JP3691803B2

JP3691803B2 - Method for quantifying heart failure markers in blood

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Publication number: JP3691803B2
Application number: JP2002069934A
Authority: JP
Inventors: 誠國近
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2022-03-14
Also published as: JP2003270250A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の心不全マーカー定量方法に関する。さらに詳しくは、心房負荷、心室負荷、心筋肥大、心筋虚血又は／及び心筋壊死に起因する心不全の診断に用いられる血液中の心不全マーカー定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、心不全マーカーの定量方法として、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血２ｍＬ以上を抗凝固剤入りの採血管に採取し、混和後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心して血漿部分と血球部分を分け、上清（血漿）部分を別の試験管に分取し、これを測定検体として定量する方法等が知られている（例えば、臨床検査マニュアル、１９８８年、文光堂、３１１〜３１６頁）。さらに通常は測定を効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存して一定量の測定検体をまとめて定量する方法等が知られている（例えば、イムノアッセイ、１９８４年、ジェイエムシー、１７３〜１７４頁）。この方法は、特に慢性心不全の診断及び急性心不全の回復期の診断等に用いられている。急性心不全、例えば急性心筋梗塞などでは、診断に緊急性が必要なため、上記血漿分離後に直ちに測定を行う方法又は採血後ただちにイムノクロマト法等の迅速測定（例えばバイオサイトダイアグノスティクス社の製品「ＴｒｉａｇｅＣＡＲＵＤＩＡＣＰＡＮＥＬ」を用いた測定）が実施されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法においては、健康診断等多数の被検者から採血し血液中の心不全マーカーを測定する場合、多数の血液から上清を分離する操作が必要であり、分離した血漿を試験管で冷蔵又は冷凍で輸送・保存する必要がある等コストが高くなる問題があった。また、急性心不全の診断に用いられるイムノクロマト法等の迅速測定は、急性心不全発症時の診断には有効であるが、回復期あるいは長期的なフォローアップにはコストが高くなる点、及び多数の検体測定に向いていない点で問題があった。すなわち、本発明の目的は、心不全マーカーを簡易に定量する方法を提供することである。特に診断に緊急性を要しない、慢性心不全の心不全マーカーを簡易に定量する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、特定の方法を用いることにより、心不全マーカーを簡易に定量できることを見いだし本発明に到達した。すなわち、本発明の血液中の心不全マーカーの定量方法の特徴は、血液担持担体から血液成分を抽出し、抽出液中の心不全マーカー濃度と、心不全マーカーの抽出率とから、心不全マーカーを定量する点を要旨とする。なお、抽出率は、血液を用いて作成した血液担持担体（１）と、血液に既知濃度の心不全マーカーを添加した添加血液を用いて作成した血液担持担体（２）とからそれぞれ抽出された抽出液中の心不全マーカーの含有量を定量して抽出液の心不全マーカーの濃度｛Ａ：担体（１）から抽出された抽出液中の濃度、Ｂ：担体（２）から抽出された抽出液中の濃度｝を求め、次式から求められる。
（抽出率）＝（Ｂ−Ａ）／（血液に添加した心不全マーカーの濃度）
【０００５】
【発明実施の形態】
本発明における心不全マーカーは、心房負荷、心室負荷、心筋肥大、心筋虚血又は／及び心筋壊死等に起因する心不全を診断するための心不全マーカーである。心不全としては、慢性心不全及び急性心不全が挙げられ、これらのうち、特に慢性心不全に好適である。心不全を診断するための心不全マーカーとしては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、心筋ミオシン軽鎖、トロポニンＴ及び血清ミオグロビン等が挙げられる。これらのうち、慢性心不全への特異性の高いという観点から、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）が好ましく、さらに好ましくは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である。
【０００６】
血液担持担体中の血液は、その採取部位及び採取方法等に制限はなく、従来の採取部位及び採取方法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取等）で得た血液の一部を本発明に用いることも当然可能であるが、該血液は、被検者への侵襲性の低減の観点から、抹消血管からの採取が好ましく、抹消血管からの採取の中でも、被検者の侵襲性低減の観点から耳朶又は指先を穿刺して採取した血液がより好ましく、被検者が自分で血液を採取できる点、穿刺時の痛感が少ない点及び血液が液滴として採取（滴下）し易い点等の観点から指先を穿刺して採取した血液が特に好ましい。
【０００７】
末梢血液を採取する方法としては、血液を採取できれば特に制限はないが、被検者自身で実施可能であるという観点から、例えば、被検者の当該部位（例えば、耳朶及び指先等）を穿刺前によくマッサージ及び／又は暖めて充血させておき、消毒ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させ、ディスポーザブル・ランセット等で当該部位を穿刺して血液を得る方法等が好ましい。
【０００８】
血液担持担体中の担体としては、血液を保持することが可能である限り、担体の材質、形状等は特に制限されないが、吸着による血液の保持が容易であり、抽出により血液成分が溶出し易い材質・形状であることが好ましく、吸着による保持が容易という観点から、吸収体であることがさらに好ましい。
【０００９】
担体には、あらかじめ、血液に対する抗凝固剤及び／又は蛋白分解酵素の阻害剤を含有していることが好ましい。血液に対する抗凝固剤としては、例えばヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、クエン酸ナトリウム及びフッ化ナトリウム等が挙げられ、これらのうち、ＥＤＴＡナトリウム塩が好ましい。蛋白分解酵素の阻害剤としては、例えばアマスタチン、アンチパイン、アンチスロンビンＩＩＩ、カルペプチン、ＰＭＳＦ及びアプロチニン等が挙げられ、これらのうち、ＰＭＳＦ及びアプロチニンが好ましい。
【００１０】
血液の抗凝固剤を使用する場合、抗凝固剤の含有量は、多孔質材が保持できる体液量に応じて適宜設定でき、体液１ｍＬ当たり、好ましくは０．１ｍｇ以上、さらに好ましくは１ｍｇ以上、そして、好ましくは１００ｍｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下となるように設定する。蛋白質分解酵素阻害剤の含有量は、多孔質材が保持できる体液量に応じて適宜設定でき、体液１ｍＬ当たり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上、そして、好ましくは１００ｍｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下となるように設定する。
【００１１】
担体に、あらかじめ血液に対する抗凝固剤及び／又は蛋白分解酵素の阻害剤とを含有させる方法は、例えば抗凝固剤及び阻害剤を含む溶液を担体に噴霧したのち乾燥させる方法、抗凝固剤及び阻害剤を含む溶液に担体を浸積したのち乾燥する方法等が適用できる。抗凝固剤及び／又は阻害剤を溶解する溶剤は、抗凝固剤及び／又は阻害剤の溶解性により適宜選択できる。水溶性の抗凝固剤及び／又は阻害剤の場合、蒸留水、脱イオン水、生理食塩水、リン酸緩衝液及びグッドの緩衝液等が使用でき、非水溶性の抗凝固剤及び／又は阻害剤の場合、適当な有機溶剤、例えばＰＭＳＦの場合は、エタノール及びアセトン等が使用できる。これらのうち、水溶性の場合、蒸留水及び脱イオン水が好ましい。非水溶性の場合は、好ましい溶剤は蛋白分解酵素阻害剤等の種類により異なるが、ＰＭＳＦの場合、エタノールである。
溶液中の抗凝固剤の含有量（ｍｇ／ｍＬ）は、抗凝固剤の種類により適宜設定できるが、溶液１ｍＬ当たり、０．０１以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上である。また１００以下が好ましく、さらに好ましくは１０以下である。
【０００１２】
溶液中の阻害剤の含有量（ｍｇ／ｍＬ）は、阻害剤の種類により適宜設定できるが、溶液１ｍＬ当たり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上、そして、好ましくは１００ｍｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下である。
【００１３】
担体の材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。これらのうち、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。
【００１４】
担体としては、公知のものが使用でき、例えば、上記の材質等からなる濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる吸収体が挙げられる。濾紙としては、例えば、ＪＩＳＰ３８０１（１９９５年）又はＴＡＰＰＩ（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｕｌｐａｎｄＰａｐｅｒＩｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定される濾紙等が挙げられる。不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。織布としては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレフィン布、ニトロセルロース布、セルロールアセテート布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げられる。シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリスチレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡セラミックス等が挙げられる。これらのうち、単位体積又は単位面積当たりに吸収する血液の量が一定になりやすいという（定量精度向上）観点から、濾紙、不織布及びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくは濾紙及び不織布、特に好ましくは濾紙である。
【００１５】
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の厚さ（ｍｍ）は、適宜選択することができるが、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．３以上である。また３．０以下が好ましく、さらに好ましくは１．０以下、特に好ましくは０．６以下である。濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の大きさ（面積ｃｍ²）は、採血、保管及び輸送時等の操作性を考慮して自由に設定できるが、１以上が好ましく、さらに好ましくは１０以上、特に好ましく２５以上である。また２００以下が好ましく、さらに好ましくは１５０以下、特に好ましく１００以下である。吸収体の孔径は自由に設定選択できるが、吸収体の平均孔径（μｍ）は１以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは５以上である。また１００以下が好ましく、さらに好ましくは８０以下、特に好ましくは５０以下である。
【００１６】
血液の担体への担持は、血液が保持できれば特に制限されず、担体と血液とを接触させることにより担体に血液を担持させることができる。担体と血液とを接触させる方法としては、例えば、血液に担体を浸漬する方法、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押し付ける方法等が挙げられる。これらのうち、簡便性の観点から、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押しつける方法が好ましく、さらに好ましくは担体に血液を滴下する方法である。
【００１７】
血液に担体を浸漬する場合、血液の使用量（ｍｌ）は担体が浸漬できる量であり、担体の大きさに決定されるが、０．０５以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．１５以上である。また２以下が好ましく、さらに好ましくは１以下、特に好ましくは０．５以下である。担体に血液を滴下する場合、血液の使用量（ｍｌ）は担体の大きさに決定されるが、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に好ましくは０．２以下である。穿刺部に担体を押し付ける場合、血液の使用量（ｍｌ）は担体の大きさに決定されるが、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に好ましくは０．２以下である。
【００１８】
血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取る場合（後述）、切取られる担体が保持できる量以上の血液を滴下すればよく、滴下する血液量を正確に制御する必要はない。例えば、ろ紙がワットマン社製ＢＦＣ１８０（厚さ０．４９ｍｍ）の場合、滴下した血液量が５０μＬであれば血液を保持した部分の大きさは直径約１２ｍｍである。１滴の液量は約４０〜６０μＬであるので、血液担持部分を直径６ｍｍの円形に打ちぬく場合、必要な血液の量は１〜２滴となる。
【００１９】
さらに、血液の安定性及び定量の再現性の観点から、血液を担体に保持させた後、乾燥させることが好ましく、担体に保持された血液の重量が５０重量％以下（好ましくは３０重量％以下）になるまで乾燥することがさらに好ましい。乾燥方法としては、例えば、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥、微加熱乾燥及び単純乾燥（風乾）等が適用でき、これらのうち、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥及び単純乾燥が好ましく、さらに好ましくは減圧乾燥及び単純乾燥であり、特に好ましくは単純乾燥である。
【００２０】
乾燥は、心不全マーカーの免疫反応性が変化しない条件で行うことが好ましく、４０℃以下の温度で行うのがさらに好ましく、特に好ましくは３０℃以下である。また０℃以上で行うことが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上である。減圧する場合は、圧力（Ｐａ）は、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また１０以下が好ましく、さらに好ましくは２以下、特に好ましくは１以下である。単純乾燥する場合の湿度（％ＲＨ）は、特に制限はないが、１０以上が好ましく、さらに好ましくは４０以上である。また９０以下が好ましく、さらに好ましくは８０以下である。乾燥時間は、担体の形状、保持した血液量により適宜設定できるが、担体が濾紙の場合、２０分〜１時間程度である。
【００２１】
血液保持担体を保存する場合、湿度（％ＲＨ）は、８０が好ましく、さらに好ましくは６０以下、特に好ましくは４０以下である。また５以上が好ましく、さらに好ましくは１０以上、特に好ましくは２０以上である。またこの場合、温度（℃）は、０以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは２以上である。また４０以下が好ましく、さらに好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。なお、湿度８０％ＲＨ以下を保てる状態（密閉下、乾燥剤存在の密閉下等）であれば郵便又は宅配便等により輸送することができる。
【００２２】
血液成分の抽出の前に、血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取ってから行うことが好ましい。例えば、均一な吸収体に血液を滴下し、過剰な血液は周囲に拡散吸収させて乾燥した後、中心部を一定の形状に切り取ったものを抽出に用いる方法が好ましい。切り取る方法としては、一定直径のパンチで打ちぬく方法及び予め入れた切取線（ミシン目等）に沿って切り出す方法等が適用できる。
【００２３】
血液担持担体から血液成分の抽出は、血液中の心不全マーカー（抗原）の免疫反応性が変化しない限り特に制限なく行うことができ、例えば、抽出用溶液に血液担持担体を浸漬し、その上清を抽出液として用いることができる。抽出用溶液として、ｐＨが中性領域の緩衝液が使用でき、例えば、ｐＨ６〜８のグッド緩衝液及びｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等が好ましく使用される。
【００２４】
また、抽出用溶液に、塩、界面活性剤、蛋白質及び抗原安定化剤等を添加することもできる。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（ＩＣＩアメリカ社））等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン及びカゼイン等が挙げられる。抗原安定化剤としては、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
【００２５】
定量再現性の観点から、担体に対する抽出用溶液の使用量及び抽出時間等の抽出条件を一定にする必要がある。抽出用溶液の使用量（ｍｌ）としては、血液担持担体１個当たり、０．０５以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．２以上である。また５以下が好ましく、さらに好ましくは１以下、特に好ましくは０．５以下である。抽出時間（分）としては、０．５以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは５以上である。また４８０以下が好ましく、さらに好ましくは１８０以下、特に好ましくは６０以下である。撹拌は、ボルテックスミキサーのような装置を用いて、容器を震動して行うことが好ましく、震動回数は１００〜２０００ｒｐｍが好ましい。
【００２６】
例えば、血液担持担体から切り取った直径６ｍｍ（厚さ０．４９ｍｍ）の濾紙（ワットマン社製ＢＦＣ１８０）の場合、以下の条件等で抽出できる。
抽出用溶液組成：塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（塩化ナトリウムの含有量：緩衝液１００ｍＬ当たり０．８５ｇ、以下同じ。）
抽出用溶液の使用量：２００〜３００μＬ
抽出温度：室温（１５〜２５℃）
抽出時間：２０分〜１時間（攪拌後の放置時間）
抽出操作：担体に抽出用溶液を加えボルテックスミキサーで攪拌後（５００ｒｐｍ、１分）、上記温度で上記時間放置する。再度攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ、５秒）し、１分間静置し分散したろ紙繊維を沈降させた後、上清液を採取し、心不全マーカー測定のための検体（抽出液）として用いる。
【００２７】
上記抽出液中の心不全マーカーの定量方法は特に制限されないが、定量値の再現性及び測定感度の観点から、免疫学的測定法が好ましい。免疫学的測定法としては従来公知の方法が使用できるが、抽出液中の心不全マーカー濃度が血液中の濃度より低いためより定量感度の高い測定法が望ましく、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が好ましい。放射免疫測定（ＲＩＡ）としては、固相抗体とＩ１２５標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、多数の測定試薬キットが市販されている。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）としては、固相抗体と酵素標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いた種々の測定試薬キットが市販されている。蛍光免疫測定（ＦＩＡ）としては、固相抗体とユーロピウム標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられる。化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）としては、固相抗体とアクリジニウムエステル標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、種々の測定試薬キットが市販されている。これらの免疫学的測定法の中で、好ましいのは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）であり、さらに好ましくは化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）である。
【００２８】
抽出液中の心不全マーカー濃度から、血液中の心不全マーカーの濃度を求める方法は、種々の方法が適用でき、例えば、（１）心不全マーカーの濃度が既知の血液を担持した血液担持担体を用いて作成した検量線を用いる方法、及び（２）心不全マーカーの濃度が既知の抽出液を用いて作成した検量線と心不全マーカーの抽出率とを用いる方法等が挙げられる。
【００２９】
（２）の方法において、抽出率は、既知濃度の心不全マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成し、これから抽出された抽出液中の心不全マーカーの含有量を定量して抽出液の心不全マーカーの濃度を求め、次式から求められる。抽出率は、以上の操作を少なくとも２回（好ましくは少なくとも３回）行い、それらの平均値を用いることが好ましい。
抽出率＝（抽出液の心不全マーカーの濃度）／（血液の心不全マーカーの濃度）
検体の血液中の心不全マーカー濃度は、検体から調製される抽出液中の心不全マーカー濃度を抽出率で除すことで求めることができるが、その際、血液担持担体の作成及び抽出の条件は抽出率を求めた時と同じ条件である必要がある。
【００３０】
なお、本発明で定量される心不全マーカーは、血液中に極低濃度で存在しているため、濃度の変動による抽出率の変動は極わずかであり、例えば、ＡＮＰの場合、０．２〜１００ｐｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。１００ｐｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＡＮＰの場合、心不全の判断の境界濃度（心機能が心不全状態であるとの判断をする境界濃度）が１０ｐｇ／ｍＬであり、１００ｐｇ／ｍＬを越えていれば心不全の判断において陽性である。）。
【００３１】
また、ＢＮＰの場合、５〜４，０００ｐｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。４，０００ｐｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＢＮＰの場合、心不全の判断の境界濃度が４６ｐｇ／ｍＬであり、４，０００ｐｇ／ｍＬを越えていれば心不全の判断において陽性である。）。ＡＮＰ及びＢＮＰ以外の心不全マーカーについても同様であり、心不全マーカーの濃度による抽出率の差よって臨床的な判断に影響することはない。
【００３２】
（１）及び（２）の方法の何れの場合も、既知濃度の心不全マーカーを含む血液又は抽出液は、濃度の異なる２種以上を用いることが好ましい。
既知濃度の心不全マーカーを含む血液又は抽出液の濃度は、測定する心不全マーカーの種類により自由に設定できるが、通常は健常人の範囲（正常域）と心不全である可能性が高い範囲との境界濃度（カットオフ）を明確に測定できる濃度で設定することが好ましく、例えば、ＡＮＰの場合、カットオフは通常１０ｐｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の心不全マーカーを含む血液は、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５ｐｇ／ｍＬ以上１０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と１０ｐｇ／ｍＬ以上５０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の心不全マーカーの濃度であるので、１０ｐｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度１０ｐｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．２ｐｇ／ｍＬに相当するので０．１ｐｇ／ｍＬ以上０．２ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と０．２ｐｇ／ｍＬ以上１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３３】
また、ＢＮＰの場合、カットオフは通常４６ｐｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の心不全マーカーを含む血液は、少なくとも４６ｐｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、１０ｐｇ／ｍＬ以上４６ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と４６ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の心不全マーカーの濃度であるので、５ｐｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度４６ｐｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．９２ｐｇ／ｍＬに相当するので０．２ｐｇ／ｍＬ以上０．９２ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と０．９２ｐｇ／ｍＬ以上２．０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３４】
ＡＮＰ、ＢＮＰ以外の心不全マーカーのカットオフを列挙すると、例えば心筋ミオシン軽鎖：２．５ｎｇ／ｍＬ、トロポニンＴ：０．２５ｎｇ／ｍＬ、血清ミオグロビン：男性６０ｎｇ／ｍＬ，女性３５ｎｇ／ｍＬである。
【００３５】
（１）の方法では、検量線の作成に抽出操作から行う必要がある点及び検量線作成用の血液は長期間保存できないので測定の際に作成する煩わしさがあるが、抽出条件が変動しても正確な測定ができるという長所がある。一方、（２）の方法は、あらかじめ抽出率を求め、抽出操作等の条件を一定にすれば多量の検体を正確かつ簡便に測定することができる。（１）及び（２）の方法のうち、簡便さの観点から、（２）の方法が好ましい。
【００３６】
本発明の定量方法は、被検者自身で採血、担体に保持・乾燥、輸送（例えば、持参、郵便及び宅配便等）することができ、心機能の健康診断等のように多数の検体を広い地域から集めて定量する場合に最適である。又、心機能検診のほか、遠隔地の患者に対する心不全治療の経過観察等においても、適用できる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に心不全マーカー（ＡＮＰ）を定量できることを示したものである。
１．血液担持担体用濾紙の作成
精製水１ＬにＥＤＴＡ２ナトリウム塩１ｇ及びアプロチニン５０００００ＫＩＵを溶解した。この溶液を採血用濾紙（品番ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に濾紙の平方センチメートル当たり５０μＬの量で噴霧した。この濾紙を室温で自然乾燥し血液担持担体用濾紙とした。
【００３８】
２．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）の指先をよくマッサージ及び暖めて充血させておき消毒用ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させてから、ディスポーザブル・ランセット（商品名「ヘモレット」、ミドリ十字株式会社製）で穿刺し、最初の血滴を拭い去り、次の血滴２滴を被検者１人当たり１０枚の血液担持担体用濾紙にぞれぞれに指先から直接滴下し吸収させた。次いで、室内（２５±１℃、６５±５％ＲＨ）で風乾し（風乾時間５，２０，４０，６０又は１２０分）、血液担持担体（血乾燥濾紙）を得た。風燥時間毎に血液担持担体（血液乾燥濾紙）の重量を計測し、初期血液重量（濾紙重量を除いた値）に対する比を乾燥度を求めた（血液担持担体２枚の平均値）。この乾燥度を表１中に示した。
次いで、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
【００３９】
【表１】

【００４０】
３．抽出操作
以下の操作は温度２０〜２５℃の室内で実施した。表１の条件で保存した各血液担持担体（血乾燥濾紙）の血液担持部分の中心部を、直径６ｍｍの１穴パンチ（事務用として市販されている物）で打ち抜いて濾紙片を得た。試験管に打ち抜いた濾紙片及び塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（抽出用溶液）２５０μＬを加え、３０秒間攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ）した後、３０分間放置した。その後、３０秒間同様に攪拌した後１分間静置し、上清を分取して抽出液を調製し、これを心不全マーカーの定量に供した。
【００４１】
４．抽出液中の心不全マーカー（ＡＮＰ）の定量
定量用試薬としては、臨床検査薬として和光純薬工業株式会社より発売されている「α−ｈＡＮＰテストワコー」を用いた。抽出液中の心不全マーカー量を決定するための標準溶液は、「α−ｈＡＮＰテストワコー」に付属の標準α−ｈＡＮＰを用いた。本試薬は血漿中の心不全マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽出液中の心不全マーカーの定量の場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明のない試薬は「α−ｈＡＮＰテストワコー」の構成試薬を使用した。
【００４２】
１）試験管に抗α−ＡＮＰ抗体ビーズ１個、反応用緩衝液１５０μＬ及び検体１５０μＬを加え、１０℃、２０時間反応した。
２）反応液をアスピレーターで吸引除去し、試験管に洗浄液５００μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗浄を５回実施した。
３）ＰＯＤ標識抗体液３００μＬを試験管に加え、１０℃、２時間反応した。
４）２）と同様に洗浄を行った。
５）発光試薬Ａ［ルミノールナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１８ｇと、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇとを、０．１Ｍ−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）メチル／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１Ｌに溶解して作成］１５０μＬ及び発光試薬Ｂ［２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解して作成］１５０μＬを試験管に加え生じた発光量を計測（アロカ株式会社「ルミネッセントリーダーＢＬＲ−２０１」を使用）した。
６）既知濃度のＡＮＰを測定した場合の発光量で検量線を作成し、測定発光量を濃度値とした。
【００４３】
５．定量結果
定量結果及び次式で求めた安定度（％）を表２〜１１に示した。
（安定度）＝（所定保存期間後の定量値）×１００／（初期定量値）
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
【００４４】
【表２】

【００４５】
【表３】

【００４６】
【表４】

【００４７】
【表５】

【００４８】
【表６】

【００４９】
【表７】

【００５０】
【表８】

【００５１】
【表９】

【００５２】
【表１０】

【００５３】
【表１１】

【００５４】
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の心不全マーカー（抗原：ＡＮＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の心不全マーカー（抗原：ＡＮＰ）は安定であることが判った。
【００５５】
＜実施例２＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に心不全マーカー（ＢＮＰ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを心不全マーカーの定量に供した。ただし、抽出に用いる濾紙片は３枚とした。
【００５６】
３．抽出液中の心不全マーカー（ＢＮＰ）の定量
測定試薬は臨床検査薬として塩野義製薬式会社より発売されている「シオノリアＢＮＰ」を用いた。抽出液中の心不全マーカー量を決定するための標準溶液は、「シオノリアＢＮＰ」の構成試薬である標準ＢＮＰを用いた。本試薬は血漿中の心不全マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽出液中の心不全マーカーの定量の場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明の無い試薬は「シオノリアＢＮＰ」の構成試薬を使用した。
【００５７】
１）試験管に抗体ビーズ、緩衝液（１ｍＬ中にアプロチニン５００ＫＩＵ、カゼイン１０ｍｇを含むリン酸緩衝液）１００μＬ及び検体２００μＬを加え、５℃、２０時間反応した。
２）反応液をアスピレーターで吸引除去し、試験管に洗浄液５００μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗浄を５回実施した。
３）ヨウ化ＢＮＰ抗体溶液液３００μＬを試験管に加え、５℃、２０時間反応した。
４）２）と同様に洗浄を行った。
５）γ−カウンターで放射能カウントを計測した。
６）既知濃度のＢＮＰを測定した場合の放射能カウントで検量線を作成し、測定カウントを濃度値とした。
【００５８】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表１２〜２１に示した。なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
【００５９】
【表１２】

【００６０】
【表１３】

【００６１】
【表１４】

【００６２】
【表１５】

【００６３】
【表１６】

【００６４】
【表１７】

【００６５】
【表１８】

【００６６】
【表１９】

【００６７】
【表２０】

【００６８】
【表２１】

【００６９】
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の心不全マーカー（抗原：ＢＮＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の心不全マーカー（抗原：ＢＮＰ）は安定であることが判った。
【００７０】
＜実施例３＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＡＮＰ濃度と従来の方法によるＡＮＰ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＡＮＰ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「α−ｈＡＮＰテストワコー」の標準ＡＮＰ（０又は１０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＡＮＰ添加血液（０又は１０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。実施例１で作成した血液担持担体用濾紙に標準ＡＮＰ添加血液（１０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＡＮＰ添加血液担持担体▲２▼を作成した。同様にして、他一方の標準ＡＮＰ添加血液（０ｐｇ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００７１】
２．抽出及び測定
実施例１記載の抽出方法と同様にして、標準ＡＮＰ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＡＮＰ濃度を測定した。それらの結果を表２２に示した。
【００７２】
【表２２】

【００７３】
３．抽出率の設定
表２２に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表２２に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０２３６）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度
Ｂ：標準ＡＮＰ（１０００ｐｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度
Ｃ：１００ｐｇ／ｍＬ（添加したＡＮＰ量）
【００７４】
４．採血
心不全患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血２ｍＬをアプロチニン１０００ＫＩＵ及びＥＤＴＡ２ナトリウム塩３ｍｇの入った試験管に入れ混和後、直ちに冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血漿）部分を分取した。
【００７５】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００７６】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＡＮＰ濃度測定を実施した。一方、従来の方法で採取、分離した血漿については、実施例１記載の「α−ｈＡＮＰテストワコー」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した。
【００７７】
７．血液中のＡＮＰ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度を抽出率（０．０２３６）で除し、血液中のＡＮＰ濃度を求めた。従来の方法で求めた血清中のＡＮＰの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＡＮＰ濃度を表２３に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＡＮＰ濃度と従来法によるＡＮＰ濃度との相関図を図１に示した。図１から判るように、従来法での血漿中のＡＮＰ濃度と本発明の方法による血液中ＡＮＰ濃度は、良好な相関性を示した。図１中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＡＮＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＡＮＰ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００７８】
【表２３】

【００７９】
＜実施例４＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＢＮＰ濃度と従来の方法によるＢＮＰ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＢＮＰ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「シオノリアＢＮＰ」の標準ＢＮＰ（０又は２０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＢＮＰ添加血液を調製した。実施例１で作成した血液担持担体用濾紙に標準ＢＮＰ添加血液（２０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＢＮＰ添加血液担持担体▲２▼を作成した。同様にして、他一方の血液（０ｐｇ／ｍＬ）１００μＬｌを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００８０】
２．抽出及び測定
実施例２記載の抽出方法と同様にして、標準ＢＮＰ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＢＮＰ濃度を測定した。それらの結果を表２４に示した。
【００８１】
【表２４】

【００８２】
３．抽出率の設定
表２４に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表２４に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０９４３）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度
Ｂ：標準ＢＮＰ（２０００ｐｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度
Ｃ：２００ｐｇ／ｍＬ（添加したＢＮＰ量）
【００８３】
４．採血
心不全患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血２ｍＬをはアプロチニン１０００ＫＩＵ及びＥＤＴＡ２ナトリウム塩３ｍｇの入った試験管に入れ混和後、直ちに冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血漿）部分を分取した。
【００８４】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００８５】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＢＮＰ濃度測定を実施した。一方、従来の方法で採取、分離した血漿については、実施例１記載の「シオノリアＢＮＰで、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した。
【００８６】
７．血液中のＢＮＰ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度を抽出率（０．０９４３）で除し、血液中のＢＮＰ濃度を求めた。従来の方法で求めた血漿中のＢＮＰの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＢＮＰ濃度を表２５に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＢＮＰ濃度と従来法によるＢＮＰ濃度との相関図を図２に示した。図２から判るように、従来法での血漿中のＢＮＰ濃度と本発明の方法による血液中ＢＮＰ濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＢＮＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＢＮＰ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００８７】
【表２５】

【００８８】
【発明の効果】
本発明の血液中の心不全マーカーの定量方法によると、心不全マーカーを極めて簡易に定量することができる。
さらに、被検者自身で採血することができるので採血のための熟練者等が不要であり、被検者が採血のため病院等に出向く必要もないという簡便性も併せもつものである。
また、血液担持担体は、簡単に輸送することができるので、多数の検体を一ヶ所に集めて測定することができ輸送及び測定のコストを低減させることができる等の効果がある。
従って、本発明の定量方法は、心機能の健康診断等の多数の検体を広い地域から集めて測定する場合に最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の方法による血漿中のＡＮＰ濃度と本発明の方法による血液中のＡＮＰ濃度との相関を表すグラフである。
【図２】従来の方法による血漿中のＢＮＰ濃度と本発明の方法による血液中のＡＮＰ濃度との相関を表すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for quantifying a heart failure marker in blood. More specifically, the present invention relates to a method for quantifying a heart failure marker in blood used for diagnosis of heart failure caused by atrial load, ventricular load, myocardial hypertrophy, myocardial ischemia or / and myocardial necrosis.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a method for quantifying a heart failure marker, a blood collection syringe is used to collect 2 mL or more of whole blood from a patient's median cubital vein into a blood collection tube containing an anticoagulant, and after mixing, 1500 G in a cooling centrifuge, A method of centrifuging for 10 minutes to separate a plasma part and a blood cell part, separating a supernatant (plasma) part into another test tube, and quantifying this as a measurement specimen is known (for example, a clinical laboratory manual, 1988, Bunkodo, pages 311 to 316). Furthermore, in order to efficiently perform the measurement, a method of quantifying a certain amount of the measurement sample by freezing or refrigerated storage is known (for example, immunoassay, 1984, JMC, 173-3). 174). This method is used particularly for diagnosis of chronic heart failure and diagnosis of recovery from acute heart failure. In acute heart failure, for example, acute myocardial infarction, diagnosis is urgent. Therefore, a method of performing measurement immediately after the plasma separation or a rapid measurement such as immunochromatography immediately after blood collection (for example, a product “Triage” manufactured by Biosite Diagnostics Inc. Measurement using “CARUDIAC PANEL”).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In the conventional method, when blood is collected from a large number of subjects such as medical examinations and heart failure markers in blood are measured, it is necessary to separate the supernatant from the large number of blood, and the separated plasma is refrigerated in a test tube. In addition, there is a problem that the cost becomes high, for example, it is necessary to transport and store it in a frozen state. In addition, rapid measurement such as immunochromatography used for diagnosis of acute heart failure is effective for diagnosis at the onset of acute heart failure, but the cost is high for recovery period or long-term follow-up, and many samples. There was a problem in that it was not suitable for measurement. That is, an object of the present invention is to provide a method for easily quantifying a heart failure marker. In particular, it is an object to provide a method for easily quantifying a heart failure marker for chronic heart failure that does not require urgency for diagnosis.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor has found that a heart failure marker can be easily quantified by using a specific method, and has reached the present invention. That is, the feature of the method for quantifying a heart failure marker in blood according to the present invention is that a blood component is extracted from a blood carrier, and the heart failure marker is quantified from the heart failure marker concentration in the extract and the extraction rate of the heart failure marker. Is the gist. The extraction rate was extracted from a blood carrier (1) prepared using blood and a blood carrier (2) prepared using added blood obtained by adding a heart failure marker of a known concentration to blood. The content of the heart failure marker in the liquid is quantified, and the concentration of the heart failure marker in the extract {A: the concentration in the extract extracted from the carrier (1), B: in the extract extracted from the carrier (2) Density | concentration} is calculated | required and it calculates | requires from following Formula.
(Extraction rate) = (B−A) / (Concentration of heart failure marker added to blood)
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The heart failure marker in the present invention is a heart failure marker for diagnosing heart failure caused by atrial load, ventricular load, myocardial hypertrophy, myocardial ischemia or / and myocardial necrosis. Examples of heart failure include chronic heart failure and acute heart failure, and among these, particularly suitable for chronic heart failure. Examples of heart failure markers for diagnosing heart failure include atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), myocardial myosin light chain, troponin T, and serum myoglobin. It is done. Of these, from the viewpoint of high specificity for chronic heart failure, atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP) and C-type natriuretic peptide (CNP) are preferable, and atrial sodium is more preferable. Diuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP).
[0006]
There is no restriction on the collection site and collection method of blood in the blood carrier, and the conventional collection site and collection method (for example, collecting 2 mL or more of whole blood mainly from the median cubital vein using a blood collection syringe) It is of course possible to use a part of the blood obtained in the present invention in the present invention, but from the viewpoint of reducing invasiveness to the subject, the blood is preferably collected from the peripheral blood vessel, and is collected from the peripheral blood vessel. Among these, from the viewpoint of reducing the invasiveness of the subject, blood collected by puncturing the earlobe or fingertip is more preferable, the subject can collect blood by himself, the point of less pain at the time of puncture, and the blood is liquid From the viewpoint of easy collection (dropping) as a drop, blood collected by puncturing a fingertip is particularly preferable.
[0007]
The method for collecting peripheral blood is not particularly limited as long as blood can be collected. From the viewpoint that it can be performed by the subject himself / herself, for example, the part of the subject (eg, earlobe and fingertip) is punctured. It is preferable to massage and / or warm in advance before congesting, wipe the puncture site with disinfecting gauze and dry, and puncture the site with a disposable lancet to obtain blood.
[0008]
The carrier in the blood-carrying carrier is not particularly limited as long as it can hold blood, but the material and shape of the carrier are not particularly limited, but it is easy to hold blood by adsorption and blood components are easily eluted by extraction. The material and shape are preferable, and from the viewpoint of easy retention by adsorption, an absorber is more preferable.
[0009]
It is preferable that the carrier contains an anticoagulant for blood and / or a protease inhibitor in advance. Examples of the anticoagulant for blood include heparin sodium, EDTA sodium salt, sodium citrate and sodium fluoride. Of these, EDTA sodium salt is preferred. Examples of the protease inhibitor include amastatin, antipain, antithrombin III, calpeptin, PMSF, and aprotinin. Among these, PMSF and aprotinin are preferable.
[0010]
When a blood anticoagulant is used, the content of the anticoagulant can be appropriately set according to the amount of body fluid that the porous material can hold, and is preferably 0.1 mg or more, more preferably 1 mg or more, per 1 mL of body fluid. And it sets so that it may become 100 mg or less preferably, more preferably 10 mg or less. The content of the protease inhibitor can be appropriately set according to the amount of body fluid that the porous material can hold, and is preferably 0.01 mg or more, more preferably 0.1 mg or more, and preferably 100 mg or less per mL of body fluid. More preferably, it is set to 10 mg or less.
[0011]
Examples of the method of adding an anticoagulant to blood and / or an inhibitor of proteolytic enzyme in the carrier in advance include, for example, a method of spraying a solution containing an anticoagulant and an inhibitor and then drying the carrier, an anticoagulant and an inhibitor. A method of drying after immersing the carrier in a solution containing the agent can be applied. The solvent for dissolving the anticoagulant and / or inhibitor can be appropriately selected depending on the solubility of the anticoagulant and / or inhibitor. In the case of a water-soluble anticoagulant and / or inhibitor, distilled water, deionized water, physiological saline, phosphate buffer, Good's buffer, etc. can be used, and a water-insoluble anticoagulant and / or inhibitor is used. In the case of the agent, an appropriate organic solvent, for example, PMSF, ethanol and acetone can be used. Of these, distilled water and deionized water are preferred when water-soluble. In the case of water-insoluble, the preferred solvent varies depending on the type of protease inhibitor and the like, but in the case of PMSF, it is ethanol.
The content (mg / mL) of the anticoagulant in the solution can be appropriately set depending on the type of the anticoagulant, but is preferably 0.01 or more, more preferably 0.1 or more per 1 mL of the solution. Moreover, 100 or less is preferable, More preferably, it is 10 or less.
[00012]
The inhibitor content (mg / mL) in the solution can be appropriately set depending on the type of the inhibitor, but is preferably 0.01 mg or more, more preferably 0.1 mg or more, and preferably 100 mg or less per 1 mL of the solution. More preferably, it is 10 mg or less.
[0013]
As the material of the carrier, known natural polymers and synthetic polymers can be used, for example, cotton, wool, cellulose, polystyrene, polyolefin, polyurethane, nitrocellulose, cellulose acetate, polyester, epoxy resin, phenol resin, silk, Examples include fibroin, lignin, hemicellulose, chitin, ebonite, rubber, glass, quartz, and ceramics. Of these, natural polymers are preferable, cellulose and cotton are more preferable, and cellulose is particularly preferable.
[0014]
As the carrier, known ones can be used, and examples thereof include filter paper made of the above materials and the like, an absorbent body made of a nonwoven fabric, a woven fabric, or a sheet-like foam. Examples of the filter paper include filter paper defined in JIS P3801 (1995) or TAPPI (Technical Association of the Pulp and Paper Industry) T205. Examples of the nonwoven fabric include polyolefin nonwoven fabric, nitrocellulose nonwoven fabric, cell sole acetate nonwoven fabric, polyester nonwoven fabric, epoxy nonwoven fabric, glass nonwoven fabric, and ceramic nonwoven fabric. Examples of the woven cloth include cotton cloth, wool cloth, cellulose cloth, polyolefin cloth, nitrocellulose cloth, cellulose acetate cloth, epoxy cloth, glass cloth, and ceramic cloth. Examples of the sheet-like foam include foamed polystyrene, foamed polyolefin, foamed polyurethane, foamed polyester, foamed epoxy resin, foamed glass, and foamed ceramic. Among these, from the viewpoint that the amount of blood absorbed per unit volume or unit area tends to be constant (improvement of quantitative accuracy), filter paper, non-woven fabric and sheet-like foam are preferred, filter paper and non-woven fabric are more preferred, and particularly preferred Is filter paper.
[0015]
The thickness (mm) of the filter paper, non-woven fabric, woven fabric or sheet-like foam can be selected as appropriate, but is preferably 0.1 or more, more preferably 0.2 or more, and particularly preferably 0.3 or more. It is. Moreover, 3.0 or less is preferable, More preferably, it is 1.0 or less, Most preferably, it is 0.6 or less. Size of filter paper, non-woven fabric, woven fabric or sheet-like foam (area cm) ² ) Can be freely set in consideration of operability during blood collection, storage and transportation, but is preferably 1 or more, more preferably 10 or more, and particularly preferably 25 or more. Moreover, 200 or less is preferable, More preferably, it is 150 or less, Most preferably, it is 100 or less. The pore size of the absorber can be freely set and selected, but the average pore size (μm) of the absorber is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, and particularly preferably 5 or more. Moreover, 100 or less is preferable, More preferably, it is 80 or less, Most preferably, it is 50 or less.
[0016]
The support of blood on the carrier is not particularly limited as long as the blood can be retained, and the carrier can be supported by bringing the carrier into contact with blood. Examples of the method of bringing the carrier into contact with blood include a method of immersing the carrier in blood, a method of dropping blood on the carrier, and a method of pressing the carrier against the puncture site. Of these, from the viewpoint of simplicity, the method of dropping blood on the carrier and the method of pressing the carrier against the puncture site are preferred, and the method of dropping blood on the carrier is more preferred.
[0017]
When the carrier is immersed in blood, the amount of blood used (ml) is the amount that the carrier can be immersed in, and is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.05 or more, more preferably 0.1 or more, especially Preferably it is 0.15 or more. Moreover, 2 or less is preferable, More preferably, it is 1 or less, Most preferably, it is 0.5 or less. When blood is dropped onto the carrier, the amount of blood used (ml) is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, particularly preferably 0.1 or more. . Moreover, 0.5 or less is preferable, More preferably, it is 0.3 or less, Most preferably, it is 0.2 or less. When the carrier is pressed against the puncture site, the amount of blood used (ml) is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, particularly preferably 0.1 or more. . Moreover, 0.5 or less is preferable, More preferably, it is 0.3 or less, Most preferably, it is 0.2 or less.
[0018]
When the blood carrying portion of the blood carrying carrier is cut to a certain size (described later), it is sufficient to drop more blood than the amount that can be held by the cut carrier, and it is not necessary to accurately control the dropped blood volume. For example, when the filter paper is BFC180 (thickness 0.49 mm) manufactured by Whatman, if the amount of dropped blood is 50 μL, the size of the portion holding the blood is about 12 mm in diameter. Since the amount of one drop is about 40 to 60 μL, when the blood-carrying portion is punched into a circle having a diameter of 6 mm, the required amount of blood is 1 to 2 drops.
[0019]
Further, from the viewpoint of blood stability and quantitative reproducibility, it is preferable that blood is retained on a carrier and then dried, and the weight of blood retained on the carrier is 50% by weight or less (preferably 30% by weight or less). It is further preferred to dry until As the drying method, for example, vacuum drying, freezing vacuum drying, fine heating drying and simple drying (air drying) can be applied, and among these, vacuum drying, freezing vacuum drying and simple drying are preferable, and vacuum drying and more preferable. Simple drying, particularly preferably simple drying.
[0020]
Drying is preferably performed under conditions that do not change the immunoreactivity of the heart failure marker, more preferably at a temperature of 40 ° C. or less, and particularly preferably at 30 ° C. or less. Moreover, it is preferable to carry out at 0 degreeC or more, More preferably, it is 10 degreeC or more. When reducing the pressure, the pressure (Pa) is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, and particularly preferably 0.1 or more. Moreover, 10 or less is preferable, More preferably, it is 2 or less, Most preferably, it is 1 or less. The humidity (% RH) for simple drying is not particularly limited, but is preferably 10 or more, and more preferably 40 or more. Moreover, 90 or less is preferable, More preferably, it is 80 or less. The drying time can be appropriately set depending on the shape of the carrier and the amount of blood held, but when the carrier is filter paper, it is about 20 minutes to 1 hour.
[0021]
When storing the blood retention carrier, the humidity (% RH) is preferably 80, more preferably 60 or less, and particularly preferably 40 or less. Moreover, 5 or more are preferable, More preferably, it is 10 or more, Most preferably, it is 20 or more. In this case, the temperature (° C.) is preferably 0 or more, more preferably 1 or more, and particularly preferably 2 or more. Moreover, 40 or less is preferable, More preferably, it is 30 or less, Most preferably, it is 10 or less. In addition, it can be transported by mail or courier as long as the humidity can be maintained at 80% RH or less (under sealing, under the presence of a desiccant).
[0022]
Prior to extraction of blood components, it is preferable to cut the blood-carrying part of the blood-carrying carrier to a certain size. For example, it is preferable to use a method in which blood is dropped on a uniform absorbent body, excess blood is diffused and absorbed in the surroundings, dried, and the center portion is cut into a fixed shape for extraction. As a cutting method, a method of punching with a punch having a constant diameter, a method of cutting along a cut line (perforation or the like) that has been put in advance, and the like can be applied.
[0023]
Extraction of blood components from the blood carrier can be performed without particular limitation as long as the immunoreactivity of the heart failure marker (antigen) in the blood does not change. For example, the blood carrier is immersed in an extraction solution and the supernatant is obtained. Can be used as an extract. As the extraction solution, a buffer solution having a neutral pH range can be used. For example, a Good buffer solution having a pH of 6-8 and a phosphate buffer solution having a pH of 6-8 are preferably used.
[0024]
In addition, salts, surfactants, proteins, antigen stabilizers, and the like can be added to the extraction solution. Examples of the salt include sodium chloride, potassium chloride, lithium bromide and the like. Examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan lauric acid monoester ethylene oxide adduct (for example, Tween 20 and Tween 40 (ICI America)). Examples of the protein include bovine serum albumin and casein. Examples of the antigen stabilizer include chelating agents such as EDTA and protease inhibitors.
[0025]
From the viewpoint of quantitative reproducibility, it is necessary to make the extraction conditions such as the amount of the extraction solution used for the carrier and the extraction time constant. The amount (ml) of the extraction solution used is preferably 0.05 or more, more preferably 0.1 or more, and particularly preferably 0.2 or more per blood carrier. Moreover, 5 or less is preferable, More preferably, it is 1 or less, Most preferably, it is 0.5 or less. The extraction time (minute) is preferably 0.5 or more, more preferably 1 or more, and particularly preferably 5 or more. Moreover, 480 or less is preferable, More preferably, it is 180 or less, Especially preferably, it is 60 or less. Stirring is preferably performed by shaking the container using a device such as a vortex mixer, and the number of shaking is preferably 100 to 2000 rpm.
[0026]
For example, in the case of a filter paper (BFC180 manufactured by Whatman Co., Ltd.) having a diameter of 6 mm (thickness 0.49 mm) cut from a blood carrier, extraction can be performed under the following conditions.
Solution composition for extraction: 0.05 mol / L phosphate buffer solution (pH 7.2) containing sodium chloride (content of sodium chloride: 0.85 g per 100 mL of buffer solution, the same shall apply hereinafter)
Use amount of extraction solution: 200 to 300 μL
Extraction temperature: room temperature (15-25 ° C)
Extraction time: 20 minutes to 1 hour (standing time after stirring)
Extraction operation: An extraction solution is added to a carrier, and the mixture is stirred with a vortex mixer (500 rpm, 1 minute) and left at the above temperature for the above time. The mixture is stirred again (500 rpm, 5 seconds with a vortex mixer), allowed to stand for 1 minute, and the dispersed filter paper fibers are allowed to settle. Then, the supernatant is collected and used as a specimen (extract) for measuring heart failure markers.
[0027]
The method for quantifying the heart failure marker in the extract is not particularly limited, but an immunoassay is preferable from the viewpoint of reproducibility of the quantified value and measurement sensitivity. Conventionally known methods can be used as immunological measurement methods. However, since the heart failure marker concentration in the extract is lower than that in blood, a measurement method with higher quantitative sensitivity is desirable. For example, radioimmunoassay (RIA), Enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA) and chemiluminescence immunoassay (CLIA) are preferred. Examples of radioimmunoassay (RIA) include a two-site sandwich measurement method using a solid phase antibody and an I125-labeled antibody, and many measurement reagent kits are commercially available. Examples of enzyme immunoassay (EIA) include a two-site sandwich assay using a solid phase antibody and an enzyme-labeled antibody, and various measurement reagent kits using peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase and the like as commercially available enzymes are commercially available. Has been. Examples of the fluorescence immunoassay (FIA) include a two-site sandwich measurement method using a solid phase antibody and a europium labeled antibody. Examples of chemiluminescence immunoassay (CLIA) include a two-site sandwich assay using a solid phase antibody and an acridinium ester-labeled antibody, and various measurement reagent kits are commercially available. Among these immunoassays, the enzyme immunoassay (EIA) is preferred, and the chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) is more preferred.
[0028]
Various methods can be applied to determine the concentration of the heart failure marker in the blood from the concentration of the heart failure marker in the extract. For example, (1) using a blood-carrying carrier supporting blood with a known concentration of the heart failure marker Examples thereof include a method using the prepared calibration curve, and (2) a method using a calibration curve prepared using an extract with a known heart failure marker concentration and the heart failure marker extraction rate.
[0029]
In the method of (2), the extraction rate is determined by preparing a blood carrier using blood containing a heart failure marker of a known concentration, and quantifying the content of the heart failure marker in the extract extracted from the blood carrier. The concentration of the marker is obtained and is obtained from the following formula. For the extraction rate, it is preferable to perform the above operations at least twice (preferably at least three times) and use an average value thereof.
Extraction rate = (concentration of heart failure marker in extract) / (concentration of heart failure marker in blood)
The heart failure marker concentration in the blood of the specimen can be obtained by dividing the heart failure marker concentration in the extract prepared from the specimen by the extraction rate. At that time, the conditions for preparation and extraction of the blood carrier are extracted. The conditions must be the same as when the rate was calculated.
[0030]
In addition, since the heart failure marker quantified in the present invention exists in the blood at a very low concentration, the variation of the extraction rate due to the variation of the concentration is extremely small. For example, in the case of ANP, 0.2 to 100 pg The same extraction rate can be used in the range of / mL. In the case of a high-concentration sample exceeding 100 pg / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (ie, in the case of ANP, judgment of heart failure) (The boundary concentration at which the heart function is determined to be in a heart failure state) is 10 pg / mL, and if it exceeds 100 pg / mL, it is positive in the determination of heart failure.)
[0031]
In the case of BNP, the same extraction rate can be used in the range of 5 to 4,000 pg / mL. In the case of a high concentration sample exceeding 4,000 pg / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (ie, in the case of BNP, heart failure The boundary concentration in the determination of 46 is 46 pg / mL, and if it exceeds 4,000 pg / mL, it is positive in the determination of heart failure.) The same applies to heart failure markers other than ANP and BNP, and clinical judgment is not affected by the difference in extraction rate depending on the concentration of heart failure markers.
[0032]
In any of the methods (1) and (2), it is preferable to use two or more blood or extracts containing different concentrations of heart failure markers.
The concentration of blood or extract containing a known concentration of heart failure marker can be freely set according to the type of heart failure marker to be measured, but usually it is the boundary between the range of normal subjects (normal range) and the range that is likely to have heart failure It is preferable to set the concentration (cutoff) at a concentration that can be clearly measured. For example, in the case of ANP, the cutoff is usually around 10 pg / mL. It is preferable to set two concentrations (for example, a concentration of 5 pg / mL or more and less than 10 pg / mL and a concentration of 10 pg / mL or more and less than 50 pg / mL) with the contained blood at least 10 pg / mL. In the case of the method (2), since it is the concentration of the heart failure marker in the extract, two concentrations considering the extraction rate based on 10 pg / mL (for example, when the extraction rate is 0.02, Since a concentration of 10 pg / mL corresponds to a concentration of 0.2 pg / mL in the extract, set it to a concentration of 0.1 pg / mL or more and less than 0.2 pg / mL and a concentration of 0.2 pg / mL or more and less than 1 pg / mL). Is preferred.
[0033]
In the case of BNP, the cut-off is usually around 46 pg / mL. Therefore, in the case of the method (1), blood containing a known concentration of heart failure marker has two concentrations (for example, 10 pg / mL) sandwiching at least 46 pg / mL. It is preferable to set a concentration of not less than 46 mL / mL and a concentration of not less than 46 pg / mL but less than 100 pg / mL. In the case of the method (2), since it is the concentration of the heart failure marker in the extract, 2 concentrations considering the extraction rate based on 5 pg / mL (for example, when the extraction rate is 0.02, The concentration of 46 pg / mL is equivalent to 0.92 pg / mL in the extract, so it is set to 0.2 pg / mL or more and less than 0.92 pg / mL and 0.92 pg / mL or more and less than 2.0 pg / mL). It is preferable to do.
[0034]
The cutoffs of heart failure markers other than ANP and BNP are listed, for example, cardiac myosin light chain: 2.5 ng / mL, troponin T: 0.25 ng / mL, serum myoglobin: male 60 ng / mL, female 35 ng / mL.
[0035]
In the method (1), it is necessary to perform the calibration curve from the extraction operation and the blood for creating the calibration curve cannot be stored for a long period of time. However, it has the advantage of being able to measure accurately. On the other hand, in the method (2), a large amount of specimens can be measured accurately and simply by obtaining the extraction rate in advance and making the conditions such as the extraction operation constant. Of the methods (1) and (2), the method (2) is preferable from the viewpoint of simplicity.
[0036]
The quantification method of the present invention allows the subject to collect blood, hold / dry on a carrier, transport (for example, bring-in, mail, courier etc.), Ideal for collecting and quantifying from a wide area. In addition to cardiac function examinations, it can also be applied to the follow-up of heart failure treatment for patients at remote locations.
[0037]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
<Example 1>
This example shows that the heart failure marker (ANP) can be accurately quantified even if the blood carrier is stored for a long period of time.
1. Preparation of filter paper for blood carrier
1 g of EDTA disodium salt and 500,000 KIU of aprotinin were dissolved in 1 L of purified water. This solution was sprayed on a filter paper for blood collection (product number BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.) in an amount of 50 μL per square centimeter of the filter paper. This filter paper was naturally dried at room temperature to obtain a filter paper for blood carrying carrier.
[0038]
2. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
Massage and warm the fingertips of 6 volunteers (subjects A to F), allow them to become congested, wipe the puncture site with a disinfecting gauze and dry it, then dispose of the disposable lancet (trade name “Hemolet”, Midori Cross Co., Ltd.) The first blood drop was wiped off, and the next 2 blood drops were directly dropped from the fingertips to 10 blood-supporting carrier filter papers per subject and absorbed. Subsequently, it was air-dried indoors (25 ± 1 ° C., 65 ± 5% RH) (air-

drying time

5, 20, 40, 60 or 120 minutes) to obtain a blood carrier (blood-dried filter paper). The weight of the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) was measured at each drying time, and the degree of dryness was determined from the ratio to the initial blood weight (value excluding the filter paper weight) (average value of two blood-carrying carriers). The dryness is shown in Table 1.
Next, the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) was stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
[0039]
[Table 1]

[0040]
3. Extraction operation
The following operations were performed in a room at a temperature of 20 to 25 ° C. The central part of the blood-carrying part of each blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) stored under the conditions shown in Table 1 was punched with a one-hole punch (commercially available for office use) having a diameter of 6 mm to obtain a piece of filter paper. Add 250 μL of filter paper punched into a test tube and sodium chloride-containing 0.05 mol / L phosphate buffer (pH 7.2) (extraction solution) and stir for 30 seconds (500 rpm with a vortex mixer), then leave for 30 minutes did. Thereafter, the mixture was stirred in the same manner for 30 seconds and then allowed to stand for 1 minute. The supernatant was collected to prepare an extract, which was used for quantification of a heart failure marker.
[0041]
4). Quantification of heart failure marker (ANP) in the extract
As the quantitative reagent, “α-hANP Test Wako” marketed by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. as a clinical test agent was used. The standard α-hANP attached to “α-hANP Test Wako” was used as a standard solution for determining the amount of heart failure marker in the extract. This reagent is a clinical test drug for measuring the heart failure marker concentration in plasma, and in the case of quantifying the heart failure marker in the extract, the measurement sensitivity is insufficient. The measurement was changed as described above. As reagents not specifically described, constituent reagents of “α-hANP Test Wako” were used.
[0042]
1) One anti-α-ANP antibody bead, 150 μL of reaction buffer and 150 μL of sample were added to a test tube, and reacted at 10 ° C. for 20 hours.
2) The reaction solution was removed by suction with an aspirator, and washed by putting 500 μL of the cleaning solution into a test tube and suctioning. This washing was performed 5 times.
3) 300 μL of the POD-labeled antibody solution was added to the test tube and reacted at 10 ° C. for 2 hours.
4) Washing was performed in the same manner as 2).
5) 0.1M-N, N-bis (2-hydroxyethyl) containing 0.18 g of luminescent reagent A [luminol sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1 g of 4- (cyanomethylthio) phenol ) Prepared by dissolving in 1 L of methyl / sodium hydroxide buffer (pH 8.5)] 150 μL and Luminescent Reagent B [Created by dissolving 200 μl of 35% hydrogen peroxide in 1 liter of deionized water] 150 μL In addition to the above, the amount of luminescence generated was measured (using “Lumincent Reader BLR-201” by Aloka Co., Ltd.).
6) A calibration curve was created with the amount of luminescence when ANP at a known concentration was measured, and the measured amount of luminescence was used as the concentration value.
[0043]
5. Quantitative results
The quantification results and the stability (%) determined by the following formula are shown in Tables 2-11.
(Stability) = (Quantitative value after a predetermined storage period) × 100 / (initial quantitative value)
The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
[0044]
[Table 2]

[0045]
[Table 3]

[0046]
[Table 4]

[0047]
[Table 5]

[0048]
[Table 6]

[0049]
[Table 7]

[0050]
[Table 8]

[0051]
[Table 9]

[0052]
[Table 10]

[0053]
[Table 11]

[0054]
The heart failure marker (antigen: ANP) in the extract obtained from the blood carrier (blood dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days. Therefore, it was found that the heart failure marker (antigen: ANP) in the blood carrier (blood dried filter paper) was stable when the drying time was 20 minutes or more.
[0055]
<Example 2>
This example shows that the heart failure marker (BNP) can be accurately quantified even if the blood carrier is stored for a long period of time.
1. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
In the same manner as in Example 1, blood carriers (blood-dried filter paper) were prepared from 6 volunteers (subjects A to F) and stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
2. Extraction operation
In the same manner as in Example 1, an extract was prepared and used for quantification of a heart failure marker. However, three filter paper pieces were used for extraction.
[0056]
3. Quantification of heart failure marker (BNP) in extract
As a measuring reagent, “Shionoria BNP” marketed by Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd. was used as a clinical test agent. As a standard solution for determining the amount of heart failure marker in the extract, standard BNP, which is a constituent reagent of “Shionoria BNP”, was used. This reagent is a clinical test drug for measuring the heart failure marker concentration in plasma, and in the case of quantifying the heart failure marker in the extract, the measurement sensitivity is insufficient. The measurement was changed as described above. As reagents not specifically described, constituent reagents of “Shionoria BNP” were used.
[0057]
1) 100 μL of antibody beads and buffer solution (phosphate buffer solution containing 500 mg of aprotinin and 10 mg of casein in 1 mL) and 200 μL of specimen were added to a test tube and reacted at 5 ° C. for 20 hours.
2) The reaction solution was removed by suction with an aspirator, and washed by putting 500 μL of the cleaning solution into a test tube and suctioning. This washing was performed 5 times.
3) 300 μL of iodinated BNP antibody solution was added to the test tube and reacted at 5 ° C. for 20 hours.
4) Washing was performed in the same manner as 2).
5) The radioactivity count was measured with a γ-counter.
6) A calibration curve was created with the radioactivity count when BNP at a known concentration was measured, and the measurement count was taken as the concentration value.
[0058]
4). Quantitative results
The quantification results and the stability determined in the same manner as in Example 1 are shown in Tables 12-21. The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
[0059]
[Table 12]

[0060]
[Table 13]

[0061]
[Table 14]

[0062]
[Table 15]

[0063]
[Table 16]

[0064]
[Table 17]

[0065]
[Table 18]

[0066]
[Table 19]

[0067]
[Table 20]

[0068]
[Table 21]

[0069]
The heart failure marker (antigen: BNP) in the extract obtained from the blood carrier (blood dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days. Therefore, it was found that the heart failure marker (antigen: BNP) in the blood carrier (blood dried filter paper) was stable when the drying time was 20 minutes or more.
[0070]
<Example 3>
This example shows that there is a good correlation between the ANP concentration obtained by the method of the present invention and the ANP concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of standard ANP-added blood carrier
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL × 2, and one of them was a standard ANP of “α-hANP Test Wako” (0 or 1000 pg / mL). ) Was added to prepare a standard ANP-added blood (0 or 1000 pg / mL). 100 μL of standard ANP-added blood (1000 pg / mL) was dropped on the blood-supporting carrier filter paper prepared in Example 1, and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard ANP-added blood supporting carrier (2). did. Similarly, 100 μL of the other standard ANP-added blood (0 pg / mL) was dropped onto a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0071]
2. Extraction and measurement
In the same manner as in the extraction method described in Example 1, extract solutions were prepared from the standard ANP-added blood carrier (1) and blood carrier (2), and the ANP concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 22.
[0072]
[Table 22]

[0073]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 22, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 22. The average value of the extraction rates of five blood samples was set as the extraction rate (0.0236) when created and extracted under the present conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: ANP concentration in the extract prepared from blood carrier (1)
B: ANP concentration in the extract prepared from the blood carrier carrying standard ANP (1000 pg / mL)
C: 100 pg / mL (amount of ANP added)
[0074]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including heart failure patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. Place 2 mL of whole blood collected from the median cubital vein into a test tube containing 1000 mg of aprotinin and 3 mg of EDTA disodium salt. I took it.
[0075]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0076]
6). Extraction and quantification
For the blood-bearing carrier, extraction and ANP concentration measurement were performed by the same method as in the case of setting the extraction rate. On the other hand, plasma collected and separated by a conventional method was measured with “α-hANP Test Wako” described in Example 1 under the conditions described in the instructions attached to the measurement reagent.
[0077]
7. Determination of ANP concentration in blood
The ANP concentration in the extract prepared from the blood carrier was divided by the extraction rate (0.0236) to obtain the ANP concentration in the blood. Table 23 shows the concentration of ANP in serum determined by the conventional method and the concentration of ANP in blood determined by the method of the present invention. Further, using these values, a correlation diagram between the ANP concentration by the method of the present invention and the ANP concentration by the conventional method is shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, the ANP concentration in plasma by the conventional method and the ANP concentration in blood by the method of the present invention showed a good correlation. In FIG. 1, the equation represents a correlation equation (X: ANP concentration in the conventional method, Y: ANP concentration in the method of the present invention), and R represents a correlation coefficient.
[0078]
[Table 23]

[0079]
<Example 4>
This example shows that there is a good correlation between the BNP concentration obtained by the method of the present invention and the BNP concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of blood carrier with standard BNP added
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL x 2 tubes, and 100 μL of “Shionoria BNP” standard BNP (0 or 2000 pg / mL) was added to one of them. In addition, standard BNP-added blood was prepared. 100 μL of standard BNP-added blood (2000 pg / mL) was dropped on the blood-supporting carrier filter paper prepared in Example 1, and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard BNP-added blood supporting carrier (2). did. Similarly, 100 μLl of the other blood (0 pg / mL) was dropped on a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0080]
2. Extraction and measurement
In the same manner as the extraction method described in Example 2, extracts were prepared from the standard BNP-added blood carrier (1) and blood carrier (2), and the BNP concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 24.
[0081]
[Table 24]

[0082]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 24, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 24. The average value of the extraction rates of five blood samples was set as the extraction rate (0.0943) when created and extracted under the present conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: BNP concentration in the extract prepared from blood-carrying carrier (1)
B: BNP concentration in the extract prepared from a blood-supporting carrier supplemented with standard BNP (2000 pg / mL)
C: 200 pg / mL (amount of added BNP)
[0083]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including heart failure patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. 2 mL of whole blood collected from the median cubital vein is mixed in a test tube containing 1000 mg of aprotinin and 3 mg of EDTA disodium salt, and immediately cooled and centrifuged at 1500 G for 10 minutes in a refrigerated centrifuge. Sorted.
[0084]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0085]
6). Extraction and quantification
For the blood-bearing carrier, extraction and BNP concentration measurement were performed by the same method as in the case of setting the extraction rate. On the other hand, plasma collected and separated by a conventional method was measured with “Shionoria BNP as described in Example 1 under the conditions described in the instructions attached to the measurement reagent.
[0086]
7. Determination of BNP concentration in blood
The BNP concentration in the extract prepared from the blood carrier was divided by the extraction rate (0.0943) to obtain the BNP concentration in the blood. Table 25 shows the concentration of BNP in plasma determined by the conventional method and the concentration of BNP in blood determined by the method of the present invention. Further, FIG. 2 shows a correlation diagram between the BNP concentration according to the method of the present invention and the BNP concentration according to the conventional method using these values. As can be seen from FIG. 2, there was a good correlation between the BNP concentration in plasma by the conventional method and the BNP concentration in blood by the method of the present invention. In FIG. 2, the equation represents a correlation equation (X: BNP concentration in the conventional method, Y: BNP concentration in the method of the present invention), and R represents a correlation coefficient.
[0087]
[Table 25]

[0088]
【The invention's effect】
According to the method for quantifying a heart failure marker in blood of the present invention, the heart failure marker can be quantified very easily.
Furthermore, since the subject can collect blood by himself / herself, an expert or the like for blood collection is unnecessary, and the subject does not need to go to a hospital or the like for blood collection.
In addition, since the blood-carrying carrier can be easily transported, it is possible to collect and measure a large number of specimens in one place and to reduce the cost of transportation and measurement.
Therefore, the quantification method of the present invention is optimal for collecting and measuring a large number of specimens from a wide area, such as a health checkup for cardiac function.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing a correlation between ANP concentration in plasma by a conventional method and ANP concentration in blood by the method of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the correlation between the BNP concentration in plasma by the conventional method and the ANP concentration in blood by the method of the present invention.

Claims

A method for quantifying a heart failure marker in blood, comprising extracting a blood component from a blood carrier and quantifying the heart failure marker from a heart failure marker concentration in the extract and an extraction rate of the heart failure marker.
The extraction rate is determined in the extracts extracted from the blood-carrying carrier (1) prepared using blood and the blood-carrying carrier (2) prepared using added blood obtained by adding a heart failure marker of a known concentration to blood. Concentration of the heart failure marker in the extract and concentration of the heart failure marker in the extract {A: concentration in the extract extracted from the carrier (1), B: concentration in the extract extracted from the carrier (2)} Is obtained from the following equation.
(Extraction rate) = (B−A) / (Concentration of heart failure marker added to blood)

The method for quantifying a heart failure marker in blood according to claim 1, wherein the heart failure marker is a chronic heart failure marker resulting from atrial load, ventricular load, myocardial hypertrophy, myocardial ischemia and / or myocardial necrosis.

The method for quantifying a heart failure marker in blood according to claim 1, wherein the heart failure marker is atrial natriuretic peptide (ANP) and / or brain natriuretic peptide (BNP).

The method for quantifying a heart failure marker in blood according to any one of claims 1 to 3, wherein the blood-carrying carrier carries blood on an absorbent containing an anticoagulant and / or a protease inhibitor for blood.

The method for quantifying a heart failure marker in blood according to any one of claims 1 to 4, wherein the blood-carrying carrier carries blood on an absorbent body using filter paper.

The method for quantifying a heart failure marker in blood according to any one of claims 1 to 5, wherein the blood carrying carrier carries blood collected from a fingertip.