JP3699756B2

JP3699756B2 - Method for measuring hydrogen peroxide, hydrogen peroxide measuring sensor using the method, and method for producing the same

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Publication number: JP3699756B2
Application number: JP28160395A
Authority: JP
Inventors: 十四夫松田; 晴樹白石; 真三吉田
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2015-10-30
Also published as: JPH09127053A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液または分散液、例えば血液、尿等の生体試料や食品試料等の液体試料中の成分の測定に使用できる過酸化水素の濃度の測定方法、およびそれに使用する過酸化水素測定センサーとその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
溶液中のある特定の物質（被測定物質）の量（従って、その濃度）を測定する方法として、試薬や酵素等を用いて、それと被測定物質との反応に関与する過酸化水素の量を測定することによって、間接的に被測定物質の量（従って、その濃度）を測定する方法が広く知られている。例えば、下記の式（１）の反応を触媒する酸化酵素を用いて、基質（Ｓ）を酸化し、生成した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量を測定することにより、基質（Ｓ）の量を測定することができる。式（１）中、ＰはＳからの生成物である。
酵素
Ｓ＋Ｏ₂ → Ｐ＋Ｈ₂Ｏ₂ （１）
【０００３】
また、生成する過酸化水素の量の測定方法としては、過酸化水素測定センサーを用いて過酸化水素を酸化し、その時の酸化電流値を測定する、電気化学的方法が知られている。
従来の過酸化水素測定センサーは、銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）の参照電極に対して０．６Ｖ程度の一定の電位を、白金よりなる測定電極（アノード）に印加し、過酸化水素を測定電極で酸化して、得られる酸化電流を測定している。しかし、この測定方法では、過酸化水素を酸化することができる電位を印加するため、その印加電位以下の電位で測定電極上で酸化される物質、従って、過酸化水素の酸化電位以下の電位で測定電極上で酸化される物質、例えばアスコルビン酸や尿酸等の物質が被測定液体試料中に共存している場合、これら共存物質も同時に酸化され、その酸化電流により、測定される過酸化水素量に誤差が含まれるという問題点がある。
【０００４】
前記問題点を回避する方法として、例えば、特公平３−３８５４０号公報に開示されているように、過酸化水素に対して選択性の透過膜で測定電極を被覆し、過酸化水素以外の測定電極により酸化され得る物質が測定電極に到達することを防ぎ、共存物質の酸化電流による妨害を防ぐことが可能である。しかしながら、このような過酸化水素選択性透過膜で測定電極を被覆する方法では、その膜がある種の抵抗層の作用をするので過酸化水素に対する電極の感度低下が起こるという問題点がある。
また、従来の過酸化水素測定センサーは、電極材料に高価な白金を使用するので、電極の製造コストが高くなる問題点もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、これらの問題点を解決し、過酸化水素の酸化電位以下の電位で測定電極上で酸化される他の物質が被測定液体試料中に共存していても、それら共存物質の妨害を受けることなく、過酸化水素に対しても感度低下を起こすことなく高感度であり、また、精度良く過酸化水素を測定できる、被測定液体試料中の過酸化水素の量の測定方法、その測定方法に用いる過酸化水素測定センサー、およびその過酸化水素測定センサーの安価で簡易な製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の要旨において、上記課題は、
過酸化水素と測定電極との間で電子伝達メディエータとして作用する物質を使用する、液体試料中の過酸化水素の濃度を測定する方法であって、
液体試料中の過酸化水素により電子伝達メディエータを酸化して、
測定電極により酸化された電子伝達メディエータを電気化学的に還元してその際に得られる還元電流または電気量を測定する
ことを特徴とする過酸化水素濃度の測定方法により解決できることが見いだされた。
【０００７】
本明細書において、「電気化学的に還元してその際に得られる還元電流または電気量を測定する」こと自体は当業者に周知の工程であり、基本的には、物質（本発明においては、酸化された電子伝達メディエータ）の電気化学的還元に際して生成する還元電流または電気量が存在する物質の量に依存することを利用して、試料中のその物質の存在量を測定する方法を意味する。このような電気化学的測定方法は、例えばポテンシャルステップクロノアンペロメトリーやダブルポテンシャルステップクロノアンペロメトリー等のクロノアンペロメトリー、パルスアンペロメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、デファレンシャルパルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、カソーディクボルタンメトリー、ポーラログラフィー、ポテンシャルステップクロノクーロメトリーやダブルポテンシャルステップクロノクーロメトリー等のクロノクーロメトリー等の方法を用いることができる。
【０００８】
尚、本発明の方法では、電気化学的測定方法により測定の直接の対象となる物質は、過酸化水素自体ではなく、液体試料中に存在する過酸化水素により酸化された電子伝達メディエータである。この酸化された電子伝達メディエータの量は、測定すべき液体試料中の過酸化水素の濃度と一定の依存関係（通常、過酸化水素の濃度が高い程、酸化された電子伝達メディエータの濃度が高くなる傾向にある）を有する。従って、酸化された電子伝達メディエータを還元することができる電位を測定電極に印加してその際に得られる還元電流または電気量を測定することによって、酸化された電子伝達メディエータの量が判り、上記依存関係に基づいて液体試料中の過酸化水素濃度を求めることができる。
【０００９】
具体的には、本発明の方法に基づく過酸化水素濃度の測定に際して、測定すべき液体試料と同じ系であって、過酸化水素濃度が既知の試料（通常、過酸化水素濃度が異なる複数の試料）を用いて、過酸化水素濃度と電子伝達メディエータの酸化および電気化学的な還元により得られる電流との関係（いわゆる検量線であり、この関係は、電子伝達メディエータを媒介とする過酸化水素濃度と還元電流との関係である）を予め求めておく。次に、濃度が未知の試料についても同様に得られる還元電流または電気量を測定する。そして、この測定電流または電気量と上記関係から、測定すべき試料中の過酸化水素濃度を求めることができる。最終的に過酸化水素濃度の値を得るには、検量線のグラフから読み取ることによりマニュアル的に行うこともでき、また、マイコンを用いる一般的なデータ処理法により実施することもできる。
【００１０】
本明細書において、液体試料とは、測定すべき物質、例えば過酸化水素を含む液体や酵素反応の基質となる物質を含む試料やそれらの希釈液であり、これは、溶液であっても、あるいは分散液であってもよい。具体的には、血液、尿、血清、血漿、漂白剤、殺菌剤、洗浄剤、果汁、清涼飲料水、それらの希釈液などを例示できる。
従って、本発明において、「電子伝達メディエータ」（以下、単に「メディエータ」とも呼ぶ）とは、過酸化水素により化学的に酸化され、かつ、電極において還元される物質のことを意味する。
【００１１】
本発明の方法では、還元電流を測定するので、過酸化水素の酸化電位以下の電位で測定電極にて酸化される物質が液体試料中に共存していても、これら共存物質の酸化電流による妨害を受けることなく、また、過酸化水素選択性膜で測定電極を被覆する必要がないため、その膜による過酸化水素に対する感度低下を起こすことなく、高感度で、精度良く過酸化水素を測定することができる。
特に、生体に由来する液体試料は、電気化学的に酸化される物質を比較的多く含み、他方、電気化学的に還元される物質をそれほど含まないので、還元電流を測定する本発明の方法には好都合である。
【００１２】
尚、本発明の方法において還元電流または電気量を測定する際には、液体試料液中に含まれている酸素が還元され、その還元電流または電気量の影響を受けることが有り得る。そのような場合、測定電極による酸素の還元反応の起こらない範囲の電位にて還元電流または電気量を測定すれば、この問題点を回避できる。液体試料中の酸素を測定する場合には、標準水素電極に対して−０．４Ｖより小さい電位が用いられている現状を考慮すると、標準水素電極に対する電位として−０．４Ｖより高い（即ち、−０．４Ｖより正側）範囲の電位、例えば、−０．２〜＋０．５Ｖ、好ましくは０〜＋０．４Ｖ、より好ましくは＋０．２〜＋０．３Ｖの範囲の電位で還元電流または電気量を測定するのが好ましい。
【００１３】
例えば、２５℃にて参照電極に銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）を用いた時には、銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）の電位は、標準水素電極に対して＋０．１９９Ｖであるので、銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）の参照電極に対して−０．５９９Ｖ以上、例えば、−０．３９９〜＋０．３０１Ｖ、好ましくは−０．１９９〜＋０．２０１Ｖ、より好ましくは＋０．００１〜＋０．１０１Ｖの範囲の電位で還元電流または電気量を測定するのが望ましい。後述する実施例を参照すると、銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）の参照電極に対して＋０．０２Ｖの電位で還元電流または電気量を測定すれば十分である。
【００１４】
また、２５℃にて参照電極に飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を用いた時には、ＳＣＥの電位は標準水素電極に対して＋０．２４１２Ｖであるので、ＳＣＥの参照電極に対して−０．６４１２Ｖ以上、例えば−０．４４１２〜＋０．２５８８Ｖ、好ましくは−０．２４１２〜＋０．１５８８Ｖ、より好ましくは−０．０４１２〜＋０．０５８８Ｖの範囲の電位で、還元電流または電気量を測定するのが望ましい。後述する実施例を参照すると、ＳＣＥの参照電極に対して０Ｖの電位で還元電流または電気量を測定すれば十分である。
【００１５】
本発明に用いられるメディエータとしては、過酸化水素により化学的に酸化され、測定電極において、還元できる物質であれば特に制限はない。しかしながら、銅化合物がメディエータとして適していることが見いだされた。種々の銅化合物を検討した結果、中でも、プリン誘導体と銅の錯体またはピリミジン誘導体と銅の錯体が、過酸化水素との反応性および電極反応の可逆性が良く、本発明のメディエータとしては特に好ましい。とりわけ、銅とアデニン誘導体の錯体または銅とグアニン誘導体の錯体は、安定性も顕著に良く、メディエータとして特に適していることも見い出された。
【００１６】
これらのメディエータは、単独でも、あるいは２以上の混合物の形態でも使用することも可能である。
本発明において、プリン誘導体としては、アデニン、グアニン、尿酸、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどを例示できるが、銅と錯体を形成し、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用する物質となるプリン誘導体であれば、特に限定されることはない。
【００１７】
本発明において、ピリミジン誘導体としては、シトシン、ウラシル、チミン、５−メチルシトシン、オキシメチルシトシン、ピリミジン、ピリミジンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオチドなどを例示できるが、銅と錯体を形成し、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用する物質となるピリミジン誘導体であれば、特に限定されることはない。
【００１８】
本発明において、アデニン誘導体としては、７−メチルアデニン、９−メチルアデニン、３−メチルアデニン、アデニンなどを例示できるが、銅と錯体を形成し、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用する物質となるアデニン誘導体であれば、特に限定されることはない。
本発明において、グアニン誘導体としては、７−メチルグアニン、９−メチルグアニン、３−メチルグアニンなどを例示できるが、銅と錯体を形成し、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用する物質となるグアニン誘導体であれば、特に限定されることはない。
【００１９】
上述の銅との錯体に加えて、本発明においてメディエータとして使用できる銅化合物としては、テトラキス（アセトニトリル）銅ヘキサフルオロリン酸塩、テトラキス（アセトニトリル）銅過塩素酸塩、ジプロペニル銅酸リチウム、銅ｔ−ブチルアセチリド、メチルビス（トリフェニルホスフィン）銅、メチル（２，２’−ビピリジン）銅、ビス（２，２’−ビピリジン）銅過塩素酸塩、メシチル銅、テトラキス（トリメチルシリルメチル）四銅、テトラクロロテトラキス（トリフェニルホスフィン）四銅、ヒドリド（トリフェニルホスフィン）銅、ニトラトビス（トリフェニルホスフィン）銅、テトラヒドロホウ酸ビス（トリフェニルホスフィン）銅、シクロペンタジエニル（トリエチルホスフィン）銅、シクロペンタジエニル（トリフェニルホスフィン）銅、ペンタメチルシクロペンタジエニル（トリフェニルホスフィン）銅、シクロペンタジエニル（イソシアン化ｔ−ブチル）銅、ビス｛ビス（トリメチルシリル）アセチレン｝ジクロロ二銅、（シクロペンタジエニル）｛ビス（トリメチルシリル）アセチレン｝銅、カルボニル｛ヒドロトリス（ピラゾリル）ホウ酸｝銅、カルボニル（ジエチレントリアミン）銅テトラフェニルホウ酸塩、（エチレン）（ジ−２−ピリジルアミン）銅過塩素酸塩、ビス（１，５−シクロオクタジエン）銅過塩素酸塩、ジクロロ（１，３−ブタジエン）二銅、ビス（１−メチルピラゾール）銅テトラフルオロホウ塩、テトラキス（ピリジン）銅過塩素酸塩、ペンタクロロ銅酸ヘキサアンミンクロム、ヘキサニトロ銅酸鉛カリウム、ジカルボナト銅酸ナトリウム三水和物、ビスオキサラト銅酸カリウム二水和物、トリス（μ−イソチオシアナト）ジアンミン銅銀、テトラアンミン銅硫酸塩一水和物、テトラアンミン銅硝酸塩、トリス（エチレンジアミン）銅硫酸塩、トリス（エチレンジアミン）銅硝酸塩二水和物、ビス（エチレンジアミン）銅硝酸塩二水和物、ビス（エチレンジアミン）銅硫酸塩二水和物、塩化ビス（エチレンジアミン）銅二水和物、エチレンジアミンアクア銅硫酸塩一水和物、テトラキス（イミダゾール）銅過塩素酸塩、テトラキス（イミダゾール）銅硫酸塩、テトラキス（ピリジン）銅硝酸塩、ヘキサキス（ピリジンＮ−オキシド）銅過塩素酸塩、テトラキス（ピリジンＮ−オキシド）銅過塩素酸塩、ジクロロビス（ピリジンＮ−オキシド）銅、テトラキス（トリメチルホスフィンオキシド）銅過塩素酸塩、ジクロロビス（トリフェニルホスフィンオキシド）銅等の銅錯体や、フッ化銅、フッ化銅二水和物、塩化銅、塩化銅二水和物、塩素酸銅六水和物、過塩素酸銅六水和物、臭化銅、ヨウ化銅、酸化銅、水酸化銅、硫化銅、硫酸銅、硫酸銅五水和物、セレン化銅、セレン化銅五水和物、アジ化銅、硝酸銅三水和物、リン化銅、リン酸銅三水和物、ヒ化銅、ヒ酸銅四水和物、炭酸銅、炭酸二水酸化二銅、シアン化銅、チオシアン酸銅、ヘキサフルオロケイ酸銅四水和物、テトラフルオロホウ酸銅四水和物、テトラクロロ銅酸アンモニウム、酢酸銅、酢酸銅一水和物、シュウ酸銅一水和物、ビス（オキサラト）銅酸カリウム二水和物、ビス（２，４−ペンタンジオナト）銅、ビス（グリシナト）銅一水和物、テトラアンミン銅硫酸塩一水和物、ビス（エチレンジアミン）銅硫酸塩二水和物、ヨード（ピリジン）銅、クロロトリス（トリフェニルホスフィン）銅、テトラシアノ銅酸カリウム、ジメチル銅酸リチウム、フェニル銅、（フェニルエチニル）銅、などを例示できるが、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用する銅化合物であれば、特に限定されることはない。
【００２０】
メディエータは、測定電極により電気的に還元され得る位置に存在する必要がある。より好ましい態様では、メディエータは測定電極に実質的に隣接しているのが好ましい。本発明の方法は、後述する本発明の過酸化水素センサーを既存の電気化学的測定システムに組み込んで、センサーを測定すべき液体試料に浸けることにより実施するのが好ましい。メディエータが測定電極に隣接して配置されることにより、従来技術のセンサーのように過酸化水素に対して抵抗となる層が実質的に存在しないので、センサーの測定感度および精度が向上する。
【００２１】
本発明の測定方法は、過酸化水素の酸化電流を測定して直接的に過酸化水素の量を求めるのではなく、メディエータを介在させることによって酸化されたメディエータの還元電流を電気化学的に測定する（従って、間接的に過酸化水素の量を求める）ことに特徴があり、この方法の実施に当たって必要となるその他の技術的事項（例えばセンサーを除く電気化学的方法による測定システム、測定条件等）は、当業者に知られた事項であり、本明細書においては省略する。
第２の要旨において、本発明は、上記第１の要旨の過酸化水素の測定方法に使用する、メディエータが測定電極に隣接して配置されている過酸化水素測定センサーを提供する。
【００２２】
本発明のセンサーにおいて、測定電極の電極材料として使用する材料は、電子伝導性物質から形成された集電性材料であれば特に制限はない。具体的には、カーボン材料、白金、金、パラジウム、オスミウム、銀、イリジウム等を使用できる。種々の材料を検討した結果、カーボン材料が、安価であり、また、電位窓が広く、更に、化学的にも安定であるので、本発明の過酸化水素測定センサーの電極材料としては、カーボン材料が特に好ましいことが見い出された。
【００２３】
使用できるカーボン材料は、特に限定されるものではなく、従来からカーボン電極において使用されているものであればよい。例えば、グラファイト、パイロリティクグラファイト（熱分解黒鉛）、グラッシーカーボン、カーボンペースト、カーボンファイバーを使用できる。
【００２４】
メディエータは、多孔性膜に担持されるのが好ましく、この多孔性膜が電極に隣接して配置され、その結果、メディエータが測定電極に隣接して配置される。本発明のセンサーに用いられる多孔性膜としては、メディエータを担持でき、メディエータと過酸化水素との反応を阻害せず、また、測定電極とメディエータとの電気化学的還元を阻害しない微細孔を有する膜であれば特に制限はない。通常、孔径０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜１０μｍの微細孔を有する膜であることが望ましい。後述するように、メディエータはこの多孔膜の主として微細孔内および露出表面に担持（例えば吸着）される。
【００２５】
膜の厚さは、メディエータが過酸化水素により酸化され、また、還元されるために測定電極に実質的に隣接することが望ましい点を考慮すると、使用に際して強度的に問題が生じない範囲で薄いのが好ましく、例えば、１〜１０００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍ程度の厚さの膜を使用するのが好ましい。
【００２６】
尚、本発明において、「メディエータが測定電極に隣接して配置される」における「隣接」とは、メディエータが測定電極に直接的に接触している状態および還元電流を測定できる範囲内の距離で測定電極から離れている状態の双方またはいずれかの状態を含む。この接触状態においては、少なくとも一部分のメディエータが電極に接触していれば十分であり、全てのメディエータが測定電極に接触する必要は必ずしもない。また、この離れた状態においては、少なくとも一部分のメディエータが測定電極から離れていれば十分であり、全てのメディエータが測定電極から離れている必要はなく、メディエータの還元電流を測定できる状態であればよい。従って、メディエータの一部分が測定電極と接触し（即ち、測定電極により担持され）、残りのメディエータが測定電極から離れている態様も本願発明における「メディエータが測定電極に隣接して配置される」状態に含まれる。
【００２７】
従って、多孔性膜を測定電極上に配置した場合、測定電極側と反対側の主表面および膜の孔内に担持されているメディエータは測定電極には接触していないが、この場合であっても、還元電流を測定できる限り、本発明では、メディエータが測定電極に隣接して配置されている状態に含まれる。別法では、メディエータを測定電極に直接的に担持して使用することができる。
【００２８】
種々の材質の多孔性膜を検討した結果、本発明のセンサーに使用する多孔性膜の材質としては、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等の高分子素材が適していた。
【００２９】
１つの好ましい態様の本発明の過酸化水素測定センサーを、図１に模式的に断面図にて示す。
本発明のセンサー１０は、銅リード線１２が接続されたカーボン電極１４をガラス管１６内に有して成り、カーボン電極１４の露出面に隣接してメディエータを担持した多孔性膜１８が配置されている。この多孔性膜１８は、いずれかの適当な手段、例えば弾性材料（例えばテフロン材料）の環状キャップ２０によってガラス管１６の端部にて電極１４に隣接した状態で保持されている。
【００３０】
図示した態様では、判り易くするために、電極１４と多孔性膜１８との間、また、ガラス管１６と多孔性膜１８との間に空隙が存在するように描いているが、これらの空隙は実際には実質的に存在しない。
図示した態様からも明らかなように、本発明に基づけば、過酸化水素測定センサーの構造を非常に簡単なものにすることができ、しかも、測定に際して、メディエータは液体試料に接触し、また、メディエータは測定電極に隣接しているので、従来技術のセンサーの膜の存在による問題点は解決される。
【００３１】
第３の要旨において、本発明は、第２の要旨の過酸化水素測定センサーの製造方法であって、メディエータを多孔性膜に担持させ、この多孔性膜を測定電極に隣接して配置して、それによって、センサーの使用に際して、測定電極が過酸化水素により酸化されたメディエータを電気化学的に還元できるようにすることを特徴とする過酸化水素測定センサー、特に精度および安定性の良い過酸化水素測定センサーの製造方法を提供する。
【００３２】
メディエータを多孔性膜に担持させるには、いずれの適当な方法を用いてもよい。特に好ましい方法では、メディエータを含む溶液または分散液に多孔性膜を浸漬し、必要に応じて洗浄し、その後、膜を乾燥するか、メディエータを含む溶液または分散液を多孔性膜に塗布もしくは滴下し、その後、膜を乾燥することにより、メディエータを多孔性膜の主として微細孔内およびその露出表面に担持させる、即ち、メディエータを多孔性膜に結合、例えば吸着させる。
【００３３】
メディエータを含む溶液または分散液に使用する溶媒は、メディエータを溶解または均一に分散できるのであれば特に限定されないが、例として、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトンを挙げることができる。また、メディエータを含む溶液または分散液中のメディエータの含有量も特に限定されるものではなく、適当に選択できる。通常、０.０１〜５０wt／v％、好ましくは０.１〜１０wt／v％、例えば２.０wt／v％の溶液を使用すれば十分である。分散液となる場合は、メディエータは、多孔性膜の孔内への担持までもが十分となるように微細な粉末であることが好ましい。
【００３４】
このようにメディエータを担持させるために溶液または分散液を使用する場合、多孔性膜は、使用する溶媒に対して耐性を有するのが好ましく、また、長期保存安定性を有するのが好ましい。このような観点からも、一般的には上述のような多孔性膜材料が好ましい。
【００３５】
本発明のセンサーの製造方法では、メディエータを多孔性膜に担持させて、それを測定電極に隣接して配置することによって、測定電極とメディエータを実質的に隣接関係で容易に保持することができるという利点がある。
従って、上述のような本発明の過酸化水素測定センサーおよびその製造方法に基づけば、簡単な構造のセンサーが容易にできるので、安価に電極を提供することが可能である。
【００３６】
本発明は、過酸化水素を含む液体試料中の過酸化水素の濃度の測定に用いることができる他に、前記の式（１）の反応を触媒する酸化酵素を用いて、液体試料中の基質を酸化し、その際に生成した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）量を測定し、測定された過酸化水素濃度に基づいて、液体試料中の基質濃度（従って、基質量）を測定することに利用できる。即ち、過酸化水素を生成する基質の濃度を測定することに利用できる。これは、過酸化水素濃度と基質濃度との間には特定の関係があり、従って、この関係を予め求めておけば、測定された過酸化水素濃度から一義的に基質濃度を推定できるからである。このような関係は、先に説明した過酸化水素濃度と還元されるメディエータとの関係と同様である。実際的には、過酸化水素濃度を媒介変数とすることにより、基質濃度と還元されるメディエータ量（従って、還元電流または電気量）との間で直接的な一義的な関係を、基質濃度が既知の試料について測定を実施して、予め検量線として求めておく。その後、基質濃度が未知の試料について、還元電流または電気量を測定し、測定値と検量線から基質濃度を求める。
【００３７】
このような基質と酵素との組み合わせの例としては、グルコースとグルコースオキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオキシダーゼ、尿素とウリカーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼ、アルコールとアルコールオキシダーゼ、ピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸とＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸とＬ−アミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースとガラクトースオキシダーゼ、ＮＡＤＨとＮＡＤＨオキシダーゼ等があげられるが、過酸化水素を生成する酵素と基質との反応であれば、制限されることはない。
【００３８】
更に、本発明の過酸化水素の測定方法を利用して、過酸化水素を生成または消失する反応を触媒する酵素の酵素活性を、生成または消失した過酸化水素を測定することにより評価することもできる。
その他にも、本発明は、試薬や酵素等を用いて、被測定物質の反応に関与する過酸化水素を測定することによって、間接的に被測定物質の濃度を測定することに利用することができる。
【００３９】
【実施例】
添付図面を参照して、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１（アデニン銅錯体の合成）
１４．８mmolのアデニンを１５０mlの０．１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液に溶解した溶液に、５０mlの０．２Ｎ−ＣｕＳＯ₄水溶液を少しづつ撹拌しながら加えた。室温で１日放置後、ガラス濾過器を用いて吸引濾過して、生成した結晶を分離した。得られた結晶を水とエタノール（１：１体積比）の混合溶媒で再結晶し、アデニン銅錯体の結晶を得た。
【００４０】
実施例２（アデニン銅錯体を吸着させた多孔性膜の作製）
孔径１μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルター材料（厚さ１００μｍ、日本ミリポアリミテッド社製、商品名：オムニポアメンブレンＪＡＷＰ０４７００）上に、実施例１にて得たアデニン銅錯体の２.０wt／v％エタノール溶液５μｌを滴下して浸透させた後、常温で乾燥して、過酸化水素と電極間の電子伝達メディエータとして作用するアデニン銅錯体をフィルター材料表面およびその孔内に吸着させた多孔性膜を得た。
【００４１】
実施例３（過酸化水素測定電極の作製）
図１に模式的に示す本発明に係る過酸化水素測定センサー１０を作製した。内径３mmガラス管１６の中に、銅リード線１２を接続した電極としてのグラッシーガーボン（東海カーボン社製、商品名：ＧＣ−３０Ｓ）１４を配置し、その先端に、実施例２において作製した多孔性膜１８をテフロンキャップ２０を用いて装着し、アデニン銅錯体を電極に隣接して配置した過酸化水素測定センサー１０を得た。
【００４２】
実施例４（過酸化水素に対する電極の応答性の確認）
実施例３において作製した過酸化水素測定センサーを、０.５Ｍの硝酸カリウムを含むｐＨ５．０のBritton−Robinsonの緩衝液（２５℃）に入れ、電位掃引速度５ｍＶ／秒でサイクリックボルタモグラムを測定した結果を図２の（ａ）に示す（参照電極：銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ））。尚、センサーを除いて、電気化学的に還元電流を測定するシステムとして、ポテンショスタット（扶桑製作所社製、商品名：ＭＯＤＥＬ３１２）、電位走査ユニット（扶桑製作所社製、商品名：ＭＯＤＥＬ１１０４）、Ｘ−Ｙレコーダ（グラフテック社製、商品名：ＷＸ２４００）を用いた。
【００４３】
次に、０．５ｍＭの過酸化水素と０.５Ｍの硝酸カリウムを含むｐＨ５.０のBritton−Robinnsonの緩衝液（２５℃）を用いて、上記（ａ）の場合と同様にしてサイクリックボルタモグラムを測定した結果を図２の（ｂ）に示す。
図２から明らかなように、過酸化水素の添加により還元電流が増加することが認められる。また、曲線（ｂ）から還元ピーク電位は、銀／塩化銀電極（飽和ＫＣｌ）の参照電極に対して＋０．０２Ｖであった。
【００４４】
実施例５（過酸化水素の検量線の作成）
実施例３において作製した過酸化水素測定センサーを、０〜３ｍＭの種々の濃度の過酸化水素と０．５Ｍの硝酸カリウムを含むｐＨ５．０のBritton−Robinsonの緩衝液（２５℃）に入れ、実施例４と同様にしてサイクリックボルタモグラムを測定し、還元電流のピーク電流値（応答電流）と過酸化水素濃度との関係を求めた結果を図３に示す。この際、検量線の作成に用いた電流値の測定電位は、参照電極に対して＋０．０２Ｖであった。
【００４５】
図３から明らかなように、過酸化水素濃度に依存した応答電流が得られており、実施例３において作製した過酸化水素測定センサーが、過酸化水素測定用のセンサーとして機能していることが判る。即ち、アデニン銅錯体が、過酸化水素の濃度に依存して化学的に酸化され、それを還元して得られる還元電流は、過酸化水素の濃度に対応している。
【００４６】
実施例６（グルコースの測定）
実施例３において作製した過酸化水素測定センサーを０〜１０ｍＭのグルコースとSigma Chemical Company社製グルコースオキシダーゼタイプII（ＥＣ１．１．３．４．）２５００Ｕ／ｍｌと０．５Ｍの硝酸カリウムを含むｐＨ６．０の酢酸緩衝液（２５℃）に入れ、電位掃引速度１０ｍＶ／秒でサイクリックボルタモグラムを測定し、ＳＣＥの参照電極に対して０Ｖにおける電流値とグルコース濃度との関係を求めた結果を図４に示す。グルコース濃度に依存した応答電流が得られており、実施例３において作製した過酸化水素測定センサーにより、グルコース濃度を測定することができることが分かる。すなわち、下記の式（２）の反応を触媒するグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースを酸化し、生成した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を実施例３において作製した過酸化水素測定センサーで測定することにより、グルコース濃度を測定することができる。
グルコースオキシダーゼ
グルコース＋Ｈ₂Ｏ＋Ｏ₂ −−−→ グルコン酸＋Ｈ₂Ｏ₂ （２）
【００４７】
尚、前記実施例では、電極材料としてグラッシーカーボンを用い、メディエータとしてアデニン銅錯体を用い、多孔性膜として孔径１μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターを用いたが、先に例示した他の電極材料、メディエータ、多孔性膜を前記のような実施例において使用することができる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、被測定液中の共存物質の影響を受けることなく、過酸化水素に対しても感度低下を起こすことなく高感度であり、精度良く、過酸化水素の濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の過酸化水素測定センサーの模式的断面図である。
【図２】図２は、実施例４にて測定したサイクリックボルタモグラムの結果である。
【図３】図３は、実施例５にて測定した過酸化水素応答の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例６にて測定したグルコース濃度と測定電流の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１０…センサー、１２…リード線、１４…電極、１６…ガラス管、
１８…多孔性膜、２０…キャップ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring the concentration of hydrogen peroxide that can be used to measure components in a liquid sample such as a solution or dispersion, for example, a biological sample such as blood or urine, or a food sample, and a hydrogen peroxide measuring sensor used therefor And its manufacturing method.
[0002]
[Prior art]
As a method of measuring the amount (and therefore the concentration) of a specific substance (substance to be measured) in the solution, the amount of hydrogen peroxide involved in the reaction between the reagent and enzyme and the substance to be measured is determined. A method for indirectly measuring the amount (and hence the concentration) of the substance to be measured by measuring is widely known. For example, by using an oxidase that catalyzes the reaction of the following formula (1), the substrate (S) is oxidized to produce hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) To measure the amount of substrate (S). In formula (1), P is a product from S.
enzyme
S + O ₂ → P + H ₂ O ₂ (1)
[0003]
As a method for measuring the amount of hydrogen peroxide to be generated, an electrochemical method is known in which hydrogen peroxide is oxidized using a hydrogen peroxide measuring sensor and the oxidation current value at that time is measured.
A conventional hydrogen peroxide measurement sensor applies a constant potential of about 0.6 V to a reference electrode of a silver / silver chloride electrode (saturated KCl) to a measurement electrode (anode) made of platinum, and generates hydrogen peroxide. The oxidation current obtained by oxidation with the measurement electrode is measured. However, in this measurement method, since a potential capable of oxidizing hydrogen peroxide is applied, a substance that is oxidized on the measurement electrode at a potential lower than the applied potential, and therefore at a potential lower than the oxidation potential of hydrogen peroxide. When substances that are oxidized on the measurement electrode, such as substances such as ascorbic acid and uric acid, coexist in the liquid sample to be measured, these coexisting substances are also oxidized at the same time, and the amount of hydrogen peroxide measured by the oxidation current There is a problem that an error is included.
[0004]
As a method for avoiding the above problem, for example, as disclosed in Japanese Patent Publication No. 3-38540, a measurement electrode is covered with a permeable membrane selective to hydrogen peroxide, and measurement other than hydrogen peroxide is performed. It is possible to prevent a substance that can be oxidized by the electrode from reaching the measurement electrode, and to prevent interference due to the oxidation current of the coexisting substance. However, the method of coating the measurement electrode with such a hydrogen peroxide selective permeable membrane has a problem in that the sensitivity of the electrode to hydrogen peroxide occurs because the membrane acts as a certain resistance layer.
In addition, since the conventional hydrogen peroxide measuring sensor uses expensive platinum as an electrode material, there is a problem that the manufacturing cost of the electrode becomes high.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the problem of the present invention is to solve these problems, even if other substances that are oxidized on the measurement electrode at a potential lower than the oxidation potential of hydrogen peroxide coexist in the liquid sample to be measured. The amount of hydrogen peroxide in the liquid sample to be measured is high sensitivity without being affected by coexisting substances, high sensitivity without causing a decrease in sensitivity to hydrogen peroxide, and accurate measurement of hydrogen peroxide. It is to provide a measurement method, a hydrogen peroxide measurement sensor used in the measurement method, and an inexpensive and simple method for manufacturing the hydrogen peroxide measurement sensor.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In the first aspect of the present invention, the above problem is as follows.
A method for measuring the concentration of hydrogen peroxide in a liquid sample using a substance that acts as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and a measuring electrode,
Oxidizing the electron transfer mediator with hydrogen peroxide in the liquid sample,
Electrochemically reduce the electron transfer mediator oxidized by the measuring electrode and measure the reduction current or quantity of electricity obtained at that time.
It has been found that this can be solved by a method for measuring the hydrogen peroxide concentration.
[0007]
In the present specification, “electrochemical reduction and measurement of the reduction current or electric quantity obtained at that time” is a process well known to those skilled in the art, and basically, a substance (in the present invention, Means a method for measuring the abundance of a substance in a sample using the fact that the reduction current or quantity of electricity generated during the electrochemical reduction of an oxidized electron transfer mediator) depends on the quantity of the substance present To do. Such electrochemical measurement methods include, for example, chronoamperometry such as potential step chronoamperometry and double potential step chronoamperometry, pulse amperometry, normal pulse voltammetry, differential pulse voltammetry, cyclic voltammetry, cathode Methods such as chronocoulometry such as dic voltammetry, polarography, potential step chronocoulometry, and double potential step chronocoulometry can be used.
[0008]
In the method of the present invention, the substance that is directly measured by the electrochemical measurement method is not hydrogen peroxide itself but an electron transfer mediator oxidized by hydrogen peroxide present in the liquid sample. The amount of oxidized electron transfer mediator depends on the concentration of hydrogen peroxide in the liquid sample to be measured, and has a certain dependency (usually, the higher the concentration of hydrogen peroxide, the higher the concentration of oxidized electron transfer mediator. Tend to be). Therefore, by applying a potential capable of reducing the oxidized electron transfer mediator to the measurement electrode and measuring the reduction current or quantity of electricity obtained at that time, the amount of the oxidized electron transfer mediator can be determined, Based on the dependency, the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample can be obtained.
[0009]
Specifically, in the measurement of the hydrogen peroxide concentration based on the method of the present invention, a sample having the same system as the liquid sample to be measured and having a known hydrogen peroxide concentration (usually a plurality of samples having different hydrogen peroxide concentrations). Sample), the relationship between the hydrogen peroxide concentration and the current obtained by the oxidation and electrochemical reduction of the electron transfer mediator (so-called calibration curve, this relationship is the hydrogen peroxide mediated by the electron transfer mediator Is a relationship between the concentration and the reduction current). Next, the reduction current or quantity of electricity obtained in the same manner is measured for a sample whose concentration is unknown. The hydrogen peroxide concentration in the sample to be measured can be obtained from this relationship between the measurement current or the amount of electricity and the above relationship. The final value of the hydrogen peroxide concentration can be obtained manually by reading from a calibration curve graph, or by a general data processing method using a microcomputer.
[0010]
In the present specification, the liquid sample is a sample to be measured, for example, a liquid containing hydrogen peroxide, a sample containing a substance that is a substrate for an enzyme reaction, or a diluted solution thereof. Or a dispersion liquid may be sufficient. Specific examples include blood, urine, serum, plasma, bleach, bactericides, detergents, fruit juices, soft drinks, and their dilutions.
Therefore, in the present invention, “electron transfer mediator” (hereinafter also simply referred to as “mediator”) means a substance that is chemically oxidized by hydrogen peroxide and reduced at the electrode.
[0011]
In the method of the present invention, since the reduction current is measured, even if a substance that is oxidized at the measurement electrode at a potential lower than the oxidation potential of hydrogen peroxide coexists in the liquid sample, the interference by the oxidation current of these coexisting substances is present. Measurement of hydrogen peroxide with high sensitivity and accuracy without causing a decrease in sensitivity to hydrogen peroxide by the membrane. be able to.
In particular, a liquid sample derived from a living body contains a relatively large amount of a substance that is electrochemically oxidized, and on the other hand, does not contain a large amount of a substance that is electrochemically reduced. Is convenient.
[0012]
In the method of the present invention, when the reduction current or the amount of electricity is measured, oxygen contained in the liquid sample solution may be reduced and affected by the reduction current or the amount of electricity. In such a case, this problem can be avoided by measuring the reduction current or the amount of electricity at a potential in a range where no oxygen reduction reaction occurs at the measurement electrode. When measuring oxygen in a liquid sample, considering the current situation where a potential smaller than −0.4 V is used with respect to the standard hydrogen electrode, the potential with respect to the standard hydrogen electrode is higher than −0.4 V (ie, A potential in the range of −0.4 V to the positive side), for example, a reduction current or an electric potential at a potential in the range of −0.2 to +0.5 V, preferably 0 to +0.4 V, more preferably +0.2 to +0.3 V. It is preferred to measure the amount.
[0013]
For example, when a silver / silver chloride electrode (saturated KCl) is used as the reference electrode at 25 ° C., the potential of the silver / silver chloride electrode (saturated KCl) is +0.199 V with respect to the standard hydrogen electrode. /0.599 V or more with respect to the reference electrode of the silver chloride electrode (saturated KCl), for example, −0.399 to +0.301 V, preferably −0.199 to +0.201 V, more preferably +0.001 to +0. It is desirable to measure the reduction current or quantity of electricity at a potential in the range of 101V. Referring to the examples described below, it is sufficient to measure the reduction current or the quantity of electricity at a potential of +0.02 V with respect to a reference electrode of a silver / silver chloride electrode (saturated KCl).
[0014]
When a saturated calomel electrode (hereinafter abbreviated as SCE) is used as a reference electrode at 25 ° C., the potential of SCE is +0.2412 V with respect to the standard hydrogen electrode, and therefore −0. The reduction current or quantity of electricity is measured at a potential in the range of 6412 V or more, for example, −0.4412 to +0.2588 V, preferably −0.2412 to +0.1588 V, more preferably −0.0412 to +0.0588 V. Is desirable. Referring to the examples described below, it is sufficient to measure the reduction current or the quantity of electricity at a potential of 0 V with respect to the SCE reference electrode.
[0015]
The mediator used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that is chemically oxidized by hydrogen peroxide and can be reduced at the measurement electrode. However, it has been found that copper compounds are suitable as mediators. As a result of examining various copper compounds, among them, purine derivatives and copper complexes or pyrimidine derivatives and copper complexes are particularly preferable as mediators of the present invention because of their good reactivity with hydrogen peroxide and reversibility of electrode reactions. . In particular, it has also been found that a complex of copper and adenine derivative or a complex of copper and guanine derivative is remarkably good in stability and is particularly suitable as a mediator.
[0016]
These mediators can be used alone or in the form of a mixture of two or more.
In the present invention, examples of the purine derivative include adenine, guanine, uric acid, caffeine, theobromine, theophylline, xanthine, hypoxanthine, purine, purine nucleoside, purine nucleotide, and the like. As long as it is a purine derivative serving as a substance acting as an electron transfer mediator between the electrode and the electrode, there is no particular limitation.
[0017]
In the present invention, examples of pyrimidine derivatives include cytosine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, oxymethylcytosine, pyrimidine, pyrimidine nucleoside, pyrimidine nucleotides, etc., but form a complex with copper, and between hydrogen peroxide and the electrode. The pyrimidine derivative is not particularly limited as long as it is a substance that acts as an electron transfer mediator.
[0018]
In the present invention, examples of the adenine derivative include 7-methyladenine, 9-methyladenine, 3-methyladenine, and adenine. However, the adenine derivative forms a complex with copper and acts as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and the electrode. There is no particular limitation as long as it is an adenine derivative serving as a substance to be treated.
In the present invention, examples of the guanine derivative include 7-methylguanine, 9-methylguanine, 3-methylguanine, etc., but a substance that forms a complex with copper and acts as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and an electrode. There is no particular limitation as long as it is a guanine derivative.
[0019]
In addition to the above-mentioned complex with copper, copper compounds that can be used as mediators in the present invention include tetrakis (acetonitrile) copper hexafluorophosphate, tetrakis (acetonitrile) copper perchlorate, lithium dipropenyl cuprate, copper t -Butyl acetylide, methyl bis (triphenylphosphine) copper, methyl (2,2'-bipyridine) copper, bis (2,2'-bipyridine) copper perchlorate, mesityl copper, tetrakis (trimethylsilylmethyl) tetracopper, tetra Chlorotetrakis (triphenylphosphine) tetracopper, hydrido (triphenylphosphine) copper, nitratobis (triphenylphosphine) copper, tetrahydroborate bis (triphenylphosphine) copper, cyclopentadienyl (triethylphosphine) copper, cyclopentadi Enil (Trifeni Phosphine) copper, pentamethylcyclopentadienyl (triphenylphosphine) copper, cyclopentadienyl (t-butyl isocyanate), bis {bis (trimethylsilyl) acetylene} dichlorodicopper, (cyclopentadienyl) {bis (Trimethylsilyl) acetylene} copper, carbonyl {hydrotris (pyrazolyl) borate} copper, carbonyl (diethylenetriamine) copper tetraphenylborate, (ethylene) (di-2-pyridylamine) copper perchlorate, bis (1, 5-cyclooctadiene) copper perchlorate, dichloro (1,3-butadiene) dicopper, bis (1-methylpyrazole) copper tetrafluoroborate, tetrakis (pyridine) copper perchlorate, pentachlorocuprate hexa Ammine chrome, lead potassium hexanitrocuprate, dicarbonatocuprate Sodium trihydrate, potassium bisoxalate cuprate dihydrate, tris (μ-isothiocyanato) diammine copper silver, tetraammine copper sulfate monohydrate, tetraammine copper nitrate, tris (ethylenediamine) copper sulfate, tris (ethylenediamine) Copper nitrate dihydrate, bis (ethylenediamine) copper nitrate dihydrate, bis (ethylenediamine) copper sulfate dihydrate, bis (ethylenediamine) copper dihydrate, ethylenediamine aqua copper sulfate monohydrate , Tetrakis (imidazole) copper perchlorate, tetrakis (imidazole) copper sulfate, tetrakis (pyridine) copper nitrate, hexakis (pyridine N-oxide) copper perchlorate, tetrakis (pyridine N-oxide) copper perchlorate Salt, dichlorobis (pyridine N-oxide) copper, tetrakis (trime Ruphosphine oxide) copper perchlorate, copper complexes such as dichlorobis (triphenylphosphine oxide) copper, copper fluoride, copper fluoride dihydrate, copper chloride, copper chloride dihydrate, copper chlorate six Hydrate, copper perchlorate hexahydrate, copper bromide, copper iodide, copper oxide, copper hydroxide, copper sulfide, copper sulfate, copper sulfate pentahydrate, copper selenide, copper selenide pentahydrate Japanese, copper azide, copper nitrate trihydrate, copper phosphide, copper phosphate trihydrate, copper arsenide, copper arsenate tetrahydrate, copper carbonate, dicarbonate dihydroxide, cyanide Copper, copper thiocyanate, copper hexafluorosilicate tetrahydrate, copper tetrafluoroborate tetrahydrate, ammonium tetrachlorocuprate, copper acetate, copper acetate monohydrate, copper oxalate monohydrate, Potassium bis (oxalato) cuprate dihydrate, bis (2,4-pentanedionato) copper, bis (glycinato) copper monohydrate, Traammine copper sulfate monohydrate, bis (ethylenediamine) copper sulfate dihydrate, iodo (pyridine) copper, chlorotris (triphenylphosphine) copper, potassium tetracyanocuprate, lithium dimethylcuprate, phenyl copper, (phenyl (Ethynyl) copper and the like can be exemplified, but there is no particular limitation as long as it is a copper compound that acts as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and the electrode.
[0020]
The mediator needs to be present at a position where it can be electrically reduced by the measuring electrode. In a more preferred embodiment, the mediator is preferably substantially adjacent to the measurement electrode. The method of the present invention is preferably carried out by incorporating the hydrogen peroxide sensor of the present invention described below into an existing electrochemical measurement system and immersing the sensor in a liquid sample to be measured. By placing the mediator adjacent to the measurement electrode, there is substantially no layer that is resistant to hydrogen peroxide as in prior art sensors, thus improving the measurement sensitivity and accuracy of the sensor.
[0021]
The measurement method of the present invention does not directly determine the amount of hydrogen peroxide by directly measuring the oxidation current of hydrogen peroxide, but electrochemically measures the reduction current of the mediator oxidized by interposing the mediator. Other technical matters (for example, measurement systems by electrochemical methods excluding sensors, measurement conditions, etc.) that are necessary to carry out this method. ) Is a matter known to those skilled in the art, and is omitted in this specification.
In a second aspect, the present invention provides a hydrogen peroxide measurement sensor used in the method for measuring hydrogen peroxide according to the first aspect, wherein a mediator is disposed adjacent to a measurement electrode.
[0022]
In the sensor of the present invention, the material used as the electrode material of the measurement electrode is not particularly limited as long as it is a current collecting material formed from an electron conductive substance. Specifically, carbon materials, platinum, gold, palladium, osmium, silver, iridium and the like can be used. As a result of studying various materials, the carbon material is inexpensive, has a wide potential window, and is also chemically stable. Therefore, as the electrode material of the hydrogen peroxide measuring sensor of the present invention, the carbon material Has been found to be particularly preferred.
[0023]
The carbon material that can be used is not particularly limited as long as it is conventionally used in carbon electrodes. For example, graphite, pyrolytic graphite (pyrolytic graphite), glassy carbon, carbon paste, and carbon fiber can be used.
[0024]
The mediator is preferably carried on a porous membrane, which is arranged adjacent to the electrode, so that the mediator is arranged adjacent to the measuring electrode. The porous membrane used in the sensor of the present invention has a micropore that can support a mediator, does not inhibit the reaction between the mediator and hydrogen peroxide, and does not inhibit the electrochemical reduction between the measurement electrode and the mediator. If it is a film | membrane, there will be no restriction | limiting in particular. Usually, it is desirable that the film has a fine pore having a pore diameter of 0.01 to 100 μm, preferably 0.1 to 10 μm. As will be described later, the mediator is supported (for example, adsorbed) mainly in the micropores and on the exposed surface of the porous membrane.
[0025]
Considering the fact that it is desirable that the mediator is substantially adjacent to the measurement electrode because the mediator is oxidized by hydrogen peroxide and reduced, the thickness of the membrane is thin as long as there is no problem in strength in use. For example, it is preferable to use a film having a thickness of about 1 to 1000 μm, preferably about 10 to 200 μm.
[0026]
In the present invention, “adjacent” in “the mediator is disposed adjacent to the measurement electrode” means a state where the mediator is in direct contact with the measurement electrode and a distance within a range where the reduction current can be measured. It includes both or either state away from the measurement electrode. In this contact state, it is sufficient that at least a part of the mediator is in contact with the electrode, and it is not always necessary that all the mediators are in contact with the measurement electrode. Further, in this separated state, it is sufficient that at least a part of the mediators are separated from the measurement electrode, and it is not necessary that all the mediators are separated from the measurement electrode, as long as the reduction current of the mediator can be measured. Good. Therefore, a state in which a part of the mediator is in contact with the measurement electrode (that is, carried by the measurement electrode) and the remaining mediator is separated from the measurement electrode is also a state in which “the mediator is disposed adjacent to the measurement electrode” in the present invention. include.
[0027]
Therefore, when the porous membrane is arranged on the measurement electrode, the mediator supported on the main surface opposite to the measurement electrode and the pores of the membrane is not in contact with the measurement electrode. As long as the reduction current can be measured, the present invention includes a state in which the mediator is disposed adjacent to the measurement electrode. Alternatively, the mediator can be used directly on the measuring electrode.
[0028]
As a result of examining porous membranes of various materials, the materials of the porous membrane used in the sensor of the present invention include polyolefins such as polyethylene and polypropylene, polytetrafluoroethylene (PTFE), cellulose acetate, nitrocellulose, polyacrylonitrile. Polymer materials such as polycarbonate, polyamide, polysulfone, and polyethersulfone were suitable.
[0029]
One preferred embodiment of the hydrogen peroxide measuring sensor of the present invention is schematically shown in a sectional view in FIG.
The sensor 10 of the present invention has a carbon electrode 14 connected to a copper lead wire 12 in a glass tube 16, and a porous film 18 carrying a mediator is disposed adjacent to the exposed surface of the carbon electrode 14. ing. The porous membrane 18 is held adjacent to the electrode 14 at the end of the glass tube 16 by any suitable means, for example, an annular cap 20 of elastic material (eg, Teflon material).
[0030]
In the illustrated embodiment, for the sake of easy understanding, the gap is drawn between the electrode 14 and the porous film 18 and between the glass tube 16 and the porous film 18. Is practically nonexistent.
As is apparent from the illustrated embodiment, the structure of the hydrogen peroxide measurement sensor can be greatly simplified based on the present invention, and in the measurement, the mediator contacts the liquid sample, and Since the mediator is adjacent to the measuring electrode, the problems due to the presence of the sensor membrane of the prior art are solved.
[0031]
In a third aspect, the present invention is a method for producing a hydrogen peroxide measurement sensor according to the second aspect, wherein a mediator is supported on a porous film, and the porous film is disposed adjacent to a measurement electrode. Hydrogen peroxide measuring sensor, in particular with high accuracy and stability, characterized by allowing the measuring electrode to electrochemically reduce the mediator oxidized by hydrogen peroxide when using the sensor A method for manufacturing a hydrogen measurement sensor is provided.
[0032]
Any suitable method may be used to support the mediator on the porous membrane. In a particularly preferred method, the porous membrane is immersed in a solution or dispersion containing the mediator and washed as necessary, and then the membrane is dried, or the solution or dispersion containing the mediator is applied or dropped onto the porous membrane. Then, by drying the membrane, the mediator is supported mainly in the micropores and on the exposed surface of the porous membrane, that is, the mediator is bound to, for example, adsorbed on the porous membrane.
[0033]
The solvent used for the solution or dispersion containing the mediator is not particularly limited as long as it can dissolve or uniformly disperse the mediator, and examples thereof include water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, and acetone. Further, the content of the mediator in the solution or dispersion containing the mediator is not particularly limited and can be appropriately selected. Usually, it is sufficient to use a solution of 0.01 to 50 wt / v%, preferably 0.1 to 10 wt / v%, for example 2.0 wt / v%. In the case of a dispersion, it is preferable that the mediator is a fine powder so that it can be sufficiently loaded into the pores of the porous membrane.
[0034]
Thus, when using a solution or a dispersion liquid to carry | support a mediator, it is preferable that a porous membrane has tolerance with respect to the solvent to be used, and it is preferable to have long-term storage stability. Also from such a viewpoint, the porous membrane material as described above is generally preferable.
[0035]
In the sensor manufacturing method of the present invention, the measurement electrode and the mediator can be easily held in a substantially adjacent relationship by supporting the mediator on the porous membrane and disposing the mediator adjacent to the measurement electrode. There is an advantage.
Therefore, based on the hydrogen peroxide measuring sensor and the manufacturing method thereof according to the present invention as described above, a sensor having a simple structure can be easily provided, so that an electrode can be provided at low cost.
[0036]
The present invention can be used for the measurement of the concentration of hydrogen peroxide in a liquid sample containing hydrogen peroxide, and in addition, a substrate in a liquid sample using an oxidase that catalyzes the reaction of the above formula (1). Hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) And can be used to determine the substrate concentration (and hence the base mass) in the liquid sample based on the measured hydrogen peroxide concentration. That is, it can be used to measure the concentration of a substrate that generates hydrogen peroxide. This is because there is a specific relationship between the hydrogen peroxide concentration and the substrate concentration. Therefore, if this relationship is obtained in advance, the substrate concentration can be uniquely estimated from the measured hydrogen peroxide concentration. is there. Such a relationship is the same as the relationship between the hydrogen peroxide concentration and the mediator to be reduced as described above. In practice, by using the hydrogen peroxide concentration as a parameter, the substrate concentration has a direct and unambiguous relationship between the substrate concentration and the amount of mediator to be reduced (and hence the reduction current or quantity of electricity). Measurement is performed on a known sample, and a calibration curve is obtained in advance. Thereafter, for a sample whose substrate concentration is unknown, the reduction current or the electric quantity is measured, and the substrate concentration is obtained from the measured value and the calibration curve.
[0037]
Examples of such substrate and enzyme combinations include glucose and glucose oxidase, cholesterol and cholesterol oxidase, urea and uricase, lactic acid and lactate oxidase, alcohol and alcohol oxidase, pyruvate and pyruvate oxidase, D-amino acid and D -Amino acid oxidase, L-amino acid and L-amino acid oxidase, galactose and galactose oxidase, NADH and NADH oxidase, etc., are not limited as long as it is a reaction between an enzyme that generates hydrogen peroxide and a substrate. .
[0038]
Furthermore, by using the method for measuring hydrogen peroxide according to the present invention, the enzyme activity of an enzyme that catalyzes a reaction that generates or disappears hydrogen peroxide can be evaluated by measuring the generated or disappeared hydrogen peroxide. it can.
In addition, the present invention can be used to indirectly measure the concentration of a substance to be measured by measuring hydrogen peroxide involved in the reaction of the substance to be measured using a reagent, an enzyme, or the like. it can.
[0039]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the accompanying drawings.
Example 1 (Synthesis of adenine copper complex)
To a solution of 14.8 mmol of adenine dissolved in 150 ml of 0.1 N NaOH aqueous solution, 50 ml of 0.2 N CuSO 4 was added. _Four The aqueous solution was added little by little with stirring. After standing at room temperature for 1 day, the resulting crystals were separated by suction filtration using a glass filter. The obtained crystal was recrystallized with a mixed solvent of water and ethanol (1: 1 volume ratio) to obtain an adenine copper complex crystal.
[0040]
Example 2 (Preparation of porous membrane adsorbed with adenine copper complex)
A PTFE membrane filter material having a pore diameter of 1 μm (thickness: 100 μm, manufactured by Nippon Millipore Ltd., trade name: Omnipore Membrane JAWP 0470), 2.0 wt / v% ethanol of the adenine copper complex obtained in Example 1 5 μl of the solution is dropped and infiltrated, and then dried at room temperature to obtain a porous film in which the adenine copper complex acting as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and the electrode is adsorbed on the surface of the filter material and in the pores. It was.
[0041]
Example 3 (Preparation of hydrogen peroxide measuring electrode)
A hydrogen peroxide measuring sensor 10 according to the present invention schematically shown in FIG. 1 was produced. A glassy garbon (trade name: GC-30S, manufactured by Tokai Carbon Co., Ltd.) 14 as an electrode to which a copper lead wire 12 was connected was placed in a glass tube 16 having an inner diameter of 3 mm, and the tip was fabricated in Example 2. A porous membrane 18 was attached using a Teflon cap 20 to obtain a hydrogen peroxide measuring sensor 10 in which an adenine copper complex was disposed adjacent to an electrode.
[0042]
Example 4 (Confirmation of electrode responsiveness to hydrogen peroxide)
The hydrogen peroxide measurement sensor prepared in Example 3 was placed in a Britton-Robinson buffer solution (25 ° C.) containing 0.5 M potassium nitrate and pH 5.0, and a cyclic voltammogram was measured at a potential sweep rate of 5 mV / sec. The results are shown in FIG. 2 (a) (reference electrode: silver / silver chloride electrode (saturated KCl)). In addition, as a system for electrochemically measuring the reduction current, excluding the sensor, potentiostat (manufactured by Fuso Seisakusho, trade name: MODEL 312), potential scanning unit (manufactured by Fuso Seisakusho, trade name: MODEL 1104), An XY recorder (trade name: WX2400, manufactured by Graphtec Corporation) was used.
[0043]
Next, using a Britton-Robinnson buffer solution (25 ° C.) containing 0.5 mM hydrogen peroxide and 0.5 M potassium nitrate (pH 25), a cyclic voltammogram was obtained in the same manner as in the case (a) above. The measurement results are shown in FIG.
As is apparent from FIG. 2, it is recognized that the reduction current increases with the addition of hydrogen peroxide. From the curve (b), the reduction peak potential was +0.02 V with respect to the reference electrode of the silver / silver chloride electrode (saturated KCl).
[0044]
Example 5 (Preparation of calibration curve for hydrogen peroxide)
The hydrogen peroxide measurement sensor prepared in Example 3 was placed in a Britton-Robinson buffer solution (25 ° C.) having a pH of 5.0 containing various concentrations of hydrogen peroxide of 0 to 3 mM and 0.5 M potassium nitrate. The cyclic voltammogram was measured in the same manner as in Example 4, and the results of determining the relationship between the peak current value (response current) of the reduction current and the hydrogen peroxide concentration are shown in FIG. At this time, the measurement potential of the current value used for preparing the calibration curve was +0.02 V with respect to the reference electrode.
[0045]
As is apparent from FIG. 3, a response current depending on the hydrogen peroxide concentration was obtained, and the hydrogen peroxide measurement sensor produced in Example 3 functions as a sensor for measuring hydrogen peroxide. I understand. That is, the adenine copper complex is chemically oxidized depending on the concentration of hydrogen peroxide, and the reduction current obtained by reducing it corresponds to the concentration of hydrogen peroxide.
[0046]
Example 6 (Measurement of glucose)
The hydrogen peroxide measurement sensor prepared in Example 3 was prepared with pH 6.0 containing 0 to 10 mM glucose, 2500 U / ml glucose oxidase type II (EC 1.1.3.4.) Manufactured by Sigma Chemical Company, and 0.5 M potassium nitrate. A cyclic voltammogram was measured at a potential sweep rate of 10 mV / sec in an acetic acid buffer solution (25 ° C.) of 0, and the relationship between the current value at 0 V and the glucose concentration with respect to the SCE reference electrode was determined. Shown in A response current depending on the glucose concentration is obtained, and it can be seen that the glucose concentration can be measured by the hydrogen peroxide measuring sensor produced in Example 3. That is, glucose is oxidized using glucose oxidase which catalyzes the reaction of the following formula (2), and hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) Can be measured with the hydrogen peroxide measuring sensor prepared in Example 3, whereby the glucose concentration can be measured.
Glucose oxidase
Glucose + H ₂ O + O ₂ --- → Gluconic acid + H ₂ O ₂ (2)
[0047]
In the above example, glassy carbon was used as the electrode material, adenine copper complex was used as the mediator, and a PTFE membrane filter having a pore diameter of 1 μm was used as the porous membrane. However, other electrode materials, mediators, Porous membranes can be used in the examples as described above.
[0048]
【The invention's effect】
According to the present invention, the concentration of hydrogen peroxide can be accurately measured without being affected by coexisting substances in the liquid to be measured, with high sensitivity without causing a decrease in sensitivity to hydrogen peroxide. Can do.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a hydrogen peroxide measuring sensor according to the present invention.
FIG. 2 is a result of cyclic voltammogram measured in Example 4.
FIG. 3 is a graph showing the results of hydrogen peroxide response measured in Example 5.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the glucose concentration measured in Example 6 and the measurement current.
[Explanation of symbols]
10 ... sensor, 12 ... lead wire, 14 ... electrode, 16 ... glass tube,
18 ... porous membrane, 20 ... cap.

Claims

A method for measuring the concentration of hydrogen peroxide in a liquid sample using a substance that acts as an electron transfer mediator between hydrogen peroxide and a measuring electrode,
Oxidizing the electron transfer mediator with hydrogen peroxide in the liquid sample,
A method for measuring a hydrogen peroxide concentration, characterized in that an electron transfer mediator oxidized by a measuring electrode is electrochemically reduced and a reduction current or an electric quantity obtained at that time is measured.

2. The method for measuring hydrogen peroxide according to claim 1, wherein the method for measuring the reduction current or the quantity of electricity is a method for measuring the reduction current or the quantity of electricity at a potential in a range where no oxygen reduction reaction occurs. .

3. The method for measuring a reduction current or an electric quantity is a method for measuring a reduction current or an electric quantity at a potential in a range higher than −0.4 V as a potential with respect to a standard hydrogen electrode. Of measuring hydrogen peroxide in water.

Substances acting as electron transfer mediator between the hydrogen peroxide and the measurement electrode, of hydrogen peroxide according to claim 1, characterized in that it consists of at least one selected from copper compounds Measuring method.

5. The method for measuring hydrogen peroxide according to claim 4, wherein the copper compound comprises at least one selected from a purine derivative and a copper complex and a pyrimidine derivative and a copper complex.

6. The method for measuring hydrogen peroxide according to claim 5, wherein the purine derivative comprises at least one selected from an adenine derivative and a guanine derivative.

The hydrogen peroxide measuring sensor used in the method according to claim 1, comprising a measuring electrode adjacent to a substance acting as an electron transfer mediator.

The hydrogen peroxide measuring sensor according to claim 7, wherein the measuring electrode is made of carbon, platinum or gold .

9. The hydrogen peroxide measuring sensor according to claim 7, wherein the electron transfer mediator is supported on a porous membrane.

9. The hydrogen peroxide measuring sensor according to claim 7 or 8, wherein the electron transfer mediator is directly supported on the measuring electrode.

8. A porous membrane carrying a substance acting as an electron transfer mediator is mounted on a measurement electrode, whereby the substance acting as an electron transfer mediator is arranged adjacent to the measurement electrode. The manufacturing method of the hydrogen peroxide measuring sensor in any one of -9.

12. The method according to claim 11, further comprising applying or dropping a solution or dispersion containing a substance acting as an electron transfer mediator on the porous membrane and drying to support the substance acting as an electron transfer mediator. Manufacturing method.

The method further comprises immersing the porous membrane in a solution containing a substance that acts as an electron transfer mediator, washing as necessary, and drying to carry a substance that acts as an electron transfer mediator. The manufacturing method of Claim 11.

The manufacturing method according to claim 11, wherein the porous film is made of a polymer material.

15. The production according to claim 14, wherein the polymer material comprises at least one selected from polytetrafluoroethylene (PTFE) , cellulose acetate, nitrocellulose, polycarbonate, polyamide, polysulfone, polyethersulfone and polyolefin. Method.

Using any of the sensor of any method or claim 7-10 of claims 1 to 6, measured hydrogen peroxide concentration produced by oxidizing the substrate in a liquid sample by an enzymatic reaction using the enzyme And measuring the concentration of the substrate in the liquid sample.

The method for measuring a substrate concentration according to claim 16, wherein the enzyme is glucose oxidase and the substrate is glucose.