.C.の好意により提供されたハイブリドーマ);CD3 mAb OKT3,IgG2a(ATCC,Rockville,MD)。シクロヘキシミドは、存在しているとき、10μg/mlの濃度で使用した。
CD4+T細胞RNA調製 RNA細胞をManiatisのグアニジニウムイソチオシアネート−CsCl法により調製した(Maniatis,T.E.ら(1989)Molecular cloning:a labotatory manual.2nd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。各条件に関する10μgの全RNAをホルムアルデヒド0.8%アガロースゲルで分解し、ニトロセルロースに移し、そしてランダムプライミングにより調製した32P−ラベル化精製AAMP-1 cDNAインサートに42℃で移した。
抗体の調製 抗原としてヒトメラノーマA2058細胞系由来の完全細胞を利用するBalb/cマウスにおける適応受動転移技術(adaptive passive transfer technique)を、ミエローマ細胞とのハイブリドーマを作るのに用いた。1AA3クローンの選別は、ゼラチンコートフィルター及び様々な化学誘引物質(IV型コラーゲン、ラミニン、自己分泌運動性因子、フィブロネクチン及びインスリン様成長因子I)を用いる従来述べられた改良Boydenチャンバー(Stracke,M.L.ら(1987)Biochem.Biophys.Res.Comm.146,339-345)においてアッセイしたときのその運動の阻害に基づく。クローン1AA3を、1AA3AAクローンを生成するように限界希釈によって再クローニングした。
cDNAライブラリー及びスクリーニング ヒトメラノーマA2058 cDNA発現ライブラリーをClontech Laboratories,Inc.により、ラムダgt11ベクターの中で構築した。ファージにより感染したY1090エッシェリヒア・コリをプレート培養し、そして1AA3AA抗体によるイムノアッセイのためにニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schnell)の上にブロットした。反応性プラークをマウスIgGに特異的なペルオキシダーゼ複合抗体を用いて検出した。
ノーザンブロッティング メッセンジャーRNAに富むA2058ヒトメラノーマRNAの調製品をFast Trackキットバージョン2.1(Invitrogen(orp.)より単離した。全細胞質RNAを公開の方法に従い(Gough,N.M.(1988)Anal.Biochem.173,93-95)、氷上の4mlの細胞を0.8mlの低温溶液A(10mMのTris Cl、pH7.5、0.15MのNaCl、1.5mMのMgCl2及び0.65%のNonidet P-40)に懸濁することにより単離した。ボルテクシング及び遠心(800G、5min、4℃)を経て得られた上清液を0.8mlの溶液B(7Mの尿素、1%のSDS、0.35MのNaCl、10mMのEDTA、pH8.0及び10mMのTris Cl、pH7.5)及び1.6mlの溶液C(フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(50:50:1))と混合した。RNAを水性相の中で除去し、そしてエタノール沈殿させた。
RNAをホルムアルデヒドの中で変性させ、1%のアガロース/ホルムアルデヒドゲル(Sambrook,J.ら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)で分離し、そして一夜かけてSxS Nytran(Schleicher & Schnell)に転写し、そしてStratalinker装置(Stratagene)で紫外光によりそれに架橋させた。Random Primer Labeling System(Bethesda Research Laboratories,Life Technologies,Inc.)により(α−32P)dCTP(NEN Research Products)でラベルした1766bpのcDNAインサートをプローブとして用いた。
全A2058メラノーマ細胞質RNA及びメッセンジャーRNAに富むRNAのノーザンブロットをChurchのプロトコールにより行った(Church,G.and Gilbert,W.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81,1991)。このフィルターを65℃で20分、洗浄バッファー(1%の硫酸ドデシルナトリウム、40mMのNaH2PO4、1mMのEDTA)で3回洗い、そして−70℃でオートラジオグラフにかけた。
DNA配列決定 陽性ファージインサートを、配列決定のためのDNAの製造のためにBluescriptプラスミド(ファージミド)(Stratagene)にサブクローニングした。二本鎖cDNAをSequenase(United States Biochemical)により、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止法を用いて配列決定した。隣接のBluescriptベクター領域に特異的であるSKプライマー(Stratagene)により獲得した配列をまず決定した。その後の配列決定は、先に得られた両ストランドの完全な配列に基づく部位上で調製したプライマーを利用した。
配列データー分析 Gen Bank(Intelligenetics,Inc.)をそのプログラムでサーチし、そして配列の更なる分析を以下のコンピュータープログラム及びソフトウェアにより行った:RAOARGOS(トランスメンブラン領域の位置決定用プログラム)、PESTFIND(分解性タンパク質部位の位置決定用プログラム)、PROSITE(タンパク質中の共通配列の位置決定用プログラム)、AACLUST(類似の帯電アミノ酸の位置決定用プログラム)、KERMIT(通信ソフトウェア)、NALIGN(核酸整合用プログラム)、PALIGN(アミノ酸配列整合用プログラム)、REPEATS(アミノ酸配列中のリピート検出用プログラム)、SEQIN(配列についてのエディティングプログラム)、TRANSL(核酸配列からアミノ酸配列への翻訳用プログラム)及びDIAPRO(アミノ酸配列の二次構造決定用プログラム)。これらのプログラムをPC/Gene(Intelligenetics,Inc.)に含ませた。Protein Identification Resourca National Biomedical Research Foundation(NBRF)由来のNBRFタンパク質配列データーベースを、PQS,XQS及びNEWプログラムによりサーチし、そしてそのプログラムを配列分析のために用いた。ALIGNプログラムにおいて、配列をbias及びgapペナルティーを伴って対合させ、行列でスコアーにかけ、スクランブルにかけ、そして最良のランダムスコア及び標準偏差(SD)が得られるまで何回も再スコアにかけた。実際の配列についてのスコアを、ランダム平均スコアから逸脱するSD単位の数値として表わす(Dayhoff,M.O.ら(1983)Meth.Enzym.91,524-545)。我々の整合は全てMutation Data Matriy(250 PAMs),md.6のbias、6のgapペナルティー及び150ランダム・ランで行った(Williams,A.F.and Barclay,A.N.(1988)Ann.Rev.Immunol.6,381-405)。
実施例1
AAMP-1の特性決定
AAMP-1抗体 AAMP-1に対して生成したモノクローナル抗体はIgG-Iサブタイプに属する。それは低温沈殿し、そして凍結及び沈殿を必要とする精製法で失活する。最初の結果は、この抗体が、改良Boydenチャンバーで行った化学誘引物質アッセイにおいて、A2058メラノーマ細胞の接着及び運動を阻害することを示唆した。しかしながら、阻害は、あるかないかの状況で起き、信頼性のある投与応答曲線はなく、そして抗体の自己凝集による立体障害をこの時点では排除することはできなかった。
1AA3AA抗体により同定されるタンパク質の特性決定 A2058メラノーマ細胞表層免疫蛍光染色が1AA3AAにより認められた。これにより約95kDの分子量を有するA2058完全細胞リゼートイムノブロット上のタンパク質が同定され、それは還元により105kDに至る見かけ上の若干の増大を示した。
ベーターガラクトシダーゼ融合タンパク質はイムノブロット上の1AA3AA抗体により陽性染色を示した。推定AAMP-1タンパク質を以下に記載する。その分子量及びグリコシル化能力は上記の1AA3AAにより同定されたタンパク質と一致しなかった。
1AA3AA陽性cDNAクローンの単離 ファージプラークの一次スクリーニングはサイズにおいて類似する3つの陽性クローンをもたらし、1AA34A,1AA335A及びAAMP-1と命名した。それらは全てドットブロット上で互いとクロスハイブリダイズした。AAMP-1は若干大きく(10bp未満の相違)、そして配列決定のために選んだ。
A2058メラノーマ全細胞質RNA及びポリアデニル酸に富むRNAのノーサンブロット 3つの陽性クローンを全て全細胞質A2058 RNAのブロットをプローブするために用いたとき、それらは一本のバンドのみとハイブリダイズした。1.6kbにある一本のバンドが、図1に示すAAMP-1でプローブした全細胞質及びポリアデニル酸に富むA2058 RNAの両方のブロット上で認められた。
ヌクレオチド配列 AAMP-1 cDNAは1765bpを有し、配列の第二リーディングフレームにおいて認められる最長オープンリーディングフレーム(1278bp)をもつ(図1;SEQ ID NO:7)。ポリAテールを除くこの配列の67%が、それぞれが7以上のヌクレオチドを含むリピートを含んでいる。最大の直接リピートはヌクレオチド#200及び#1684にあるAGGAGGAAGAG(SEQ ID NO:8に示す)である。その配列はヌクレオチド#196及び#1427にある10員リピートのそれと重複する。他の10員直接リピートが位置#947及び#1507に認められ、そして第三の10員リピートが#1110及び#1170にある。複数のパリンドロームが配列の中にある。最大のパリンドロームGGGTTCTAGAACCC(SEQ ID NO:9に示す)がヌクレオチド#227に認められる。10員パリンドロームがヌクレオチド#1148及び#1341にも認められる。8員パリンドロームがヌクレオチド#227,#1118,#1514及び#1709に存在する。1765bpの配列の最後の25ヌクレオチドはポリアデニル酸化ヌクレオチドテールを含んで成り、そして通常ポリAテールの前にある共通配列AATAAAAがヌクレオチド#1722にある。
推定アミノ酸配列 AAMP-1 cDNAの中の1278bpのオープンリーディングフレームは、少なくとも45.7キロダルトンの分子量を有するタンパク質を予想させる。
この推定タンパク質は多重イムノグロブリン様ドメインを含み、それがイムノグロブリン(Ig)超科の構成員であることを示す。それは2つの潜在的なトランスメンブラン領域及び複数のセリン/スレオニンホスホリル化部位を含む。酸性アミノ末端領域も存在する。ヘパリン結合性部位がaa7〜12に存在する。この領域はP189及びそのフラグメントの両方に含まれている(SEQ ID NO:4及びSEQ ID NO:6のそれぞれを参照のこと)。
イムノグロブリン超科相同性 AAMPの配列のタンパク質データーバンクとの比較は、それが独特であり、且つイムノグロブリン様ドメインを含むことを示唆する。AAMPにおけるこのIgタイプドメインは公知の科の構成員の多重Igドメインと配列相同性を示す(Dayhoffら、Meth.Enzym.91:524-45(1983)のALIGNプログラムにおけるスコアにより、3.00S.D.以上と示唆)。全ての潜在的なIgドメインを包括するAAMP領域aa87−357は、NRBFプログラムCHOFASにおけるChou and Fasmanの方法(Advances in Enz.47,45(1978))を用い、二次構造としての推定ベータ−シート及びターンを含み、Igドメインの特徴的な二次構造(図1)と一致した(Williamsら、Ann.Rev.Immunol.6:381-405(1988);Williamsら、Immunoglobulin Genes(Honjo,T.,Alt,F.W.and Rabbitts,T.H.編)pp361-87,Academic Press Limited,San Diego,CA)。非重複性システインペアーのまわりに形成される4つの潜在的なIgドメインがこれらの推定から考えられるが、このアレンジメントはいくつかの隣り合うドメイン間にごく少数のアミノ酸残基しか許容しない。従って、隣り合うAAMPドメインが排除されるように、推定ドメインの間に短い距離しか許容しないようにして、Ig超科構成員との整合を行った。AAMPにおけるドメインのこのデザインは、最も多く考えられるIg超科対応物の数、並びにある種のタンパク質、例えばDCCタンパク質(Fearonら、Science 247:49-56(1990))、神経・グリアル細胞接着性分子(Burgoonら、J.Cell.Biol.112:1017-29(1991))及びNCAM(Cunringhamら、Science 236:799-806(1987))における多重ドメインとの有意義な整合を示した。別のシステインペアーにより規定される潜在的なドメインの別のデザインはより少ない対合を示した。
潜在的なトランスメンブラン領域 AAMPは、ROAARGOSプログラムPC/Gene(1991)Intelligenetics,Inc.,Release 6.5を用いるRao and Argosの方法(Raoら、Biochem.Biophys.Acta 869:197-214(1986))に従い、帯電残基を欠く一のトランスメンブラン領域及びアスパラギン酸を含む別の領域を有する。AAMPの帯電していない、且つより一層トランスメンブランらしい領域aa385−410もCD4のトランスメンブラン領域と整合する。
潜在的なホスホリル化部位 AAMP-1 TMRsのアミノ末端側上に、潜在的なカゼインキナーゼIIホスホリル化部位(S,T)−x−x−(E,D)の共通パターンを有する5つの部位がある。これらは位置#14,#133及び#319にあるセリン、並びに位置#120及び#176にあるスレオニンを含む(SEQ ID NO:7に示す)。
4つの潜在的なタンパク質キナーゼCホスホリル化部位も(S,T)−x−(R,K)の共通パターンと共に存在している。これらは、TMRのアミノ末端側の位置#249及び#302にある2個のスレオニン並びにTMRのカルボキシ末端側の位置#369にあるスレオニン及び位置#419にあるセリン(SEQ ID NO:7に示す)を含む。
実施例2
ペプチドの調製−AAMP配列のアミノ末端に由来するペプチドP189及びペプチドP189の変異体(この特異的なペプチド及び配列は以下の通りである:P189のP350−スクランブル配列(SEQ ID NO:10に示す)、P357-QQLQQMESESES(SEQ ID NO:11に示す)、P358-RRLRRMQSQSQS(SEQ ID NO:12に示す)、P359-RRGRRGESESES(SEQ ID NO:13に示す)、P360-RRLRRMEAEAEA(SEQ ID NO:14に示す)、P369-RLRRMESESE(SEQ ID NO:15に示す)をBiosearchモデル9600ペプチドシンセサイザーで、標準のMerrifield固相合成プロトコール及びt−ブトキシカルボニル試薬を用いて合成した。このペプチドを逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分析した。
細胞接着アッセイ−プレートにリンカーアームを介して付加されたAAMPペプチドに対するA2058ヒトメラノーマ細胞の特異的な接着はここに記載の変更を伴って公知の方法に従って実施した。ペプチドをまず50%のDMSO溶液の中に2mg/mlの濃度において、100℃で10分加熱しながら溶かし、そして12000gで1分遠心して任意の残留粒子を除去した。4.75mlにスルフォ−N−ヒドロキシスクシニミド溶液(184μg/ml)(Pierce)と組合せたペプチドアリコート0.25mlをCova Link(商標)96穴プレート(Nunc)に加えた。このプレートは、1014/cm2の密度でリンカーアームを介して、プレート表層より2nm上に付加されているアミノ基を伴って製造者から提供されたものである。50μlの最終容量のペプチド−スルホ−N−ヒドロキシスクシニミド溶液を有する適当な希釈物を各アッセイのためにデュプリケートで各ペプチドについて用意した。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(1.23mg/ml)(Sigma)を各ウェルに50μlのアリコートとして加えて室温で2時間インキュベートし、細胞表層に対する結合にとって有用な完全配列とした。改良Cova Link(商標)バッファー(111.6g/lのNaCl、10.0g/lのMgSO4、0.05%のTween 20)による3回の洗浄でこれらの試薬を除去した。これらのプレートを3日間洗浄液に入れたままとし、次いでCova Linkバッファー含有PBSで4回洗った。ヘパリン結合阻害アッセイのため、第4回目の洗浄液には表示濃度のヘパリンナトリウム(Lyphomed)を含ませ、それをプレートの上に室温で1時間放置しておいた。これらのアッセイにおいて、プレートを再び2回洗い、未結合のヘパリンを除去し、次いで細胞を加えた(100,000細胞/ウェル)。37℃で1時間のインキュベーションの後、未結合の細胞をPBSで洗い流し、そして付加細胞をDiff Quik(商標)(Baxter Healthcare)で染色した。染料を10%のメタノール及び5%の酢酸溶液で溶出させ、そして光度計で620nmにおいて測定した。620nmで光学的に測定した細胞色素保持力は得られる吸収の範囲にわたり、結合した細胞数に相関した(目視計測数)。1O.D単位は約100,000個付加したメラノーマ細胞(101,679±11,800S.D.実際の細胞計測数)を表わす。Student t検定を、本発明のペプチドとコントロールペプチドとの細胞結合結果の平均値間の相違の検定のために用いた。
Cova Link(商標)プレート上の細胞結合能の研究の結果をP189、及びP189配列の変異体を含むペプチドについて獲得した。ペプチド189、及びその配列変異体であってArg Arg X Arg Arg Xモチーフ(ここでX=Leu,Met又はGly)を含むものは、7.2μMにおいて、全て同等の細胞結合能結果を示した:P189=0.708±0.104S.D.,P358=0.710±0.013S.D.,P359=0.670±0.046S.D.,P360=0.645±0.60S.D.の、接着性細胞色素保持力の単位O.D.)。各O.D単位は、約100,000個の付加した細胞を表わす。Arg Arg X Arg Arg Xモチーフを欠くペプチドは有意に低い細胞結合特性を示した(図5)。0.1%のBSAを有する半強度(half-strength)DMEM(PBSで希釈)において、P189の結合能とP350のそれ(P189のスクランブルバージョン)との間の相違は、P189の結合能がP350のそれの2.06倍となるほど、上昇した。ヘパリンは濃度が上昇するとP189に対する細胞結合能を暫進的に阻害した(図5に示す通り)。
50U/mlのヘパリンと事前にインキュベートしたP189コートプレートに対する細胞結合能は、ヘパリンに曝露していないP189プレートに対する細胞結合能を49%にまで下げた。100U/mlのヘパリンにより、細胞結合能は更に低下し、そしてスクランブルペプチド(P350)に対する細胞結合能の30%未満であった。
細胞凝集アッセイ−組織培養チャンバースライド(8チャンバーPermanox(商標)スライド、Lab Tek(商標)、Nunc Inc.)にマウスのIV型コラーゲン(Collaborative Biomedical products)をコートした(1μg/ml)。室温で1時間後にIV型コラーゲン溶液をアスピレート除去し、そしてそのスライドを風乾した。0.1%のBSA-DEME(50万個/ml)中のA2058ヒトメラノーマ細胞の単一細胞懸濁物をP189及び変異体のペプチドと個別にロッカー上で室温で1時間インキュベートした。細胞懸濁物のアリコート(250μl)を次いでスライドチャンバーの中に、各データー点についてデュプリケートで分注した。そのスライドをペトリ皿の中で37℃で1時間インキュベートし、そしてPBSで優しく洗い、そしてDiff Quick(商標)で染色した。大きな細胞群の数(>10細胞より成る丸い密集した細胞)について顕微鏡で評価した。P189(200μg/ml)により誘導される細胞凝集に対する添加物の効果をチェックするために更なるアッセイを行った。これらにはヘパリンナトリウム(5〜25U/ml)、オキシム酸ナトリウム(0.03〜0.1M)、シクロヘキシミド(1〜10μg/ml)(Sigma)、メチル−アルファ−D−マンノピラノシド(0.06M)(Calbiochem Corp.)、D(+)−ガラクトース、N−アセチル−D−グルコサミン(0.06M)(Sigma Chemical)が含まれる。
P189は200μg/mlで溶液の中で凝集体を形成し、これもバックグランドより高いレベルで(9.1±1.3X;2アッセイにおいて)トリチウム化ヘパリン(0.05U/ml)と結合し、そして等量の未ラベルヘパリンがあるとその結合能は55%下がる。バックグランドを超える平均結合能は競合なしでは5567±189cpm/μmoleタンパク質であり、そして未ラベルのヘパリンの存在下では(1:1の競合)2495±320cpm/μmoleである(図4)。P189はA2058メラノーマ細胞も凝集させ、10以上の細胞より成る数多くの密集群をもたらした。P350(P189のスクランブルバージョン)はA2058メラノーマ細胞凝集に対する影響を示さず、そしてヘパリンは5U/mlで、P189の細胞凝集効果を完全に失わせた。変異配列を有するその他のペプチド(P357−P360)は細胞凝集についてはるかに小さい効果を示した(図6)。Arg Arg Leu Arg Arg Met配列モチーフを有する2種のペプチド(P358及びP360)は、このモチーフを欠いている他の変異体よりも多くの細胞を結合させるが、しかしP189ほど細胞を結合させなかった。P189により生ずる細胞凝集は解糖系及びタンパク質合成のインヒビターによる、又はメチルマンノピラノシド、ガラクトース、N−アセチル−グルコサミン及びラクトースの如くの糖による細胞の処理によってなくならなかった。
H 3 −ヘパリン結合アッセイ トリチウム化ヘパリン(ヘパリンナトリウム塩、〔3H(G)〕-,NEN DuPone)と未ラベルヘパリンとの競合を利用するヘパリン結合アッセイを、組織AAMP、可溶化P189(Cova Link(商標)プレート上に固定)及び凝集P189について、0.1%のBSA-DMEM溶液中で行った。細菌リゼート中の組換AAMP及び等量の牛血清アルブミンをゲル精製のために電気泳動し、そしてImmobilon-P(商標)にブロットした。これらのブロットをトリチウム化ヘパリン2.5U/ml(10.7uCi/ml)のみと及び上昇していく量の未ラベルヘパリン(0.125〜0.25U/ml)と、室温で3時間競合のためにインキュベートした。3回の洗浄後、AAMP組換タンパク質及びBSAのバンド(各ヘパリン濃度についてトリプリケート)を、ブロットに付したImmobilon-Pストリップから切り出し、シンチレーションバイアルの中に入れ、そして比較のためにカウントした。可溶化P189(6.25μg/ml)を上記の通りにしてCova Link(商標)プレートに固定化し、そしてトリチウム化ヘパリン50U/ml(0.213μCi/ml)のみと、及び上昇する量の未ラベルヘパリン(50〜500U/ml)と、室温で1時間競合のためにインキュベートした。3回の洗浄後、プレートウェルを、各ヘパリン濃度についてデュプリケート又はトリプリケートにて、シンチレーションバイアルの中に入れ、そしてカウントした。別のアッセイにおいて、P189の凝集体(0.1%のBSA-DMEM中で200μg/ml)を、ロッカー上で1時間室温で、トリチウム化ヘパリン(0.05U/ml)のみと、及び上昇していく量の未ラベルヘパリン(0.05〜5U/ml)と、競合のためにインキュベートした。遠心の後、その沈殿物を0.1%のBSA-DMEMで洗い、再び遠心し、次いでカウントのためにシンチレーションバイアルに移した。未ラベルヘパリンと競合させたAAMP組換タンパク質によるアッセイについてのバックグランドcpm/μmoleタンパク質レベルを、ラベルしたヘパリンのないAAMP組換タンパク質の平均バックグランドcpm/μmoleタンパク質に標準化した。
AAMP及びP189のヘパリン結合 細胞リゼートからゲル精製し、そしてImmobilon-P(商標)にブロットした組換AAMPは、同一の条件下でブロットさせた等量の牛血清アルブミンと比較してヘパリンと結合する。AAMPのトリチウム化ヘパリン(2.5U/ml)との結合能は等量の未ラベルヘパリンにより競合的に阻害されうる(図4)。AAMP組換タンパク質によるトリチウム化ヘパリンの結合能はμmoleのタンパク質当りバックグランドを超えるcpmとして、競合なしでの結合能(9134±2699 S.D.cpm/μmoleタンパク質、6アッセイ)及び等量の低温ヘパリンによる競合を伴う結合能(2139cpm±762S.D.cpm/μmoleタンパク質、3アッセイ)について表わした。
Cova Link(商標)プレートに共有結合した可溶化P189(6.25μg/ml)は、表示の通り2アッセイにおいてバックグランドを超えて(3.0±0.6倍)ヘパリンと結合し、そしてトリチウム化ヘパリン(50U/ml)結合能は等量の未ラベルヘパリンにより競合させたとき低まる(図4)。最良のアッセイにおいて、競合なしでのトリチウム化ヘパリン結合能は6035cpm/μmoleのタンパク質であり、等量の未ラベルヘパリンが伴うと1423cpm/μmoleタンパク質に至るまで競合した。
AAMP及びそのフラグメントは細胞間、細胞・支持体間接着を助長する能力を発揮する。これらのペプチドはヘパリン結合能も発揮する。かかる特性は創傷治癒、補てつの許容、及び組織の中でのヘパリンの集中、並びに悪性細胞の転移及び侵入の阻害において有用であることが実証された。
ここで挙げた全ての公開物、特許明細書及び特許は引用することで本明細書に組入れる。
本発明の理解のし易さのために詳しく本発明を説明してきたが、本発明にはその範囲を逸脱することなく様々な改良を施すことができうることを当業者は理解するであろう。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:Beckner,Marie E.
Liotta,Lance A.
Krutzsch,Henry C.
(ii)発明の名称:ヒト細胞接着性タンパク質AAMP-1及びその利用
(iii)配列の数:15
(iv)連絡先:
(A)あて先:Townsend and Townsend Khourie and Crew
(B)通り:379 Lytton Avenue
(C)市:Palo Alto
(D)州:California
(E)国:US
(F)郵便番号:94301
(v)コンピューター読取フォーム:
(A)媒体タイプ:Floppy disk
(B)コンピューター:IBM PC compatible
(C)作動システム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0,Version #1.25
(vi)現出願データー:
(A)出願番号:US 08/083,945
(B)出願日:1993年6月25日
(C)分類:
(vii)先の出願のデーター:
(A)出願番号:US 07/827,043
(B)出願日:1992年1月29日
(viii)代理人/代理店の情報:
(A)名称:Dow,Karen B.
(B)登録番号:29,684
(C)参照/事件番号:15280-156-1
(ix)通信情報:
(A)電話:(415)326-2400
(B)ファックス:(415)326-2422
(2)SEQ ID NO:1についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1765塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(iv)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:34..1278
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:1:
(2)SEQ ID NO:2についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:415アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:2:
(2)SEQ ID NO:3についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:DNA(ゲノム)
(iv)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..36
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:3:
(2)SEQ ID NO:4についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:4:
(2)SEQ ID NO:5についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:DNA(ゲノム)
(iv)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..18
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:5:
(2)SEQ ID NO:6についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:6:
(2)SEQ ID NO:7についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:426アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:7:
(2)SEQ ID NO:8についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:DNA(ゲノム)
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:8:
(2)SEQ ID NO:9についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:14塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子のタイプ:DNA(ゲノム)
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:9:
(2)SEQ ID NO:10についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:10:
(2)SEQ ID NO:11についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:11:
(2)SEQ ID NO:12についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:12:
(2)SEQ ID NO:13についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:13:
(2)SEQ ID NO:14についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:12アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:14:
(2)SEQ ID NO:15についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)分子のタイプ:ペプチド
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:15:
Claims (11)
- 通常一体化している夾雑物を実質的に含まず、SEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列を含んで成る、ヘパリン結合性ポリペプチドをコードする単離されたDNAセグメント。
- SEQ ID NO:1に示すヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:1に示すヌクレオチド配列において1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入されたヌクレオチド配列を含んで成る、請求項1記載のDNAセグメント。
- SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、請求項1記載のDNAセグメント。
- SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、請求項1記載のDNAセグメント。
- 通常一体化している夾雑物を実質的に含まず、SEQ ID NO:1に示すヌクレオチド配列又はそのうちの少なくとも18個の連続ヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたDNAセグメント。
- SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含んで成る、実質的に純粋なヘパリン結合性ポリペプチド。
- SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列から成る、請求項6記載のヘパリン結合性ポリペプチド。
- SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含んで成る、請求項6記載のヘパリン結合性ポリペプチド。
- 請求項1記載のDNAセグメントを含んで成る組換DNA分子。
- 請求項9記載の組換DNA分子を含み、且つヘパリン結合性ポリペプチドを発現できる細胞。
- 前記ヘパリン結合性ポリペプチドがSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含んで成る、請求項10記載の細胞。
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