JP3691798B2

JP3691798B2 - Method for quantifying tumor markers in blood

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Publication number: JP3691798B2
Application number: JP2002039707A
Authority: JP
Inventors: 誠國近
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2002-02-18
Filing date: 2002-02-18
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2022-02-18
Also published as: JP2003240774A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。さらに詳しくは、肺癌の診断に用いられる血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、肺癌の腫瘍マーカーの定量方法として、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取し、室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心して血清部分と血餅部分を分け、上清（血清）部分を別の試験管に分取し、これを測定検体として定量する方法等が知られている（例えば、臨床検査マニュアル、１９８８年、文光堂、３１１〜３１６頁）。さらに通常は測定を効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存して一定量の測定検体をまとめて定量する方法等が知られている（例えば、イムノアッセイ、１９８４年、ジェイエムシー、１７３〜１７４頁）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法においては、健康診断等多数の被検者から採血し血液中の腫瘍マーカーを測定する場合、多数の血液から上清を分離する操作が必要であり、分離した血清を試験管で冷蔵又は冷凍で輸送・保存する必要がある等コストが高くなる問題があった。
すなわち、本発明の目的は、肺癌の腫瘍マーカーを簡易に定量する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、特定の方法を用いることにより、肺癌の腫瘍マーカーを簡易に定量できることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法の特徴は、血液担持担体から血液成分を抽出し、抽出液中の腫瘍マーカー濃度と、腫瘍マーカーの抽出率とから、肺癌の腫瘍マーカーを定量することを特徴とする血液中の腫瘍マーカー定量方法。
抽出率は、血液を用いて作成した血液担持担体（１）と、血液に既知濃度の腫瘍マーカーを添加した添加血液を用いて作成した血液担持担体（２）とからそれぞれ抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度｛Ａ：担体（１）から抽出された抽出液中の濃度、Ｂ：担体（２）から抽出された抽出液中の濃度｝を求め、次式から求められる。
（抽出率）＝（Ｂ−Ａ）／（血液に添加した腫瘍マーカーの濃度）
【０００５】
【発明実施の形態】
本発明における腫瘍マーカーは、肺癌を診断するための腫瘍マーカーである。
肺癌としては、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌及び肺腺癌等が挙げられる。肺癌を診断するための腫瘍マーカーとしては、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）、可溶性サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルルイスＸ抗原（ＳＬＸ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）及びフェリチン及び膵癌胎児性抗原（ＰＯＡ）等が挙げられる。これらのうち、肺癌への特異性の観点から、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）、可溶性サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、フェリチン及び膵癌胎児性抗原（ＰＯＡ）が好ましく、さらに好ましくは神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）及び可溶性サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ）である。
【０００６】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法においては、腫瘍マーカー１種のみを定量してもよく、２種以上の腫瘍マーカーを定量してもよいが、癌診断の感度及び特異性の観点から２種以上の腫瘍マーカーを定量することが好ましく、さらに好ましくは２〜３種の腫瘍マーカーを定量することである。
２種以上の腫瘍マーカーを定量するには、上記の腫瘍マーカーから適宜選択することができるが、肺小細胞癌に特異性の高いマーカー（例えばＮＳＥ又はＰｒｏＧＲＰ）と、肺非小細胞癌（扁平上皮癌又は腺癌）に特異性の高いマーカー（例えば、ＣＹＦＲＡ又はＳＣＣ）とを組み合わせて用いることが好ましく、さらに好ましくはＰｒｏＧＲＰとＣＹＦＲＡとの組み合わせである。
【０００７】
血液担持担体中の血液は、その採取部位及び採取方法等に制限はなく、従来の採取部位及び採取方法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取等）で得た血液の一部を本発明に用いることも当然可能であるが、該血液は、被検者への侵襲性の低減の観点から、抹消血管からの採取が好ましく、抹消血管からの採取の中でも、被検者の侵襲性低減の観点から耳朶又は指先を穿刺して採取した血液がより好ましく、被検者が自分で血液を採取できる点、穿刺時の痛感が少ない点及び血液が液滴として採取（滴下）し易い点等の観点から指先を穿刺して採取した血液が特に好ましい。
【０００８】
末梢血液を採取する方法としては、血液を採取できれば特に制限はないが、被検者自身で実施可能であるという観点から、例えば、被検者の当該部位（例えば、耳朶及び指先等）を穿刺前によくマッサージ及び／又は暖めて充血させておき、消毒ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させ、ディスポーザブル・ランセット等で当該部位を穿刺して血液を得る方法等が好ましい。
【０００９】
血液担持担体中の担体としては、血液を保持することが可能である限り、担体の材質、形状等は特に制限されないが、吸着による血液の保持が容易であり、抽出により血液成分が溶出し易い材質・形状であることが好ましく、吸着による保持が容易という観点から、吸収体であることがさらに好ましい。
担体の材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。
これらの中で、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。
【００１０】
担体としては、公知のものが使用でき、例えば、上記の材質等からなる濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる吸収体が挙げられる。
吸収体の孔径は、自由に設定選択できるが、平均孔径（μｍ）の範囲が１以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは５以上である。また１００以下が好ましく、さらに好ましくは８０以下、特に好ましくは５０以下である。
濾紙としては、例えば、ＪＩＳＰ３８０１（１９９５年）又はＴＡＰＰＩ（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｕｌｐａｎｄＰａｐｅｒＩｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定される濾紙等が挙げられる。
不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。
織布としては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレフィン布、ニトロセルロース布、セルロールアセテート布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げられる。
【００１１】
シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリスチレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡セラミックス等が挙げられる。
これらの中で、単位体積又は単位面積当たりに吸収する血液の量が一定になりやすいという（定量精度向上）観点から、濾紙、不織布及びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくは濾紙及び不織布、特に好ましくは濾紙、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布であり、最も好ましくは濾紙である。
【００１２】
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の厚さ（ｍｍ）は、適宜選択することができるが、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．３以上である。また３．０以下が好ましく、さらに好ましくは１．０以下、特に好ましくは０．６以下である。
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の大きさ（面積、ｃｍ²）は、採血、保管及び輸送時等の操作性を考慮して自由に設定できるが、１以上が好ましく、さらに好ましくは１０以上、特に好ましく２５以上である。また２００以下が好ましく、さらに好ましくは１５０以下、特に好ましく１００以下である。
【００１３】
血液の担体への担持は、血液が保持できれば特に制限されず、担体と血液とを接触させることにより担体に血液を担持させることができる。
担体と血液とを接触させる方法としては、例えば、血液に担体を浸漬する方法、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押し付ける方法等が挙げられる。これらのうち、簡便性の観点から、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押しつける方法が好ましく、さらに好ましくは担体に血液を滴下する方法である。
【００１４】
血液に担体を浸漬する場合、血液の使用量（ｍＬ）は担体が浸漬できる量であればよく、担体の大きさに決定されるが、０．０５以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．１５以上である。また２以下が好ましく、さらに好ましくは１以下、特に好ましくは０．５以下である。
担体に血液を滴下する場合、血液の使用量（ｍＬ）は担体の大きさに決定されるが、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に好ましくは０．２以下である。
穿刺部に担体を押し付ける場合、血液の使用量（ｍＬ）は担体の大きさに決定されるが、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．５以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に好ましくは０．２以下である。
【００１５】
血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取る場合（後述）、切取られる担体が保持できる量以上の血液を滴下すればよく、滴下する血液量を正確に制御する必要はない。例えば、ろ紙がワットマン社製ＢＦＣ１８０（厚さ０．４９ｍｍ）の場合、滴下した血液量が５０μＬであれば血液を保持した部分の大きさは直径約１２ｍｍである。１滴の液量は約４０〜６０μＬであるので、血液担持部分を直径６ｍｍの円形に打ちぬく場合、必要な血液の量は１〜２滴となる。
【００１６】
さらに、血液の安定性及び定量の再現性の観点から、血液を担体に保持させた後、乾燥させることが好ましく、担体に保持された血液の重量が５０重量％以下（好ましくは３０重量％以下）になるまで乾燥することがさらに好ましい。
乾燥方法としては、例えば、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥、微加熱乾燥及び単純乾燥（風乾）等が適用でき、これらのうち、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥及び単純乾燥が好ましく、さらに好ましくは減圧乾燥及び単純乾燥であり、特に好ましくは単純乾燥である。
【００１７】
乾燥は、腫瘍マーカーの抗原性が変化しない条件で行うことが好ましく、４０℃以下の温度で行うのがさらに好ましく、特に好ましくは１０〜３０℃で行う。減圧する場合、圧力（Ｐａ）は、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また１０以下が好ましく、さらに好ましくは２以下、特に好ましくは１以下である。
単純乾燥する場合の湿度（％ＲＨ）は、特に制限はないが、９０以下が好ましく、さらに好ましくは８０以下である。また１０以上が好ましく、さらに好ましくは４０以上である。
乾燥時間は、担体の形状、保持した血液量により適宜設定できるが、担体が濾紙の場合、２０分〜１時間程度である。
【００１８】
血液保持担体を保存する場合、湿度（％ＲＨ）は、８０以下が好ましく、さらに好ましくは６０以下、特に好ましくは４０以下である。また１０以上がさらに好ましく、特に好ましくは２０以上である。温度（℃）は、０以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは２以上である。また４０以下が好ましく、さらに好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。
なお、湿度８０％ＲＨ以下を保てる状態（密閉下、乾燥剤存在の密閉下等）であれば郵便又は宅配便等により輸送することができる。
【００１９】
血液成分の抽出の前に、血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取ってから行うことが好ましい。例えば、均一な吸収体に血液を滴下し、過剰な血液は周囲に拡散吸収させて乾燥した後、中心部を一定の形状に切り取ったものを抽出に用いる方法が好ましい。
切り取る方法としては、一定直径のパンチで打ちぬく方法及び予め入れた切取線（ミシン目等）に沿って切り出す方法等が適用できる。
【００２０】
血液担持担体から血液成分の抽出は、血液中の腫瘍マーカー（抗原）の抗原性が変化しない限り特に制限なく行うことができ、例えば、抽出用溶液に血液担持担体を浸漬し、その上清を抽出液として用いることができる。
抽出用溶液として、ｐＨが中性領域の緩衝液が使用でき、例えば、ｐＨ６〜８のグッド緩衝液及びｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等が好ましく使用される。
【００２１】
また、抽出用溶液に、塩、界面活性剤、蛋白質及び抗原安定化剤等を添加することもできる。
塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（ＩＣＩアメリカ社））等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。
蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン及びカゼイン等が挙げられる。
抗原安定化剤としては、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
【００２２】
定量再現性の観点から、担体に対する抽出用溶液の使用量及び抽出時間等の抽出条件を一定にする必要がある。
抽出用溶液の使用量（ｍＬ）としては、０．０５以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．２以上である。また５以下が好ましく、さらに好ましくは１以下、特に好ましくは０．５以下である。
抽出時間（分）としては、０．５以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは５以上である。また４８０以下が好ましく、さらに好ましくは１８０以下、特に好ましくは６０以下である。
撹拌は、ボルテックスミキサーのような装置を用いて、容器を震動して行うことが好ましく、震動回数は１００〜２０００ｒｐｍが好ましい。
【００２３】
例えば、血液担持担体から切り取った直径６ｍｍ（厚さ０．４９ｍｍ）の濾紙（ワットマン社製ＢＦＣ１８０）の場合、以下の条件等で抽出できる。
抽出用溶液組成：塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（塩化ナトリウムの含有量：緩衝液１００ｍＬ当たり０．８５ｇ、以下同じ。）
抽出用溶液の使用量：２００〜３００μＬ
抽出温度：室温（１５〜２５℃）
抽出時間：２０分〜１時間（攪拌後の放置時間）
抽出操作：担体に抽出用溶液を加えボルテックスミキサーで攪拌後（５００ｒｐｍ、１分）、上記温度で上記時間放置する。再度攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ、５秒）し、１分間静置し分散したろ紙繊維を沈降させた後、上清液を採取し、腫瘍マーカー測定のための検体（抽出液）として用いる。
【００２４】
上記抽出液中の腫瘍マーカーの定量方法は特に制限されないが、定量値の再現性及び測定感度の観点から、免疫学的測定法が好ましい。
免疫学的測定法としては従来公知の方法が使用できるが、抽出液中の腫瘍マーカー濃度が血液中の濃度より低いためより定量感度の高い測定法が望ましく、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が好ましい。
【００２５】
放射免疫測定（ＲＩＡ）としては、固相抗体とＩ１２５標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、多数の測定試薬キットが市販されている。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）としては、固相抗体と酵素標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いた種々の測定試薬キットが市販されている。
蛍光免疫測定（ＦＩＡ）としては、固相抗体とユーロピウム標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられる。
化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）としては、固相抗体とアクリジニウムエステル標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、種々の測定試薬キットが市販されている。
これらの免疫学的測定法のうち、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が好まい。またＥＩＡのうち、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）がさらに好ましい。
【００２６】
抽出液中の腫瘍マーカー濃度から、血液中の腫瘍マーカーの濃度を求める方法は、種々の方法が適用でき、例えば、（１）腫瘍マーカーの濃度が既知の血液を担持した血液担持担体を用いて作成した検量線を用いる方法、及び（２）腫瘍マーカーの濃度が既知の抽出液を用いて作成した検量線と腫瘍マーカーの抽出率とを用いる方法等が挙げられる。
【００２７】
（２）の方法において、抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成し、これから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。抽出率は、以上の操作を少なくとも２回（好ましくは少なくとも３回）行い、それらの平均値を用いることが好ましい。
抽出率＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度）
検体の血液中の腫瘍マーカー濃度は、検体から調製される抽出液中の腫瘍マーカー濃度を抽出率で除すことで求めることが出来るが、その際、血液担持担体の作成及び抽出の条件は抽出率を求めた時と同じ条件である必要がある。
【００２８】
なお、本発明で定量される腫瘍マーカーは、血液中に極低濃度で存在しているため、濃度の変動による抽出率の変動は極わずかであり、例えば、ＮＳＥの場合、０．２〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。１００ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＮＳＥの場合、癌判断の境界濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、１００ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。
【００２９】
また、ＰｒｏＧＲＰの場合、５〜４，０００ｐｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。４，０００ｐｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＰｒｏＧＲＰの場合、癌判断の境界濃度が４６ｐｇ／ｍＬであり、４，０００ｐｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。ＮＳＥ及びＰｒｏＧＲＰ以外の腫瘍マーカーについても同様であり、腫瘍マーカーの濃度よって臨床的な判断に影響することはない。
【００３０】
また、ＳＣＣの場合、０．１〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。５０ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＳＣＣの場合、癌判断の境界濃度が１．５ｎｇ／ｍＬであり、５０ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。
【００３１】
また、ＳＹＦＲＡの場合、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。５０ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＳＹＦＲＡの場合、癌判断の境界濃度が３．５ｎｇ／ｍＬであり、５０ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。ＮＳＥ、ＰｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ及びＳＹＦＲＡ以外の腫瘍マーカーについても同様であり、腫瘍マーカーの濃度よって臨床的な判断に影響することはない。
【００３２】
（１）及び（２）の方法の何れの場合も、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液は、濃度の異なる２種以上を用いることが好ましい。
既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液の濃度は、測定する腫瘍マーカーの種類により自由に設定できるが、通常は健常人の範囲（正常域）と癌である可能性が高い範囲との境界濃度（カットオフ）を明確に測定できる濃度で設定することが好ましく、例えば、ＮＳＥの場合、カットオフは通常１０ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と１０ｎｇ／ｍＬ以上５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、１０ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度１０ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．２ｎｇ／ｍＬに相当するので０．１ｎｇ／ｍＬ以上０．２ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．２ｎｇ／ｍＬ以上１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３３】
また、ＰｒｏＧＲＰの場合、カットオフは通常４６ｐｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも４６ｐｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、１０ｐｇ／ｍＬ以上４６ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と４６ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、５ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度４６ｐｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．９２ｐｇ／ｍＬに相当するので０．２ｐｇ／ｍＬ以上０．９２ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と０．９２ｐｇ／ｍＬ以上２．０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３４】
また、ＣＹＦＲＡの場合、カットオフは通常３．５ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも３．５ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、１．０ｎｇ／ｍＬ以上３．５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と３．５ｎｇ／ｍＬ以上２０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、３．５ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度３．５ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．０７ｎｇ／ｍＬに相当するので０．０２ｎｇ／ｍＬ以上０．０７ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．０７ｎｇ／ｍＬ以上０．４ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３５】
ＮＳＥ、ＰｒｏＧＲＰ、ＣＹＦＲＡ以外の腫瘍マーカーのカットオフを列挙すると、例えばＣＥＡ：５．０ｎｇ／ｍＬ、ＩＡＰ：５０１μｇ／ｍＬ、フェリチン：２００ｎｇ／ｍＬ、ＰＯＡ：２０Ｕ／ｍＬ、ＴＰＡ：１３０Ｕ／Ｌ、ＳＣＣ：１．５ｎｇ／ｍＬである。
【００３６】
（１）の方法では、検量線の作成に抽出操作から行う必要がある点及び検量線作成用の血液は長期間保存できないので測定の際に作成する煩わしさがあるが、抽出条件が変動しても正確な測定ができるという長所がある。一方、（２）の方法は、あらかじめ抽出率を求め、抽出操作等の条件を一定にすれば多量の検体を正確かつ簡便に測定することができる。（１）及び（２）の方法のうち、簡便さの観点から、（２）の方法が好ましい。
【００３７】
本発明の定量方法は、被検者自身で採血、担体に保持・乾燥、輸送（例えば、持参、郵便及び宅配便等）することができ、肺癌の健康診断等のように多数の検体を広い地域から集めて定量する場合に最適である。又、癌検診のほか、遠隔地の患者に対する癌治療の経過観察等においても、適用できる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＮＳＥ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）の指先をよくマッサージ及び暖めて充血させておき消毒用ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させてから、ディスポーザブル・ランセット（商品名「ヘモレット」、ミドリ十字株式会社製）で穿刺し、最初の血滴を拭い去り、次の血滴２滴を被検者１人当たり１０枚の採血用濾紙（品番ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）ぞれぞれに指先から直接滴下し吸収させた。次いで、室内（２５±１℃、６５±５％ＲＨ）で風乾し（風乾時間５，２０，４０，６０又は１２０分）、血液担持担体（血乾燥濾紙）を得た。
風燥時間毎に血液担持担体（血液乾燥濾紙）の重量を計測し、初期血液重量（濾紙重量を除いた値）に対する比を乾燥度を求めた（血液担持担体２枚の平均値）。この乾燥度を表１中に示した。
次いで、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
【００３９】
【表１】

【００４０】
２．抽出操作
以下の操作は温度２０〜２５℃の室内で実施した。
表１の条件で保存した各血液担持担体（血乾燥濾紙）の血液担持部分の中心部を、直径６ｍｍの１穴パンチ（事務用として市販されている物）で打ち抜いて濾紙片を得た。
試験管に打ち抜いた濾紙片及び塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（抽出用溶液）２５０μＬを加え、３０秒間攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ）した後、３０分間放置した。その後、３０秒間同様に攪拌した後１分間静置し、上清を分取して抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００４１】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＮＳＥ）の定量
定量用試薬としては、臨床検査薬として和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライトＮＳＥ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライトＮＳＥコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＮＳＥの定量ができる。
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は１０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。
【００４２】
４．定量結果
定量結果及び次式で求めた安定度を表２〜１１に示した。
（安定度）＝（所定保存期間後の定量値）×１００／（初期定量値）
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＮＳＥ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＮＳＥ）は安定であることが判った。
【００４３】
【表２】

【００４４】
【表３】

【００４５】
【表４】

【００４６】
【表５】

【００４７】
【表６】

【００４８】
【表７】

【００４９】
【表８】

【００５０】
【表９】

【００５１】
【表１０】

【００５２】
【表１１】

【００５３】
＜実施例２＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＰｒｏＧＲＰ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００５４】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＰｒｏＧＲＰ）の定量
測定試薬は臨床検査薬として国際試薬株式会社より発売されている「イムチェック−ＰｒｏＧＲＰ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、「イムチェック−ＰｒｏＧＲＰ」の構成試薬である校正用ＰｒｏＧＲＰを用いた。
本試薬は血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明の無い試薬は「イムチェック−ＰｒｏＧＲＰ」の構成試薬を使用した。
【００５５】
１）抗ＰｒｏＧＲＰ抗体固定プレートのウエルに反応用緩衝液１００μＬ及び検体５０μＬを加え、３７℃、６０分反応した。
２）反応液をアスピレーターで吸引除去し、ウエルに洗浄液３３０μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗浄を５回実施した。
３）ＰＯＤ標識抗体液１００μＬをウエルに加え、３７℃、３０分反応した。
４）２）と同様に洗浄を行った。
５）発光試薬Ａ［ルミノールナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１８ｇと、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇとを、０．１Ｍ−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）メチル／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１Ｌに溶解して作成］５０μＬ及び発光試薬Ｂ［２００μＬの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解して作成］５０μＬをウエルに加え生じた発光量を計測（大日本製薬株式会社「ルミノスキャンアセント」を使用）した。
６）既知濃度のＰｒｏＧＲＰを測定した場合の発光量で検量線を作成し、測定発光量を濃度値とした。
【００５６】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表１２〜２１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＰｒｏＧＲＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＰｒｏＧＲＰ）は安定であることが判った。
【００５７】
【表１２】

【００５８】
【表１３】

【００５９】
【表１４】

【００６０】
【表１５】

【００６１】
【表１６】

【００６２】
【表１７】

【００６３】
【表１８】

【００６４】
【表１９】

【００６５】
【表２０】

【００６６】
【表２１】

【００６７】
＜実施例３＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＣＹＦＲＡ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００６８】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＣＹＦＲＡ）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、ロシュ・ダイアグノティックス株式会社より発売されている「エンチムンテストシフラ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、シーアイエスダイアグノスティックス株式会社より発売されている「ボール・シフラ・キット」の標準シフラを用いた。
本試薬は血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明の無い試薬は「エンチムンテストシフラ」の構成試薬を使用した。
【００６９】
１）ストレプトアビジンチューブに説明書記載の通り調製したビオチン化抗体４００μＬ及び検体１００μＬを加え、２５℃、６０分反応した。
２）説明書記載の通り調製したＰＯＤ標識抗体５００μＬをチューブに追加し、２５℃、６０分反応した。
３）反応液をアスピレーターで吸引除去し、チューブに洗浄液１１００μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗浄を３回実施した。
４）発光試薬Ａ［ルミノールナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１８ｇと、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇとを、０．１Ｍ−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）メチル／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１Ｌに溶解して作成］５００μＬ及び発光試薬Ｂ［２００μＬの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解して作成］５００μＬをチューブに加え生じた発光量を計測（アロカ株式会社「ルミネッセントスリーダーＢＬＲ−２０１」を使用）した。
６）既知濃度の標準シフラを測定した場合の発光量で検量線を作成し、測定発光量を濃度値とした。
【００７０】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表２２〜３１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＹＦＲＡ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＹＦＲＡ）は安定であることが判った。
【００７１】
【表２２】

【００７２】
【表２３】

【００７３】
【表２４】

【００７４】
【表２５】

【００７５】
【表２６】

【００７６】
【表２７】

【００７７】
【表２８】

【００７８】
【表２９】

【００７９】
【表３０】

【００８０】
【表３１】

【００８１】
＜実施例４＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＳＣＣ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００８２】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＳＣＣ）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、ダイナボット株式会社より発売されている「ＳＣＣ・ダイナパック」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、「ＳＣＣ・ダイナパック」のコントロール試薬を用いた。
本試薬は血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明の無い試薬は「ＳＣＣ・ダイナパック」の構成試薬を使用した。
【００８３】
１）試験管にマイクロパーティクル２００μＬ及び検体１００μＬを加え、３７℃、６０分反応した。
２）試験管を遠心分離にかけた後、上清をアスピレーターで除いた。洗浄液１ｍＬを分注し攪拌後、再度遠心分離を行い上清をアスピレーターで除くことで洗浄を行った.この洗浄操作を３回行った.
３）標識抗体２００μＬを試験管に加え、３７℃、６０分反応した。
４）２）と同様に洗浄を行った。
５）発光試薬［ＢＡＬＤＡＰＳ５４０ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（インタージェンカンパニー）］５００μＬを試験管に加え生じた発光量を計測（アロカ株式会社「ルミネッセントスリーダーＢＬＲ−２０１」を使用）した。
６）既知濃度の標準ＳＣＣを測定した場合の発光量で検量線を作成し、測定発光量を濃度値とした。
【００８４】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表３２〜４１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＳＣＣ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＳＣＣ）は安定であることが判った。
【００８５】
【表３２】

【００８６】
【表３３】

【００８７】
【表３４】

【００８８】
【表３５】

【００８９】
【表３６】

【００９０】
【表３７】

【００９１】
【表３８】

【００９２】
【表３９】

【００９３】
【表４０】

【００９４】
【表４１】

【００９５】
＜実施例５＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＮＳＥ濃度と従来の方法によるＮＳＥ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＮＳＥ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライトＮＳＥコントロールセット」の標準ＮＳＥ溶液（０又は９０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＮＳＥ添加血液（０又は９０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＮＳＥ添加血液（９０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＮＳＥ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００９６】
２．抽出及び測定
実施例１記載の抽出方法と同様にして、標準ＮＳＥ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＮＳＥ濃度を測定した。それらの結果を表４２に示した。
【００９７】
【表４２】

【００９８】
３．抽出率の設定
表４２に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表４２に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１８１）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＮＳＥ濃度
Ｂ：標準ＮＳＥ（９０ｎｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＮＳＥ濃度
Ｃ：９ｎｇ／ｍＬ（添加したＮＳＥ量）
【００９９】
４．採血
肺小細胞癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１００】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１０１】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＮＳＥ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例１記載の「スフィアライトＮＳＥ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量１０μＬ）。
【０１０２】
７．血液中のＮＳＥ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＮＳＥ濃度を抽出率（０．０１８１）で除し、血液中のＮＳＥ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＮＳＥの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＮＳＥ濃度を表４３に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＮＳＥ濃度と従来法によるＮＳＥ濃度との相関図を図１に示した。図１から判るように、従来法での血清中のＮＳＥ濃度と本発明の方法による血液中ＮＳＥ濃度は、良好な相関性を示した。図１中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＮＳＥ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＮＳＥ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１０３】
【表４３】

【０１０４】
＜実施例６＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＰｒｏＧＲＰ濃度と従来の方法によるＰｒｏＧＲＰ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＰｒｏＧＲＰ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「イムチェック−ＰｒｏＧＲ」の標準ＰｒｏＧＲＰ溶液（０又は１０００ｐｇ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＰｒｏＧＲＰ添加血液（０又は１０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＰｒｏＧＲＰ添加血液（１０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＰｒｏＧＲＰ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０ｐｇ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【０１０５】
２．抽出及び測定
実施例２記載の抽出方法と同様にして、標準ＰｒｏＧＲＰ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＰｒｏＧＲＰ濃度を測定した。それらの結果を表４４に示した。
【０１０６】
【表４４】

【０１０７】
３．抽出率の設定
表４４に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表４４に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１８９）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＰｒｏＧＲＰ濃度
Ｂ：標準ＰｒｏＧＲＰ（１０００ｐｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＰｒｏＧＲＰ濃度
Ｃ：１００ｐｇ／ｍＬ（添加したＰｒｏＧＲＰ量）
【０１０８】
４．採血
肺小細胞癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１０９】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１１０】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＰｒｏＧＲＰ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例２記載の「イムチェック−ＰｒｏＧＲＰ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した。
【０１１１】
７．血液中のＰｒｏＧＲＰ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＰｒｏＧＲＰ濃度を抽出率（０．０１８９）で除し、血液中のＰｒｏＧＲＰ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＰｒｏＧＲＰの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＰｒｏＧＲＰ濃度を表４５に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＰｒｏＧＲＰ濃度と従来法によるＰｒｏＧＲＰ濃度との相関図を図２に示した。図２から判るように、従来法での血清中のＰｒｏＧＲＰ濃度と本発明の方法による血液中ＰｒｏＧＲＰ濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＰｒｏＧＲＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＰｒｏＧＲＰ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１１２】
【表４５】

【０１１３】
＜実施例７＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＣＹＦＲＡ濃度と従来の方法によるＣＹＦＲＡ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＣＹＦＲＡ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「ボール・シフラ・キット」の標準ＣＹＦＲＡ溶液（０又は６０ng／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＣＹＦＲＡ添加血液（０又は６０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＣＹＦＲＡ添加血液（６０ng／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＣＹＦＲＡ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０ng／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【０１１４】
２．抽出及び測定
実施例３記載の抽出方法と同様にして、標準ＣＹＦＲＡ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＣＹＦＲＡ濃度を測定した。それらの結果を表４６に示した。
【０１１５】
【表４６】

【０１１６】
３．抽出率の設定
表４６に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表４６に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１９８）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＣＹＦＲＡ濃度
Ｂ：標準ＣＹＦＲＡ（６０ng／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＣＹＦＲＡ濃度
Ｃ：６ng／ｍＬ（添加したＣＹＦＲＡ量）
【０１１７】
４．採血
肺非小細胞癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１１８】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１１９】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＣＹＦＲＡ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例３記載の「エンチムンテストシフラ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した。
【０１２０】
７．血液中のＣＹＦＲＡ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＣＹＦＲＡ濃度を抽出率（０．０１９８）で除し、血液中のＣＹＦＲＡ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＣＹＦＲＡの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＣＹＦＲＡ濃度を表４７に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＣＹＦＲＡ濃度と従来法によるＣＹＦＲＡ濃度との相関図を図３に示した。図３から判るように、従来法での血清中のＣＹＦＲＡ濃度と本発明の方法による血液中ＣＹＦＲＡ濃度は、良好な相関性を示した。図３中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＣＹＦＲＡ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＣＹＦＲＡ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１２１】
【表４７】

【０１２２】
＜実施例８＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＳＣＣ濃度と従来の方法によるＳＣＣ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＳＣＣ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「ＳＣＣ・ダイナパック」の標準ＳＣＣ溶液（０又は５０ng／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＳＣＣ添加血液を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＳＣＣ添加血液（６０ng／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＳＣＣ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０ng／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【０１２３】
２．抽出及び測定
実施例４記載の抽出方法と同様にして、標準ＳＣＣ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＳＣＣ濃度を測定した。それらの結果を表４８に示した。
【０１２４】
【表４８】

【０１２５】
３．抽出率の設定
表４８に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表４８に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０２００）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＳＣＣ濃度
Ｂ：標準ＳＣＣ（５０ng／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＳＣＣ濃度
Ｃ：５ng／ｍＬ（添加したＳＣＣ量）
【０１２６】
４．採血
肺非小細胞癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１２７】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１２８】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＳＣＣ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例４記載の「ＳＣＣ・ダイナパック」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した。
【０１２９】
７．血液中のＳＣＣ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＳＣＣ濃度を抽出率（０．０２００）で除し、血液中のＳＣＣ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＳＣＣの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＳＣＣ濃度を表４９に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＳＣＣ濃度と従来法によるＳＣＣ濃度との相関図を図４に示した。図４から判るように、従来法での血清中のＳＣＣ濃度と本発明の方法による血液中ＳＣＣ濃度は、良好な相関性を示した。図４中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＳＣＣ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＳＣＣ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１３０】
【表４９】

【発明の効果】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法によると、肺癌の腫瘍マーカーを極めて簡易に定量することができる。
さらに、被検者自身で採血することができるので採血のための熟練者等が不要であり、被検者が採血のため病院等に出向く必要もないという簡便性も併せもつものである。
また、血液担持担体は、簡単に輸送することができるので、多数の検体を一ヶ所に集めて測定することができ輸送及び測定のコストを低減させることができる等の効果がある。
従って、本発明の定量方法は、肺癌の健康診断等の多数の検体を広い地域から集めて測定する場合に最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の方法による血清中のＮＳＥ濃度と本発明の方法による血液中のＮＳＥ濃度との相関を表すグラフである。
【図２】従来の方法による血清中のＰｒｏＧＲＰ濃度と本発明の方法による血液中のＰｒｏＧＲＰ濃度との相関を表すグラフである。
【図３】従来の方法による血清中のＣＹＦＲＡ濃度と本発明の方法による血液中のＣＹＦＲＡ濃度との相関を表すグラフである。
【図４】従来の方法による血清中のＳＣＣ濃度と本発明の方法による血液中のＳＣＣ濃度との相関を表すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for quantifying tumor markers in blood. More specifically, the present invention relates to a method for quantifying a tumor marker in blood used for diagnosis of lung cancer.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a method for quantifying a tumor marker for lung cancer, using a syringe for blood collection, 2 mL or more of whole blood is collected mainly from the patient's median cubital vein, left to stand at room temperature for 1 hour or more, and then 1500 G in a refrigerated centrifuge. A method is known in which the serum portion and the clot portion are separated by cooling and centrifuging for 10 minutes, the supernatant (serum) portion is separated into another test tube, and this is quantified as a measurement specimen (for example, a clinical laboratory manual) 1988, Bunkodo, pages 311 to 316). Furthermore, in order to efficiently perform the measurement, a method of quantifying a certain amount of the measurement sample by freezing or refrigerated storage is known (for example, immunoassay, 1984, JMC, 173-3). 174).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In the conventional method, when blood is collected from a large number of subjects such as medical examinations and the tumor marker in the blood is measured, an operation for separating the supernatant from the large number of blood is required, and the separated serum is refrigerated in a test tube. In addition, there is a problem that the cost becomes high, for example, it is necessary to transport and store it in a frozen state.
That is, an object of the present invention is to provide a method for easily quantifying a tumor marker for lung cancer.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor has found that a tumor marker for lung cancer can be easily quantified by using a specific method, and has reached the present invention.
That is, the method for quantifying a tumor marker in blood of the present invention is characterized by extracting a blood component from a blood carrier and quantifying a tumor marker for lung cancer from the tumor marker concentration in the extract and the extraction rate of the tumor marker. A method for quantifying a tumor marker in blood, comprising:
The extraction rate was determined in the extracts extracted from the blood-carrying carrier (1) prepared using blood and the blood-carrying carrier (2) prepared using added blood obtained by adding a tumor marker of a known concentration to blood. The amount of tumor marker contained in the extract was quantified and the concentration of the tumor marker in the extract {A: concentration in the extract extracted from the carrier (1), B: concentration in the extract extracted from the carrier (2)} Is obtained from the following equation.
(Extraction rate) = (B−A) / (Concentration of tumor marker added to blood)
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The tumor marker in the present invention is a tumor marker for diagnosing lung cancer.
Examples of lung cancer include small cell lung cancer, lung squamous cell carcinoma, and lung adenocarcinoma. Tumor markers for diagnosing lung cancer include neuron specific enolase (NSE), gastrin releasing peptide precursor (ProGRP), squamous cell carcinoma associated antigen (SCC), soluble cytokeratin 19 fragment (CYFRA), carcinoembryonic antigen ( CEA), sialyl Lewis X antigen (SLX), immunosuppressive acidic protein (IAP), tissue polypeptide antigen (TPA) and ferritin and pancreatic carcinoembryonic antigen (POA). Among these, from the viewpoint of specificity to lung cancer, neuron-specific enolase (NSE), gastrin releasing peptide precursor (ProGRP), squamous cell carcinoma associated antigen (SCC), soluble cytokeratin 19 fragment (CYFRA), immunosuppressive acidity Protein (IAP), tissue polypeptide antigen (TPA), ferritin and pancreatic carcinoembryonic antigen (POA) are preferred, more preferably neuron specific enolase (NSE), gastrin releasing peptide precursor (ProGRP), squamous cell carcinoma associated antigen ( SCC) and soluble cytokeratin 19 fragment (CYFRA).
[0006]
In the method for quantifying tumor markers in blood of the present invention, only one type of tumor marker may be quantified, or two or more types of tumor markers may be quantified, but from the viewpoint of sensitivity and specificity of cancer diagnosis It is preferable to quantify two or more kinds of tumor markers, and more preferably to quantify two to three kinds of tumor markers.
In order to quantify two or more kinds of tumor markers, the tumor markers can be appropriately selected from the above-mentioned tumor markers, but a marker highly specific for small cell lung cancer (for example, NSE or ProGRP) and non-small cell lung cancer (flattened) It is preferable to use in combination with a marker (for example, CYFRA or SCC) highly specific for epithelial cancer or adenocarcinoma, and more preferably a combination of ProGRP and CYFRA.
[0007]
There is no restriction on the collection site and collection method of blood in the blood carrier, and the conventional collection site and collection method (for example, collecting 2 mL or more of whole blood mainly from the median cubital vein using a blood collection syringe) It is of course possible to use a part of the blood obtained in the present invention in the present invention, but from the viewpoint of reducing invasiveness to the subject, the blood is preferably collected from the peripheral blood vessel, and is collected from the peripheral blood vessel. Among these, from the viewpoint of reducing the invasiveness of the subject, blood collected by puncturing the earlobe or fingertip is more preferable, the subject can collect blood by himself, the point of less pain at the time of puncture, and the blood is liquid From the viewpoint of easy collection (dropping) as a drop, blood collected by puncturing a fingertip is particularly preferable.
[0008]
The method for collecting peripheral blood is not particularly limited as long as blood can be collected. From the viewpoint that it can be performed by the subject himself / herself, for example, the part of the subject (eg, earlobe and fingertip) is punctured. It is preferable to massage and / or warm in advance before congesting, wipe the puncture site with disinfecting gauze and dry, and puncture the site with a disposable lancet to obtain blood.
[0009]
The carrier in the blood-carrying carrier is not particularly limited as long as it can hold blood, but the material and shape of the carrier are not particularly limited, but it is easy to hold blood by adsorption and blood components are easily eluted by extraction. The material and shape are preferable, and from the viewpoint of easy retention by adsorption, an absorber is more preferable.
As the material of the carrier, known natural polymers and synthetic polymers can be used, for example, cotton, wool, cellulose, polystyrene, polyolefin, polyurethane, nitrocellulose, cellulose acetate, polyester, epoxy resin, phenol resin, silk, Examples include fibroin, lignin, hemicellulose, chitin, ebonite, rubber, glass, quartz, and ceramics.
Among these, natural polymers are preferable, cellulose and cotton are more preferable, and cellulose is particularly preferable.
[0010]
As the carrier, known ones can be used, and examples thereof include filter paper made of the above materials and the like, an absorbent body made of a nonwoven fabric, a woven fabric, or a sheet-like foam.
The pore diameter of the absorber can be freely set and selected, but the average pore diameter (μm) is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, and particularly preferably 5 or more. Moreover, 100 or less is preferable, More preferably, it is 80 or less, Most preferably, it is 50 or less.
Examples of the filter paper include filter paper defined in JIS P3801 (1995) or TAPPI (Technical Association of the Pulp and Paper Industry) T205.
Examples of the nonwoven fabric include polyolefin nonwoven fabric, nitrocellulose nonwoven fabric, cell sole acetate nonwoven fabric, polyester nonwoven fabric, epoxy nonwoven fabric, glass nonwoven fabric, and ceramic nonwoven fabric.
Examples of the woven cloth include cotton cloth, wool cloth, cellulose cloth, polyolefin cloth, nitrocellulose cloth, cellulose acetate cloth, epoxy cloth, glass cloth, and ceramic cloth.
[0011]
Examples of the sheet-like foam include foamed polystyrene, foamed polyolefin, foamed polyurethane, foamed polyester, foamed epoxy resin, foamed glass, and foamed ceramic.
Among these, from the viewpoint that the amount of blood absorbed per unit volume or unit area tends to be constant (improved quantitative accuracy), filter paper, non-woven fabric and sheet-like foam are preferable, and filter paper and non-woven fabric are more preferable. Preferred are filter paper, polyolefin nonwoven fabric, nitrocellulose nonwoven fabric, cell sole acetate nonwoven fabric, polyester nonwoven fabric, epoxy nonwoven fabric, glass nonwoven fabric and ceramic nonwoven fabric, and most preferred is filter paper.
[0012]
The thickness (mm) of the filter paper, non-woven fabric, woven fabric or sheet-like foam can be selected as appropriate, but is preferably 0.1 or more, more preferably 0.2 or more, and particularly preferably 0.3 or more. It is. Moreover, 3.0 or less is preferable, More preferably, it is 1.0 or less, Most preferably, it is 0.6 or less.
Size of filter paper, non-woven fabric, woven fabric or sheet-like foam (area, cm ² ) Can be freely set in consideration of operability during blood collection, storage and transportation, but is preferably 1 or more, more preferably 10 or more, and particularly preferably 25 or more. Moreover, 200 or less is preferable, More preferably, it is 150 or less, Most preferably, it is 100 or less.
[0013]
The support of blood on the carrier is not particularly limited as long as the blood can be retained, and the carrier can be supported by bringing the carrier into contact with blood.
Examples of the method of bringing the carrier into contact with blood include a method of immersing the carrier in blood, a method of dropping blood on the carrier, and a method of pressing the carrier against the puncture site. Of these, from the viewpoint of simplicity, the method of dropping blood on the carrier and the method of pressing the carrier against the puncture site are preferred, and the method of dropping blood on the carrier is more preferred.
[0014]
When the carrier is immersed in blood, the amount of blood used (mL) may be an amount that allows the carrier to be immersed, and is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.05 or more, more preferably 0.1 or more. Especially preferably, it is 0.15 or more. Moreover, 2 or less is preferable, More preferably, it is 1 or less, Most preferably, it is 0.5 or less.
When blood is dropped onto the carrier, the amount of blood used (mL) is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, particularly preferably 0.1 or more. . Moreover, 0.5 or less is preferable, More preferably, it is 0.3 or less, Most preferably, it is 0.2 or less.
When the carrier is pressed against the puncture site, the amount of blood used (mL) is determined by the size of the carrier, but is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, particularly preferably 0.1 or more. . Moreover, 0.5 or less is preferable, More preferably, it is 0.3 or less, Most preferably, it is 0.2 or less.
[0015]
When the blood carrying portion of the blood carrying carrier is cut to a certain size (described later), it is sufficient to drop more blood than the amount that can be held by the cut carrier, and it is not necessary to accurately control the dropped blood volume. For example, when the filter paper is BFC180 (thickness 0.49 mm) manufactured by Whatman, if the amount of dropped blood is 50 μL, the size of the portion holding the blood is about 12 mm in diameter. Since the amount of one drop is about 40 to 60 μL, when the blood-carrying portion is punched into a circle having a diameter of 6 mm, the required amount of blood is 1 to 2 drops.
[0016]
Further, from the viewpoint of blood stability and quantitative reproducibility, it is preferable that blood is retained on a carrier and then dried, and the weight of blood retained on the carrier is 50% by weight or less (preferably 30% by weight or less). It is further preferred to dry until
As the drying method, for example, vacuum drying, freezing vacuum drying, fine heating drying and simple drying (air drying) can be applied, and among these, vacuum drying, freezing vacuum drying and simple drying are preferable, and vacuum drying and more preferable. Simple drying, particularly preferably simple drying.
[0017]
Drying is preferably performed under conditions that do not change the antigenicity of the tumor marker, more preferably at a temperature of 40 ° C. or less, and particularly preferably at 10 to 30 ° C. In the case of reducing the pressure, the pressure (Pa) is preferably 0.02 or more, more preferably 0.05 or more, and particularly preferably 0.1 or more. Moreover, 10 or less is preferable, More preferably, it is 2 or less, Most preferably, it is 1 or less.
The humidity (% RH) for simple drying is not particularly limited, but is preferably 90 or less, more preferably 80 or less. Moreover, 10 or more are preferable, More preferably, it is 40 or more.
The drying time can be appropriately set depending on the shape of the carrier and the amount of blood held, but when the carrier is filter paper, it is about 20 minutes to 1 hour.
[0018]
When storing the blood retention carrier, the humidity (% RH) is preferably 80 or less, more preferably 60 or less, and particularly preferably 40 or less. Further, 10 or more is more preferable, and 20 or more is particularly preferable. The temperature (° C.) is preferably 0 or more, more preferably 2 or more, and particularly preferably 2 or more. Moreover, 40 or less is preferable, More preferably, it is 30 or less, Most preferably, it is 10 or less.
In addition, it can be transported by mail or courier as long as the humidity can be maintained at 80% RH or less (under sealing, under the presence of a desiccant).
[0019]
Prior to extraction of blood components, it is preferable to cut the blood-carrying part of the blood-carrying carrier to a certain size. For example, it is preferable to use a method in which blood is dropped on a uniform absorbent body, excess blood is diffused and absorbed in the surroundings, dried, and the center portion is cut into a fixed shape for extraction.
As a cutting method, a method of punching with a punch having a constant diameter, a method of cutting along a cut line (perforation or the like) that has been put in advance, and the like can be applied.
[0020]
Extraction of blood components from the blood carrier can be performed without any limitation as long as the antigenicity of the tumor marker (antigen) in the blood does not change. For example, the blood carrier is immersed in an extraction solution, It can be used as an extract.
As the extraction solution, a buffer solution having a neutral pH range can be used. For example, a Good buffer solution having a pH of 6-8 and a phosphate buffer solution having a pH of 6-8 are preferably used.
[0021]
In addition, salts, surfactants, proteins, antigen stabilizers, and the like can be added to the extraction solution.
Examples of the salt include sodium chloride, potassium chloride, lithium bromide and the like.
Examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan lauric acid monoester ethylene oxide adduct (for example, Tween 20 and Tween 40 (ICI America)).
Examples of the protein include bovine serum albumin and casein.
Examples of the antigen stabilizer include chelating agents such as EDTA and protease inhibitors.
[0022]
From the viewpoint of quantitative reproducibility, it is necessary to make the extraction conditions such as the amount of the extraction solution used for the carrier and the extraction time constant.
The amount (mL) of the extraction solution used is preferably 0.05 or more, more preferably 0.1 or more, and particularly preferably 0.2 or more. Moreover, 5 or less is preferable, More preferably, it is 1 or less, Most preferably, it is 0.5 or less.
The extraction time (minute) is preferably 0.5 or more, more preferably 1 or more, and particularly preferably 5 or more. Moreover, 480 or less is preferable, More preferably, it is 180 or less, Especially preferably, it is 60 or less.
Stirring is preferably performed by shaking the container using a device such as a vortex mixer, and the number of shaking is preferably 100 to 2000 rpm.
[0023]
For example, in the case of a filter paper (BFC180 manufactured by Whatman Co., Ltd.) having a diameter of 6 mm (thickness 0.49 mm) cut from a blood carrier, extraction can be performed under the following conditions.
Solution composition for extraction: 0.05 mol / L phosphate buffer solution (pH 7.2) containing sodium chloride (content of sodium chloride: 0.85 g per 100 mL of buffer solution, the same shall apply hereinafter)
Use amount of extraction solution: 200 to 300 μL
Extraction temperature: room temperature (15-25 ° C)
Extraction time: 20 minutes to 1 hour (standing time after stirring)
Extraction operation: An extraction solution is added to a carrier, and the mixture is stirred with a vortex mixer (500 rpm, 1 minute) and left at the above temperature for the above time. The mixture is stirred again (500 rpm, 5 seconds with a vortex mixer), allowed to stand for 1 minute to settle the dispersed filter paper fiber, and then the supernatant is collected and used as a specimen (extract) for tumor marker measurement.
[0024]
The method for quantifying the tumor marker in the extract is not particularly limited, but an immunological measurement method is preferable from the viewpoint of reproducibility of the quantified value and measurement sensitivity.
A conventionally known method can be used as the immunological measurement method, but a measurement method with higher quantitative sensitivity is desirable because the tumor marker concentration in the extract is lower than the concentration in blood. For example, radioimmunoassay (RIA), Enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA) and chemiluminescence immunoassay (CLIA) are preferred.
[0025]
Examples of radioimmunoassay (RIA) include a two-site sandwich measurement method using a solid phase antibody and an I125-labeled antibody, and many measurement reagent kits are commercially available. Examples of enzyme immunoassay (EIA) include a two-site sandwich assay using a solid phase antibody and an enzyme-labeled antibody, and various measurement reagent kits using peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase and the like as commercially available enzymes are commercially available. Has been.
Examples of the fluorescence immunoassay (FIA) include a two-site sandwich measurement method using a solid phase antibody and a europium labeled antibody.
Examples of chemiluminescence immunoassay (CLIA) include a two-site sandwich assay using a solid phase antibody and an acridinium ester-labeled antibody, and various measurement reagent kits are commercially available.
Of these immunoassays, enzyme immunoassay (EIA) is preferred. Of EIA, chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) is more preferable.
[0026]
Various methods can be applied to obtain the concentration of the tumor marker in the blood from the concentration of the tumor marker in the extract. For example, (1) using a blood-carrying carrier carrying blood with a known tumor marker concentration Examples thereof include a method using a prepared calibration curve, and (2) a method using a calibration curve prepared using an extract with a known tumor marker concentration and the extraction rate of the tumor marker.
[0027]
In the method of (2), the extraction rate is determined by preparing a blood-bearing carrier using blood containing a tumor marker of a known concentration, and quantifying the content of the tumor marker in the extract extracted from the blood carrier. The concentration of the marker is obtained and is obtained from the following formula. For the extraction rate, it is preferable to perform the above operations at least twice (preferably at least three times) and use an average value thereof.
Extraction rate = (concentration of tumor marker in extract) / (concentration of tumor marker in blood)
The tumor marker concentration in the blood of the specimen can be determined by dividing the tumor marker concentration in the extract prepared from the specimen by the extraction rate. The conditions must be the same as when the rate was calculated.
[0028]
In addition, since the tumor marker quantified in the present invention exists in blood at a very low concentration, the variation in extraction rate due to the variation in concentration is very small. For example, in the case of NSE, 0.2 to 100 ng The same extraction rate can be used in the range of / mL. In the case of a high-concentration sample exceeding 100 ng / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (that is, in the case of NSE, cancer judgment If the boundary concentration is 10 ng / mL and exceeds 100 ng / mL, the cancer determination is positive.)
[0029]
In the case of ProGRP, the same extraction rate can be used in the range of 5 to 4,000 pg / mL. In the case of a high-concentration sample exceeding 4,000 pg / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (that is, in the case of ProGRP, cancer If the boundary concentration of judgment is 46 pg / mL and exceeds 4,000 pg / mL, it is positive in cancer judgment.) The same applies to tumor markers other than NSE and ProGRP, and the clinical judgment is not affected by the concentration of the tumor marker.
[0030]
In the case of SCC, the same extraction rate can be used in the range of 0.1 to 50 ng / mL. In the case of a high-concentration sample exceeding 50 ng / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (that is, in the case of SCC, cancer judgment If the boundary concentration is 1.5 ng / mL and exceeds 50 ng / mL, it is positive in cancer judgment).
[0031]
In the case of SYFRA, the same extraction rate can be used in the range of 0.5 to 50 ng / mL. In the case of a high-concentration sample exceeding 50 ng / mL, the obtained extraction rate may differ from the actual extraction rate, but it does not affect clinical judgment (ie, in the case of SYFRA, the cancer judgment If the boundary concentration is 3.5 ng / mL and exceeds 50 ng / mL, it is positive in cancer judgment). The same applies to tumor markers other than NSE, ProGRP, SCC, and SYFRA, and clinical judgment is not affected by the concentration of the tumor marker.
[0032]
In any of the methods (1) and (2), it is preferable to use two or more kinds of blood or extract containing different concentrations of tumor markers.
The concentration of blood or extract containing a known concentration of tumor marker can be freely set according to the type of tumor marker to be measured, but usually it is the boundary between the range of normal subjects (normal range) and the range likely to be cancer It is preferable to set the concentration (cutoff) at a concentration at which it can be clearly measured. For example, in the case of NSE, the cutoff is usually around 10 ng / mL. It is preferable to set two concentrations (for example, a concentration of 5 ng / mL or more and less than 10 ng / mL and a concentration of 10 ng / mL or more and less than 50 ng / mL) of the contained blood at least 10 ng / mL. Further, in the case of the method (2), since it is the concentration of the tumor marker in the extract, two concentrations considering the extraction rate based on 10 ng / mL (for example, when the extraction rate is 0.02, Since the concentration of 10 ng / mL corresponds to the concentration of 0.2 ng / mL in the extract, set it to a concentration of 0.1 ng / mL or more and less than 0.2 ng / mL and a concentration of 0.2 ng / mL or more and less than 1 ng / mL). Is preferred.
[0033]
In the case of ProGRP, the cutoff is usually around 46 pg / mL. Therefore, in the case of the method (1), blood containing a known concentration of tumor marker is at least 2 concentrations (for example, 10 pg / mL) sandwiching at least 46 pg / mL. It is preferable to set a concentration of not less than 46 mL / mL and a concentration of not less than 46 pg / mL but less than 100 pg / mL. Further, in the case of the method (2), since it is the concentration of the tumor marker in the extract, 2 concentrations considering the extraction rate based on 5 ng / mL (for example, when the extraction rate is 0.02, The concentration of 46 pg / mL is equivalent to 0.92 pg / mL in the extract, so it is set to 0.2 pg / mL or more and less than 0.92 pg / mL and 0.92 pg / mL or more and less than 2.0 pg / mL). It is preferable to do.
[0034]
In the case of CYFRA, the cut-off is normally around 3.5 ng / mL. Therefore, in the case of the method (1), blood containing a tumor marker of a known concentration has at least 2 concentrations (at least 3.5 ng / mL). For example, it is preferable to set a concentration of 1.0 ng / mL or more and less than 3.5 ng / mL and a concentration of 3.5 ng / mL or more and less than 20 ng / mL. In the case of the method (2), since it is the concentration of the tumor marker in the extract, two concentrations considering the extraction rate based on 3.5 ng / mL (for example, when the extraction rate is 0.02, Since the blood concentration of 3.5 ng / mL corresponds to the concentration of 0.07 ng / mL in the extract, the concentration is 0.02 ng / mL or more and less than 0.07 ng / mL and 0.07 ng / mL or more and less than 0.4 ng / mL. (Density) is preferably set.
[0035]
The tumor marker cutoffs other than NSE, ProGRP, and CYFRA are listed, for example, CEA: 5.0 ng / mL, IAP: 501 μg / mL, ferritin: 200 ng / mL, POA: 20 U / mL, TPA: 130 U / L, SCC : 1.5 ng / mL.
[0036]
In the method (1), it is necessary to perform the calibration curve from the extraction operation and the blood for creating the calibration curve cannot be stored for a long period of time. However, it has the advantage of being able to measure accurately. On the other hand, in the method (2), a large amount of specimens can be measured accurately and simply by obtaining the extraction rate in advance and making the conditions such as the extraction operation constant. Of the methods (1) and (2), the method (2) is preferable from the viewpoint of simplicity.
[0037]
The quantification method of the present invention allows blood to be collected by a subject himself / herself, held / dried on a carrier, transported (for example, brought-in, postal mail, courier service, etc.), and a large number of specimens can be used widely such as lung cancer health examinations. Ideal for collecting and quantifying from the region. In addition to cancer screening, the present invention can also be applied to the follow-up of cancer treatment for remote patients.
[0038]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
<Example 1>
This example shows that the tumor marker (NSE) can be accurately quantified even if the blood-carrying carrier is stored for a long period of time.
1. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
Massage and warm the fingertips of 6 volunteers (subjects A to F), allow them to become congested, wipe the puncture site with a disinfecting gauze and dry it, then dispose of the disposable lancet (trade name “Hemolet”, Midori Cross Co., Ltd.) The first blood drop is wiped off, and the next 2 drops are directly applied from the fingertips to each of 10 blood collection filter papers (part number BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.) per subject. Dropped and absorbed. Subsequently, it was air-dried indoors (25 ± 1 ° C., 65 ± 5% RH) (air-

drying time

5, 20, 40, 60 or 120 minutes) to obtain a blood carrier (blood-dried filter paper).
The weight of the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) was measured at each drying time, and the degree of dryness was determined from the ratio to the initial blood weight (value excluding the filter paper weight) (average value of two blood-carrying carriers). The dryness is shown in Table 1.
Next, the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) was stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
[0039]
[Table 1]

[0040]
2. Extraction operation
The following operations were performed in a room at a temperature of 20 to 25 ° C.
The central part of the blood-carrying part of each blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) stored under the conditions shown in Table 1 was punched with a one-hole punch (commercially available for office use) having a diameter of 6 mm to obtain a piece of filter paper.
Add 250 μL of filter paper punched into a test tube and sodium chloride-containing 0.05 mol / L phosphate buffer (pH 7.2) (extraction solution) and stir for 30 seconds (500 rpm with a vortex mixer), then leave for 30 minutes did. Thereafter, the mixture was stirred in the same manner for 30 seconds and then allowed to stand for 1 minute. The supernatant was collected to prepare an extract, which was used for quantification of tumor markers.
[0041]
3. Quantification of tumor marker (NSE) in extract
As a quantification reagent, “Spherelite NSE” marketed by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. as a clinical test agent was used.
As a standard solution for determining the amount of tumor marker in the extract, “Spherelite NSE Control Set” sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
As the quantitative device, SphereLight 180 manufactured by Olympus Optical Co., Ltd. was used.
By using this reagent and apparatus, NSE can be quantified by chemiluminescent enzyme immunoassay.
The quantitative reagent to be used is a clinical test drug for measuring the tumor marker concentration in serum, the amount of specimen used for normal measurement is set to 10 μL, and the reaction time is about 15 minutes in total. In the case of quantification of the tumor marker in the extract, since the concentration was lower than that in serum, 100 μL of the extract was used.
[0042]
4). Quantitative results
The quantification results and the stability determined by the following formula are shown in Tables 2-11.
(Stability) = (Quantitative value after a predetermined storage period) × 100 / (initial quantitative value)
The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
The tumor marker (antigen: NSE) in the extract obtained from the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days.
Therefore, it was found that the tumor marker (antigen: NSE) in the blood carrier (blood dry filter paper) was stable when the drying time was 20 minutes or more.
[0043]
[Table 2]

[0044]
[Table 3]

[0045]
[Table 4]

[0046]
[Table 5]

[0047]
[Table 6]

[0048]
[Table 7]

[0049]
[Table 8]

[0050]
[Table 9]

[0051]
[Table 10]

[0052]
[Table 11]

[0053]
<Example 2>
This example shows that the tumor marker (ProGRP) can be accurately quantified even if the blood-carrying carrier is stored for a long period of time.
1. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
In the same manner as in Example 1, blood carriers (blood-dried filter paper) were prepared from 6 volunteers (subjects A to F) and stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
2. Extraction operation
In the same manner as in Example 1, an extract was prepared and used for quantification of tumor markers.
[0054]
3. Quantification of tumor marker (ProGRP) in extract
As a measurement reagent, “Imcheck-ProGRP” marketed by Kokusai Reagent Co., Ltd. was used as a clinical test agent.
The standard solution for determining the amount of tumor marker in the extract was ProGRP for calibration, which is a constituent reagent of “Imcheck-ProGRP”.
This reagent is a clinical test agent for measuring the tumor marker concentration in serum, and in the case of quantifying the tumor marker in the extract, the measurement sensitivity is insufficient. The measurement was changed as described above. As reagents not specifically described, constituent reagents of “Imcheck-ProGRP” were used.
[0055]
1) 100 μL of a reaction buffer and 50 μL of a sample were added to the wells of an anti-ProGRP antibody fixed plate, and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
2) The reaction solution was removed by suction with an aspirator, and washed by putting 330 μL of the washing solution into the well and sucking. This washing was performed 5 times.
3) 100 μL of POD-labeled antibody solution was added to the well and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
4) Washing was performed in the same manner as 2).
5) 0.1M-N, N-bis (2-hydroxyethyl) containing 0.18 g of luminescent reagent A [luminol sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1 g of 4- (cyanomethylthio) phenol ) Prepared by dissolving in 1 L of methyl / sodium hydroxide buffer (pH 8.5)] 50 μL and Luminescent Reagent B [Created by dissolving 200 μL of 35% hydrogen peroxide in 1 liter of deionized water] 50 μL in the well In addition, the amount of luminescence produced was measured (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. “Lumino Scan Ascent” was used).
6) A calibration curve was created with the amount of luminescence when ProGRP at a known concentration was measured, and the measured amount of luminescence was used as the concentration value.
[0056]
4). Quantitative results
The quantification results and the stability determined in the same manner as in Example 1 are shown in Tables 12-21.
The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
The tumor marker (antigen: ProGRP) in the extract obtained from the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days.
Therefore, it was found that when the drying time was 20 minutes or more, the tumor marker (antigen: ProGRP) in the blood carrier (blood dry filter paper) was stable.
[0057]
[Table 12]

[0058]
[Table 13]

[0059]
[Table 14]

[0060]
[Table 15]

[0061]
[Table 16]

[0062]
[Table 17]

[0063]
[Table 18]

[0064]
[Table 19]

[0065]
[Table 20]

[0066]
[Table 21]

[0067]
<Example 3>
This example shows that the tumor marker (CYFRA) can be accurately quantified even if the blood carrier is stored for a long period of time.
1. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
In the same manner as in Example 1, blood carriers (blood-dried filter paper) were prepared from 6 volunteers (subjects A to F) and stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
2. Extraction operation
In the same manner as in Example 1, an extract was prepared and used for quantification of tumor markers.
[0068]
3. Quantification of tumor marker (CYFRA) in the extract
The measuring reagent used was “Enthym Test Shifura” sold by Roche Diagnostics Co., Ltd. as a clinical test agent.
As the standard solution for determining the amount of the tumor marker in the extract, a standard sifra of “BALL SIFLER KIT” marketed by CIS Diagnostics Co., Ltd. was used.
This reagent is a clinical test agent for measuring the tumor marker concentration in serum, and in the case of quantifying the tumor marker in the extract, the measurement sensitivity is insufficient. The measurement was changed as described above. Reagents that are not specifically described were constituent reagents of “Entimune Test Shifura”.
[0069]
1) 400 μL of biotinylated antibody and 100 μL of specimen prepared as described in the instructions were added to a streptavidin tube and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
2) 500 μL of POD-labeled antibody prepared as described in the instructions was added to the tube and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
3) The reaction solution was removed by suction with an aspirator, and washed by putting 1100 μL of the washing solution into a tube and sucking. This washing was performed three times.
4) 0.1M-N, N-bis (2-hydroxyethyl) containing 0.18 g of luminescent reagent A [luminol sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1 g of 4- (cyanomethylthio) phenol ) Prepared by dissolving in 1 L of methyl / sodium hydroxide buffer (pH 8.5)] 500 μL and luminescent reagent B [prepared by dissolving 200 μL of 35% hydrogen peroxide in 1 liter of deionized water] 500 μL in a tube In addition, the amount of emitted light was measured (using Aloka Co., Ltd. “Luminescent Reader BLR-201”).
6) A calibration curve was created based on the amount of luminescence when a standard Schiffler with a known concentration was measured, and the measured amount of luminescence was used as the concentration value.
[0070]
4). Quantitative results
The quantification results and the stability determined in the same manner as in Example 1 are shown in Tables 22 to 31.
The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
The tumor marker (antigen: CYFRA) in the extract obtained from the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days.
Therefore, it was found that the tumor marker (antigen: CYFRA) in the blood carrier (blood dry filter paper) was stable when the drying time was 20 minutes or more.
[0071]
[Table 22]

[0072]
[Table 23]

[0073]
[Table 24]

[0074]
[Table 25]

[0075]
[Table 26]

[0076]
[Table 27]

[0077]
[Table 28]

[0078]
[Table 29]

[0079]
[Table 30]

[0080]
[Table 31]

[0081]
<Example 4>
This example shows that the tumor marker (SCC) can be accurately quantified even if the blood carrier is stored for a long period of time.
1. Collection of blood and blood carrier (blood dry filter paper)
In the same manner as in Example 1, blood carriers (blood-dried filter paper) were prepared from 6 volunteers (subjects A to F) and stored under the storage conditions described in Table 1 (storage days 0, 3, 7, 14, 28).
2. Extraction operation
In the same manner as in Example 1, an extract was prepared and used for quantification of tumor markers.
[0082]
3. Quantification of tumor marker (SCC) in the extract
As a measuring reagent, “SCC Dynapack” sold by Dynabot Co., Ltd. was used as a clinical test agent.
As a standard solution for determining the amount of tumor marker in the extract, a control reagent of “SCC Dynapack” was used.
This reagent is a clinical test agent for measuring the tumor marker concentration in serum, and in the case of quantifying the tumor marker in the extract, the measurement sensitivity is insufficient. The measurement was changed as described above. Reagents not specifically described used constituent reagents of “SCC Dynapack”.
[0083]
1) 200 μL of microparticles and 100 μL of specimen were added to a test tube and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
2) After centrifuging the test tube, the supernatant was removed with an aspirator. 1 mL of the washing solution was dispensed, stirred, and then centrifuged again, and the supernatant was removed with an aspirator. This washing operation was performed 3 times.
3) 200 μL of labeled antibody was added to a test tube and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
4) Washing was performed in the same manner as 2).
5) Luminescent reagent [BALD APS 540 Chemiluminescent Substrate (Intergen Company)] was added to 500 μL of the test tube, and the amount of luminescence produced was measured (using “Lumincents Reader BLR-201” by Aloka Co., Ltd.).
6) A calibration curve was created with the amount of luminescence when standard SCC at a known concentration was measured, and the measured amount of luminescence was used as the concentration value.
[0084]
4). Quantitative results
The determination results and the stability determined in the same manner as in Example 1 are shown in Tables 32-41.
The initial quantitative value was obtained by adding the blood carrier to the extraction solution immediately after the blood carrier was prepared, and quantifying it by starting the extraction operation.
The tumor marker (antigen: SCC) in the extract obtained from the blood-carrying carrier (blood-dried filter paper) prepared and stored under each condition is 28 days at a storage temperature of 4 ° C., 25 days, except when the drying time is 5 minutes. The stability was 90% or more at 7 ° C for 7 days.
Therefore, it was found that when the drying time was 20 minutes or more, the tumor marker (antigen: SCC) in the blood carrier (blood dried filter paper) was stable.
[0085]
[Table 32]

[0086]
[Table 33]

[0087]
[Table 34]

[0088]
[Table 35]

[0089]
[Table 36]

[0090]
[Table 37]

[0091]
[Table 38]

[0092]
[Table 39]

[0093]
[Table 40]

[0094]
[Table 41]

[0095]
<Example 5>
This example shows that there is a good correlation between the NSE concentration obtained by the method of the present invention and the NSE concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of blood carrier with standard NSE added
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL × 2, and one of them was filled with a standard NSE solution of “Sphereite NSE Control Set” (0 or 90 ng / Standard NSE-added blood (0 or 90 ng / mL) was prepared by adding 100 μL).
100 μL of standard NSE-added blood (90 ng / mL) was dropped on a filter paper (BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.) and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard NSE-added blood carrying carrier (2).
In the same manner, 100 μL of the other blood was dropped on a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0096]
2. Extraction and measurement
In the same manner as in the extraction method described in Example 1, extract solutions were prepared from the standard NSE-added blood carrier (1) and blood carrier (2), and the NSE concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 42.
[0097]
[Table 42]

[0098]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 42, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 42. The average value of the extraction rates of five blood samples was set as the extraction rate (0.0181) when prepared and extracted under the present conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: NSE concentration in the extract prepared from the blood carrier (1)
B: NSE concentration in an extract prepared from a blood carrier with standard NSE (90 ng / mL) added
C: 9 ng / mL (the amount of NSE added)
[0099]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including small cell lung cancer patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. Whole blood collected from the median cubital vein was allowed to stand at room temperature for 1 hour or longer, then cooled and centrifuged at 1500 G for 10 minutes in a refrigerated centrifuge, and the supernatant (serum) portion was further collected.
[0100]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0101]
6). Extraction and quantification
For the blood-bearing carrier, extraction and NSE concentration measurement were performed in the same manner as in the case of setting the extraction rate.
On the other hand, the serum collected and separated by the conventional method was measured with “Sphere Light NSE” described in Example 1 under the conditions described in the instructions attached to the measurement reagent (sample amount: 10 μL).
[0102]
7. Determination of NSE concentration in blood
The NSE concentration in the extract prepared from the blood carrier was divided by the extraction rate (0.0181) to obtain the NSE concentration in the blood.
Table 43 shows the NSE concentration in serum determined by the conventional method and the NSE concentration in blood determined by the method of the present invention. Further, using these values, a correlation diagram between the NSE concentration by the method of the present invention and the NSE concentration by the conventional method is shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, the serum NSE concentration by the conventional method and the blood NSE concentration by the method of the present invention showed a good correlation. In FIG. 1, the equation represents a correlation equation (X: NSE concentration in the conventional method, Y: NSE concentration in the method of the present invention), and R represents a correlation coefficient.
[0103]
[Table 43]

[0104]
<Example 6>
This example shows that there is a good correlation between the ProGRP concentration obtained by the method of the present invention and the ProGRP concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of blood carrier with standard ProGRP added
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL × 2 pieces, and one of them was a standard ProGRP solution of “Imcheck-ProGR” (0 or 1000 pg / mL) ) Was added to each sample to prepare standard ProGRP-added blood (0 or 1000 pg / mL).
100 μL of standard ProGRP-added blood (1000 pg / mL) was dropped onto filter paper (BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.), and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard ProGRP-added blood carrying carrier (2).
Similarly, 100 μL of the other blood (0 pg / mL) was dropped on a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0105]
2. Extraction and measurement
In the same manner as in the extraction method described in Example 2, extracts were prepared from the standard ProGRP-added blood carrier (1) and blood carrier (2), and the ProGRP concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 44.
[0106]
[Table 44]

[0107]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 44, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 44. The average value of the extraction rates of five blood samples was set as the extraction rate (0.0189) when prepared and extracted under these conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: ProGRP concentration in the extract prepared from blood carrier (1)
B: ProGRP concentration in an extract prepared from a blood-supporting carrier supplemented with standard ProGRP (1000 pg / mL)
C: 100 pg / mL (amount of ProGRP added)
[0108]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including small cell lung cancer patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. Whole blood collected from the median cubital vein was allowed to stand at room temperature for 1 hour or longer, then cooled and centrifuged at 1500 G for 10 minutes in a refrigerated centrifuge, and the supernatant (serum) portion was further collected.
[0109]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0110]
6). Extraction and quantification
For the blood-bearing carrier, extraction and ProGRP concentration measurement were performed in the same manner as in the extraction rate setting.
On the other hand, the serum collected and separated by the conventional method was measured with “Imcheck-ProGRP” described in Example 2 under the conditions as described in the instructions attached to the measurement reagent.
[0111]
7. Determination of ProGRP concentration in blood
The ProGRP concentration in the extract prepared from the blood-carrying carrier was divided by the extraction rate (0.0189) to determine the ProGRP concentration in the blood.
Table 45 shows the concentration of ProGRP in serum determined by the conventional method and the concentration of ProGRP in blood determined by the method of the present invention. Further, using these values, a correlation diagram between the ProGRP concentration by the method of the present invention and the ProGRP concentration by the conventional method is shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the serum ProGRP concentration by the conventional method and the blood ProGRP concentration by the method of the present invention showed a good correlation. In FIG. 2, the equation represents a correlation equation (X: ProGRP concentration in the conventional method, Y: ProGRP concentration in the method of the present invention), and R represents a correlation coefficient.
[0112]
[Table 45]

[0113]
<Example 7>
This example shows that there is a good correlation between the CYFRA concentration obtained by the method of the present invention and the CYFRA concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of blood carrier with added standard CYFRA
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL × 2 pieces, and one of them was added to a standard CYFRA solution (0 or 60 ng / kg) of “Ball Shifra Kit”. 100 mL of each) was added to prepare standard CYFRA-added blood (0 or 60 ng / mL).
100 μL of standard CYFRA-added blood (60 ng / mL) was dropped on a filter paper (BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.) and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard CYFRA-added blood-carrying carrier (2).
Similarly, 100 μL of the other blood (0 ng / mL) was dropped on a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0114]
2. Extraction and measurement
In the same manner as the extraction method described in Example 3, an extract was prepared from each of the standard CYFRA-added blood carrier (1) and the blood carrier (2), and the CYFRA concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 46.
[0115]
[Table 46]

[0116]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 46, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 46. The average value of the extraction rates of five blood samples was set as the extraction rate (0.0198) when prepared and extracted under these conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: CYFRA concentration in the extract prepared from blood carrier (1)
B: CYFRA concentration in the extract prepared from a blood carrier with standard CYFRA (60 ng / mL) added
C: 6 ng / mL (the amount of CYFRA added)
[0117]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including non-small cell lung cancer patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. Whole blood collected from the median cubital vein was allowed to stand at room temperature for 1 hour or longer, then cooled and centrifuged at 1500 G for 10 minutes in a refrigerated centrifuge, and the supernatant (serum) portion was further collected.
[0118]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0119]
6). Extraction and quantification
For the blood carrier, extraction and CYFRA concentration measurement were performed in the same manner as in the extraction rate setting.
On the other hand, the serum collected and separated by the conventional method was measured with the “Enthym test Shifura” described in Example 3 under the conditions according to the instructions attached to the measurement reagent.
[0120]
7. Determination of CYFRA concentration in blood
The CYFRA concentration in the extract prepared from the blood carrier was divided by the extraction rate (0.0198) to obtain the CYFRA concentration in the blood.
Table 47 shows the serum CYFRA concentration determined by the conventional method and the blood CYFRA concentration determined by the method of the present invention. In addition, using these values, a correlation diagram between the CYFRA concentration by the method of the present invention and the CYFRA concentration by the conventional method is shown in FIG. As can be seen from FIG. 3, the CYFRA concentration in serum by the conventional method and the CYFRA concentration in blood by the method of the present invention showed a good correlation. In FIG. 3, the equation represents a correlation equation (X: CYFRA concentration in the conventional method, Y: CYFRA concentration in the method of the present invention), and R represents a correlation coefficient.
[0121]
[Table 47]

[0122]
<Example 8>
This example shows that there is a good correlation between the SCC concentration obtained by the method of the present invention and the SCC concentration obtained by the conventional method.
1. Preparation of standard SCC-added blood carrier
1.8 mL of blood was collected from 5 volunteers (subjects G to K), divided into 0.9 mL x 2 pieces, and one of them was a standard SCC solution of "SCC Dynapac" (0 or 50 ng / mL) 100 μL of each was added to prepare standard SCC-added blood.
100 μL of standard SCC-added blood (60 ng / mL) was dropped on a filter paper (BFC180, manufactured by Whatman Co., Ltd.) and dried at room temperature (25 ± 2 ° C.) for 1 hour to prepare a standard SCC-added blood-carrying carrier (2).
Similarly, 100 μL of the other blood (0 ng / mL) was dropped on a filter paper and dried to prepare a blood carrying carrier (1).
[0123]
2. Extraction and measurement
In the same manner as in the extraction method described in Example 4, an extract was prepared from each of the standard SCC-added blood carrier 1 and blood carrier 2, and the SCC concentration in the extract was measured. The results are shown in Table 48.
[0124]
[Table 48]

[0125]
3. Extraction rate setting
From the measured values shown in Table 48, the extraction rate was calculated from the following equation. The results are shown in Table 48. The average value of the extraction rates of the five blood samples was set as the extraction rate (0.0200) when created and extracted under these conditions.
Extraction rate = (B−A) / C
A: SCC concentration in the extract prepared from blood carrier (1)
B: SCC concentration in the extract prepared from a blood carrier with standard SCC (50 ng / mL) added
C: 5 ng / mL (amount of added SCC)
[0126]
4). Blood collection
Blood was collected from 20 people including non-small cell lung cancer patients. Blood collection was performed by the method described in Example 1 (blood collection from the fingertip) and the conventional method (collecting 2 mL or more of whole blood from the median cubital vein using a blood collection syringe) from the median cubital vein. Whole blood collected from the median cubital vein was allowed to stand at room temperature for 1 hour or longer, then cooled and centrifuged at 1500 G for 10 minutes in a refrigerated centrifuge, and the supernatant (serum) portion was further collected.
[0127]
5. Preparation of blood carrier (blood dry filter paper)
A blood carrier (blood dried filter paper) was prepared in the same manner as described in Example 1. The drying time was set to 1 hour, which is the same as the extraction rate setting.
[0128]
6). Extraction and quantification
For the blood-bearing carrier, extraction and SCC concentration measurement were performed in the same manner as in the extraction rate setting.
On the other hand, the serum collected and separated by the conventional method was measured with “SCC Dynapack” described in Example 4 under the conditions as described in the instructions attached to the measurement reagent.
[0129]
7. Determination of SCC concentration in blood
The SCC concentration in the extract prepared from the blood carrier was divided by the extraction rate (0.0200) to obtain the SCC concentration in blood.
Table 49 shows the SCC concentration in serum determined by the conventional method and the SCC concentration in blood determined by the method of the present invention. Further, FIG. 4 shows a correlation diagram between the SCC concentration by the method of the present invention and the SCC concentration by the conventional method using these values. As can be seen from FIG. 4, the SCC concentration in serum by the conventional method and the SCC concentration in blood by the method of the present invention showed a good correlation. In FIG. 4, the equation is a correlation equation (X: SCC concentration in the conventional method, Y: SCC concentration in the method of the present invention), and R indicates a correlation coefficient.
[0130]
[Table 49]

【The invention's effect】
According to the method for quantifying tumor markers in blood of the present invention, lung cancer tumor markers can be quantified very easily.
Furthermore, since the subject can collect blood by himself / herself, an expert or the like for blood collection is unnecessary, and the subject does not need to go to a hospital or the like for blood collection.
In addition, since the blood-carrying carrier can be easily transported, it is possible to collect and measure a large number of specimens in one place and to reduce the cost of transportation and measurement.
Therefore, the quantification method of the present invention is optimal when collecting and measuring a large number of specimens such as lung cancer health examinations from a wide area.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the correlation between serum NSE concentration by a conventional method and blood NSE concentration by a method of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the correlation between the serum ProGRP concentration by the conventional method and the blood ProGRP concentration by the method of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the correlation between the CYFRA concentration in serum by the conventional method and the CYFRA concentration in blood by the method of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the correlation between the SCC concentration in serum by a conventional method and the SCC concentration in blood by the method of the present invention.

Claims

A method for quantifying a tumor marker in blood, comprising extracting a blood component from a blood carrier and quantifying a tumor marker for lung cancer from the tumor marker concentration in the extract and the extraction rate of the tumor marker.
The extraction rate was determined in the extracts extracted from the blood-carrying carrier (1) prepared using blood and the blood-carrying carrier (2) prepared using added blood obtained by adding a tumor marker of a known concentration to blood. The amount of tumor marker contained in the extract was quantified and the concentration of the tumor marker in the extract {A: concentration in the extract extracted from the carrier (1), B: concentration in the extract extracted from the carrier (2)} Is obtained from the following equation.
(Extraction rate) = (B−A) / (Concentration of tumor marker added to blood)

The method for quantifying a tumor marker in blood according to claim 1, wherein the lung cancer is small cell lung cancer, lung squamous cell carcinoma and / or lung adenocarcinoma.

The tumor marker is at least one tumor marker selected from the group consisting of neuron specific enolase (NSE), gastrin releasing peptide precursor (ProGRP), squamous cell carcinoma associated antigen (SCC) and soluble cytokeratin 19 fragment (CYFRA) The method for quantifying a tumor marker in blood according to claim 1 or 2.

The method for quantifying a tumor marker in blood according to any one of claims 1 to 3, wherein the blood-carrying carrier carries blood on an absorbent body using filter paper.

The method for quantifying a tumor marker in blood according to any one of claims 1 to 4, wherein the blood-carrying carrier carries blood collected from a fingertip.